干细胞的分化状态的判定方法以及该判定方法中使用的新的分化标记与流程
本发明涉及一种新的分化标记，其能够在分化的初始阶段判定干细胞的分化状态。
背景技术：
对于ES细胞(Embryonic Stem cell，胚胎干细胞)、iPS细胞(Induced Pluripoent Stem Cell，诱导多能干细胞)等多能干细胞而言，为了维持其多能性，需要采用下述技术，例如，与饲养层细胞共同培养、用来自饲养层的条件培养基(CM)进行培养、对培养基添加碱性FGF(bFGF/FGF2，basic Fibroblast Growth Factor，碱性成纤维细胞生长因子)或LIF(leukemia inhibitory factor，白血病抑制因子)等。否则有时会因环境、细胞状态而丧失多分化能力，导致容易分化。因此，准确地获知干细胞的未分化状态(具备多能性的状态)、分化状态很重要。
另外，在再生医疗领域中，在使多能干细胞分化为目标细胞后，再进行移植，但是，在进行该移植的细胞中混有未分化细胞时，可能导致肿瘤形成。鉴于此，对经分化诱导处理的多能干细胞中是否混有未分化干细胞进行判定的技术很重要。
然而，难以根据细胞表观来判断细胞的分化状态。
因此，作为判定多能干细胞的分化状态的方法，实施对作为分化状态的指标的标记进行检测的方法。例如，碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)、Nanog、Oct4、TRA-1-60、Sox、LIF-R等作为多能干细胞的多能性标记众所周知。多能干细胞在未分化状态下表达这些标记，因此，通过检测这些标记，能够判断干细胞是否维持未分化状态。然而，如果干细胞不处在已进行一定程度的分化的状态下(例如，截止至三胚层中的任意时期为止)，上述标记就不能判定分化状态。因此，在分化诱导后的分化初始阶段，难以判断未分化细胞是维持其未分化状态(多能性)，还是处于已获得未来进行分化的分化能力的状态。
另一方面，已知被称作Fox(Forkhead box)的具有叉头(forkhead)或翼螺旋(winged helix)DNA结合域的转录因子的一组(非专利文献1)，而且，已知其在人体内存在有约50种(FOXB1、FOXB2等)。虽然已知Fox的表达蛋白质主要作为生长调节因子、组织特异性调节因子、细胞周期调节因子而发挥作用，但是，作用基本上尚未阐明。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Eddy H van Roon等.Clinical Epigenetics 2013,Jan 16；5(1):2.doi:10.1186/1868-7083-5-2。
技术实现要素：
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，提供一种能够在分化的初始阶段判定未分化干细胞的分化状态的方法。
解决问题的技术方案
本发明是为了解决上述课题而完成的，并且具有以下构成。
(1)细胞分化状态的判定方法，其对干细胞中FOXB2基因的表达进行检测并基于该检测结果进行判定。
(2)分化标记，其选自FOXB2基因来源的mRNA或蛋白质。
众所周知的是，用添加有碱性FGF(bFGF,FGF2，basic Fibroblast Growth Factor，碱性成纤维细胞生长因子)的培养基对ES细胞、iPS细胞等未分化细胞进行培养时，该未分化细胞长期维持未分化状态并进行增殖。
本发明人等为了解决上述课题进行了精心的研究，结果发现，使用未添加bFGF的培养基来培养iPS细胞时(分化诱导处理)，在开始培养后，经3～5天，检测出iPS细胞中FOXB2 mRNA的表达，而且确认了其表达量显著增加的现象。另外，还确认了在使用添加有bFGF的培养基进行培养并维持未分化状态的iPS细胞中，未确认到FOXB2 mRNA的表达。由此，发现FOXB2 mRNA作为ES细胞、iPS细胞的分化标记很有用，而且，通过测定所述FOXB2mRNA的表达，能够筛选出处于分化初始阶段的细胞，从而完成了本发明。
发明效果
通过实施本发明的方法，能够在分化的初始阶段判定干细胞的分化状态。另外，本发明能够用于干细胞的品质管理、分化细胞的制备、分离方法中。进而，由于本发明能够在培养初始阶段判定分化的细胞，因此，本发明在细胞的早期筛选、干细胞的品质管理方面很有用，能够有望缩短培养期间、降低培养基的成本。
附图说明
图1是在实施例1中得到的表示通过RT-PCR法检测hiPS细胞的FOXB2 mRNA的表达的结果的电泳图。在图1中，分别示出了(1)FOXB2 mRNA的表达的检测结果、(2)GAPDH mRNA的表达的检测结果、(3)OCT3/4 mRNA的表达的检测结果、(4)NANOG mRNA的表达的检测结果、(5)SOX2 mRNA的表达的检测结果。
图2是在实施例2中得到的表示通过RT-PCR法研究FOXB2 mRNA的表达的结果的电泳图。
图3是在实施例3中得到的表示通过RT-PCR法研究FOXB2 mRNA的表达的结果的电泳图。
图4是在实施例4中得到的表示通过RT-PCR法研究的Foxb2 mRNA的表达的结果的电泳图。
图5是在参考例1中得到的使用未添加bFGF的培养基而培养的hiPS细胞的照片(图5(1))以及使用添加有bFGF的培养基而培养的hiPS细胞的照片(图5(2))。
具体实施方式
作为本发明的干细胞，可举出具有所谓的自我复制能力以及能分化成各种细胞的分化能力的细胞。例如，除了作为具有多分化能力(多能性)的未分化细胞的ES细胞、iPS细胞以外，还可举出ntES细胞(nuclear transfer Embryonic Stem Cell，核转移胚胎干细胞)、EG细胞(Embryonic Cell，胚胎生殖细胞)、EC细胞(Embryonic Cell，胚胎瘤干细胞)等。
另外，作为干细胞所来源的动物，例如，可举出人、牛、马、狗、豚鼠、小鼠、大鼠等哺乳动物。
作为用于本发明的细胞分化状态的判定方法中的受检细胞的干细胞，可举出经公知的分化诱导处理的干细胞、经维持未分化状态的处理的干细胞、经公知的多能性诱导处理而脱分化的体细胞等。
作为对未分化干细胞进行分化诱导处理的方法，可采用已知的方法，没有特别的限定。例如，可举出在使用公知的分化诱导物质来处理细胞后对其进行培养的方法、使用不含有bFGF、LIF的培养基进行培养等在未分化干细胞被分化诱导的环境下进行培养的方法等。
作为诱导未分化干细胞进行分化的化学物质(分化诱导物质)，已知：例如，诱导分化为神经细胞的维甲酸(Retinoic Acid)；诱导分化为心肌细胞的精胺(Spermine)、丁酸钠(Sodium Butyrate)、曲古菌素A(Trichostatin A)；诱导小鼠ES细胞分化为胰岛素生成细胞的DNA甲基转移酶抑制剂(DNA Methyltransferase Inhibitor)等。
“未分化状态”是指，例如，细胞处于具有上述自我复制能力以及能分化成各种细胞的分化能的状态。
对于“维持未分化状态的处理”而言，例如，只要是公知的维持干细胞的未分化状态的处理即可，例如，可举出与饲养层细胞共培养、向培养基中添加bFGF、LIF的处理等。
本发明的FOXB2基因是指，对用于判定的细胞所来源的动物物种中存在的FOXB2蛋白质进行编码的基因DNA、RNA等。另外，还包括对FOXB2蛋白质的同源物、突变体以及衍生物等进行编码的基因。进而，还包括在严格条件下与所述基因进行杂交的碱基序列以及包含该序列的基因、具有与FOXB2基因具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的碱基序列的基因等。
具体而言，例如，作为人FOXB2基因，可举出与由序列号1表示的碱基序列(人FOXB2mRNA的碱基序列)对应的基因、具有对由序列号2表示的蛋白质进行编码的碱基序列的基因、或者具有与所述碱基序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的碱基序列的基因。
例如，作为小鼠Foxb2基因，可举出与由序列号34表示的碱基序列(小鼠Foxb2mRNA的碱基序列)对应的基因、具有对由序列号35表示的蛋白质进行编码的碱基序列的基因、或者具有与所述碱基序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的碱基序列的基因。
作为本发明的FOXB2 mRNA，可举出由用于判定的细胞所来源的动物物种中存在的FOXB2基因转录的mRNA，例如，上述FOXB2基因来源的mRNA。
作为FOXB2基因来源的mRNA，例如，作为人FOXB2 mRNA，可举出下述mRNA等。
·具有由序列号1表示的碱基序列(GenBank Accession No.NM_001013735)的mRNA
·具有与由序列号1表示的碱基序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的碱基序列的mRNA
·对由序列号2表示的氨基酸序列进行编码的mRNA
·对由序列号2表示的氨基酸序列经1个～几个、优选为1～5个、更优选为1～3个氨基酸的缺失、插入、添加或取代而形成的氨基酸序列进行编码的mRNA
·对与由序列号2表示的氨基酸序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的氨基酸序列进行编码的mRNA。
例如，作为小鼠Foxb2 mRNA，可举出下述mRNA等。
·具有由序列号34表示的碱基序列(GenBank Accession No.NM_008023)的mRNA
·具有与由序列号34表示的碱基序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的碱基序列的mRNA
·对由序列号35表示的氨基酸序列进行编码的mRNA
·对由序列号35表示的氨基酸序列经1个～几个、优选为1～5个、更优选为1～3个氨基酸的缺失、插入、添加或取代而形成的氨基酸序列进行编码的mRNA
·对与由序列号2表示的氨基酸序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的氨基酸序列进行编码的mRNA
作为本发明的FOXB2蛋白质，可举出由用于判定的细胞所来源的动物物种中存在的FOXB2基因翻译而成的蛋白质。也可以是这种FOXB2蛋白质的同源物、突变体以及衍生物。
例如，作为人FOXB2蛋白质，可举出下述蛋白质等。
·具有由序列号2表示的氨基酸序列的蛋白质、或者具有所述氨基酸序列经1个或几个、优选为1～5个、更优选为1～3个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列的蛋白质
·具有与由序列号2表示的氨基酸序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的氨基酸序列的蛋白质
作为小鼠FOXB2蛋白质，可举出下述蛋白质等。
·具有由序列号35表示的氨基酸序列的蛋白质、或者具有所述氨基酸序列经1个或几个、优选为1～5个、更优选为1～3个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列的蛋白质
·具有与由序列号35表示的氨基酸序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的氨基酸序列的蛋白质
＜I.本发明的细胞分化状态的判定方法＞
本发明的细胞分化状态的判定方法是“对干细胞的FOXB2基因的表达进行检测并基于该检测结果进行判定的细胞分化状态的判定方法。”
＜I-1.对FOXB2基因的表达进行检测的方法＞
作为对FOXB2基因的表达进行检测的方法，可举出对FOXB2 mRNA的表达进行检测的方法、或者对FOXB2蛋白质的表达进行检测的方法。
本发明中，“对表达进行检测”的情况，包括“对FOXB2基因是否表达(例如，是否存在FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白质)进行检测”的情况以及“对FOXB2基因表达量(例如，FOXB2mRNA的量、或者FOXB2蛋白质的量)进行测定”的情况。
FOXB2基因的表达的检测是在经分化诱导处理后的受检细胞表达至能够检测到FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白质的程度后进行的。具体而言，在对受检细胞进行分化诱导处理后，以上限为7天以内、优选为6天以内、更优选为5天以内、下限为1天以上、优选为2天以上、更优选为3天以上进行培养，然后采集细胞，进行下述FOXB2基因表达的检测即可。其间，可以每天采集细胞，进行FOXB2基因表达的检测。
(1)对FOXB2 mRNA的表达进行检测的方法
对FOXB2 mRNA的表达进行检测的方法，只要是已知的检测mRNA的方法，就没有特别的限定，可适当地选择公知的方法。
例如，除了RT-PCR法(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链反应)、实时RT-PCR法、竞争PCR法、原位PCR(in situ PCR)法、原位杂交法、DNA阵列法、Northern杂交(Northern hybridization)法、FISH法、斑点印迹法、核糖核酸酶保护法(RNase protection assay)、RT-LAMP法以外，还可举出：使用结合于金纳米粒子的与目标RNA互补的互补链(捕获链)以及作为捕获链的互补链的报告链的SmartFlareTM法、使用具有与目标RNA对应的序列的两种荧光探针(还原触发型荧光激活探针(Reduction-triggered Fluorescence activation probe)，RETF probe)的检测法、利用芳香族亲核取代反应的检测法(使用CNs-AMCA探针及MBA探针的方法，所述CNs-AMCA探针是结合有与目标RNA互补的DNA且修饰了以2-氰基-4-硝基苯磺酰基保护的氨基香豆素的探针，所述MBA探针是结合有与目标RNA互补的DNA且经由苯硫酚基修饰的探针)等方法。
1)RT-PCR法
RT-PCR法是指以目标FOXB2基因(例如，FOXB2 mRNA)为模板，通过逆转录反应合成cDNA后，利用PCR进行DNA扩增的方法(Kawasaki,E.S.,et al.,Amplification of RNA.In PCR Protocol,A Guide to methods and applications,Academic Press,Inc.,SanDiego,21-27(1991))。对逆转录反应及DNA扩增反应的条件没有特别的限定，能够采用适当优选的条件。另外，该目标基因(例如，FOXB2 mRNA)的扩增区域无须是该基因全长，只要对扩增产物的确认没有妨碍，也可以是该基因中的一部分区域。对于已扩增的cDNA量(相当于mRNA量)而言，例如，可以在将上述DNA扩增反应液用于电泳后，使用与目标扩增片段特异性杂交的探针来进行检测。
具体而言，例如，首先采用公知的方法从受检细胞中提取、分离mRNA。接着，将具有与FOXB2 mRNA的碱基序列对应的碱基序列的核苷酸链用作扩增用引物，以上述得到的mRNA为模板来实施RT-PCR法，从而合成、扩增与FOXB2 mRNA或其中的一部分区域互补的单链DNA(cDNA)。并且通过检测所述扩增产物(cDNA)的有无、多寡(量)，能够检测细胞中FOXB2 mRNA的存在、量。
作为上述使用的扩增用引物，例如，作为检测人的FOXB2 mRNA时使用的扩增引物，可举出例如具有由序列号4表示的碱基序列的引物。作为检测小鼠的Foxb2 mRNA时的扩增引物，可举出例如具有由序列号37表示的碱基序列的引物。
进而，以通过上述方法扩增的cDNA为模板，基于FOXB2 mRNA的碱基序列，使用以使FOXB2 mRNA的目标区域能够扩增而制备的一对引物，按照常规方法进一步实施PCR法等核酸扩增反应，检测扩增产物的有无、多寡(量)，即能够更准确地检测FOXB2 mRNA的存在、量。该扩增产物的检测可通过检测扩增产物的电泳法等常规方法进行。
以通过上述方法扩增的cDNA为模板来实施核酸扩增反应时，可通过实时扩增检测法来进行。作为利用实时扩增检测法的检测法，例如，可举出实时PCR检测法。
作为实时PCR检测法的例子，可举出利用嵌入剂(例如，SYBRTM Green I)进行实时PCR的常规嵌入剂法、TaqManTM实时PCR法、MGB Eclipse探针系统(MGB Eclipse Probe System)法、分子信标荧光探针技术(Molecular Beacons Probe Technology)法、LUX荧光引物(LUX Fluorogenic Primer)法、淬灭探针PCR(Quenching probe-PCR(QP))法、循环探针(cycling probe)法等，但是，并不限于这些方法。
作为所述PCR(包括实时PCR。)中使用的“以使FOXB2 mRNA的目标区域能够扩增的方式制备的一对引物”，可举出对FOXB2 mRNA的碱基序列或其特定区域(部分序列)进行扩增的一对引物。
作为这样的一对引物，例如，可举出对人的FOXB2 mRNA(由序列号1表示的碱基序列)或其特定区域(部分区域)进行扩增的一对引物。具体而言，例如，以由序列号1表示的碱基序列中的第45～223位的长度为179bp的区域(序列号3)为目标序列时，可举出具有由序列号9表示的碱基序列的引物以及具有由序列号10表示的碱基序列的引物这一对引物。
另外，例如，也可举出对小鼠中Foxb2 mRNA(由序列号34表示的碱基序列)或其特定区域(部分序列)进行扩增的一对引物。具体而言，例如，以由序列号34表示的碱基序列中的第132～300位的长度为169bp的区域(序列号36)为目标序列时，可举出具有由序列号45表示的碱基序列的引物以及具有由序列号46表示的碱基序列的引物这一对引物。
市面上销售有各种FOXB2 mRNA扩增用引物，因此，也可使用这些市售的引物。
如果以采用RT-PCR法进行的人FOXB2 mRNA的检测法为例详细说明，则如下所述。
在从受检细胞中提取的、经DNase处理的总RNA(Total RNA)500ng～10μg中加入1μL的1～10μM的FOXB2 mRNA的扩增引物(例如，具有序列号4的碱基序列的引物)，在65～80℃温度条件下保温2～5分钟，然后，在用冰冷却条件下，加入5×缓冲液4μL、2.5mM dNTPs 4μL、RNase抑制剂0.5μL(20U)、逆转录酶(ReverTra Ace)1μL(100U)，用蒸馏水将总量调节为20μL，进行混合，在37～50℃条件下保温20～60分钟，由此进行逆转录反应。然后，通过常规方法来回收得到的cDNA。
接着，将得到的cDNA 1μL、蒸馏水5μL、2×PCR缓冲液12.5μL、2mM dNTPs 4μL、DNA聚合酶(KOD FX Neo)0.5μL(0.5U)、1μL的5～10μM正向引物(例如，具有序列号9的碱基序列的引物)、1μL的5～10μM反向引物(例如，具有序列号10的碱基序列的引物)进行混合。接着，例如，进行94℃条件下2分钟、98℃条件下10秒钟→56℃条件下20秒钟→68℃条件下30秒钟的反应，进行28～30个循环左右。
PCR结束后，例如，利用电泳进行扩增产物的检测、分析，从而检测FOXB2 mRNA。
或者，回收cDNA后，使用嵌入剂(例如，SYBRTM Green I)以及例如与上述相同的正向引物和反向引物，将上述得到的cDNA用作模板，使用Taq DNA聚合酶等聚合酶进行实时PCR。并且，通过测定与扩增产物的扩增量相关地嵌入的嵌入剂的荧光强度，进行扩增产物的检测、分析，从而检测FOXB2 mRNA。
进而，可通过毛细管电泳法(J.Chromatogr.593 253－258(1992)、Anal.Chem.641926－1932(1992)，WO2007/027495等)、毛细管电泳芯片法进行以采用上述方法扩增而成的cDNA为模板实施核酸扩增反应后的扩增产物的检测、分析。即，可以在回收cDNA后，使用例如由荧光物质等标记物质标记的引物、嵌入剂，使用检测器对通过毛细管电泳芯片分离的标记PCR扩增产物来源的信号进行检测。作为检测器，可以使用示差折光检测器、荧光检测器、UV检测器等设备，其中，优选UV检测器、荧光检测器，更优选荧光检测器。例如，使用LiBASys(岛津制作所(株)制造)等全自动免疫分析仪，能够实时地进行从PCR至电泳为止的操作。
2)Northern印迹杂交法
作为通过Northern印迹杂交法来检测FOXB2 mRNA的方法，例如，可举出以下方法：将从受检细胞提取、分离出的mRNA固定于适当的载体，将所述mRNA和具有与FOXB2 mRNA互补的碱基序列的标记探针(也称作cDNA)进行杂交，检测杂交的程度，由此，检测受检细胞的FOXB2 mRNA。其中使用的探针可以由FOXB2 mRNA整个碱基序列的互补序列构成，也可以由其中的一部分碱基序列构成。另外，也能够在所述检测法中使用将该探针固定化的微阵列、DNA芯片。
需要说明的是，在本发明的检测FOXB2 mRNA的方法中所使用的试剂中，能够使用通常在该领域中所使用的试剂类，例如，能够使用不会抑制共存的试剂等的稳定性、不会阻碍PCR等核酸扩增反应、杂交反应的缓冲剂、稳定剂、防腐剂等。另外，对于所述试剂类的浓度而言，通常可以从本领域通常使用的浓度范围内适当选择。
如果例举缓冲液的具体例子，例如，可举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液、弗罗那缓冲液(veronal buffer)、硼酸缓冲液、Good’s缓冲液等通常实施PCR等核酸扩增反应、杂交反应时使用的所有缓冲液。对所述缓冲液的pH也没有特别的限定，但是，例如，可举出5～9的范围。
另外，根据需要，使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、根据酶选择的基质(dNTP、rNTP等)、或者双链嵌入剂(溴化乙锭，SYBRTM Green等)或FAM、TAMRA等标记检测物质等。
需要说明的是，使用原位PCR法、原位杂交法时，能够不破坏受检细胞来进行FOXB2mRNA的检测。
(2)对FOXB2蛋白质的表达进行检测的方法
1)不破坏细胞而进行检测的方法
FOXB2蛋白质是转录因子，因此，其存在于细胞核内。
不破坏细胞而对核内物质进行染色的技术正在被开发，因此，使用该技术，能够不破坏细胞而检测核内的FOXB2蛋白质。例如，使用含有Triton TM、NP-40、Tween 20TM、Saponin、Digitonin TM、Leucoperm TM等表面活性剂的缓冲液，使受检细胞的核膜局部可溶化。由此，能够不破坏细胞膜的结构而生成使抗体能够通过的间隙，因此，接下来使用由荧光物质等标记的抗FOXB2抗体进行核蛋白质的染色，能够检测核内的FOXB2蛋白质。
另外，对核内物质进行染色的各种试剂也可商购获得。因此，也可使用这些市售试剂对核内的FOXB2蛋白质进行染色，从而检测FOXB2蛋白质的表达。
2)破坏细胞而检测的方法
另外，也能够使用以下破坏细胞的方法来检测FOXB2蛋白质。
首先，对受检细胞培养物实施过滤或离心分离等常规方法，收集菌体或细胞，使其悬浮于适当的缓冲液中，例如，采用表面活性剂处理、超声波处理、溶菌酶处理、冻结-融化等方法对细胞等的细胞壁和/或细胞膜进行破坏后，使用离心分离、过滤等方法，得到含FOXB2蛋白质的提取液。
接着，可采用已知的检测蛋白质的方法来对得到的提取液中的FOXB2蛋白质进行检测。
作为对提取液中的FOXB2蛋白质进行检测的方法，例如，除了使用对FOXB2蛋白质具有亲和性的物质(例如抗体等)的所谓的酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、Western免疫印迹(Western blot)法、免疫组织化学法、抗体阵列法、利用简易免疫层析进行的测定法等已知的依据免疫学测定法的方法以外，还可举出采用上述方法与高效液相色谱(HPLC)、电泳法、毛细管电泳法、毛细管电泳芯片法等的组合的方法等。作为其检测原理，例如，可举出夹心法、竞争法、双抗体法等，但是，并不限于这些方法。对于这些测定法的具有条件而言，可由本领域技术人员进行适当设定。
另外，例如，可采用根据免疫散射比浊法、免疫透射比浊法等免疫凝集法的测定法来检测FOXB2蛋白质。所述检测法还可以根据公知的方法来进行。
上述1)及2)的方法中，对于用于检测FOXB2蛋白质的针对FOXB2蛋白质的抗体(抗FOXB2抗体)而言，只要是能识别FOXB2蛋白质、该蛋白质中的一部分肽、或它们的盐的抗体即可，没有特别的限定。
例如，可以是多克隆抗体、单克隆抗体中的任意一种，可以任意单独地使用或适当地组合它们来使用。另外，对于这些抗体而言，如果需要，可以使用胃蛋白酶，木瓜蛋白酶等酶进行消化来用作F(ab')2、Fab'或Fab。进而，也能够使用针对FOXB2蛋白质的市售的抗体。
该抗体可以由标记物质进行标记。作为用于标记的标记物质，可举出以下述物质为代表的具有作为自旋标记剂的性质的物质：例如用于EIA(ELISA)的碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、微过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、胆碱酯酶、苹果酸脱氢酶、荧光素酶等酶类；例如用于RIA的99mTc、131I、125I、14C、3H等放射性同位素；例如用于FIA的荧光素、丹磺酰、荧光胺、香豆素、萘胺或它们的衍生物等荧光性物质；例如萤光素、异鲁米诺、鲁米诺、双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯等发光性物质；例如苯酚、萘酚、蒽或它们的衍生物等在紫外部分具有吸收的物质；例如具有4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基、3-氨基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷基-1-氧基、2,6-二-叔丁基-α-(3,5-二-叔丁基-4-氧代-2,5-环己二烯-1-亚基)-对甲苯氧基等氧基的化合物等。
作为针对FOXB2蛋白质的抗体的具体例子，例如，可举出“针对具有由序列号2表示的氨基酸序列的蛋白质的抗体”、“针对具有由序列号35表示的氨基酸序列的蛋白质的抗体”等。
另外，用于检测上述FOXB2蛋白质的试剂及其检测时的浓度、实施检测时的测定条件等(反应温度、反应时间、反应时的pH、测定波长、测定装置等)全部可以根据已知的如上所述的免疫学测定法的测定操作法进行设定，能无例外地使用通常在该领域中使用的全自动分析装置、分光光度计。
＜I-2.细胞分化状态的判定方法＞
通过上述方法对干细胞的FOXB2基因的表达进行检测，并基于得到的结果对受检细胞的分化状态进行判定。
本发明中，“已分化的/经分化的”或“已分化的状态”包括细胞处于“分化的初始阶段”的状态、“已获得未来进行分化的分化能力的(经分化诱导的)”状态以及“经分化的”状态中的任意状态的情况。
优选的是，本发明中，“已分化的/经分化的”或者“已分化的状态”是细胞处于“分化的初始阶段”的状态或者“已获得未来进行分化的分化能力的(经分化诱导的)”状态中的任意状态的情况。
本发明中，“分化的初始阶段”是指分化诱导处理后的早期，具体而言，是指从分化诱导处理开始至第7天为止、优选至第6天为止、更优选至第3～5天为止的时期。
或者，本发明中，“分化的初始阶段”包括未分化干细胞分化为三胚层中的任意胚层前的阶段以及分化诱导处理后未分化标记(例如OCT3/4、NANOG、SOX2等)消失前的阶段。
作为本发明的分化状态的判定方法，例如，可举出下述方法。
(1)基于FOXB2 mRNA的表达的检测结果进行判定的方法
作为基于FOXB2 mRNA的检测结果进行判定的方法，例如，可举出下述方法。
1)通过上述方法对受检细胞中FOXB2 mRNA进行检测，在检测出FOXB2 mRNA的情况下，判定所述受检细胞处于已分化的状态。
2)对受检细胞的FOXB2 mRNA进行检测，并且使用已确认为未分化状态的未分化干细胞作为对比，同样地对FOXB2 mRNA进行检测。而且，在受检细胞的FOXB2 mRNA的检测量多于作为对比对象的未分化干细胞的FOXB2 mRNA的检测量的情况下，判定所述受检细胞处于已分化的状态。此时，关于受检细胞的FOXB2 mRNA的检测量与作为对比对象的未分化干细胞的FOXB2 mRNA的检测量相比是否更多，可比较这两者来相对地进行判断。
3)关于受检细胞的FOXB2 mRNA的检测量与作为对比对象的未分化干细胞的FOXB2mRNA检测量相比是否更多的判断，可通过比较受检细胞的FOXB2 mRNA的检测量和预先已测定的未分化干细胞的FOXB2 mRNA的检测量来实施。而且，在受检细胞的FOXB2 mRNA的检测量比预先已测定的未分化干细胞的FOXB2 mRNA的检测量更多的情况下，判定所述受检细胞处于已分化的状态。
4)可以预先设定能判断受检细胞是否处于已分化状态的边界值(截止值)，通过判断受检细胞的FOXB2 mRNA检测量是否高于该边界值来判断受检细胞的分化状态。在此情况下，受检细胞的FOXB2 mRNA的检测量高于截止值时，判定所述受检细胞处于已分化的状态。
(2)基于FOXB2蛋白质的检测结果进行判定的方法
作为基于FOXB2蛋白质的检测结果进行判定的方法，例如，可举出下述方法。
1)通过上述方法对受检细胞中的FOXB2蛋白质进行检测，在检测出FOXB2蛋白质的情况下，判定所述细胞处于已分化的状态。
2)对受检细胞的FOXB2蛋白质进行检测，并且使用已确认为未分化状态的未分化干细胞作为对比，同样地对FOXB2蛋白质进行检测。而且，在受检细胞的FOXB2蛋白质的检测量多于作为对比对象的未分化干细胞的FOXB2蛋白质的检测量的情况下，判定所述受检细胞处于已分化的状态。此时，关于受检细胞的FOXB2蛋白质的检测量与作为对比对象的未分化干细胞的FOXB2蛋白质的检测量相比是否更多，可比较这两者来相对地进行判断。
3)关于受检细胞的FOXB2蛋白质的检测量与作为对比对象的未分化干细胞的FOXB2蛋白质检测量相比是否更多的判断，可通过比较受检细胞的FOXB2蛋白质的检测量和预先已测定的未分化干细胞的FOXB2蛋白质的检测量来实施。而且，在受检细胞的FOXB2蛋白质的检测量比预先已测定的未分化干细胞的FOXB2蛋白质的检测量更多的情况下，判定所述受检细胞处于已分化的状态。
4)进一步地，可以预先设定能判断受检细胞是否处于已分化的状态的边界值(截止值)，通过判断受检细胞的FOXB2蛋白质检测量是否高于该边界值来判断受检细胞的分化状态。在此情况下，在受检细胞的FOXB2蛋白质的检测量高于截止值的情况下，判定所述受检细胞处于已分化的状态。
为了实施本发明的细胞分化状态的判定方法，具体而言，例如，可实施下述方法。
通过公知方法对iPS细胞或ES细胞等未分化干细胞(受检细胞)进行分化诱导处理。接着，在进行分化诱导处理后，以上限为7天以内、优选为6天以内、更优选为5天以内且下限为1天以上、优选为2天以上、更优选为3天以上进行培养后，采集细胞，通过上述方法检测FOXB2基因的表达(FOXB2 mRNA的表达或FOXB2蛋白质的表达)。并且，在确认了FOXB2基因的表达的情况下，判定所述细胞处于已分化的状态(包括“所述细胞群中存在处于已分化状态的细胞”的情况。下同。)。
或者，对受检细胞的FOXB2基因的表达进行检测(FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白质的检测)，并且使用已确认为未分化状态的未分化干细胞作为对比，同样地对FOXB2基因表达进行检测。并且，在受检细胞的FOXB2基因表达的检测量(FOXB2 mRNA的表达量或FOXB2蛋白质的表达量)多于作为对比对象的未分化干细胞的FOXB2基因表达的检测量的情况下，判定所述受检细胞处于已分化的状态。
另外，将预先测定的未分化干细胞的FOXB2基因表达的检测量(FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白质的检测量)与受检细胞的FOXB2基因表达的检测量进行比较，在受检细胞的FOXB2基因表达的检测量比作为对比对象的未分化干细胞的FOXB2基因表达的检测量更多的情况下，判定所述受检细胞处于已分化的状态。
进一步地，预先设定能判断受检细胞是否处于已分化的状态的边界值(截止值)，在受检细胞的FOXB2 mRNA的检测量或FOXB2蛋白质的检测量高于该边界值得情况下，判定所述受检细胞处于已分化的状态。
此外，对于未进行分化诱导处理的未分化干细胞，如果实施本发明的分化状态的判定方法，能够确认所述未分化干细胞是否维持未分化状态。
(3)本发明的应用
本发明的细胞分化状态的判定方法还能够应用于下述方法中。
1)在细胞筛选方法中的应用
针对含有某种细胞群的试样，采用本发明的方法对构成细胞群的细胞的FOXB2mRNA进行检测。并且，在检测到FOXB2 mRNA的情况下，判定所述试样中存在处于已分化状态的细胞(“已分化的状态”的含义与上述相同。下同。)，在未检测到FOXB2 mRNA的情况下，则判定所述试样中不存在处于已分化状态的细胞。或者，在对FOXB2蛋白质的表达进行检测并检测到FOXB2蛋白质的情况下，判定所述试样中存在处于已分化状态的细胞，而在未检测到FOXB2蛋白质的情况下，判定所述试样中不存在处于已分化状态的细胞。
2)在干细胞的品质管理中的应用
对于实施了公知的分化诱导处理的干细胞，通过采用本发明的方法来检测FOXB2基因的表达(检测FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白质)，能够判断该细胞是处于已分化状态还是处于混入有未分化干细胞的状态。因此，本发明的方法能够用于分化细胞的品质管理。
另外，对于实施了维持未分化状态的处理的干细胞，通过采用本发明的方法来检测FOXB2基因的表达(检测FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白质)，能够确认该细胞是否维持未分化状态。因此，本发明的方法能够用于未分化干细胞的品质管理。
3)在培养基的品质检查方法中的应用
为了对未分化干细胞在维持其未分化状态的同时进行培养，需要其培养基是例如不含有分化诱导因子且能够维持未分化细胞的未分化状态并进行培养的培养基。如果使用本发明的分化状态的判定方法，能够对这种培养基进行品质检查。
例如，将未分化干细胞在作为判定对象的培养基中培养几天，例如，培养3～7天左右，通常培养5～6天左右，然后，对细胞中FOXB2 mRNA的表达进行检测，在未检测到FOXB2mRNA的情况下，能够判定该培养基是能够一边维持干细胞的未分化状态一边进行培养的培养基。或者，对培养后的该细胞中的FOXB2蛋白质的表达进行检测，在未检测到FOXB2蛋白质的情况下，能够判定该培养基是能够一边维持干细胞的未分化状态一边进行培养的培养基。
4)在分化细胞的制备、分离方法中的应用
应用本发明的方法，能够对分化细胞进行制备、分离。
例如，在上述“(2)对FOXB2蛋白质的表达进行检测的方法”中记载的“1)不破坏细胞而进行检测的方法”中，使由标记物质标记的抗FOXB2蛋白质抗体与含有或预测含有处于已分化状态的细胞的细胞进行反应后，采用流式细胞仪等方法仅对由荧光标记的细胞进行分离、纯化，从而能够制备、分离处于已分化状态的细胞。
进一步地，通过与上述相同的方法，通过流式细胞仪等方法仅对未进行荧光标记的细胞进行分离、纯化，从而能够制备、分离未分化干细胞。
5)在分化诱导因子的筛选方法中的应用
能够将本发明应用在确认某种物质是否具有未分化干细胞的分化诱导能力的方法中。
例如，将未分化干细胞在含有受检物质的培养基中培养几天，例如，培养3～7天后，通常培养5～6天左右后，在对培养细胞的FOXB2 mRNA的表达进行检测并检测到FOXB2mRNA的情况下，确认受检物质诱导未分化干细胞的分化。或者，在对该培养细胞的FOXB2蛋白质的表达进行检测并检测到FOXB2蛋白质的情况下，确认受检物质诱导未分化干细胞的分化。
＜II.本发明的分化标记＞
作为本发明的分化标记，可举出“选自FOXB2基因来源的mRNA或蛋白质中的分化标记”。具体而言，本发明的分化标记是干细胞的分化标记。干细胞的具体示例如上所述。
作为“FOXB2基因来源的mRNA或蛋白质”，可举出上述本发明的FOXB2 mRNA及FOXB2蛋白质。其具体示例如上所述。
更具体而言，例如，可举出选自下述(i)～(vii)的分化标记。
(i)具有由序列号1或序列号34表示的碱基序列的mRNA
(ii)具有与由序列号1或序列号34表示的碱基序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的碱基序列的mRNA
(iii)对由序列号2或序列号35表示的氨基酸序列进行编码的mRNA
(iv)对由序列号2或序列号35表示的氨基酸序列经1个～多个、优选为1～5个、更优选为1～3个氨基酸的缺失、插入、取代或添加而形成的氨基酸序列进行编码的mRNA
(v)与由序列号2或序列号35表示的氨基酸序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的氨基酸序列进行编码的mRNA
(vi)具有由序列号2或序列号35表示的氨基酸序列或者该氨基酸序列经1个或多个、优选1～5个、更优选1～3个氨基酸的缺失、插入、取代或添加而成的氨基酸序列的蛋白质
(vii)具有与由序列号2或序列号35表示的氨基酸序列具有70％、优选为80％、更优选为95％、进一步更优选为97％以上的序列同源性的氨基酸序列的蛋白质。
＜III.本发明的分化状态判定用试剂盒＞
作为本发明的细胞分化状态判定用试剂盒，可举出具有对FOXB2基因的表达进行检测的试剂的试剂盒，或者具有对FOXB2基因的表达量进行测定的试剂的试剂盒。
例如，可举出下述试剂盒。
(a)具有用于检测FOXB2 mRNA的表达或用于测定其表达量的引物或者它们的标记物的试剂盒
(b)具有用于检测FOXB2蛋白质的表达或用于测定其表达量的针对FOXB2蛋白质的抗体(即，识别FOXB2蛋白质的抗体，优选与FOXB2蛋白质特异性结合的抗体)或者该抗体的标记物等的试剂盒。
构成上述试剂盒的构成试剂的优选形式以及具体示例如上所述。
作为上述(a)的“用于检测FOXB2 mRNA的表达或者用于测定其表达量的引物”的示例，例如，可举出“用于检测由序列号1或序列号34表示的碱基序列或其部分序列的引物”。
更具体而言，例如，可举出
(a-1)以通过逆转录反应得到的cDNA为模板进行PCR时所使用的一对引物，或者
(a-2)用于逆转录反应的扩增引物以及以通过逆转录反应得到的cDNA为模板进行PCR时所使用的一对引物的组合。
对于构成(a-1)的一对引物的引物而言，至少其中的一者可根据需要被标记物质所标记。
作为(a-1)的一对引物的具体示例，可举出“具有由序列号9表示的碱基序列的引物与具有由序列号10表示的碱基序列的引物这一对引物”或者“具有由序列号45表示的碱基序列的引物以及具有由序列号46表示的碱基序列的引物这一对引物”。
作为(a-2)的具体示例，可举出“由序列号4表示的引物以及下述一对引物的组合：具有由序列号9表示的碱基序列的引物和具有由序列号10表示的碱基序列的引物这一对引物”或者“由序列号37表示的引物以及下述一对引物的组合：具有由序列号45表示的碱基序列的引物和具有由序列号46表示的碱基序列的引物这一对引物”。
上述(b)中的“用于检测FOXB2蛋白质的表达或者用于测定其表达量的针对FOXB2蛋白质的抗体”的具体示例如上所述。
例如，可举出“针对具有由序列号2或序列号35表示的氨基酸序列的蛋白质的抗体”。
含有上述(a-1)或(a-2)作为构成要件的试剂盒中，还可以含有用于RT-PCR法的逆转录酶、根据需要进一步选择的核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶等)、根据酶而选择的底物(dNTP、rNTP等)以及双链嵌入剂(SYBRTM Green、溴化乙锭等)或FAM、TAMRA等标记检测物质等。
另外，含有上述(a-1)或(a-2)作为构成要件的试剂盒中，例如，可以含有不会抑制共存试剂等的稳定性且不会妨碍PCR、杂交反应的缓冲剂、稳定剂、防腐剂等。另外，对于它们的浓度而言，通常可以从该领域中通常使用的浓度范围中适当地进行选择。
如果例举缓冲液的具体示例，可举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液、弗罗那缓冲液(veronal buffer)、硼酸缓冲液、Good’s缓冲液等通常实施PCR、杂交反应时使用的所有缓冲液。对所述缓冲液的pH也没有特别的限定，但是，例如，可举出5～9的范围。
在含有上述(b)作为构成要件的试剂盒所含的试剂中，可以包括不会抑制共存试剂的稳定性、不会阻碍抗原抗体反应的该领域中通常使用的试剂类，例如，缓冲剂、敏化剂、表面活性剂、防腐剂(例如，叠氮化钠、水杨酸、苯甲酸等)、稳定剂(例如，白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、表面活性剂、糖类等)、激活剂、避免对共存物质产生影响的试剂及其他在该领域中通常所使用的试剂类。另外，对于所述试剂类等的浓度范围等，可以适当地选择通常用于已知的该测定方法中的浓度范围等来使用。缓冲液等的具体示例、缓冲液的pH及浓度如上所示。
另外，对于本发明的细胞分化状态判定用试剂盒中所含的(a-1)、(a-2)(b-1)等而言，可以是悬浮于适当缓冲液而成的悬浮液等处于溶液状态的物品，或者，也可以是冷冻而成的冷冻品、冷冻干燥而成的冷冻干燥品。对于用于所述目的的缓冲液等的具体示例、缓冲液的pH及浓度如上所述。
进而，本发明的试剂盒中，还包括在用于对本发明的干细胞的FOXB2基因的表达(例如，FOXB2 mRNA的表达或者FOXB2蛋白质的表达)进行检测的方法中使用的说明书或者用于实施本发明的判定细胞分化状态的方法的说明书等。该“说明书”是指该方法的特征、原理、操作步骤、判定步骤等通过文章或图表等形式来实质记载的该试剂盒的操作说明书、附加文档、或者手册(散页印刷品)等。
下面，列举实施例进一步具体说明本发明，但是本发明并不受到这些实施例的任何限定。
实施例
实施例1.
通过RT-PCR法，对经分化诱导处理的hiPS细胞检测FOXB2 mRNA及公知的未分化标记的表达。
(1)干细胞的培养及分化诱导处理
使用添加或未添加bFGF(100ng/mL)的培养基(人多能干细胞培养基，StemSure hPSC Medium，和光纯药工业(株)制)，对hiPS细胞(201B7株，京都大学iPS细胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式会社))以及作为对比的、作为已分化的细胞的HDF细胞(来自正常人体细胞的成纤维细胞，龙沙公司(ロンザジャパン)(株)制造)进行三次传代培养，在培养的第5天回收细胞。
(2)总RNA的提取
使用作为市售的核酸提取试剂的试剂盒ISOGEN(日本基因(ニッポンジーン)制)，根据实物说明书，从上述(1)中回收的细胞中提取总RNA。
(3)DNase处理
在上述(2)中提取的总RNA 1μg中，加入蒸馏水，使总量成为17μL，加入10X反应缓冲液(普洛麦格公司(プロメガ)(株)制造)2μL、RQ1无RNA酶活性的脱氧核糖核酸酶(RQ1RNase-Free DNase)(普洛麦格公司(株)制造)1μL(1U)并进行混合，在37℃温度条件下孵育20分钟。然后，添加停止缓冲液(20mM EGTA)(普洛麦格公司(株)制造)1μL并进行混合，在65℃温度条件下孵育10分钟。然后，在反应物中添加结合缓冲液(5.5M胍盐酸盐(和光纯药工业(株)制)、20mM Tris-HCl pH6.6)100μL进行混合，然后，将其转移至Econospin(核酸纯化用硅胶膜离心柱，基因设计公司((株)ジーンデザイン)制)中，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，除去离心管中的溶液。接着，在离心管中添加洗涤缓冲液(2mM Tris-HCl pH7.5(日本基因公司)、80％乙醇(和光纯药工业(株)制))500μL，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，除去离心管的溶液。进而，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，然后，将Econospin(结合有mRNA)更换为新的离心管，添加洗脱缓冲液(10mMTris-HCl pH8.0)(日本基因公司)50μL，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，回收总RNA。然后，进行乙醇沉淀，将得到的沉淀物溶解于9.5μL蒸馏水中。
(4)逆转录反应
在9.5μL上述(3)中的经DNase处理的总RNA中，添加1μL混合引物(各5μM)，该混合引物含有以下述各mRNA为目标的扩增引物。下述引物均为西格玛奥德里奇(シグマアルドリッチ)公司制造。
·FOXB2 mRNA的扩增引物：CAGAAGCTACCCTTGCCAG(序列号4，GenBank Accession No.NM_001013735:242-260(相当于GenBank Accession No.NM_001013735的碱基序列中第242-260号的碱基序列的互补链的碱基序列。下同。))；
·OCT3/4 mRNA的扩增引物：GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG(序列号5，GenBank Accession No.NM_002701:641-661)；
·NANOG mRNA的扩增引物：GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC(序列号6，GenBank Accession No.NM_024865:631-651)；
·SOX2 mRNA的扩增引物：GACCACACCATGAAGGCATTC(序列号7，GenBank Accession No.NM_003106:572-592)；
·GAPDH mRNA的扩增引物：GTCTACATGGCAACTGTGAGG(序列号8，GenBank Accession No.NM_002046:1303-1323)
(GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)。
将各个混合物在72℃温度孵育3分钟后，立即进行冰冷处理。接着，加入5×缓冲液(东洋纺(株)制)4μL、2.5mM dNTPs(日本基因公司制)4μL、RNase抑制剂(特级)(和光纯药工业(株)制)0.5μL(20U)、ReverTra Ace(东洋纺(株)制)1μL(100U)进行混合，在42℃温度孵育50分钟。然后，加入结合缓冲液(5.5M胍盐酸盐(和光纯药工业(株)制)、20mM Tris-HCl pH6.6(和光纯药工业(株)制))100μL进行混合，转移至Econospin(核酸纯化用硅胶膜离心柱，基因设计公司制)中，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，除去离心管的溶液。然后，添加洗涤缓冲液(2mM Tris-HCl pH7.5(日本基因公司制)、80％乙醇(和光纯药工业(株)制))500μL，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，除去离心管的溶液。然后，进一步地，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离后，更换为新的离心管，添加洗脱缓冲液(10mMTris-HCl pH8.5)(日本基因公司制)25μL，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，使得到的沉淀物溶解于1μL蒸馏水中，回收cDNA。
需要说明的是，为了确认本实验体系中未混入基因组DNA，使用相同的试样，除了不添加RTase(ReverTra Ace(东洋纺(株)制)，逆转录酶)以外，进行与上述相同的反应。
(5)PCR反应
将上述(4)中得到的cDNA 1μL、蒸馏水5μL、KOD FX Neo(东洋纺)用2×PCR缓冲液12.5μL、2mM dNTPs(东洋纺)4μL、KOD FX Neo(东洋纺)0.5μL(0.5U)、各正向引物(10μM)1μL、各反向引物(10μM)1μL进行混合。
使用的各引物的碱基序列如下所述。下述引物均为西格玛奥德里奇公司制造。
FOXB2 cDNA、GenBank Accession No.NM_001013735:45-67、201-223
正向引物:CTACTCTTACATCTCGCTGACCG(序列号9)
反向引物:GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG(序列号10)
扩增链长:179bp
※序列号9的正向引物与序列号10的反向引物分别基于FOXB2 cDNA、GenBank Accession No.NM_001013735的第45-67位的碱基序列以及第201-223位的碱基序列进行设计。下同。
由此，通过使用所述一对引物的核酸扩增反应，FOXB2基因(由序列号1表示的碱基序列)的第45～223位共计179bp的区域(序列号3)(GenBank Accession No.NM_001013735.1的第45-223位)得以扩增。
OCT3/4 cDNA、GenBank Accession No.NM_002701:340-361、515-535
正向引物:CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG(序列号11)
反向引物:CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG(序列号12)
扩增链长:196bp
NANOG cDNA、GenBank Accession No.NM_024865:284-305、528-550
正向引物:CACCTATGCCTGTGATTTGTGG(序列号13)
反向引物:CATTGAGTACACACAGCTGGGTG(序列号14)
扩增链长:267bp
SOX2 cDNA、GenBank Accession No.NM_003106:31-54、443-464
正向引物:GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG(序列号15)
反向引物:CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG(序列号16)
扩增链长:434bp
GAPDH cDNA、GenBank Accession No.NM_002046:240-260、618-638
正向引物:GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC(序列号17)
反向引物:GGCATTGCTGATGATCTTGAG(序列号18)
扩增链长:399bp
将各混合物置于热循环仪中，以94℃2分钟、98℃10秒钟→56℃20秒钟→68℃30秒钟的方式使OCT3/4 cDNA、NANOG cDNA、SOX2 cDNA及FOXB2 cDNA进行扩增时，进行28个循环，以所述同样方式使GAPDH cDNA进行扩增时，进行20个循环，然后，在68℃温度条件下进行2分钟的反应。
(6)电泳
将上述(5)中得到的PCR扩增产物5μL与6×上样缓冲液双色染料(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因公司制)1μL进行混合，使用1.5％琼脂糖凝胶对其进行电泳。使用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业(株)制)进行染色。
需要说明的是，对于上述(4)中不添加RTase进行反应而得到的反应物，进行上述(5)～(6)的处理。
(7)结果
将结果一并示于图1中。
由图1的结果可知，作为通常已被确认的未分化标记的OCT3/4 mRNA(图1(3))、NANOG mRNA(图1(4))及SOX2 mRNA(图1(5))，在维持未分化、多能性的状态的hiPS细胞(hiPS/bFGF(+)/RTase(+)的情况)中进行了表达。还确认了它们在分化诱导处理后第5天的hiPS细胞(hiPS/bFGF(-)/RTase(+)的情况)中仍然进行表达(确认了电泳条带)。然而，OCT3/4 mRNA、NANOG mRNA及SOX2 mRNA在作为已分化的细胞的HDF细胞中未进行表达。
另一方面，确认了FOXB2 mRNA(图1(1))在分化诱导处理后第5天的hiPS细胞(hiPS/bFGF(-)/RTase(+)的情况)中进行表达(确认了电泳带)。然而，FOXB2 mRNA在维持未分化、多能性的状态的hiPS细胞(hiPS/bFGF(+)/RTase(+)的情况)以及作为已分化的细胞(特别是分化已完成的细胞)的HDF细胞中未进行表达。
需要说明的是，在全部mRNA的检测结果中，在RTase(-)的情况下未确认到电泳条带，由此，确认了在本实验体系中未混入基因组DNA。
另外，参见GAPDH mRNA的检测结果(图1(2))，在“hiPS/bFGF(+)/RTase(+)”、“hiPS/bFGF(-)/RTase(+)”、“HDF/RTase(+)”的情况下确认了电泳条带，而在“hiPS/bFGF(+)/RTase(-)”、“hiPS/bFGF(-)/RTase(-)”、“DF/RTase(-)”的情况下未确认到电泳条带。由此，确认了在本实验体系中mRNA未分解。
因此，可知FOXB2 mRNA作为分化标记很有用，通过对FOXB2 mRNA进行检测，能够判定细胞的分化状态。另外，即使在通常所测定的未分化标记(OCT3/4,NANOG,SOX2)的表达未被检测到变化的阶段也检测到了FOXB2 mRNA的显著表达，因此，可知与现有的未分化标记相比，在分化的初始阶段，FOXB2 mRNA更能够判定细胞的分化状态。
实施例2.
(1)干细胞的培养及分化诱导处理
使用添加或未添加bFGF的培养基(人多能干细胞培养基，StemSure hPSC Medium，和光纯药工业(株)制)对hiPS细胞(201B7株，京都大学iPS细胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式会社))进行培养，在培养的第3天、第5天、第7天回收细胞。
另外，使用MEM培养基(+10％FBS)(和光纯药工业(株)制)，对作为对比且作为已分化的细胞的HDF细胞(来自于人正常细胞的成纤维细胞，龙沙公司制造)进行培养，在培养的第7天回收细胞。
(2)总RNA的提取
通过与实施例1(2)相同的方法，从上述(1)中回收的培养的第3天、第5天、第7天的细胞中分别提取总RNA。
另外，使用HMSC-bm细胞(人骨髓来源间充质干细胞)的总RNA(美国ScienCell研究实验室(ScienCell Research Laboratories)制)作为对比。
(3)DNase处理
采用与实施例1(3)中相同的方法，分别对在上述(2)中提取的总RNA及HMSC-bm细胞的总RNA 1μg进行DNAase处理。
(4)逆转录反应
在上述(3)中经DNase处理的总RNA 9.5μL中，加入含有下述引物的混合引物(各5μM)1μL。下述引物均为西格玛奥德里奇公司制造。
·FOXB2 mRNA的扩增引物：CAGAAGCTACCCTTGCCAG(序列号4，GenBank Accession No.NM_001013735:242-260)；
·OCT3/4 mRNA的扩增引物：GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG(序列号5，GenBank Accession No.NM_002701:641-661)；
·NANOG mRNA的扩增引物：GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC(序列号6，GenBank Accession No.NM_024865:631-651)；
·SOX2 mRNA的扩增引物：GACCACACCATGAAGGCATTC(序列号7，GenBank Accession No.NM_003106:572-592)；
·GAPDH mRNA的扩增引物：GTCTACATGGCAACTGTGAGG(序列号8，GenBank Accession No.NM_002046:1303-1323)，
对于各混合物，采用与实施例1(4)相同的方法进行逆转录反应，分别回收cDNA。
(5)PCR反应
将上述(4)中得到的cDNA 1μL、蒸馏水5μL、KOD FX Neo(东洋纺(株)制)用2×PCR缓冲液12.5μL、2mM dNTPs(东洋纺(株)制)4μL、KOD FX Neo(东洋纺(株)制)0.5μL(0.5U)、各正向引物(10μM)1μL、各反向引物(10μM)1μL进行混合。
使用的各引物的碱基序列如下所述。下述引物均为西格玛奥德里奇公司制造。
FOXB2 cDNA、GenBank Accession No.NM_001013735:45-67、201-223
正向引物:CTACTCTTACATCTCGCTGACCG(序列号9)
反向引物:GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG(序列号10)
扩增链长:179bp
OCT3/4 cDNA、GenBank Accession No.NM_002701:340-361、515-535
正向引物:CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG(序列号11)
反向引物:CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG(序列号12)
扩增链长:196bp
NANOG cDNA、GenBank Accession No.NM_024865:284-305、528-550
正向引物:CACCTATGCCTGTGATTTGTGG(序列号13)
反向引物:CATTGAGTACACACAGCTGGGTG(序列号14)
扩增链长:267bp
SOX2 cDNA、GenBank Accession No.NM_003106:31-54、443-464
正向引物:GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG(序列号15)
反向引物:CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG(序列号16)
扩增链长:434bp
GAPDH cDNA、GenBank Accession No.NM_002046:240-260、618-638
正向引物:GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC(序列号17)
反向引物:GGCATTGCTGATGATCTTGAG(序列号18)
扩增链长:399bp
将各混合物置于热循环仪中，以94℃2分钟、98℃10秒钟→56℃20秒钟→68℃30秒钟的方式使OCT3/4 cDNA、NANOG cDNA、SOX2 cDNA及FOXB2 cDNA进行扩增时，进行28个循环，以所述同样的方式使GAPDH cDNA进行扩增时，进行20个循环，然后，在68℃温度条件下反应2分钟。
(6)电泳
将PCR扩增产物5μL与6×上样缓冲液双色染料(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因公司制)1μL进行混合，使用1.5％琼脂糖凝胶对其进行电泳。使用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业(株)制)进行染色。
需要说明的是，对于上述(4)中不添加RTase进行反应而得到的反应物，进行上述(5)～(6)的处理。
(7)结果
将结果一并示于图2中。
由图2的结果可知，使用未添加bFGF的培养基对hiPS细胞进行培养并进行分化诱导处理时，随着培养期间的增长，FOXB2 mRNA的表达量成比例地增加。
相对于此，确认了即使使用未添加bFGF的培养基进行培养并进行分化诱导处理，截止至分化诱导处理后第7天为止，FOXB2 mRNA以外的公知未分化标记(OCT3/4 mRNA,NANOG mRNA,SOX2 mRNA,GAPDH mRNA)仍然未消失而进行表达。
另一方面，即使使用未添加bFGF的培养基对HMSC-bm(人骨髓来源间充质干细胞)进行培养，也没有确认到FOXB2 mRNA的表达，也没有确认到公知的未分化标记(OCT3/4mRNA,NANOG mRNA,SOX2 mRNA,GAPDH mRNA)的表达。HMSC-bm是由干细胞(RS细胞)经中胚层而形成的体干细胞。由此，可推测如果未分化干细胞的分化进展至所述程度，则FOXB2 mRNA不再表达，换言之，FOXB2 mRNA在细胞分化的初始阶段特异性地表达。
另外，在培养第5天的HDF细胞中没有确认到FOXB2 mRNA的表达，也没有确认到公知的未分化标记(OCT3/4 mRNA,NANOG mRNA,SOX2 mRNA,GAPDH mRNA)的表达。
需要说明的是，在全部mRNA的检测结果中，在RTase(-)的情况下未确认到电泳条带，因此，确认了本实验体系中未混入基因组DNA。另外，在RTase(+)的全部情况下GAPDHmRNA都被检测到，因此，确认了在本实验体系中mRNA未分解，能够准确地检测mRNA的表达。
根据上述结果可知，相比于通常所测定的未分化标记(OCT3/4,NANOG,SOX2)的表达的改变被检测出的时期，FOXB2 mRNA的表达更早地得以检测。由此可知，FOXB2 mRNA作为细胞分化的初始阶段的分化标记特别有用，换言之，通过检测FOXB2 mRNA的表达，能够在分化的初始阶段判定细胞的分化状态。
实施例3.
(1)干细胞的培养及分化诱导处理
使用添加bFGF(100ng/mL)或未添加bFGF的培养基(人多能干细胞培养基，StemSure hPSC Medium，和光纯药工业(株)制)对hiPS细胞(201B7株，京都大学iPS细胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式会社))以及作为对比且作为已分化的细胞的HDF细胞(来自于正常人体细胞的成纤维细胞，龙沙公司制造)进行三次传代培养，在培养的第6天回收细胞。
(2)总RNA的提取
使用作为市售的核酸提取试剂的试剂盒ISOGEN(日本基因公司制)，根据实物说明书，从上述(1)中回收的细胞中提取总RNA。
(3)DNase处理
使用与实施例1(3)中相同的方法，分别对上述(2)中提取的总RNA 1μg进行DNase处理。
(4)逆转录反应
在上述(3)中经DNase处理的总RNA 9.5μL中，添加混合引物(各5μM)1μL，该混合引物含有以下述各mRNA为目标的扩增引物。下述引物均为西格玛奥德里奇公司制造。
·FOXB2 mRNA的扩增引物：CAGAAGCTACCCTTGCCAG(序列号4，GenBank Accession No.NM_001013735:242-260)
·OCT3/4 mRNA的扩增引物：GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG(序列号5，GenBank Accession No.NM_002701:641-661)
·NANOG mRNA的扩增引物：GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC(序列号6，GenBank Accession No.NM_024865:631-651)
·SOX2 mRNA的扩增引物：GACCACACCATGAAGGCATTC(序列号7，GenBank Accession No.NM_003106:572-592)
·FGF5 mRNA的扩增引物：CTCCCTGAACTTGCAGTCATC(序列号19，GenBank Accession No.NM_004464:709-729)
·CDX2 mRNA的扩增引物：CCTGAGGAGTCTAGCAGAGTC(序列号20，GenBank Accession No.NM_001265:1359-1379)
·GATA4 mRNA的扩增引物：GATTACGCAGTGATTATGTCCC(序列号21，GenBank Accession No.NM_001308094:1110-1131)
·GATA6 mRNA的扩增引物：CATCTTGACCCGAATACTTGAG(序列号22，GenBank Accession No.NM_005257:1961-1982)
·SOX17 mRNA的扩增引物：CCCAGGAGTCTGAGGATTTCC(序列号23，GenBank Accession No.NM_022454:1515-1535)
·GAPDH mRNA的扩增引物：GTCTACATGGCAACTGTGAGG(序列号8，GenBank Accession No.NM_002046:1303-1323)
将各混合物在72℃温度孵育3分钟后，立即进行冰冷处理。接着，加入5×缓冲液(东洋纺(株)制)4μL、2.5mM dNTPs(日本基因公司制)4μL、RNase抑制剂(特级)(和光纯药工业(株)制)0.5μL(20U)、ReverTra Ace(东洋纺(株)制)1μL(100U)进行混合，在42℃温度孵育50分钟。然后，加入结合缓冲液(5.5M胍盐酸盐(和光纯药工业(株)制)、20mM Tris-HCl pH6.6(和光纯药工业(株)制))100μL并进行混合，转移至Econospin(基因设计公司制)中，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，除去离心管的溶液。然后，添加洗涤缓冲液(2mM Tris-HCl pH7.5(日本基因公司制)、80％乙醇(和光纯药工业(株)制)500μL，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，除去离心管的溶液。然后，进一步地在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，然后更换为新的离心管，添加洗脱缓冲液(10mMTris-HCl pH8.5)(日本基因公司制)25μL，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，使得到的沉淀物溶解于1μL的蒸馏水中，回收cDNA。
(5)PCR反应
将上述(4)中得到的cDNA 1μL、蒸馏水5μL、KOD FX Neo(东洋纺(株)制)用2×PCR缓冲液12.5μL、2mM dNTPs(东洋纺(株)制)4μL、KOD FX Neo(东洋纺(株)制)0.5μL(0.5U)、各正向引物(10μM)1μL、各反向引物(10μM)1μL进行混合。
使用的各引物的碱基序列如下所述。下述引物均为西格玛奥德里奇公司制造。
FOXB2 cDNA、GenBank Accession No.NM_001013735:45-67、201-223
正向引物:CTACTCTTACATCTCGCTGACCG(序列号9)
反向引物:GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG(序列号10)
扩增链长:179bp
OCT3/4 cDNA、GenBank Accession No.NM_002701:340-361、515-535
正向引物:CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG(序列号11)
反向引物:CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG(序列号12)
扩增链长:196bp
NANOG cDNA、GenBank Accession No.NM_024865:284-305、528-550
正向引物:CACCTATGCCTGTGATTTGTGG(序列号13)
反向引物:CATTGAGTACACACAGCTGGGTG(序列号14)
扩增链长:267bp
SOX2 cDNA、GenBank Accession No.NM_003106:31-54、443-464
正向引物:GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG(序列号15)
反向引物:CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG(序列号16)
扩增链长:434bp
FGF5 cDNA、GenBank Accession No.NM_004464:462-482、615-637
正向引物:GCAGAGCAGTTTCCAGTGGAG(序列号24)
反向引物:GTATTCCTACAATCCCCTGAGAC(序列号25)
扩增链长:176bp
CDX2 cDNA、GenBank Accession No.NM_001265:923-944、1176-1196
正向引物:CAAATATCGAGTGGTGTACACG(序列号26)
反向引物:GACACTTCTCAGAGGACCTGG(序列号27)
扩增链长:274bp
GATA4 cDNA、GenBank Accession No.NM_001308094:795-816、1020-1040
正向引物:CAGCTCCTTCAGGCAGTGAGAG(序列号28)
反向引物:CGGGAGACGCATAGCCTTGTG(序列号29)
扩增链长:246bp
GATA6 cDNA、GenBank Accession No.NM_005257:1682-1703、1842-1864
正向引物:GCTTGTGGACTCTACATGAAAC(序列号30)
反向引物:GCTGCAATCATCTGAGTTAGAAG(序列号31)
扩增链长:183bp
SOX17 cDNA GenBank Accession No.NM_022454:1286-1306、1490-1511
正向引物:CGGAATTTGAACAGTATCTGC(序列号32)
反向引物:GCTCCTCCAGGAAGTGTGTAAC(序列号33)
扩增链长:226bp
GAPDH cDNA、GenBank Accession No.NM_002046:240-260、618-638
正向引物:GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC(序列号17)
反向引物:GGCATTGCTGATGATCTTGAG(序列号18)
扩增链长:399bp
将各混合物置于热循环仪中，以94℃2分钟、98℃10秒钟→56℃20秒钟→68℃30秒钟的方式使OCT3/4 cDNA、NANOG cDNA及SOX2 cDNA进行扩增时，进行24个循环，以所述相同的方式使FOXB2 cDNA、FGF5 cDNA、GATA4 cDNA、GATA6 cDNA及SOX17 cDNA进行扩增时，进行28个循环，以所述相同的方式使GAPDH cDNA进行扩增时，进行20个循环，在68℃温度反应2分钟。
(6)电泳
将上述(5)中得到的PCR扩增产物5μL与6×上样缓冲液双色染料(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因公司制)1μL进行混合，用1.5％琼脂糖凝胶对其进行电泳。用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业(株)制)进行染色。
需要说明的是，对于在上述(4)中不添加RTase进行反应而得到的反应物，进行上述(5)～(6)的处理。
(7)结果
将结果一并示于图3中。
由图3的结果可知，确认了在使用未添加bFGF的培养基对hiPS细胞进行培养并进行分化诱导的情况下，即使在分化诱导后(hiPS/bFGF(-)/RTase(+)的情况)的第6天，作为未分化标记的OCT3/4 mRNA、NANOG mRNA及SOX2 mRNA仍然进行表达(确认了电泳条带)。
另外，确认了作为公知的分化标记的FGF5 mRNA(外胚层分化标记)、CDX2 mRNA(外胚层分化标记)、GATA4 mRNA(内胚层分化标记)、GATA6 mRNA(内胚层分化标记)、SOX7 mRNA(内胚层分化标记)、SSEA-1 mRNA(分化标记)在分化诱导处理后第6天的hiPS细胞中仍未表达(未确认到电泳条带)。
另一方面，确认了FOXB2 mRNA在分化诱导处理后第6天的hiPS细胞(hiPS/bFGF(-)/RTase(+)的情况)中进行表达(确认了电泳条带)。
需要说明的是，在全部mRNA的检测结果中，在RTase(-)的情况下未确认到电泳条带，因此，确认了在实验体体系中未混入基因组DNA。
另外，观察GAPDH mRNA的检测结果，在“hiPS/bFGF(+)/RTase(+)”、“hiPS/bFGF(-)/RTase(+)”、“HDF/RTase(+)”的情况下确认了电泳条带，在“hiPS/bFGF(+)/RTase(-)”、“hiPS/bFGF(-)/RTase(-)”、“DF/RTase(-)”的情况下未确认到电泳条带。由此，确认了本实验体系中mRNA未进行分解。
因此，可知FOXB2 mRNA作为分化标记很有用，通过检测FOXB2 mRNA，能够判定细胞的分化状态。另外，即使在通常的未分化标记(OCT3/4,NANOG,SOX2)的表达的变化未被检测出的阶段，也检测出了FOXB2 mRNA的显著表达。
进一步可知，在已知作为目前最有前景的分化标记的FGF5 mRNA还未进行表达的阶段，就检测出FOXB2 mRNA的表达。即，FOXB2 mRNA能够比现有的分化标记、未分化标记在分化的更早阶段(初始阶段)判定细胞的分化状态。
根据上述内容，可知FOXB2 mRNA是相比于现有的分化/未分化标记更加极为有用的分化标记。另外，由于能够在培养初始阶段判定已分化的细胞，因此，在细胞的早期筛选、干细胞的品质管理等方面很有用，有望能够缩短培养期间、降低培养基的成本等。
实施例4.
使用未添加LIF的培养基对小鼠ES细胞进行培养并进行分化诱导处理，通过RT-PCR法检测FOXB2 mRNA及公知的未分化标记的表达。
(1)干细胞的培养及分化诱导处理
使用添加LIF(1000单位)或未添加LIF的培养基(StemSure DMEM、StemSure血清替代品、MEM非必需氨基酸溶液、L-谷氨酰胺溶液、StemSure2-巯基乙醇溶液，和光纯药工业(株)制)对mES细胞(D3株，ATCC，b723512)进行三次传代培养，在培养的第3天、第5天、第7天回收细胞。
(2)总RNA的提取
使用作为市售的核酸提取试剂的试剂盒ISOGEN(日本基因公司制)，根据实物说明书，从上述(1)中回收的细胞中提取总RNA。
(3)DNase处理
在上述(2)中提取的总RNA 1μg中，加入蒸馏水，使总量成为17μL，加入10X反应缓冲液(普洛麦格公司制造)2μL、RQ1无RNA酶活性的脱氧核糖核酸酶(RQ1RNase-Free DNase)(普洛麦格公司制造)1μL(1U)并进行混合，在37℃温度孵育20分钟。然后，加入停止缓冲液(20mM EGTA)(普洛麦格公司制造)1μL进行混合，在65℃温度孵育10分钟。然后，在反应物中加入结合缓冲液(5.5M胍盐酸盐(和光纯药工业(株)制)，20mM Tris-HCl pH6.6)100μL进行混合后，转移至Econospin(核酸纯化用硅胶膜离心柱，日本基因公司制)中，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，除去离心管的溶液。接着，在离心管中，添加洗涤缓冲液(2mM Tris-HCl pH7.5(日本基因公司制)、80％乙醇(和光纯药工业(株)制)500μL，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，除去离心管的溶液。进而，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离后，将Econospin(结合有mRNA)更换为新的离心管，添加洗脱缓冲液(10mMTris-HCl pH8.0)(日本基因公司制)50μL，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，回收总RNA。然后，进行乙醇沉淀，将得到的沉淀物溶解于9.5μL蒸馏水中。
(4)逆转录反应
在上述(3)中经DNase处理的总RNA 9.5μL中，加入混合引物(各5μM)1μL，该混合引物含有以下述各mRNA为目标的扩增引物。下述引物均为西格玛奥德里奇公司制造。
·Foxb2 mRNA的扩增引物：CATGATGAACTTGTAGATGTC(序列号37，GenBank Accession No.NM_008023:302-322)
·Oct3/4 mRNA的扩增引物：CATGTTCTTAAGGCTGAGCTGC(序列号38，GenBank Accession No.NM_013633:617-638)
·Nanog mRNA的扩增引物：CTGAATCAGACCATTGCTAGTC(序列号39，GenBank Accession No.NM_028016:388-408)
·Sox2 mRNA的扩增引物：CAACGATATCAACCTGCATGG(序列号40，GenBank Accession No.NM_011443:2120-2140)
·Klf2 mRNA的扩增引物：GAACTGGTGGCAGAGTCATTTTC(序列号41，GenBank Accession No.NM_008452:1205-1227)
·Esrrb mRNA的扩增引物：GATTCGAGACGATCTTAGTCAATG(序列号42，GenBank Accession No.NM_011934:957-980)
·Fgf5 mRNA的扩增引物：GACGCATAGGTATTATAGCTG(序列号43，GenBank Accession No.NM_010203:729-749)
·Gapdh mRNA的扩增引物：CTTGATGTCATCATACTTGGC(序列号44，GenBank Accession No.NM_001289726:843-863)
将各混合物在72℃温度孵育3分钟后，立即进行冰冷处理。接着，添加5×缓冲液(东洋纺(株)制)4μL、2.5mM dNTPs(日本基因公司制)4μL、RNase抑制剂(特级)(和光纯药工业(株)制)0.5μL(20U)、ReverTra Ace(东洋纺(株)制)1μL(100U)进行混合，在42℃温度孵育50分钟。然后，添加结合缓冲液(5.5M胍盐酸盐(和光纯药工业(株)制)、20mM Tris-HCl pH6.6(和光纯药工业(株)制)100μL进行混合，转移至Econospin(基因设计公司制)，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，除去离心管的溶液。然后，添加洗涤缓冲液(2mM Tris-HCl pH7.5(日本基因公司制)、80％乙醇(和光纯药工业(株)制)500μL，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，除去离心管的溶液。然后，进一步在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离后，更换为新的离心管，添加洗脱缓冲液(10mMTris-HCl pH8.5)(日本基因公司制)25μL，在12000×g、室温条件下进行1分钟的离心分离，将得到的沉淀物溶解于1μL的蒸馏水中，回收cDNA。
(5)PCR反应
将上述(4)中得到的cDNA 1μL、蒸馏水5μL、KOD FX Neo(东洋纺(株)制)用2×PCR缓冲液12.5μL、2mM dNTPs(东洋纺(株)制)4μL、KOD FX Neo(东洋纺(株)制)0.5μL(0.5U)、各正向引物(10μM)1μL、各反向引物(10μM)1μL进行混合。
使用的各引物的碱基序列如下所述。下述引物均为西格玛奥德里奇公司制造。
Foxb2 cDNA、GenBank Accession No.NM_008023:132-152、279-300
正向引物:CTTTCCAAGAGGCGTTAAGGC(序列号45)
反向引物:CTCAGAGGCAGCATCTTCTCAG(序列号46)
扩增链长:169bp
Oct3/4 cDNA、GenBank Accession No.NM_013633:163-186、480-501
正向引物:GAACCTGGCTAAGCTTCCAAG(序列号47)
反向引物:GCTTGGCAAACTGTTCTAGCTC(序列号48)
扩增链长:339bp
Nanog cDNA、GenBank Accession No.NM_028016:110-134、388-408
正向引物:GCATTAGACATTTAACTCTTCTTTC(序列号49)
反向引物:CTTGAAGAGGCAGGTCTTCAG(序列号50)
扩增链长:299bp
Sox2 cDNA、GenBank Accession No.NM_011443:1652-1674、1836-1859
正向引物:GAATCGGACCATGTATAGATCTG(序列号51)
反向引物:CATTTGATTGCCATGTTTATCTCG(序列号52)
扩增链长:208bp
Klf2 cDNA、GenBank Accession No.NM_008452:910-931、1159-1182
正向引物:GAAGCCTTATCATTGCAACTGG(序列号53)
反向引物:CTGTCCTAAGGTCCAATAAATAGC(序列号54)
扩增链长:273bp
Esrrb cDNA、GenBank Accession No.NM_011934:552-573、760-782
正向引物:GCAAGAGCTACGAGGACTGTAC(序列号55)
反向引物:GTTTGGTGATCTCACATTCATTG(序列号56)
扩增链长:231bp
Fgf5 cDNA、GenBank Accession No.NM_010203:445-465、617-639
正向引物:GAACATAGCAGTTTCCAGTGG(序列号57)
反向引物:GTTGCTGAAAACTCCTCGTATTC(序列号58)
扩增链长:195bp
Gapdh cDNA、GenBank Accession No.NM_001289726:224-246、512-534
正向引物:GTTCCAGTATGACTCCACTCACG(序列号59)
反向引物:CATTGCTGACAATCTTGAGTGAG(序列号60)
扩增链长:311bp
将各混合物置于热循环仪中，以94℃2分钟、98℃10秒钟→57℃20秒钟→68℃30秒钟的方式使Oct3/4 cDNA、Nanog cDNA、Sox2 cDNA、Klf2 cDNA及Esrrb cDNA进行扩增时，进行25个循环，以所述同样方式使Fgf5 cDNA及FOXB2 cDNA进行扩增时，进行30个循环，以所述同样方式使Gapdh cDNA进行扩增时，进行20个循环，在68℃温度反应2分钟。
(6)电泳
将上述(5)中得到的PCR扩增产物5μL与6×上样缓冲液双色染料(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因公司制)1μL进行混合，用1.5％的琼脂糖凝胶对其进行电泳。使用GelRed核酸凝胶染色试剂(和光纯药工业(株)制)进行染色。
需要说明的是，针对在上述(4)中不添加RTase进行反应而得到的反应物，进行上述(5)～(6)的处理。
(7)结果
将结果一并示于图4中。
由图4的结果可知，确认了FOXB2 mRNA在分化诱导处理后第7天的ES细胞(LIF(-)/RTase(+)的情况)中进行表达(确认了电泳条带)。但是，FOXB2 mRNA在维持未分化/多能性的状态的ES细胞(LIF(+)/RTase(+)的情况)中未进行表达。
确认了作为分化标记的Fgf5 mRNA在分化诱导处理后第7天的ES细胞(LIF(-)/RTase(+)的情况)中进行表达(确认了电泳条带)。
另外，确认了作为未分化标记的OCT3/4 mRNA、NANOG mRNA及SOX2 mRNA在维持未分化/多能性的状态的ES细胞(LIF(+)/RTase(+)的情况)中进行了表达。另外，确认了即使在分化诱导处理后第7天的ES细胞(LIF(-)/RTase(+)的情况)中仍进行表达(确认了电泳条带)。
需要说明的是，由于在全部mRNA的检测结果中，在RTase(-)的情况下未确认到电泳条带，因此，确认了本实验体系中没有混入基因组DNA。
另外，对GAPDH mRNA的检测结果进行观察，在“LIF(+)/RTase(+)”和“LIF(-)/RTase(+)”的情况下确认了电泳条带，而在“LIF(+)/RTase(-)”和“LIF(-)/RTase(-)”的情况下未确认到电泳条带。由此，确认了在本实验体系中mRNA未进行分解。
由上述结果可知，FOXB2 mRNA的表达，与被认为是目前最具前景的分化标记的Fgf5mRNA在同样程度的早期被检测出。另外，即使在常规未分化标记(OCT3/4,NANOG,SOX2)的表达的变化未被检测出的阶段，FOXB2 mRNA的表达也被显著地检测出。进一步地，在已知作为初始标记的Klf2 mRNA、Esrrb mRNA仍未消失的分化诱导后第7天的阶段，确认了FOXB2mRNA的表达。
由上述内容可知，与以往的未分化标记相比，FOXB2 mRNA在分化的初始阶段就能够判定ES细胞的分化状态。另外，由于在培养初始阶段能够判定已分化的细胞，因此，在细胞的早期筛选、干细胞的品质管理等方面有用，能够有望缩短培养期间、降低培养基的成本等。
参考例1.细胞的分化状态的确认
(1)干细胞的培养和分化诱导处理
使用下述培养基对hiPS细胞(201B7株，京都大学iPS细胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式会社))进行培养。
使用添加或未添加+bFGF及+ROCK抑制剂的hPSCΔ培养基(和光纯药工业(株)制)，将hiPS细胞播种于4个孔中，以使20000细胞/孔，培养1天。
从第2天开始，对于4个孔中的每2个孔，将培养基设为(1)hPSCΔ培养基、+bFGF、(2)hPSCΔ培养基、+bFGF(100mg/mL)，每天分别交换培养基。培养6天后，观察细胞。
(2)结果
将结果示于图5中。
在图5中，(1)是使用未添加bFGF的培养基进行培养(分化诱导处理)的hiPS细胞的照片。(2)是使用添加有bFGF的培养基进行培养的hiPS细胞的照片。
可知通过使用未添加bFGF的培养基进行培养，对hiPS进行培养时，iPS细胞分化诱导为神经细胞系的细胞。
由图5(1)可知，使用未添加bFGF的(-bFGF)培养基进行培养时，在培养的第6天，确认了细胞形态变成突起状或纤维状的状态(克隆的边缘呈刺状)。
但是，由图5(2)可知，在使用添加有bFGF(+bFGF)的培养基进行培养时，没有观察到如使用未添加bFGF的培养基进行培养时那样的细胞形态的变化。
根据上述内容，确认了使用未添加bFGF的培养基进行培养时，hiPS细胞的分化受到诱导。
实验例1.FOXB2蛋白质的检测1
1)抗人FOXB2蛋白质抗体固定化ELISA用微孔板的制备
将抗人FOXB2蛋白质抗体的溶液(50mM MOPS缓冲液(pH7.0))分别注入ELISA用微孔板(能肯公司(Nunk社)制)的各孔中，然后，静置24小时，从而得到固定了抗人FOXB2蛋白质抗体的微孔板。
2)过氧化物酶标记抗FOXB2蛋白质抗体的制备
通过常规方法对抗人FOXB2蛋白质抗体进行过氧化物酶标记。
3)试样的制备
回收分化诱导后第3天的hiPS细胞，通过超声来破坏hiPS细胞，从而得到细胞的裂解液。将得到的裂解液溶解于缓冲液中，制成试样。
4)测定
将上述3)中制备的试样添加至上述1)中制备的抗FOXB2蛋白质抗体固定ELISA用微孔板各孔中，在37℃温度反应1小时左右。接着，使用缓冲液洗涤各孔。
将上述2)中制备的过氧化物酶标记抗FOXB2蛋白质抗体分别注入各孔中，在37℃反应1小时左右。使用缓冲液洗涤各孔，接着使用蒸馏水洗涤各孔，在各孔中，分别添加50μL的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液(和光纯药工业(株)制)，在25℃温度反应30分钟。然后，在各孔中分别添加50μL的反应停止液(1M磷酸溶液)，使反应停止。使用Vmax(分子器件公司(モレキュラーデバイス社)制)对450nm处的吸光度进行测定。
其结果是，在检测到FOXB2蛋白质的情况下，判定用作试样的hiPS细胞处于已分化的状态。或者，判定在用作试样的hiPS细胞的细胞群中包含处于已分化的状态的细胞。
实验例2.FOXB2蛋白质的检测2
1)试样的制备
回收分化诱导后第3天的hiPS细胞，通过超声来破坏hiPS细胞，得到细胞的裂解液。使得到的裂解液溶解于缓冲液中，制成试样。
2)过氧化物酶标记抗FOXB2蛋白质抗体的制备
通过常规方法对抗人FOXB2蛋白质抗体进行过氧化物酶标记。
3)Western印迹法
将上述1)中得到的试样施加于SuperSepTM(电泳用凝胶，和光纯药工业(株)，5-20％的梯度凝胶)，进行SDS-PAGE电泳(恒定电流25mA)。接着，采用半干印迹法，将电泳后所分离部分转印于PVDF膜。
使封闭剂Block Ace(DS生物医学制药公司(ファーマバイオメディカル(株))制)溶解于PBS-T(含吐温20的磷酸盐缓冲液，Phosphate Buffered Saline with TweenTM 20，pH 7.4)中，制成封闭液。在该封闭液中浸渍上述转印后的PVDF膜，在室温进行1个小时的封闭处理，然后，洗涤PVDF膜，使其浸渍于封闭液中。
接着，将上述2)中得到的过氧化物酶标记抗人FOXB2蛋白质抗体添加至封闭液中，在室温浸渍1小时左右。洗涤PVDF膜，使用ECLTM Prime Western免疫印迹法检测试剂(Western Blotting Detection Reagent)(过氧化物酶的化学发光底物，GE医疗制)进行发光，使用LAS4000(富士フイルム(株)制)，以10秒的曝光时间进行检测。
其结果是，在检测到FOXB2蛋白质的情况下，判定用作试样的hiPS细胞处于已分化的状态。或者，判定用作试样的hiPS细胞的细胞群中包含处于已分化的状态的细胞。
判定包含状态的细胞。
工业实用性
根据本发明，能够在分化的初始阶段判定干细胞的分化状态。另外，本发明能够用于干细胞的品质管理、分化细胞的制备、分离方法中。进而，由于本发明能够在培养初始阶段判定已分化的细胞，因此，在细胞的早期筛选、干细胞的品质管理方面有用，能够有望缩短培养期间、降低培养基的成本。
序列表
<110> 和光纯药工业株式会社
<120> 细胞分化状态的判定方法
<130> 1993PCT
<150> JP2014-167800
<151> 2014-08-20
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人 FOXB2
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1299)
<400> 1
atg ccg cgg ccg ggg aag agc tcg tac agc gac caa aaa ccg ccc tac 48
Met Pro Arg Pro Gly Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Gln Lys Pro Pro Tyr
1 5 10 15
tct tac atc tcg ctg acc gcc atg gca atc cag cac tcg gcc gag aag 96
Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser Ala Glu Lys
20 25 30
atg ctg ccg ctg agc gac atc tac aag ttc atc atg gag cgc ttc ccc 144
Met Leu Pro Leu Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu Arg Phe Pro
35 40 45
tac tac cgc gag cac aca cag cgc tgg cag aac agc ctg cgc cac aac 192
Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu Arg His Asn
50 55 60
ctc tcc ttc aac gac tgc ttc atc aag att ccg cgg agg ccc gac cag 240
Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg Pro Asp Gln
65 70 75 80
cct ggc aag ggt agc ttc tgg gcg ctg cac ccc gac tgc ggg gac atg 288
Pro Gly Lys Gly Ser Phe Trp Ala Leu His Pro Asp Cys Gly Asp Met
85 90 95
ttc gag aac ggc agc ttc ctg cgg cgt cgc aag cgc ttc aag gtg ctg 336
Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Lys Arg Phe Lys Val Leu
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cgc gcc gac cat act cac ttg cac gcg gga agc acc aag agc gcg ccg 384
Arg Ala Asp His Thr His Leu His Ala Gly Ser Thr Lys Ser Ala Pro
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ggc gcc ggt ccg gga ggg cac ctt cac ccc cat cac cac cac cac ccc 432
Gly Ala Gly Pro Gly Gly His Leu His Pro His His His His His Pro
130 135 140
cac cac cac cat cat cac cac gct gcc gca cac cac cac cat cac cac 480
His His His His His His His Ala Ala Ala His His His His His His
145 150 155 160
cac cca ccc cag ccg ccg ccg ccg ccg ccc ccg ccg ccg ccg cac atg 528
His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Met
165 170 175
gta cac tat ttc cat cag caa ccg cct act gct ccg cag ccg cct ccg 576
Val His Tyr Phe His Gln Gln Pro Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Pro
180 185 190
cac ctc ccg tca cag ccc ccg cag caa ccg ccc cag cag tcg cag cct 624
His Leu Pro Ser Gln Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Ser Gln Pro
195 200 205
cag cag ccg tct cac ccc ggc aag atg cag gag gcg gcg gcc gtg gcg 672
Gln Gln Pro Ser His Pro Gly Lys Met Gln Glu Ala Ala Ala Val Ala
210 215 220
gcg gcg gcg gcg gcg gcc gcg gca gcc gcg gtg ggc agc gtg gga cgc 720
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg
225 230 235 240
ctg tct cag ttc cca ccc tac ggg ctg ggc tcg gcc gcc gcc gct gcc 768
Leu Ser Gln Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
gcc gcg gcc gcg gcg tcc acg tca ggc ttc aag cac ccc ttt gcc att 816
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ser Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile
260 265 270
gag aac att att ggc cgg gac tac aag ggc gtg ctg cag gct gga ggg 864
Glu Asn Ile Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly
275 280 285
ctg ccc ttg gcg tcc gtc atg cac cac ctg ggc tac ccc gtg ccc ggc 912
Leu Pro Leu Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly
290 295 300
cag ctt ggc aac gtc gtc agc tcc gtg tgg ccg cac gtt ggc gtc atg 960
Gln Leu Gly Asn Val Val Ser Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met
305 310 315 320
gat tcg gtg gcc gcc gcc gcg gcc gcc gca gcc gca gcc gga gtc cct 1008
Asp Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro
325 330 335
gta ggc ccg gag tat ggg gcc ttc ggg gtc ccg gtc aag tcc ctg tgc 1056
Val Gly Pro Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ser Leu Cys
340 345 350
cac tcg gca agc cag agc ctg cct gcc atg ccg gtg ccc atc aag ccc 1104
His Ser Ala Ser Gln Ser Leu Pro Ala Met Pro Val Pro Ile Lys Pro
355 360 365
acg cct gcg ctg ccg ccc gtg tcc gcg ctg cag ccg ggg ctc act gtc 1152
Thr Pro Ala Leu Pro Pro Val Ser Ala Leu Gln Pro Gly Leu Thr Val
370 375 380
ccc gcg gct tcg cag cag cct ccg gcg cca tcc acc gtg tgc tcc gcg 1200
Pro Ala Ala Ser Gln Gln Pro Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ser Ala
385 390 395 400
gcc gcg gcc tcg ccc gtt gcc tct ctg ctg gag ccc aca gcc cct acc 1248
Ala Ala Ala Ser Pro Val Ala Ser Leu Leu Glu Pro Thr Ala Pro Thr
405 410 415
tcg gcc gaa agc aag ggc ggc tcc ttg cac tcg gtg cta gtg cac tcc 1296
Ser Ala Glu Ser Lys Gly Gly Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser
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tag 1299
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<212> PRT
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Met Pro Arg Pro Gly Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Gln Lys Pro Pro Tyr
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Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser Ala Glu Lys
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Met Leu Pro Leu Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu Arg Phe Pro
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Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu Arg His Asn
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Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg Pro Asp Gln
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Pro Gly Lys Gly Ser Phe Trp Ala Leu His Pro Asp Cys Gly Asp Met
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Arg Ala Asp His Thr His Leu His Ala Gly Ser Thr Lys Ser Ala Pro
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Gly Ala Gly Pro Gly Gly His Leu His Pro His His His His His Pro
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His His His His His His His Ala Ala Ala His His His His His His
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His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Met
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Val His Tyr Phe His Gln Gln Pro Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Pro
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His Leu Pro Ser Gln Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Ser Gln Pro
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg
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Leu Ser Gln Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ser Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile
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Glu Asn Ile Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly
275 280 285
Leu Pro Leu Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Asn Val Val Ser Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met
305 310 315 320
Asp Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro
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Val Gly Pro Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ser Leu Cys
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His Ser Ala Ser Gln Ser Leu Pro Ala Met Pro Val Pro Ile Lys Pro
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Thr Pro Ala Leu Pro Pro Val Ser Ala Leu Gln Pro Gly Leu Thr Val
370 375 380
Pro Ala Ala Ser Gln Gln Pro Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ser Ala
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ser Pro Val Ala Ser Leu Leu Glu Pro Thr Ala Pro Thr
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gctgagcgac atctacaagt tcatcatgga gcgcttcccc tactaccgcg agcacacaca 120
gcgctggcag aacagcctgc gccacaacct ctccttcaac gactgcttca tcaagattc 179
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cacctatgcc tgtgatttgt gg 22
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<223> 寡核苷酸引物
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<212> DNA
<213> 小鼠 FOXB2
<220>
<221> CDS
<222> (191)..(1474)
<400> 34
ttgcggggac ccggggcagc tccccgaagg aggaggacca aggcaaaagg ggtctgggga 60
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ctggtatccg gctttccaag aggcgttaag gcccactgtg ggccggacgg aggtggaaga 180
gcctgggaag atg cca cgg cca ggg aag agt tcc tac agc gac caa aag 229
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1 5 10
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Pro Pro Tyr Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser
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30 35 40 45
cgc ttc ccc tac tac cgc gag cac acg cag cgc tgg cag aac agc ctg 373
Arg Phe Pro Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu
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145 150 155
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160 165 170
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Glu Asn Ile Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly
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Leu Pro Leu Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly
290 295 300
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Gln Leu Ser Asn Val Val Gly Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met
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385 390 395
gcc gcc tca ccc aca gcc cct ctc ttg gag ccc acc gca gcc ggc agg 1429
Ala Ala Ser Pro Thr Ala Pro Leu Leu Glu Pro Thr Ala Ala Gly Arg
400 405 410
gct gac agc aag ggg agc tcc cta cac tcg gtg ttg gtg cat tct 1474
Ala Asp Ser Lys Gly Ser Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser
415 420 425
taggggaccc cgcgaccggt gagaaggcgc ctgtcgagag a 1515
<210> 35
<211> 428
<212> PRT
<213> 小鼠 FOXB2
<400> 35
Met Pro Arg Pro Gly Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Gln Lys Pro Pro Tyr
1 5 10 15
Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser Ala Glu Lys
20 25 30
Met Leu Pro Leu Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu Arg Phe Pro
35 40 45
Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu Arg His Asn
50 55 60
Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg Pro Asp Gln
65 70 75 80
Pro Gly Lys Gly Ser Phe Trp Ala Leu His Pro Asp Cys Gly Asp Met
85 90 95
Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Lys Arg Phe Lys Val Leu
100 105 110
Arg Ala Asp His Ala His Leu His Ser Gly Ser Ser Lys Gly Ala Pro
115 120 125
Gly Thr Gly Pro Gly Gly His Leu His Pro His His Pro His His Ala
130 135 140
His His His His His His His His His Ala Ala His His His His His
145 150 155 160
His His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Met Val Pro
165 170 175
Tyr Phe His Gln Gln Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Pro His Leu Pro
180 185 190
Ser Gln Pro Ala Gln Gln Pro Gln Pro Gln Ser Gln Pro Pro Gln Thr
195 200 205
Ser His Pro Gly Lys Met Gln Glu Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg Leu Ser Gln
225 230 235 240
Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ser Thr Thr Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile Glu Asn Ile
260 265 270
Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly Leu Pro Leu
275 280 285
Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly Gln Leu Ser
290 295 300
Asn Val Val Gly Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met Asp Ser Val
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro Val Gly Pro
325 330 335
Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ala Leu Cys His Ser Ala
340 345 350
Asn Gln Ser Leu Pro Ala Val Pro Val Pro Ile Lys Pro Thr Pro Ala
355 360 365
Leu Pro Pro Val Thr Thr Leu Pro Pro Ala Leu Ser Val Pro Thr Ala
370 375 380
Ser Gln Gln Leu Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ala Ala Ala Ala Ser
385 390 395 400
Pro Thr Ala Pro Leu Leu Glu Pro Thr Ala Ala Gly Arg Ala Asp Ser
405 410 415
Lys Gly Ser Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser
420 425
<210> 36
<211> 169
<212> DNA
<213> 小鼠 FOXB2
<400> 36
ctttccaaga ggcgttaagg cccactgtgg gccggacgga ggtggaagag cctgggaaga 60
tgccacggcc agggaagagt tcctacagcg accaaaagcc gccctactct tacatctcac 120
tgaccgccat ggccatccag cattcggctg agaagatgct gcctctgag 169
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
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catgatgaac ttgtagatgt c 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 38
catgttctta aggctgagct gc 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 39
ctgaatcaga ccattgctag tc 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 40
caacgatatc aacctgcatg g 21
<210> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
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gaactggtgg cagagtcatt ttc 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 42
gattcgagac gatcttagtc aatg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
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gacgcatagg tattatagct g 21
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<220>
<223> 寡核苷酸引物
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<212> DNA
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ctcagaggca gcatcttctc ag 22
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<211> 21
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gaacctggct aagcttccaa g 21
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<212> DNA
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<223> 寡核苷酸引物
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gcattagaca tttaactctt ctttc 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
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<220>
<223> 寡核苷酸引物
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<220>
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<223> 寡核苷酸引物
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<223> 寡核苷酸引物
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<400> 60
cattgctgac aatcttgagt gag 23
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