一种DNA重组干细胞载体新冠疫苗的制作方法

一种dna重组干细胞载体新冠疫苗
技术领域
1.本发明涉及一种dna重组干细胞载体新冠疫苗，属于生物医学领域的传染病防治技术。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars
‑
cov
‑
2)已对全球公众健康构成严重威胁。sars
‑
cov
‑
2的主要结构 包括单股正链核酸(ssrna)、刺突蛋白(s)、膜蛋白(m)、包膜蛋白(e)和核壳蛋白(n)。 其中s蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成n端的s1亚基和c端的s2亚基，s1亚基由n 端的结构域(s1
‑
ntd)和受体结合域(s1
‑
rbd)组成，s1
‑
rbd负责识别并结合宿主细胞表面 受体血管紧张素转换酶2(ace2)，s2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进 入细胞引起感染。n蛋白为rna合成所必需，在病毒组装和rna转录中起着至关重要的作用， 同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。m和e蛋白在病毒装配中起重要作用。
3.目前的新冠病毒疫苗主要以s蛋白或其rbd为靶点设计开发。在新冠病毒载体疫苗的制 备中，人腺病毒5型(ad5)是应用最广泛的病毒载体。人腺病毒含有26
‑
45kb的双链线性 dna基因组，基因组中含有4个早期转录基因区(e1
‑
e4)和1个晚期转录基因区，两端各有 1段约100bp的反向未端重复序列(itr)。第一代腺病毒载体删除了e1和e3区基因，第二 代腺病毒载体删除了e1
‑
e4区基因，ad5为第三代腺病毒载体，删除了所有病毒编码基因， 仅保留5’和3’端itr及包装信号，可容纳36kb外源基因。虽然ads的细胞毒性和免疫源性 减弱，外源基因表达时效提高，可感染的细胞多而应用广，但易引起非特异性感染而不适用 于靶向治疗，临床应用中易产生副作用。ad5不与宿主细胞dna整合，虽较安全但使目的基 因表达不稳定，进入宿主细胞后易被网状内皮细胞吞噬而失去作用。同时由于ad5无法复制， 会使体内重组病毒越来越少，所以不适用于临床慢性疾病的长期治疗。ad5本质为病毒，仍具 有免疫源性和细胞毒性，宿主对病毒载体的免疫应答会干扰对目的抗原的免疫应答，大多数 正常人已受过腺病毒感染，对病毒载体的预存免疫也会干扰疫苗的免疫效果。
4.目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(mscs)和自然杀伤细胞 (nk)，其中应用最多的是mscs。mscs来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，能迁移到 损伤的确切部位，定向分化为肺组织细胞和毛细血管内皮细胞等多种细胞系，产生多种细胞 因子和分泌大量的含有mirna的外泌体、囊泡，通过影响pi3k/akt、nf
‑
κb等信号通路来治 疗肺损伤，通过调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等机制修复受损器官。干细胞具有 非常强的抗病毒能力，能在病毒感染局部幸存并发挥作用，已初步表明mscs在重症新冠肺炎 治疗中的安全性和有效性，具有良好的临床应用前景。但尚未见以进一步改造的干细胞取代腺 病毒载体制备新冠病毒载体疫苗的文献报道。
5.通常间充质干细胞在体外传代至15
‑
30代就会出现衰老或死亡，而经猿猴病毒40大t抗 原基因(sv40lt)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表 型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。 这为干细胞体外培养寿命的改良和产业扩增提供了依据。文献报道，sars
‑
cov能
phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna或lv3
‑
ncov
‑
n
‑
shrna，将重组质粒phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna和包装质粒 (phblv、pspax2载体和pmd2g载体)或者将重组质粒lv3
‑
ncov
‑
n
‑
shrna和包装质粒 (plv/helper
‑
sl3、plv/helper
‑
sl4和plv/helper
‑
sl5)共转染293ft细胞，包装携带shrna 的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使shrna基因整合到干细胞dna上，从而获得能干扰ncov 在干细胞内复制的新功能。
14.进而，制成一种人工装配永生化基因htert和/或sv40lt、新冠病毒rna干扰基因shrna 和新冠病毒易感基因ace2的dna重组干细胞。
15.进而，将dna重组干细胞替换现有技术的腺病毒载体，制备干细胞载体新冠疫苗。例如， 根据genbank分析sars
‑
cov
‑
2的s蛋白氨基酸序列(rbd氨基酸为gly319～asn541)，采 用氨基酸密码子同义置换，合成rbd肽段对应核酸的全基因，在rbd基因两端分别插入ecor 和ixhoi的酶切位点，将合成的rbd基因构建重组质粒phblv
‑
rbd，或在rbd基因两端分 别插入hindiii和xho i的酶切位点，将合成的rbd基因构建重组质粒pgc
‑
fu
‑
rbd，分别包装 携带rbd的慢病毒，将慢病毒转染dna重组干细胞，使rbd基因整合到重组干细胞dna上， 从而能通过rbd基因表达rbd蛋白刺激宿主产生新冠病毒抗体。
16.最终，制备一种兼具干细胞天然治疗功能、人工改良的永生化功能、新冠病毒易感功能、 新冠病毒rna干扰功能以及s1
‑
rbd抗体产生功能的dna重组干细胞载体新冠疫苗。
17.本发明的有益效果在于：
18.将原本弃用的组织细胞改造为具有多种新功能的dna重组干细胞，用于替换传统的腺病 毒载体，制备dna重组干细胞载体新冠疫苗。
19.dna重组干细胞因装配了永生化基因(sv40lt和/或htert)而解决了超低温永久保存问 题、可再生利用问题、需无限扩增的商业化问题。
20.dna重组干细胞因装配了新冠病毒的rna干扰基因而更易抑制病毒在干细胞内复制，使 原本易被病毒杀灭的干细胞改造为易杀灭病毒的dna重组干细胞。
21.dna重组干细胞在装配新冠病毒易感基因(ace2)的基础上装配rna干扰基因，更易与 宿主细胞竞争将病毒吸入干细胞内并在干细胞内进行rna干扰，从而减少宿主细胞受感染机 会。这种ace2的应用方法克服了通常担心治疗用干细胞被病毒感染的传统偏见，而且dna 重组干细胞中装配的ace2基因能表达ace2蛋白，这种蛋白能刺激宿主产生ace2抗体，而 ace2抗体因能阻抑新冠病毒与ace2受体结合从而能阻止新冠病毒感染新的宿主细胞。
22.同时装配了ace2基因和rna干扰基因的dna重组干细胞，前者将病毒吸入干细胞内，后 者抑制病毒在干细胞内复制，起到“引毒入胞、胞内杀毒”的作用，使具有组织损伤作用的 抗病毒反应从宿主组织转移到干细胞内，从而可减轻宿主组织因抗病毒反应所致的损伤。
23.dna重组干细胞被用作疫苗载体时，因取代了具有免疫原性的腺病毒载体、可以同型选 用以及外源基因不进入宿主细胞内等原因，所以疫苗的使用较安全；又因装配的s1
‑
rbd基因 能表达rbd蛋白，rbd蛋白能刺激宿主产生rbd中和抗体，即使干细胞被吞噬，其抗原信息 也会被吞噬细胞传递给免疫细胞而产生rbd中和抗体，所以能阻止新冠病毒通过s1
‑
rbd与宿 主细胞ace2受体结合而感染宿主细胞。
附图说明
24.图1是本发明所述的以g418和嘌呤霉素筛选得到的永生化细胞克隆图。
25.图2是本发明所述的被sv40lt和htert转染的细胞克隆的传代培养图。
26.图3是重组ace2的干细胞与分离的病毒共培养72小时的细胞生长状态。
27.图4是重组ace2和shrna的干细胞与分离的病毒共培养72小时的细胞生长状态。
28.在图1中，因被sv40lt和htert转染的永生化细胞不会被g418和嘌呤霉素杀死而存活， 存活的单个细胞生长后形成细胞克隆。
29.在图2中，被sv40lt和htert转染的细胞在传代中呈梭形贴壁生长，生长旺盛。
30.在图3中，可见细胞呈圆形、漂浮、死亡状态，说明细胞内ace2基因的表达有利于将病 毒吸入胞内并在胞内繁殖、致细胞较快死亡。
31.在图4中，可见细胞仍呈梭形贴壁生长，说明shrna的表达能干扰病毒在胞内复制，使 重组ace2和shrna的干细胞能将病毒吸入胞内并在胞内杀灭。
具体实施方式
32.下面结合附图，对本发明的具体实施方法作详细的描述，但这些范例性的描述并不对本 发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
33.实施例一、dna重组干细胞的制备
34.1.间充质干细胞(msc)的采集
35.1.1.羊水间充质干细胞的采集
36.按产前诊断流程采集待检孕妇的羊水细胞，进行细胞培养和产前诊断，在倒置显微镜下 从剩余的羊水细胞中筛选出贴壁生长的梭形羊水细胞或间充质干细胞。
37.1.2.脐带间充质干细胞的采集
38.从液氮罐中取出冻存的脐带，置37℃水浴快速解冻，以无菌pbs清洗，去除残留的血迹， 将脐带剪成大小约1mm3的组织块，置于铺有胎牛血清的培养皿中，在37℃放置6h后，加入 10％胎牛血清的dmem培养基，37℃5％co2培养箱中培养，观察贴壁组织周围的细胞生长情况， 当细胞达到80％
‑
90％融合度时，用胰酶消化传代，获得间充质干细胞。
39.1.3.肺间充质干细胞的采集
40.无菌取流产胎儿肺脏组织，机械离散，0.25％胰蛋白酶消化后，用孔径为100μm的纱布 过滤，1 000r/min离心5min，弃上清液，添加dmem培养液(0.1umolβ
‑
巯基乙醇，100ui/ml 青链霉素，10％胎牛血清)。在37℃、5％co2条件下培养。45min后换液，以去除尚未贴壁的 细胞，后每48h换液。待细胞汇合度达80％后，0.25％胰蛋白酶消化传代。
41.2.间充质干细胞的永生化性能改良
42.2.1.htert/plpcx和sv40lt/plxsn重组载体的构建
43.2.1.1.sv40lt/plxsn的构建
44.以sv40 dna(strain 766)为模板，上游引物为5
’‑
gcccaggatccttaacaacaacaacaat
‑3’
， 下游引物为5
’‑
acgctgaattccctctgagctat
‑3’
，进行sv40 lt高保真长片段的pcr扩增；sv40lt的pcr产物与plxsn反转录病毒载体均经ecor i/bamh i酶切、连接、转化、筛选和测序 验证，获得含sv40lt/plxsn重组反转录病毒载体。
45.2.1.2.htert/plpcx的构建
46.用ecor i酶切pires2
‑
egfp
‑
htert质粒得到htert cdna片段，去磷酸化后亚克隆到 plpcx反转录病毒载体ecor i位点，用t4dna连接酶置22℃条件下连接，转化至感受态 e.colidhs
‑
alpha大肠埃希氏菌，37℃培养过夜，挑选无色菌落接种，纯化重组质粒，经酶 切和测序鉴定后，扩大培养含htert的大肠埃希氏菌，用endotoxin
‑
free的质粒纯化 plpcx
‑
htert重组克隆。
47.2.2.将sv40lt和htert联合转染间充质干细胞
48.将待转染的间充质细胞配成约8
×
105个细胞浓度接种，置5％co2和37℃培养，24h后用 含sv40lt基因的重组逆转录病毒感染(polybrene浓度为8ug/ml)，1周后用500ug/ml的g418 筛选4周，待细胞克隆出现后，再用含htert基因的重组逆转录病毒感染(polybrene浓度 为8ug/ml)，1周后用2ug/ml的嘌呤霉素筛选，获得细胞克隆(见图1)。
49.2.3.永生化间充质干细胞的鉴定
50.2.3.1.永生化干细胞的生物学特性鉴定
51.包括
①
细胞系为梭形、成纤维状。
②
western检测可见分别在相对分子质量为120000和 93000处出现白色条带。
③
细胞系的生长曲线呈典型的“s”生长特征。
④
细胞系的染色体核 型为二倍体。
⑤
细胞系不能在软琼脂中生长。
⑥
裸鼠致瘤试验呈阴性。
52.2.3.2.永生化干细胞的表面分子检测
53.用流式细胞仪检测细胞膜表面分子，阳性分子包括cd73
‑
apc、cd90
‑
fitc、cd44
‑
pe、 cd105
‑
cy5.5；阴性分子包括cd11b
‑
pe、cd19
‑
pe、cd34
‑
pe、cd45
‑
pe、hla
‑
dr
‑
pe。通过鉴 定，获得能在体外永久传代的永生化间充质干细胞。图2为传至第35代的干细胞。
54.2.3.3.肺干细胞系的鉴定
55.人肺干细胞系需符合：
①
相差显微镜观察：呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状。
②
流式 细胞仪检测：细胞表面标志物cd45、cd11a、cd14、cd90、cd34、cd71、cd25、cd105、cd117、 cd166和cd44为阳性。
③
共聚焦技术检测：角蛋白表达呈阴性，四个干性相关因子c
‑
myc、 oct4、nanog和nestin呈阳性。
④
间接免疫荧光检测：波形蛋白(vimentin)、iii型胶原 (collagen iii)、纤维连接蛋白(fibronectin，fn)表达呈阳性，而表面活性蛋白c前体 (pro
‑
surfactant protein c，prosp
‑
c)、血管性血友病因子(von willebrand factor，vwf) 及α平滑肌肌动蛋白(α
‑
smooth muscle actin，α
‑
sma)表达呈阴性。
56.3.永生干细胞的新冠病毒易感基因(ace2)装配
57.3.1.慢病毒表达载体phblv
‑
ace2
‑
oe或pgc
‑
fu
‑
ace2的构建和鉴定
58.pcr扩增质粒pc
‑
dna3.1
‑
hygro(+)
‑
mace2中的ace2(或从肺组织细胞中提取rna，逆转 录为cdna，再pcr扩增ace2)。根据genbank的人ace2 mrna序列，设计合成pcr引物序列， 人ace2扩增的外端引物：f1(f out)5
’‑
gat gga gta ccg act gga gtc
‑3’
，r1(rout)5
’‑
ctaata tcg atg gag gca taa
‑3’
，产物547bp。内端引物：f2(f in)5
’‑
gag gag gat gtgcga gtg gct a
‑3’
，r2(r in)5
’‑
cca acc act atc act ccc atc a
‑3’
，产物269bp。人β
ꢀ‑
actin的扩增引物序列：f 5
’‑
gct cgt cgt cga caa cgg ctc
‑3’
，r 5
’‑
caa aca tga tctgggtcatcttct
‑3’
，产物353bp。pcr条件：94℃ 5min，然后94℃变性30s、55℃退火30s、 68℃延伸5min，循环30次，最后于68℃延伸10min。
59.用bamh i和ecori分别酶切载体phblv
‑
cmv
‑
ace2
‑
ef1
‑
zsgreen
‑
t2a
‑
puro和上述pcr 产物，或用agei和ecori分别酶切pgc
‑
f和上述pcr产物，用琼脂糖电泳纯化，将线性化
的 载体dna、酶切回收的pcr产物、t4噬菌体dna连接酶及其缓冲液、ddh2o置16℃连接过夜， 将连接液转化感受态细胞，阳性克隆用pcr和测序鉴定。用lb培养液扩增转化菌，用质粒提 取试剂盒提取phblv
‑
ace2
‑
oe或pgc
‑
fu
‑
ace2，采用lipofectamine 2000转染293ft细胞， 转染72h后用western
‑
blot检测ace2基因的表达。
60.3.2.携带ace2慢病毒的包装及其滴度测定
61.将慢病毒表达载体(phblv
‑
oe
‑
ace2)、包装质粒(pspax2载体和pmd2g)或将 pgc
‑
fu
‑
ace2、包装质粒(phelper 1.0和phelper 2.0)分别按invitmgen公司upofectamine2000说明进行共转染293ft细胞，获得携带ace2基因的重组慢病毒(oe
‑
ace2)或 lentiviral
‑
ace。
62.同时将phblv空载(含gfp基因)、包装质粒(pspax2载体和pmd2g)共转染另一组 293ft细胞，所获得的仅携带gfp基因的空载体(nc
‑
gfp)作为对照。
63.转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒的细胞上清液，4℃，4000 g离心10min，再以0.45μm滤器过滤上清液，除去细胞碎片，离心，得到高滴度的慢病毒。
64.以待鉴定的病毒原液感染293t细胞，4d后抽提rna，应用real
‑
time pcr法测定待测 慢病毒的病毒滴度。
65.3.3.永生化干细胞的重组慢病毒转染
66.取永生化干细胞，以每孔1
×
106个细胞密度接种于6孔板，分为目的基因过表达 (oe
‑
ace2)组、空载体(nc
‑
gfp)对照组、空白组，每组2孔，待细胞汇合至30％时，慢病毒 组加入5倍稀释的慢病毒原液，空载体组加入5倍稀释的空载体原液，培养24h后更换10％fbs 的dmem液，并加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素(2.50μg
·
ml
‑1)，维持嘌呤霉素浓度，隔天换 液，直至空白对照组细胞完全死亡，筛选结束(用氨苄青霉素筛选lentiviral
‑
ace转染的细 胞)。未被嘌呤霉素杀死的细胞即为已被重组慢病毒转染并已在dna上整合了ace2基因的干 细胞系，下称重组ace2干细胞。
67.3.4.重组ace2干细胞的ace2基因检测
68.3.4.1.rt
‑
pcr检测ace2基因的mrna转录水平
69.取ace2干细胞，以1
×
106个细胞密度接种于6孔板，培养4d后荧光显微镜观察荧光的 表达，并应用rt
‑
pcr检测ace2干细胞中ace2基因的转录水平。rt
‑
pcr扩增ace2的引物序 列为：ace2上游：cmv
‑
f：5
’‑
cgcaaatgg6cggtaggcgtg
‑3’
；下游： ef1
‑
rn：5
’‑
gccagtacacgacatcactt
‑3’
；β
‑
actin上游和下游分别为： 5
’‑
tggacttcgagcaagagatgg
‑3’
、5
’‑
atctccttctgcatcctgtcg
‑3’
。rt
‑
pcr检测到 oe
‑
ace2组中ace2基因呈高水平转录，与对照组相比，显示1条额外的由ace2转录的409bp 的mrna条带。并且经ace2/b
‑
actin积分光密度值(iod)比较和统计学分析，发现携带ace2 基因的dna重组干细胞的mrna表达量明显增多(p＜0.01)(正常细胞组为0.234
±
0.101，空 载体对照组为0.247
±
0.098，ace2干细胞组为0.682
±
0.118)，提示明显增加ace2转录。
70.3.4.2.western
‑
blot检测ace2干细胞的蛋白表达水平
71.抽提各组细胞裂解液的蛋白，bac法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％sds
‑
page 分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗vdr抗体为一抗，用ecl化学 发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。western
‑
blot检
测到 ace2干细胞组ace2基因的蛋白表达明显增加，显示1条由ace2表达的很明显的蛋白表达条 带(ace2
‑
90kda)，而正常细胞组和空载体组只有1条相同的β
‑
actin(42kda)条带。
72.4.重组ace2干细胞的新冠病毒rna干扰基因装配
73.4.1.设计新冠病毒的sirna基因
74.以ambion公司(http：//www.ambion.com/techlib/misc/sirnatools.html)的shrna在线 设计软件，从sars
‑
cov
‑
2(nc_045512.2株orf1ab、3’utr、s、e、m、n)的保守序列中筛 选出多个sirna备选序列。根据人类基因组数据库、rna结合的tm值及特异性的比对结果，分别优选3条与人类基 因组没有同源性的保守sirna序列(表1a)，同时设计1条无关的sirna序列作为阴性对照 (nc：5
’‑
ttctccgaacgtgtcacgtaa
‑3’
)。
75.表1a nc_045512.2株新冠病毒s、e、m、n基因的sirna候选序列
[0076][0077]
4.2.合成shrna模板
[0078]
靶序列确定以后，根据慢病毒干扰载体phblv
‑
u6
‑
mcs
‑
cmv
‑
zsgreen
‑
pgk
‑
puro的多克隆 酶切位点，设计shrna模板，使每个模板由两条大部分互补的长度为52
‑
60nt的单链dna构 成，寡核苷酸单链dna的3’端有2
‑
5个u字形突出，包括靶序列的正义序列、loop序列、靶 序列的反义序列、转录终止信号以及酶切后的粘性末端序列，经退火互补后能形成带有bamhi和ecori酶切位点粘性末端的dna双链(如用psilencer4.1.cmv.neo，则用bamh i和hindiii)。如表1b，“斜体”表示酶切位点，“加粗”表示茎环结构，“下划线”表示正义链。
[0079]
表1b以表1a中的sirna合成s、e、m、n基因相对应的shrna模板
[0080][0081]
4.3.慢病毒干扰载体的构建
[0082]
以新冠病毒n基因的靶向干扰序列(ncov
‑
n
‑
sirna
‑
1/2/3)作为实施例，以t4连接酶将 合成的shrna模板与线性化的慢病毒载体phblv
‑
u6
‑
mcs
‑
cmv
‑
zsgreen
‑
pgk
‑
puro连接，构建 慢病毒干扰载体phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna1/2/3，转化感受态e.coli dh5α。
[0083]
4.4.慢病毒干扰载体的鉴定
[0084]
取慢病毒干扰载体转化的感受态e.coli dh5α10μl，涂布于含50μg.ml
‑1嘌呤霉素的 lb平板抗性培养，筛选出阳性克隆，提取质粒，以pcr、bamh i和ecori酶切或测序鉴定， 培养测序正确的阳性克隆，按质粒抽提试剂盒抽提质粒。观察重组慢病毒干扰载体中3个靶 向ncov
‑
n
‑
sirna1/2/3干扰基因与设计的干扰序列是否完全一致。
[0085]
4.5.携带shrna慢病毒的包装
[0086]
取对数生长期的293ft细胞，以5
×
106cell
·
ml
‑1的密度接种于培养瓶，加入重组
质粒和 慢病毒包装质粒(phblv、pspax2载体和pmd2g载体三质粒组成)各4μg，并与 lipofectamine200脂质体共转染，8h后更换为完全培养基，继续培养48h，然后收集富含慢 病毒的上清液，离心，过滤，分装，置于
‑
80℃保存。
[0087]
4.6.慢病毒滴度的检测
[0088]
①
孔稀释法计数荧光细胞：取慢病毒原液10μl，用10％fbs的dmem培养液10倍稀释 为3
‑
5个梯度，将293ft细胞按每孔3
×
104个细胞的密度接种于96孔板，37℃ 5％co2培养 24h后，每孔更换为10％fbs的dmem培养液150μl继续培养48h，用荧光显微镜计数荧光细 胞，计算病毒滴度。结果在重组质粒phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna(lv3
‑
ncov
‑
n
‑
shrna)转染293 ft 细胞后，被包装成慢病毒颗粒，在荧光显微镜下293ft细胞内呈现绿色荧光。
②
real time 定量pcr法测定：以10％fbs的dmem培养液培养293ft细胞，以待测定的慢病毒原液感染， 根据invitrogen公司的trizol操作说明抽提rna，rt
‑
qpcr测定所抽提rna的浓度。
[0089]
4.7.重组ace2干细胞的慢病毒转染
[0090]
以每孔1
×
106个细胞密度将生长状态良好的ace2干细胞接种于6孔板，待细胞融合至 30％时，试验组细胞分别加入5倍稀释的慢病毒原液，分别命名为phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna1组、 phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna2组、phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna3组。同时设立阴性对照组(仅转染慢病毒干 扰载体的肺干细胞组)和空白对照组(未转染慢病毒干扰载体的正常肺干细胞组)。
[0091]
4.8.筛选转染阳性的ace2干细胞
[0092]
上述细胞培养24h后更换10％fbs的dmem液，并加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素(2.00μ g
·
ml
‑1)，维持嘌呤霉素浓度，隔天换液，直至空白对照组细胞完全死亡，筛选结束。未被嘌 呤霉素杀死的ace2干细胞即为已被重组慢病毒干扰载体转染并已在dna上整合了新冠病毒靶 向干扰序列(ncov
‑
shrna)的肺干细胞。这种ace2(肺)干细胞能表达dsrna，dsrna能干 扰ncov基因，从而产生干细胞内的抗病毒作用，下称基因沉默dna重组干细胞。
[0093]
本发明包括选用慢病毒载体psilencer4.1.cmv.neo、以ecor i和hind iii酶切、构建 重组载体lv3
‑
ncov
‑
n
‑
shrna、将重组载体与包装质粒(plv/helper
‑
sl3、plv/helper
‑
sl4、 plv/helper
‑
sl5)共转染293ft细胞、包装慢病毒、以氨苄青霉素筛选阳性克隆。
[0094]
4.9.验证dna重组干细胞的shrna表达
[0095]
4.9.1.rt
‑
pcr检测shrna的mrna表达
[0096]
用trizol试剂分别提取dna重组干细胞的ncov
‑
n
‑
shrna1、ncov
‑
n
‑
shrna2和 ncov
‑
n
‑
shrna3组的总rna，设计如表2所示的引物，以gapdh为内参照，定量分析 ncov
‑
n
‑
shrna1/2/3的mrna，pcr条件为：95℃ 3min变性，95℃ 12s，62℃ 40s，72℃ 30s， 共40个循环。每组均设3个随机复孔。反应结束后，仪器自动记录每个样品管中ct值，以 gapdh为内参照，计算目的基因的相对含量，用2
‑
δct
表示。观察空白对照组、阴性对照组 phblv
‑
ncov
‑
n的mrna表达量以及phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna1、phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna2和 phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna3组这3个干扰组中phblv
‑
ncov
‑
n的mrna表达量是否下降，推断3个 特异性靶点对ncov
‑
n基因是否有沉默效果，与阴性和空白对照组有无统计学差异，筛选出干 扰效果最佳组(phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna2)。
[0097]
表2新冠病毒s、e、m、n基因靶向干扰序列sirna1～sirna3扩增引物的设计
[0098][0099][0100]
4.9.2.western blotting检测shrna的蛋白表达
[0101]
①
抽提各组细胞裂解液的蛋白，bac法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％sds
‑
page 分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗vdr抗体为一抗，用ecl化学 发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。
②
观察空白对照组、 阴性对照组的phblv
‑
ncov
‑
n蛋白表达量以及phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna1、phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna2 和phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna3组这3个干扰组中重组慢病毒phblv
‑
ncov
‑
n蛋白的表达量，与阳性 对照组和空白对照组间有无统计学差异。
③
结果为phblv
‑
ncov
‑
n
‑
shrna2组能有效干扰 ncov
‑
n基因的蛋白表达。
[0102]
本发明涉及的载体还包括过表达载体如phblv
‑
cmv
‑
ires
‑
zsgreen、phblv
‑
cmv
‑
ef1
‑
rfp、、 phblv
‑
cmv
‑
ires
‑
puro、phblv
‑
ires
‑
zsgreen
‑
pgk
‑
puro、phblv
‑
cmvie
‑
zsgreen
‑
t2a
‑
puro、 phblv
‑
cmvie
‑
rfp
‑
t2a
‑
puro、phblv
‑
cmvie
‑
luc
‑
t2a
‑
puro、phblv
‑
cmvie
‑
zsgreen
‑
t2a
‑
luc、 pgc
‑
fu，干扰载体如phblv
‑
u6
‑
zsgreen、phblv
‑
u6
‑
zsgreen
‑
puro、phblv
‑
u6
‑
puro、 phblv
‑
u6
‑
zsgreen
‑
t2a
‑
puro、phblv
‑
u6
‑
rfp
‑
t2a
‑
puro、phblv
‑
u6
‑
luc
‑
t2a
‑
puro、 phblv
‑
u6
‑
rfp、phblv
‑
u6
‑
zsgreen
‑
t2a
‑
luc、phblv
‑
u6
‑
rfp
‑
t2a
‑
luc，干扰过表达双框架载 体如phbad
‑
u6
‑
cmv(用于构建同时表达两种基因的重组载体，例如表达shrna和ace2的 phbad
‑
u6/shrna
‑
cmv/ace2、表达shrna和rbd的phbad
‑
u6/shrna
‑
cmv/rbd)。
[0103]
5.dna重组干细胞的功能检测
[0104]
5.1.dna重组干细胞的体外抗病毒功能检测
[0105]
5.1.1.样本采集
[0106]
取covid
‑
19确诊患者的咽拭，按100∶1的比例加入双抗(10000iu的青霉素和10000μg 的链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100iu和100μg，置4℃过夜，备用。
[0107]
5.1.2.病毒培养和分离
[0108]
将vero
‑
e6接种至含(10％胎牛血清)dmem培养液的12.5cm2培养瓶中，置36℃、5％co2培养箱中培养成30％汇合度的单层细胞，吸去培养液，用dmem清洗细胞2遍，然后在培养瓶 中加入0.5ml经过双抗处理的covid
‑
19患者样本，置36℃、5％co2培养箱中吸附90min后， 吸去样本，加入3.5ml dmem培养液(10％胎牛血清)，每天观察细胞病变效应(cpe)，经培养 5～7d后，取病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心，分离新冠病毒，用培养液配成103～10
5 tcid
50
/ml病毒液(同时用于后述的动物试验)。
[0109]
5.1.3.dna重组干细胞与病毒共培养
[0110]
设立间充质干细胞组、永生化干细胞组、ace2干细胞组、dna重组干细胞组(重组ace2 和shrna干细胞组)，每组接种12孔板，使每孔含有2
×
105个细胞、2ml dmem培养液(10％ 胎牛血清)，置36℃、5％co2培养箱中培养至30％汇合度时，每孔加病毒液0.5ml，继续培养。 然后分别于培养1小时、6小时、24小时和72小时后每组各取3孔的上清液，混合后以1∶4、 1∶12、1∶36、1∶108、1∶324、1∶972、1∶2916、1∶8748倍稀释，进行rt
‑
pcr检测。
[0111]
5.1.4.实时荧光rt
‑
pcr检测病毒rna
[0112]
核酸提取试剂盒(批号：2019004)、2019新型冠状病毒(orf1ab/n)核酸检测试剂盒(批 号：20200123)和da3200核酸提取仪，购自中山大学达安基因股份有限公司，abi 7500型pcr 仪购自美国thermo fisher scientific。按试剂盒说明书操作，扩增反应条件为：50℃ 15min； 95℃ 15min；94℃ 15s；55℃ 45s；共45个循环，在55℃采集荧光信号。
[0113]
根据试剂盒说明，结果判断标准如下：
①
如果检测样本在orf1ab和n基因通道无扩增 曲线或ct值＞38，判为sars
‑
cov
‑
2阴性；
②
如果检测样品在orf1ab和n基因通道ct值 ≤38，且有明显的扩增曲线，判为sars
‑
cov
‑
2阳性；
③
如果检测样品在orf1ab或者n基 因通道ct值≤38，另一通道无扩增曲线，复检结果与原来结果一致，判为sars
‑
cov
‑
2阳性。
[0114]
5.1.5.病毒rna检测结果
[0115]
在表3中，4组干细胞培养1小时培养液rna检测阳性的最大稀释度均为1∶4，被认为是 外源加入病毒的检测结果。在表4～5中，当4组干细胞培养6小时后，仅dna重组干细胞组 培养液和细胞内rna检测结果仍为1∶4，而以ace2干细胞组的细胞内rna含量最高；在表6～ 8中，当4组干细胞培养24～72小时后，仍以dna重组干细胞组的rna检测结果阳性滴度最 低(1∶12)，而以ace2干细胞组的细胞内rna检测结果阳性滴度最高(＞1∶8748)，说明ace2 能促进病毒进入干细胞内并在胞内复制，而shrna能干扰胞内病毒复制。
[0116]
表3干细胞与分离的新冠病毒共培养1小时培养液中病毒rna检测结果
[0117][0118]
表4干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的培养液病毒rna检测结果
[0119][0120][0121]
表5干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的细胞内病毒rna检测结果
[0122][0123]
表6干细胞与分离的新冠病毒共培养24小时培养液的病毒rna检测结果
[0124][0125]
表7干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时培养液的病毒rna检测结果
[0126][0127]
表8干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞内病毒rna检测结果
[0128][0129][0130]
5.1.6.dna重组干细胞与病毒共培养特点
[0131]
重组ace2的干细胞组在培养72小时后细胞变圆、漂浮、死亡，如图3，说明细胞内ace2 基因的表达有利于将病毒吸入胞内并在胞内繁殖、致细胞较快死亡，而重组ace2和shrna的 干细胞组在培养72小时后仍呈贴壁生长，如图4，说明shrna的表达能干扰病毒在胞内复制， 使重组ace2和shrna的干细胞能将病毒吸入胞内并在胞内杀灭。
[0132]
5.2.dna重组干细胞的动物体内抗病毒功能检测
[0133]
5.2.1.dna重组干细胞的准备
[0134]
取dna重组干细胞接种于10％fbs的dmem完全培养液中进行细胞培养，每隔两三天更 换培养液1次；5d左右细胞铺满瓶底约90％，0.25％胰酶消化2～3min，800r/min，离心 半径12cm，离心5min，按1∶2接种于75cm2培养瓶中，于37℃、5％co2恒温培养箱中扩 增培养，4～5d传代1次。
[0135]
5.2.2.实验动物的分组
[0136]
选择6
‑
8周龄、40克左右的spf级雌性balb/c小鼠，随机分为dna重组干细胞组(用 于感染nc_045512.2株、接种携带ace2和shrna的干细胞)、ace2干细胞组(用于感染 nc_045512.2株、接种携带ace2的干细胞)，另设干细胞组(用于感染nc_045512.2株、接 种未重组ace2和shrna的干细胞)、阳性对照组(用于感染nc_045512.2株、接种生理盐水) 和阴性对照组(仅接种生理盐水)。
[0137]
5.2.3.实验动物的感染和接种
[0138]
dna重组干细胞组、ace2干细胞组、干细胞组和阳性对照组分别经鼻腔喷雾接种40μl 的nc_045512.2株病毒液，滴度为105/mltcid
50
，阴性对照组经鼻腔喷雾接种40μl生理盐水。 然后，在各组小鼠腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.006ml/g或0.6mg/g)，肌肉松弛后固定于板 上；颈部皮肤备皮，碘伏擦拭消毒，颈部皮肤剪开约1cm小口，组织镊子分离组织，暴露
气 管；将1
×
106个干细胞缓慢注入小鼠气管(阴性和阳性对照组注入生理盐水)，复位组织、缝 合皮肤；每天观察小鼠的临床症状，在感染后第7天处死小鼠，进行肺组织的病毒检测。
[0139]
5.2.4.试验结果的检测
[0140]
①
rt
‑
pcr检测
[0141]
按trizol法取200μl dmem制成的处死小鼠肺组织匀浆标本，加入800μl trizol，室 温放置5min使蛋白彻底的裂解，加入氯仿200μl，用手剧烈震荡15sec，室温放置3min，4℃，12,000g离心15min，取上清至新的eppendorf管，加入0.5ml异丙醇，室温放置10min， 4℃，12,000g离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，7,500g离心5min，弃上清， 再重复漂洗1次，以30μl depc处理过的水溶解沉淀。按试剂盒进行引物设计、pcr扩增和 产物电泳，为了比较不同实验组病毒复制量的不同，可同时扩增宿主基因β
‑
actin作为内参， 将目的基因与内参基因表达水平灰度值的比值作为各样品病毒的半定量分析。
[0142]
②
细胞病变效应(cpe)观察
[0143]
将
‑
70℃冰冻的肺组织解冻后用dmem制成10％匀浆，3,000rpm离心20min，取100pl上 清接种于长成单层veroe6细胞的24孔培养板上，每份标本接种2个孔，37℃吸附1h，然后 吸出标本液，用pbs(加2％双抗)洗3遍后加dmem补充至1.5ml，置37℃、5％co2培养箱培养， 观察培养液的ph，如发现变黄或变蓝，及时调整ph或更换培养液，每天观察细胞病变效应 (cpe)，记录是否出现cpe，连续观察7天，若不出现cpe进行盲传，传3～4代，观察结果。 接种细胞产生病变的特点是细胞变圆、融合，透光性减弱，最终细胞死亡脱落。
[0144]
③
间接免疫荧光检测
[0145]
将出现病变效应(cpe)的veroe6细胞用胰酶消化和pbs清洗，按每孔10μl(107/ml)滴加 于抗原载玻片上，待干燥后置冷丙酮中固定10min，用pbs冲洗(干燥后放
‑
20℃保存)，在制 备的抗原片上滴加抗s蛋白单抗(1∶200，pbs配置)，37℃湿盒中孵育30
‑
40min，pbs冲洗三 次后，滴加fitc标记的二抗(1∶500，0.02％伊文思蓝
‑
pbs配制)，37℃湿盒中孵育20
‑
30min， pbs冲洗3次后，用50％甘油
‑
pbs封片，荧光显微镜下观察荧光。结果判定：在阴性对照和 阳性对照成立的条件下，标本接种的veroe6细胞均出现红色荧光判断小鼠未感染病毒；标 本接种的veroe6细胞细胞膜或细胞浆中出现绿色荧光判断为小鼠感染了病毒。
[0146]
④
细胞培养半数感染量(tcid
50
)的百分率
[0147]
取每只处死小鼠(每组10只)肺组织匀浆上清100μl，以10倍递次稀释法稀释成不同 的稀释度，分别接种经hank氏液洗3次的组织培养单层veroe6细胞96孔培养板，每孔细胞 接种30μl，每个稀释度接种4个细胞孔，轻微振荡，使匀浆与细胞充分接触，放37℃吸附 1min，以hank氏液洗3次，加入细胞维持液，放37℃ co2培养箱培养，在普通倒置显微镜 下观察记录细胞病变情况，连续观察10
‑
14天，分别计算各组veroe6细胞半数感染量(tcid
50
) 的百分率，然后比较各组tcid
50
百分率的差异，百分率越大病毒含量越多。从表9
‑
14的结果 可知，dna重组干细胞组具有较低的veroe6细胞半数感染量，而ace2干细胞组具有较高的 veroe6细胞半数感染量，说明ace2能将病毒吸入干细胞内复制，但能被具有靶向干扰功能 的dna重组干细胞干扰、杀灭。
[0148]
表9 dna重组干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0149][0150]
表10 ace2干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0151][0152]
表11干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0153][0154]
表12阳性对照组10只处死小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0155][0156]
表13阴性对照组10只处死小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
细胞后，其中的ace2基因能表达蛋白，进而刺激小鼠产生ace2
‑
ab。
[0168]
表15接种dna重组干细胞组小鼠和接种干细胞组小鼠的ace2
‑
ab检测结果比较
[0169][0170]
5.3.4.ace2
‑
ab的抗病毒检测
[0171]
①
将ace2
‑
ab(兔抗ace2抗体)和ace1
‑
ab(兔抗ace1抗体)分别配成0.05、0.5、5、 50和100ug/ml，然后分别与1
×
104个vero e6细胞混合，置37℃水浴1h，洗涤细胞3次。
[0172]
②
分别用2ml dmem培养液(10％fbs)混悬细胞，移入12孔板，每孔加入20ul 103/mltcid
50
病毒液，置37℃、5％co2培养箱3～5天，每天观察细胞病变效应(cpe)。
[0173]
③
用台盼蓝染色法计数1000个细胞中的活细胞和死细胞数目，计算细胞成活率(成活率 ＝未染色的细胞数/观察的细胞总数，也可用rt
‑
pcr检测培养液或细胞的病毒rna含量)。
[0174]
④
结果发现，当试验组的ace2
‑
ab浓度分别为0.05、0.5、5、50和100ug/ml时，相应 的细胞成活率分别为55％、60％、75％、85％和85％；而当对照组的ace1
‑
ab浓度分别为0.05、 0.5、5、50和100ug/ml时，相应的细胞成活率均为10～15％。
[0175]
说明dna重组干细胞携带的ace2能表达ace2蛋白，进而刺激机体产生ace2
‑
ab，而 ace2
‑
ab具有抗病毒作用。
[0176]
5.4.dna重组干细胞产生的细胞因子的抗炎症作用
[0177]
当机体受病毒或细菌感染时，会产生各种细胞因子，有些细胞因子具有抗炎作用，而有 些细胞因子具有致炎作用。本实验以细菌内毒素(lps)分别处理各试验组细胞8小时(表 16)，然后按酶联免疫吸附测定(elisa))试剂盒说明，采用双抗体夹心法测定培养细胞上清 液的人白细胞介素，结果发现，永生化干细胞组经lps处理后，其il
‑
1β和il
‑
8均明显增 加，而il
‑
10未见明显增加；重组ace2干细胞组经lps处理后，其il
‑
1β和il
‑
8均未见明 显增减，而il
‑
10可见明显增加。
[0178]
文献报道，il
‑
1β和il
‑
8均为致炎细胞因子。其中il
‑
1β广泛参与人体组织破坏、水 肿形成等病理损伤过程，虽可促进β防御素
‑
4的生成，但总体上破坏大于防御。而il
‑
8通 过趋化中性粒细胞、激活中性粒细胞溶酶体酶活性和吞噬作用，达到杀菌和损伤细胞的目的， il
‑
8主要促进细胞毒、局部炎症和肿瘤细胞增殖。
[0179]
il
‑
10的作用不同于il
‑
1β和il
‑
8。il
‑
10是一种重要的抗炎因子，主要通过抑制单核、 巨噬细胞等产生致炎因子和趋化因子而发挥抗炎作用。表16的结果表明，dna重组干细胞(携 带ace2)能在lps的作用下，通过增加il
‑
10的分泌而抑制炎症反应。
[0180]
表16 dna重组干细胞的抗炎症细胞因子检测结果
[0181][0182]
实施例二、dna重组干细胞在新冠疫苗制备中的应用
[0183]
1.dna重组干细胞的rbd基因装配
[0184]
1.1.rbd基因的合成
[0185]
参照genbank登录号(mn908947.3)对sars
‑
cov
‑
2的s蛋白氨基酸序列进行分析， 其rbd氨基酸为gly319～asn541，采用氨基酸密码子同义置换，对rbd肽段对应的核酸进 行全基因组合成。合成前进行密码子优化，目的是提高基因组中g+c％的含量，增加mrna在 哺乳动物细胞中的稳定性或mrna输入细胞质的速率，避免稀有trnas的损耗，增强蛋白表达， 提高免疫原性。具体方法如下：统计分析nc_045512.2株病毒密码子和人类密码子的使用频 率(http：www.kazusa.or.jp/codon)，使用人类偏好密码子对nc045512.2株病毒的s1
‑
rbd 基因进行密码子优化，使其密码子使用频率与人类一致，同时在基因5’末端添加ecor i的 酶切识别序列gaattc，在3’末端添加xhoi酶切识别序列ctcgag。优化基因序列的g+c％由 48％提高至70％，密码子第三位的g+c％则由39％提高到100％。优化的rbd基因序列765bp： atgaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagca actgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatct ctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgat tataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataatt acctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaa tggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagta gtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttca acttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacac tactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagtaa。
[0186]
1.2.携带rbd基因的慢病毒表达载体构建
[0187]
以t4连接酶将合成的s1
‑
rbd基因与线性化的慢病毒表达载体进行连接，构建慢病毒表 达载体(pgc
‑
fu
‑
rbd或phblv
‑
rbd)，然后转化感受态e.coli dh5α，将其涂布于含50μg.ml
‑1氨苄青霉素的lb平板抗性培养，筛选出阳性克隆，提取质粒，进行pcr、酶切或测序鉴定， 扩增培养测序正确的阳性克隆，按质粒抽提试剂盒抽提重组质粒。同理将能刺激宿主产生抗 体的其他核酸序列构建慢病毒表达载体，制备相应的dna重组干细胞载体新冠疫苗。
[0188]
1.3.携带rbd基因的慢病毒包装
[0189]
取对数生长期的293ft细胞，以5
×
106cell
·
ml
‑1的密度接种于培养瓶。将慢病毒表达载 体(pgc
‑
fu
‑
rbd)、包装质粒(phelper 1.0和phelper 2.0)分别进行高纯度无内毒素抽提， 按invitmgen公司upofectamine 2000使用说明进行共转染293ft细胞。同时将dgc
‑
fu(含 gfp基因)、包装质粒(phelper 1.0和phelper 2.0)共转染另一组293ft细胞，所获得的 仅携带gfp基因的空载体(kntiviml～gfp)作为对照。转染8h后更换为完全培养基，继续培 养48h，收集富含慢病毒的上清液，4℃，4000g离心10min，再以0.45μm滤器过滤，得 到高滴度的慢病毒，分装，置于
‑
80℃保存。
[0190]
1.4.携带rbd基因的慢病毒滴度检测
[0191]
①
孔稀释法计数荧光细胞：取慢病毒原液10μl，用10％fbs的dmem培养液10倍稀释 为3
‑
5个梯度，将293ft细胞按每孔3
×
104个细胞的密度接种于96孔板，37℃ 5％co2培养 24h后，每孔更换为10％fbs的dmem培养液150μl继续培养48h，用荧光显微镜计数荧光细 胞，计算病毒滴度。结果在重组质粒pgc
‑
fu
‑
rbd转染293ft细胞后，被包装成慢病毒颗粒， 在荧光显微镜下293ft细胞内呈现绿色荧光。
②
real time定量pcr法测定：以10％fbs的 dmem培养液培养293ft细胞，以待测定的慢病毒原液感染，然后根据invitrogen公司的 trizol操作说明书抽提rna，以做rt
‑
qpcr测定所抽提rna的浓度。
[0192]
1.5.携带rbd基因的慢病毒转染rna干扰干细胞
[0193]
以每孔1
×
106个细胞密度将生长状态良好的rna干扰干细胞接种于6孔板，待细胞融合 至30％时，试验组细胞分别加入5倍稀释的慢病毒原液，同时设立阴性对照组(仅转染慢病 毒载体)和空白对照组(未转染慢病毒载体)。上述细胞培养24h后更换10％fbs的dmem液， 并加入最佳筛选浓度的氨苄青霉素(2.50μg
·
ml
‑1)，维持氨苄青霉素浓度(氨苄青霉素筛选 pgc
‑
fu
‑
rbd、嘌呤霉素筛选筛选phblv
‑
rbd)，隔天换液，直至空白对照组细胞完全死亡。未 被杀死的细胞即为已被重组慢病毒转染并已在dna上整合了新冠病毒s1
‑
rbd的rna干扰干细 胞，即所述的rna干扰干细胞载体疫苗。
[0194]
2.dna重组干细胞载体新冠疫苗的rbd基因检测
[0195]
2.1.rt
‑
pcr检测rbd基因的mrna转录
[0196]
取dna重组干细胞，以1
×
106个细胞密度接种于6孔板，培养4d后，应用rt
‑
pcr检测dna重组干细胞中rbd基因的转录水平。rt
‑
pcr扩增rbd的引物序列为：rbd上游： 5
’‑
gattactcattcattcgatattac
‑3’
；下游：5
’‑
atatgcaacagatgatcggaac
‑3’
；β
ꢀ‑
actin上游：5
’‑
tggacttcgagcaagagatgg
‑3’
；下游：5
’‑
atctccttctgcatcctgtcg
‑3’
。 rt
‑
pcr检测到rbd基因呈高水平转录，与对照组相比，显示1条由rbd转录的409bp条带。
[0197]
2.2.western
‑
blot检测rbd基因的蛋白表达
[0198]
抽提dna重组干细胞裂解液的蛋白，bac法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％ sds
‑
page分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗vdr抗体为一抗， 用ecl化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。 western
‑
blot检测到dna重组干细胞组rbd基因的蛋白表达明显增加。
[0199]
2.3.免疫荧光检测rbd基因的蛋白表达
[0200]
制备dna重组干细胞抗原片，以兔抗sars
‑
cov
‑
2多克隆特异抗体作为第一抗体，以fitc 标记的羊抗兔igg作为第二抗体进行间接免疫荧光(ifa)检测，dna重组干细胞中可以观察到 sars
‑
cov
‑
2特异荧光颗粒，表明rbd基因在细胞中得到了表达。
[0201]
3.dna重组干细胞载体新冠疫苗的免疫功能检测
[0202]
3.1.dna重组干细胞载体新冠疫苗的准备
[0203]
取携带rbd的dna重组干细胞载体新冠疫苗接种于10％fbs的dmem完全培养液中进行 细胞培养，待细胞铺满瓶底约90％时，0.25％胰酶消化，进行传代、扩增培养。
[0204]
3.2.实验动物的准备
[0205]
选择6
‑
8周龄、40克左右的spf级雌性balb/c小鼠，随机分为重组干细胞疫苗组(携 带ace2、shrna和rbd基因的干细胞)、重组干细胞对照组(携带ace2和shrna基因的干细 胞)，每组10只。
[0206]
3.3.动物接种及标本采集
[0207]
在各组小鼠的腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.006ml/g或0.6mg/g)，肌肉松弛后固定于 板上；颈部皮肤备皮，碘伏擦拭消毒，颈部皮肤剪开约1cm小口，组织镊子分离肌肉及结缔组织， 暴露气管；将干细胞缓慢注入小鼠气管，复位组织、缝合皮肤；每天观察小鼠的临床症状，采集 接种后1、2、4、6周的静脉血，3，000g离心10min，分离的血清于
‑
20℃保存，用于测定 sars
‑
cov
‑
2特异性抗体igg和igm。
[0208]
3.4.检测方法
[0209]
①
elisa检测igg
[0210]
按试剂盒操作：每孔加入1∶10稀释的100μl待检血清，放37℃温箱孵育30min，用洗 涤液充分洗涤；加入100μl hrp标记的羊抗鼠igg(1∶500)，放37℃温箱孵育30min，用洗 涤液充分洗涤；加入底物液，放37℃温箱孵育10min，最后加入终止液50μl，在450nm波 长下测定od值。
[0211]
②
elisa检测igm
[0212]
按试剂盒操作：每孔加入1∶10稀释的100μl待检血清，放37℃温箱孵育30min，用洗 涤液充分洗涤；加入100μl hrp标记的羊抗鼠igm(1∶500)，放37℃温箱孵育30min，用洗 涤液充分洗涤：加入底物液，放37℃温箱孵育10min，最后加入终止液50μl，在450nm波 长下测定od值。
[0213]
③
中和抗体的测定
[0214]
取抗体阳性血清标本100μl，56℃水浴30min灭活，以排除非特异性反应因素。将试验 血清用0.22μm的过滤器过滤后进行倍比稀释，使之成为1∶2，1∶4，1∶8
……
。然后将病毒稀 释成每个细胞孔1/2接种量中含100tcid
50
(计算病毒稀释倍数的公式为：tcid50/0.2ml的对 数减中和试验要求病毒含量/0.1ml的对数减病毒滴定时每孔细胞接种量与中和试验时每孔细 胞接种病毒量之间倍数的对数，所得对数的反对数即为病毒应稀释的倍数)。将稀释好的病毒 按每管200μl加入等量的稀释好的血清，充分混匀后，37℃水浴作用120min。每个样品4 个复孔接种veroe6细胞，除阴性细胞对照孔外，每孔100μl病毒
‑
血清混合物。阳性细胞对 照：50μl病毒稀释液+50μl病毒+100μl细胞。阴性细胞对照：加100μl病毒稀释液。37℃， 5％co2培养箱孵育，逐日观察细胞病变效应(cpe)。
[0215]
3.5.检测结果
[0216]
①
特异性抗体检测结果：dna重组干细胞载体新冠疫苗在接种后1、2、4、6周的igg 和igm检测结果见表17。检测结果表明，经dna重组干细胞疫苗接种的小鼠外周血igg、igm 阳性及其同时阳性的例次分别为17、19和9例，而对照组的阳性例次分别为3、4和1例， 说明
dna重组干细胞载体新冠疫苗与对照组相比，在接种后有较多例次产生了特异性抗体。
[0217]
表17 dna重组干细胞载体新冠疫苗在接种小鼠后的特异性抗体检测结果
[0218][0219]
②
中和抗体检测结果：将接种后第4周血清igg阳性的7例小鼠血清，按本发明所述的 中和抗体检测方法操作，结果阳性(对照组)的veroe6细胞在培养3
‑
5天内全部发生细胞病 变效应(cpe)；而阴性(对照组)细胞呈贴壁生长(+)，均未发生cpe；7例小鼠血清在1∶16～ 128倍稀释后仍能抑制病毒对veroe6细胞的攻击，但随着稀释倍数的增大，不能抑制病毒对 细胞的攻击，使veroe6细胞出现cpe。说明7例小鼠血清样本中的igg具有中和病毒的作用， 进而说明dna重组干细胞载体新冠疫苗能刺激小鼠产生中和抗体，其效价为1∶16～128。
[0220]
表18 dna重组干细胞载体新冠疫苗的中和抗体致veroe6细胞半数感染的试验结果
[0221][0222]
4.dna重组干细胞载体新冠疫苗的应用
[0223]
以产前诊断后剩余羊水细胞、新生儿脐带血细胞、脐带组织或胎盘组织细胞制备的dna 重组肺干细胞载体新冠疫苗，可按姓名、abo血型或hla分型冻存于
‑
196℃干细胞库备用。 当新冠病毒流行时，可取各型dna重组肺干细胞载体疫苗进行培养扩增，然后按自身
或同型 使用原则选用dna重组肺干细胞载体疫苗，进行个体化治疗，以提高干细胞治疗或疫苗接种 的效果，减少、消除其免疫排斥等毒副作用，解决covid
‑
19特效药物缺乏问题。