腺苷脱氨酶或其修饰物在制备糖尿病治疗药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及腺苷脱氨酶或其修饰物在制备糖尿病治疗药物中的应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种常见的代谢内分泌病，临床上早期无症状，至症状期才有多食、多饮、多尿、烦渴、善饥、消瘦或肥胖、疲乏无力等症状。根据世界卫生组织的数据，2014年2型糖尿病已成为一种全球流行病，影响了超过4亿人。90％以上的糖尿病为2型糖尿病，主要是由胰岛素抵抗和相对性胰岛素分泌不足所致。2型糖尿病患者并不依赖外源胰岛素而生存，但有些需要用胰岛素来控制高血糖症。
3.血糖浓度不受控制的升高是2型糖尿病的标志，长期血糖升高可导致严重的并发症，包括心血管并发症，神经病，肾衰竭和癌症。普遍认为，肝糖异生过多是导致2型糖尿病患者血糖水平升高的主要原因。因此，降低肝糖异生是管理2型糖尿病中血糖水平的可行策略。有证据表明，肝脏糖异生异常与肥胖、非酒精性脂肪肝、糖尿病等疾病密切相关。抑制糖异生可以治疗肥胖、非酒精性脂肪肝、糖尿病等疾病。
4.腺苷脱氨酶(ada)是一种嘌呤分解代谢酶，将腺苷转化为肌苷，从而有助于减少组织和细胞中存在的腺苷水平。腺苷脱氨酶缺乏症是一种罕见的遗传性嘌呤代谢疾病，其特征是免疫缺陷，发育不良和代谢异常。缺乏ada会导致有毒代谢产物积聚，从而引起细胞介导的体液免疫缺陷，导致严重的联合免疫缺陷(scid)。造血干细胞移植可以治愈联合免疫缺陷，但往往受限于良好的供体匹配。其他治疗包括使用牛乙二醇酶(peg-ada)进行的酶替代疗法(ert)，以及最近的基因疗法。peg-ada已在全球众多患者中使用，其可以恢复患者代谢排毒功能和保护患者免疫功能，并且使患者在临床上保持良好状态。然而目前尚未见腺苷脱氨酶或其修饰物用于抑制肝脏糖异生的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供腺苷脱氨酶或其修饰物在制备糖尿病治疗药物中的应用。
6.本发明所述的糖尿病为2型糖尿病。
7.本发明所述的腺苷脱氨酶为代谢腺嘌呤核苷的蛋白，包括提取自动物组织的腺苷脱氨酶和其他基因重组的腺苷脱氨酶等。
8.在本发明具体实施方式中，采用的腺苷脱氨酶为天然提取牛腺苷脱氨酶或大肠杆菌表达的鼠腺苷脱氨酶，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.本发明所述的腺苷脱氨酶修饰物为将腺苷脱氨酶进行化学修饰，增加稳定性，延长半衰期，包括但不限于聚乙二醇修饰、右旋糖酐修饰、肝素修饰等。
10.本发明还提供一种糖尿病治疗药物，含有腺苷脱氨酶或其修饰物中的一种或多种。进一步地，所述的糖尿病治疗药物还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
11.本发明与现有技术相比，其显著优点是：(1)腺苷脱氨酶是生物体天然具有的蛋白，来源广泛且具有优异的生物相容性；(2)首次公开了腺苷脱氨酶及其修饰物能够对糖异生产生明显的抑制作用。
附图说明
12.图1为天然提取牛腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠禁食血糖影响结果图。
13.图2为天然提取牛腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠丙酮酸耐受的影响结果图。
14.图3为聚乙二醇修饰天然提取牛腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠禁食血糖影响结果图。
15.图4为聚乙二醇修饰天然提取牛腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠丙酮酸耐受的影响结果图。
16.图5为大肠杆菌表达鼠腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠禁食血糖影响结果图。
17.图6为大肠杆菌表达鼠腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠丙酮酸耐受的影响结果图。
18.图7为聚乙二醇修饰大肠杆菌表达鼠腺苷脱氨酶对糖尿病禁食血糖影响结果图。
19.图8为聚乙二醇修饰大肠杆菌表达鼠腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠丙酮酸耐受的影响结果图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述。下述实施例中采用的方法如无特殊说明，均为本领域常规使用的方法。
21.以下实施例中采用的各原料，如无特殊说明，均为市售产品。
22.以下实施例涉及到的腺苷脱氨酶包含通过购买或者由申请人自制。采用的天然提取牛腺苷脱氨酶购自上海生工生物工程有限公司，以及自制的大肠杆菌表达的鼠腺苷脱氨酶。
23.以下实施例涉及到的腺苷脱氨酶修饰物包含通过购买或者由申请人自制。采用聚乙二醇(购自北京凯正联合医药技术有限公司)修饰天然提取牛腺苷脱氨酶，以及聚乙二醇修饰的大肠杆菌表达的鼠腺苷脱氨酶。
24.实施例1天然提取牛腺苷脱氨酶对糖尿病糖异生的影响。
25.(1)实验分组
26.选用spf级雄性db/db小鼠，8周，标准实验条件下饲养：12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。随机分为两组，对照组和腺苷脱氨酶处理组。对照组予对应药物介质(pbs缓冲液)处理；腺苷脱氨酶处理组，腹腔注射天然提取牛腺苷脱氨酶(5u/g)。
27.(2)禁食血糖测定
28.腹腔注射腺苷脱氨酶24小时后，每组取3只用于测定糖异生率，具体方法为：过夜禁食后，尾静脉采血测空腹血糖，记为小鼠禁食血糖。
29.(3)丙酮酸耐受实验
30.腹腔注射腺苷脱氨酶24小时后，每组取3只用于测定糖异生率，具体方法为：禁食16小时后，尾静脉采血测空腹血糖，记作0分钟时血糖值；其后，按体重2g/kg剂量腹腔注射丙酮酸钠，分别于15,30,60,120分钟尾静脉采血测血糖。从而检测糖异生水平。
31.(4)实验结果
32.结合如图1所示，实验结果表明，糖尿病小鼠给予腺苷脱氨酶处理后，小鼠禁食血糖明显下降。结合图2实验结果表明，糖尿病小鼠给予腺苷脱氨酶处理后，小鼠丙酮酸耐受能力得到缓解。以上结果表明，天然提取牛腺苷脱氨酶能够有效降低糖尿病db/db小鼠血糖，改善小鼠糖异生水平。
33.实施例2聚乙二醇修饰天然提取牛腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠糖异生的影响
34.(1)聚乙二醇修饰天然提取牛腺苷脱氨酶的制备
35.用1ml无菌pbs(10mmol/l，ph9.0)将ada稀释至500u/ml。然后加入分子量为20kda的mpeg-spa(北京凯正联合医药技术有限公司)，终浓度为100mg/ml，室温混合5h。最后加入pbs(10mmol/l,ph7.4)，将peg-ada稀释至终浓度150u/ml。
36.(2)实验分组
37.选用spf级雄性db/db小鼠，8周，标准实验条件下饲养：12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。随机分为两组，对照组和腺苷脱氨酶处理组。对照组予对应药物介质(pbs)处理；腺苷脱氨酶处理组，腹腔注射聚乙二醇修饰天然提取牛腺苷脱氨酶(1.5u/g)。
38.(3)禁食血糖测定
39.腹腔注射腺苷脱氨酶24小时后，每组取3只用于测定糖异生率，具体方法为：过夜禁食后，尾静脉采血测空腹血糖，记为小鼠禁食血糖。
40.(4)丙酮酸耐受实验
41.腹腔注射腺苷脱氨酶24小时后，每组取3只用于测定糖异生率，具体方法为：禁食16小时后，尾静脉采血测空腹血糖，记作0分钟时血糖值；其后，按体重2g/kg剂量腹腔注射丙酮酸钠，分别于15,30,60,120分钟尾静脉采血测血糖。从而检测糖异生水平。
42.(5)实验结果
43.结合图3，实验结果表明，糖尿病小鼠给予腺苷脱氨酶处理后，小鼠禁食血糖明显下降。结合图4实验结果表明，糖尿病小鼠给予腺苷脱氨酶处理后，小鼠丙酮酸耐受能力得到缓解。以上结果表明，聚乙二醇修饰天然提取牛腺苷脱氨酶能够有效降低糖尿病db/db小鼠血糖，改善小鼠糖异生水平。
44.实施例3大肠杆菌表达的鼠腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠糖异生的影响
45.(1)大肠杆菌表达的鼠腺苷脱氨酶的制备
46.pcr扩增鼠腺苷脱氨酶片段dna(seq id no.1)克隆到载体pge-x-4t-1中。将得到的质粒转入大肠杆菌bl21(de3)。将pge-x-4t-1::ada转化的大肠杆菌置于添加了100mol/l氨苄青霉素的lb培养基中培养。将2ml过夜培养物转入200ml新鲜lb培养基中，在37℃、摇床转速230rpm的培养条件下培养约2小时，直到含菌培养基的od
600
达到0.6。加入过滤灭菌的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.2mmol/l，在28℃、摇床转速2300rpm的培养条件下继续培养约24小时。4℃离心(13000rpm)收集菌体，重新悬浮于添加10mm蛋白酶抑制剂的25ml磷酸缓冲生理盐水(pbs)裂解缓冲液中，超声破碎(功率：300w，工作时间5秒，间歇时间10秒，总次数30)。gst标记的蛋白通过gst亲和层析纯化。首先在谷胱甘肽sepharose 4b亲和柱上纯化gst-ada，然后在凝血酶4℃过夜去除gst标签。凝血酶在孵育后立即用苯甲脒-琼脂糖层析去除。
47.(2)选用spf级雄性db/db小鼠，8周，标准实验条件下饲养：12小时光照-12小时黑
暗循环，自由摄取水和食物。随机分为两组，对照组和腺苷脱氨酶处理组。对照组予对应药物介质(pbs)处理；腺苷脱氨酶处理组，腹腔注射鼠腺苷脱氨酶(5u/g)。
48.(3)禁食血糖测定
49.腹腔注射腺苷脱氨酶24小时后，每组取3只用于测定糖异生率，具体方法为：过夜禁食后，尾静脉采血测空腹血糖，记为小鼠禁食血糖。
50.(4)丙酮酸耐受实验
51.腹腔注射腺苷脱氨酶24小时后，每组取3只用于测定糖异生率，具体方法为：禁食16小时后，尾静脉采血测空腹血糖，记作0分钟时血糖值；其后，按体重2g/kg剂量腹腔注射丙酮酸钠，分别于15,30,60,120分钟尾静脉采血测血糖。从而检测糖异生水平。
52.(5)实验结果
53.结合图5，实验结果表明，糖尿病小鼠给予腺苷脱氨酶处理后，小鼠禁食血糖明显下降。结合图6实验结果表明，糖尿病小鼠给予腺苷脱氨酶处理后，小鼠丙酮酸耐受能力得到缓解。以上结果表明，鼠腺苷脱氨酶能够有效降低糖尿病db/db小鼠血糖，改善小鼠糖异生水平。
54.实施例4聚乙二醇修饰的大肠杆菌表达的鼠腺苷脱氨酶对糖尿病小鼠糖异生的影响大肠杆菌表达的鼠腺苷脱氨酶的制备
55.pcr扩增鼠腺苷脱氨酶片段dna(seq id no.1)克隆到载体pge-x-4t-1中。将得到的质粒转入大肠杆菌bl21(de3)。将pge-x-4t-1::ada转化的大肠杆菌置于添加了100mol/l氨苄青霉素的lb培养基中培养。将2ml过夜培养物转入200ml新鲜lb培养基中，在37℃、摇床转速230rpm的培养条件下培养约2小时，直到含菌培养基的od
600
达到0.6。加入过滤灭菌的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.2mmol/l，在28℃、摇床转速2300rpm的培养条件下继续培养约24小时。4℃离心(13000rpm)收集菌体，重新悬浮于添加10mm蛋白酶抑制剂的25ml磷酸缓冲生理盐水(pbs)裂解缓冲液中，超声破碎(功率：300w，工作时间5秒，间歇时间10秒，总次数30)。gst标记的蛋白通过gst亲和层析纯化。首先在谷胱甘肽sepharose 4b亲和柱上纯化gst-ada，然后在凝血酶4℃过夜去除gst标签。凝血酶在孵育后立即用苯甲脒-琼脂糖层析去除。
56.(2)聚乙二醇修饰鼠腺苷脱氨酶的制备
57.用1ml无菌pbs(10mmol/l，ph9.0)将ada稀释至500u/ml。然后加入分子量为20kda的mpeg-spa(北京凯正联合医药技术有限公司)，终浓度为100mg/ml，室温混合5h。最后加入pbs(10mmol/l，ph7.4)，将peg-ada稀释至终浓度150u/ml。
58.(3)实验分组
59.选用spf级雄性db/db小鼠，8周，标准实验条件下饲养：12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。随机分为两组，对照组和腺苷脱氨酶处理组。对照组予对应药物介质(pbs)处理；腺苷脱氨酶处理组，腹腔注射聚乙二醇修饰鼠腺苷脱氨酶(1.5u/g)。
60.(4)禁食血糖测定
61.腹腔注射腺苷脱氨酶24小时后，每组取3只用于测定糖异生率，具体方法为：过夜禁食后，尾静脉采血测空腹血糖，记为小鼠禁食血糖。
62.(5)丙酮酸耐受实验
63.腹腔注射腺苷脱氨酶24小时后，每组取3只用于测定糖异生率，具体方法为：禁食
16小时后，尾静脉采血测空腹血糖，记作0分钟时血糖值；其后，按体重2g/kg剂量腹腔注射丙酮酸钠，分别于15,30,60,120分钟尾静脉采血测血糖。从而检测糖异生水平。
64.(6)实验结果
65.结合图7，实验结果表明，糖尿病小鼠给予腺苷脱氨酶处理后，小鼠禁食血糖明显下降。结合图8实验结果表明，糖尿病小鼠给予腺苷脱氨酶处理后，小鼠丙酮酸耐受能力得到缓解。以上结果表明，聚乙二醇修饰鼠腺苷脱氨酶能够有效降低糖尿病db/db小鼠血糖，改善小鼠糖异生水平。