香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

[0001]
本发明属药物化学领域，具体涉及一类香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

[0002]
癌症当前已成为危害人类生命健康的重要杀手。据世界卫生组织(who)预测，到2030年，全球每年新增癌症患者将达到2200万例，并且与癌症相关的死亡病例将达到1300万例。尽管当前癌症的治疗手段不断丰富，居高不下的癌症发生率和死亡率却依然发生。因此，积极寻找新型抗肿瘤药物是科学家一直关注的问题。
[0003]
香豆素，别名苯并吡喃酮，是一大类存在于植物界中香豆素类化合物的结构母核。之前的研究发现，香豆素类化合物具有广泛的药理学活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗凝血、抗氧化等功效。值得一提的是，一些含有香豆素结构的化合物已经被批准上市并在市场上广泛应用，例如华法林(抗凝药)、苯丙香豆素(抗凝药)、新生霉素钠(抗菌药)、三甲沙林(治疗银屑病)、甲氧沙林(治疗银屑病和白癜风)、双香豆乙酯(抗血栓)、卡波罗孟(治疗缺血性心脏病)、双香豆素(治疗深静脉血栓)、醋硝香豆素(治疗血栓栓塞)、氯克罗孟(治疗血栓栓塞)、羟甲香豆素(治疗胆汁分泌和胆道痉挛)以及5-甲氧基补骨脂素(治疗皮肤肿瘤、艾滋病、银屑病和白癜风)等，这些药物的广泛应用说明了香豆素骨架的优势。我们也注意到，在抗肿瘤治疗领域，以香豆素骨架上市的药物较少，因此，开发以香豆素为母核的新型抗肿瘤分子具有很大的发展空间。
[0004]
为了发现具有潜在抗肿瘤活性的小分子化合物，根据此前有过报道具有较好抗肿瘤活性的片段之一—二硫代氨基甲酸酯，我们在设计的时候引入了二硫代氨基甲酸酯片段，设计出了一类新型的香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物，并且对其抗肿瘤活性进行了大量筛选，最终发现此类化合物具有潜在的抗肿瘤活性，尤其是抗结肠癌活性。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供了一类香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，研究发现，该类香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物具有较好的抗肿瘤活性，尤其是抗结肠癌活性。
[0006]
一类香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物为式(i)所示的化合物或其药用盐；
[0007]
[0008]
式(i)中：r表示为被不同的直链烷基、异丙基、叔丁基、环烷基、羟基、烷基醇基、炔基、氰基、哌嗪基、n-烷基哌嗪基、芳香基或取代芳香基取代的二级胺、乙撑亚胺、三甲烯亚胺、四氢吡咯基、哌啶基、环己亚胺、哌嗪基、吗啉基、咪唑基。
[0009]
进一步，其中r表示
[0010][0011]
中的一种；
[0012]
其中，波浪线表示连接位置。
[0013]
作为优选，所述的香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物为以下化合物或其药用盐中的一种或者几种：
[0014]
[0015][0016]
作为优选，所述的香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物为以下化合物或其药用盐中的一种或者组合：
[0017][0018]
作为优选，所述的抗肿瘤药物用于治疗肿瘤或与肿瘤相关的疾病。这20种化合物具有较广谱的抗肿瘤活性，可以治疗的癌症的例子包括，但是不限于，胃癌、结肠癌、乳腺
癌、肝癌、白血病、淋巴癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、食道癌、中枢神经系统癌。本发明的香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物具有潜在的抗肿瘤活性，尤其是抗结肠癌活性，在癌症及癌症相关疾病治疗方面有潜在的应用前景。
[0019]
作为优选，所述的抗肿瘤药物包括治疗有效量的活性成分和药用辅料，其中，活性成分为香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物。所述的药用辅料指药学领域常用的药物载体，例如：填充剂、粘合剂、稀释剂、赋型剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等。另外还可以在组合物中加入其他辅剂如甜味剂、香味剂等。
[0020]
作为优选，所述的抗肿瘤药物的抗肿瘤药物由香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物和其他抗肿瘤药物组合，所述的抗肿瘤药物包括抗肿瘤抗生素、各种生物烷化剂、抗代谢药物、分子靶向药物及免疫检查点抑制剂等。
[0021]
本发明抗肿瘤药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括片剂、注射剂、气雾剂、栓剂、软膏剂、胶囊剂、膜剂、滴丸剂、控释或缓释剂或纳米制剂。本发明可以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、胶囊、粒剂等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。
[0022]
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0023]
所述的香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物结构新颖，并且具有较好的抗肿瘤活性，可以用于制备肿瘤和与肿瘤相关疾病的药物。
附图说明
[0024]
图1为本发明所述目标化合物id1-id20对三种不同的结肠癌细胞系的细胞增殖抑制情况。(a)化合物id1-id20对rko细胞的抑制率(10μm)；(b)化合物id1-id20对sw620细胞的抑制率(10μm)；(c)化合物id1-id20对sw480细胞的抑制率(10μm)；(d)化合物id11对rko细胞的ic
50
值；(e)化合物id11对sw620细胞的ic
50
值；(f)化合物id11对sw480细胞的ic
50
值；
[0025]
图2为本发明所述目标化合物id11对两种不同的结肠癌细胞系的细胞集落形成抑制情况。(a)sw620细胞；(b)sw480细胞；
[0026]
图3为本发明所述目标化合物id11对两种不同的结肠癌细胞系的细胞周期阻滞情况。(a)sw620细胞和sw480细胞周期阻滞结果；(b)sw620细胞和sw480细胞周期阻滞结果统计图(g2/m期)；(c)sw620细胞和sw480细胞周期相关蛋白的免疫印迹结果。**表示p＜0.01，***表示p＜0.001；
[0027]
图4为本发明所述目标化合物id11对两种不同的结肠癌细胞系的细胞凋亡诱导情况。(a)sw620细胞和sw480细胞凋亡结果；(b)sw620细胞和sw480细胞凋亡结果统计图(总凋亡细胞)；(c)sw620细胞和sw480细胞凋亡相关蛋白的免疫印迹结果。*表示p＜0.05，***表示p＜0.001。
具体实施方式
[0028]
下文将结合具体实施例详细描述本发明的内容。应当注意的是，下述实施例中描
述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
[0029]
实施例1
[0030]
化合物id1-id20的结构如表1所示。
[0031]
表1
[0032][0033]
制备上述的香豆素-二硫代氨基甲酸酯衍生物的方法，包括如下步骤：
nch2ch2ch2ch2n-(pyrrolidine)),2.10-2.03(2h,m,-nch2ch2ch2ch2n-(pyrrolidine)),2.01-1.94(2h,m,-nch2ch2ch2ch2n-(pyrrolidine)).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm):191.5,160.7,153.2,143.3,133.7,132.8,128.3,118.7,117.0,116.8,55.3,50.6,39.8,26.0,24.2.hrms(esi,m/z)calcd.for c
15
h
15
no2s2(m+na)
+
328.0436,found 328.0444.
[0051]
实施例9化合物id8的合成
[0052]
2-氧代-2h-苯并吡喃-6-基)甲基哌啶-1-碳二硫代酸酯(id8)的合成步骤类似实施例3中化合物id2的合成步骤b。化合物id8的理化数据如下：淡黄色固体。产率:70％。熔点:130.1-131.0℃。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.67(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.56-7.53(2h,m,h-5,h-7),7.26(1h,d,j＝8.0hz,h-8),6.40(1h,d,j＝9.6hz,h-3),4.62(2h,s,-sch
2-),4.28(2h,br,h-a),3.86(2h,br,h-e),1.69(6h,br,h-b,h-c,h-d).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm):194.3,160.7,153.2,143.3,133.3,132.9,128.4,118.7,117.0,116.8,53.2,51.4,40.7,26.0,25.4,24.2.hrms(esi,m/z)calcd.for c
16
h
17
no2s2(m+na)
+
342.0593,found 342.0585.
[0053]
实施例10化合物id9的合成
[0054]
2-氧代-2h-苯并吡喃-6-基)甲基氮杂环庚烷-1-碳二硫代酸酯(id9)的合成步骤类似实施例3中化合物id2的合成步骤b。化合物id9的理化数据如下：白色固体。产率:66％。熔点:72.6-73.5℃。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.65(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.53-7.50(2h,m,h-5,h-7),7.22(1h,d,j＝8.0hz,h-8),6.37(1h,d,j＝9.6hz,h-3),4.58(2h,s,-sch
2-),4.15(2h,t,j＝6.0hz,h-a),3.83(2h,t,j＝6.0hz,h-f),1.84-1.79(4h,m,h-b,h-e),1.23-1.20(2h,m,h-c),0.85-0.78(2h,m,h-d).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm):195.0,160.6,153.2,143.3,133.4,132.8,128.4,118.7,116.9,116.7,55.8,52.8,40.6,27.3,26.6,26.5,26.1.hrms(esi,m/z)calcd.for c
17
h
19
no2s2(m+na)
+
356.0749,found 356.0751.
[0055]
实施例11化合物id10的合成
[0056]
2-氧代-2h-苯并吡喃-6-基)甲基吗啉-4-碳二硫代酸盐(id10)的合成步骤类似实施例2中化合物id1的合成步骤b。化合物id10的理化数据如下：白色固体。产率:57％。熔点:135.4-136.3℃。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ(ppm):8.04(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.73(1h,s,h-5),7.63(1h,dd,j1＝8.4hz,j2＝1.8hz,h-7),7.35(1h,d,j＝9.0hz,h-8),6.48(1h,d,j＝9.0hz,h-3),4.63(2h,s,-sch
2-),4.22(2h,br,-n(ch2ch2)2o-(morpholine)),3.90(2h,br,-n(ch2ch2)2o-(morpholine)),3.65(4h,br,-n(ch2ch2)2o-(morpholine)).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ(ppm):197.8,162.9,155.8,147.1,136.0,135.9,131.8,121.7,119.5,119.5,68.6
×
2,54.4,53.3,43.1.hrms(esi,m/z)calcd.for c
15
h
15
no3s2(m+na)
+
344.0386,found 344.0391.
[0057]
实施例12化合物id11的合成
[0058]
2-氧代-2h-苯并吡喃-6-基)甲基1h-咪唑-1-碳二硫酸酯(id11)的合成步骤类似实施例2中化合物id1的合成步骤b。需要指出的是，在合成id11时，催化剂为磷酸钾，反应溶剂选用丙酮。化合物id11的理化数据如下：黄色固体。产率:68％。熔点:139.1-140.0℃。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):8.64(1h,s,h-b),8.05(1h,d,j＝9.6hz,h-4),8.01(1h,s,h-5),7.82(1h,s,h-e),7.71(1h,d,j＝8.4hz,h-7),7.40(1h,d,j＝8.4hz,h-8),7.17(1h,s,
h-d),6.50(1h,d,j＝9.6hz,h-3),4.78(2h,s,-sch
2-).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):197.8,159.7,153.0,143.8,135.9,133.0,131.7,130.6,129.0,118.7,118.3,116.6
×
2,39.6.hrms(esi,m/z)calcd.for c
14
h
10
n2o2s2(m+na)
+
325.0076,found 325.0070.
[0059]
实施例13化合物id12的合成
[0060]
2-氧代-2h-苯并吡喃-6-基)甲基4-甲基哌嗪-1-碳二硫酸酯(id12)的合成步骤类似实施例2中化合物id1的合成步骤b。化合物id12的理化数据如下：淡黄色固体。产率:53％。熔点:124.3-125.2℃。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):8.03(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.73(1h,d,j＝2.0hz,h-5),7.62(1h,dd,j1＝8.8hz,j2＝2.0hz,h-7),7.35(1h,d,j＝8.4hz,h-8),6.48(1h,d,j＝9.6hz,h-3),4.61(2h,s,-sch
2-),4.23(2h,br,-n(ch2ch2)2n-(piperazine)),3.87(2h,br,-n(ch2ch2)2n-(piperazine)),2.38(4h,br,-n(ch2ch2)2n-(piperazine)),2.19(3h,s,-nch3).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):194.1,159.8,152.6,143.9,132.9,132.8,128.7,118.5,116.4
×
2,53.9
×
2,50.9,49.5,45.0
×
2.hrms(esi,m/z)calcd.for c
16
h
18
n2o2s2(m+na)
+
357.0702,found 357.0709.
[0061]
实施例14化合物id13的合成
[0062]
2-氧代-2h-苯并吡喃-6-基)甲基4-异丙基哌嗪-1-碳二硫酸酯(id13)的合成步骤类似实施例3中化合物id2的合成步骤b。化合物id13的理化数据如下：淡黄色固体。产率:58％。熔点:73.6-74.5℃。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):8.04(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.73(1h,d,j＝2.0hz,h-5),7.63(1h,dd,j1＝8.8hz,j2＝2.4hz,h-7),7.35(1h,d,j＝8.4hz,h-8),6.48(1h,d,j＝9.6hz,h-3),4.61(2h,s,-sch
2-),4.21(2h,br,-n(ch2ch2)2n-ch(ch3)2),3.86(2h,br,-n(ch2ch2)2n-ch(ch3)2),2.71-2.65(1h,m,-n(ch2ch2)2n-ch(ch3)2),2.50-2.49(4h,m,-n(ch2ch2)2n-ch(ch3)2),0.96(3h,s,-n(ch2ch2)2n-ch(ch3)2),0.95(3h,s,-n(ch2ch2)2n-ch(ch3)2).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):193.7,159.8,152.6,143.9,132.9,132.8,128.7,118.5,116.4
×
2,53.4,51.5,50.1,47.7,47.6
×
2,18.0
×
2.hrms(esi,m/z)calcd.for c
18
h
22
n2o2s2(m+h)
+
363.1195,found 363.1201.
[0063]
实施例15化合物id14的合成
[0064]
2-氧代-2h-苯并吡喃-6-基)甲基4-(叔丁基)哌嗪-1-碳二硫酸酯(id14)的合成步骤类似实施例3中化合物id2的合成步骤b。化合物id14的理化数据如下：淡黄色固体。产率:62％。熔点:159.4-160.3℃。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):8.04(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.73(1h,d,j＝2.0hz,h-5),7.62(1h,dd,j1＝8.8hz,j2＝2.4hz,h-7),7.35(1h,d,j＝8.4hz,h-8),6.48(1h,d,j＝9.6hz,h-3),4.60(2h,s,-sch
2-),4.18(2h,br,-n(ch2ch2)2n-c(ch3)3),3.84(2h,br,-n(ch2ch2)2n-c(ch3)3),2.55(4h,br,-n(ch2ch2)2n-c(ch3)3),1.00(9h,s,-n(ch2ch2)2n-c(ch3)3).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):193.5,159.8,152.6,143.9,133.0,132.8,128.7,118.5,116.4
×
2,53.3,51.7,50.4,45.4,45.3,45.2,25.5
×
3.hrms(esi,m/z)calcd.for c
19
h
24
n2o2s2(m+h)
+
377.1352,found 377.1349.
[0065]
实施例16化合物id15的合成
[0066]
2-氧代-2h-苯并吡喃-6-基)甲基4-(2-羟乙基)哌嗪-1-碳二硫酸酯(id15)的合成步骤类似实施例2中化合物id1的合成步骤b。化合物id15的理化数据如下：淡黄色固体。产率:43％。熔点:120.9-121.8℃。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):8.04(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.73(1h,d,j＝2.0hz,h-5),7.62(1h,dd,j1＝8.4hz,j2＝2.0hz,h-7),7.35(1h,d,j＝
444.0827.
[0073]
实施例20化合物id19的合成
[0074]
2-氧代-2h-苯并吡喃-6-基)甲基4-苯基哌啶-1-碳二硫酸酯(id19)的合成步骤类似实施例3中化合物id2的合成步骤b。化合物id19的理化数据如下：白色固体。产率:66％。熔点:115.6-116.5℃。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):7.68(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.58-7.56(2h,m,h-5,h-7),7.33-7.27(3h,m,h-g,h-i,h-8),7.24-7.18(3h,m,h-f,h-h,h-j),6.42(1h,d,j＝9.2hz,h-3),5.75(1h,br,h-a),4.72-4.64(3h,m,-sch
2-,h-a),3.26-3.16(2h,m,h-e),2.92-2.84(1h,m,h-c),2.00-1.96(2h,m,h-b),1.80(2h,br,h-d).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm):194.9,160.6,153.3,144.2,143.2,133.2,132.9,128.6
×
2,128.4,126.8,126.7
×
2,118.7,117.0,116.9,52.6,50.8,42.5,40.8,33.2,32.6.hrms(esi,m/z)calcd.for c
22
h
21
no2s2(m+na)
+
418.0906,found 418.0910.
[0075]
实施例21化合物id20的合成
[0076]
2-氧代-2h-苯并吡喃-6-基)甲基4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-碳二硫酸酯(id20)的合成步骤类似实施例2中化合物id1的合成步骤b。化合物id20的理化数据如下：橙色固体。产率:66％。熔点:95.0-96.0℃。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):8.04(1h,d,j＝9.6hz,h-4),7.73(1h,d,j＝2.0hz,h-5),7.62(1h,dd,j1＝8.4hz,j2＝2.4hz,h-7),7.35(1h,d,j＝8.8hz,h-8),6.48(1h,d,j＝9.6hz,h-3),4.59(2h,d,j＝4.0hz,-sch
2-),3.36-3.23(2h,m,-ch(ch2ch2)n-(piperidine)),2.58-2.53(1h,m,-ch(ch2ch2)n-(piperidine)),2.52-2.49(2h,m,-ch(ch2ch2)n-(piperidine)),2.45(4h,br,-n(ch2ch2)2n-ch
3-(piperazine)),2.30(4h,br,-n(ch2ch2)2n-ch
3-(piperazine)),2.14(3h,s,-n(ch2ch2)2n-ch3),1.867-1.839(2h,m,-ch(ch2ch2)n-(piperidine)),1.38-1.34(2h,m,-ch(ch2ch2)n-(piperidine)).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):193.2,159.8,152.6,144.0,133.0,132.8,128.7,118.5,116.4
×
2,59.7,54.9
×
2,48.3
×
3,45.5
×
2,39.8,28.0,27.5.hrms(esi,m/z)calcd.for c
21
h
27
n3o2s2(m+h)
+
418.1617,found 418.1630.
[0077]
实施例22化合物的体外抗肿瘤活性测试
[0078]
细胞系和试剂：结肠癌细胞系sw620、sw480和rko细胞购自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(中国上海)；胎牛血清(fbs)购自于hyclone(美国犹他州)；rpmi-1640培养基和磷酸盐缓冲液(pbs)购自于浙江森瑞生物科技有限公司(中国湖州)；一抗包括anti-cdc2、anti-cyclinb1、anti-cleaved parp、anti-bcl-2、anti-actin和二抗购自santa cruz biotechnology(美国加利福尼亚州)。dmso购自sigma
–
aldrich(美国密苏里州)。mts粉末购自promega(美国普洛麦格公司)。
[0079]
细胞培养和给药：在37℃含5％co2培养箱环境下，细胞培养于含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基中。化合物用dmso配制成母液浓度为20mm的溶液置于-30℃冰箱，根据实验需要稀释成相应浓度。
[0080]
实施例23化合物id1-id20抗结肠癌细胞增殖测定
[0081]
sw620、sw480和rko细胞培养于包含10％fbs的rpmi-1640培养基的96孔板(6000个细胞/孔)中，贴壁过夜后给予不同浓度的含相应培养基的化合物，作用72小时。弃去培养基，每孔加入含10％mts的新鲜培养液于每孔中，37℃孵育30分钟。最后在酶标仪中设置波长490nm下检测96孔板的吸光度值。其中，对于抑制率测定，化合物浓度设置为10μm。对于
ic
50
值测定，化合物浓度梯度设置为0.625μm，1.25μm，2.5μm，5μm和10μm。化合物的ic
50
值可用graphpad prism 7.0软件计算出。采用不同的化合物进行检测，得到的结果如图1(a-f)所示。
[0082]
实施例24细胞集落形成实验
[0083]
sw620和sw480细胞培养于包含10％fbs的rmpi-1640培养基的6孔板(1000个细胞/孔)，贴壁过夜后给予dmso和不同浓度(4μm，8μm，16μm和32μm)的含相应培养基的化合物id11，作用24小时。之后每孔用新鲜的rpmi-1640培养基替换，继续培养直至长出明显的细胞集落(每个集落细胞数大于50个)。培养结束后，弃去培养基，每孔加入1ml甲醇，固定15分钟。弃去甲醇，每孔加入1ml 0.1％结晶紫溶液，染色30分钟以上。用自来水洗去染液，晾干，拍照，最后进行结果分析。得到的结果如图2(a,b)所示。
[0084]
实施例25细胞周期测定
[0085]
sw620和sw480细胞培养于包含10％fbs的rmpi-1640培养基的6孔板(5
×
105个细胞/孔)，贴壁过夜后给予不同浓度(8μm和16μm)的含相应培养基的化合物id11，作用24小时。之后收集细胞加入75％冰乙醇进行固定。pbs清洗细胞后，用碘化丙啶(pi)进行避光染色30分钟，之后将流式细胞管置于facscalibur flow cytometer(bdbiosciences,ca)中检测细胞周期分布情况。得到的结果如图3(a,b)所示。
[0086]
实施例26细胞凋亡测定
[0087]
sw620和sw480细胞培养于包含10％fbs的rmpi-1640培养基的6孔板(5
×
105个细胞/孔)，贴壁过夜后给予不同浓度(8μm和16μm)的含相应培养基的化合物id11，作用24小时。收集细胞后，用冰冷的pbs清洗两次。之后加入fitc conjugated annexin v和碘化丙啶(pi)避光作用30分钟进行双染，之后将流式细胞管置于facscalibur flow cytometer中检测细胞凋亡情况。得到的结果如图4(a,b)所示。
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实施例27蛋白质免疫印迹(western blot)测定
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化合物处理之后，收集细胞，用蛋白裂解缓冲液裂解细胞，之后在4℃下离心除杂。采用bradford protein assay kit(bio-rad,hercules,ca)方法测定样品的蛋白浓度。蛋白样品加入上样缓冲液后，进行电泳，之后转移到聚偏二氟乙烯膜(pvdf膜)上。转膜结束后，用1
×
tbst新鲜配制的5％脱脂牛奶进行封闭，之后于4℃在1
×
tbst中用特异性的一抗孵化过夜。接下来用1
×
tbst清洗3次，用辣根过氧化物酶(hrp)结合的二抗室温孵化1小时，通过ecl kit(bio-rad,hercules,ca)在曝光仪中进行免疫发光检测。采用不同的化合物进行检测，得到的结果如图3(c)和图4(c)所示。
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统计学分析
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所有的实验独立重复三次，结果用平均值
±
标准误差(sd)呈现。实验结果的统计学意义用one-way anova评价。p<0.05认为有统计学意义。
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本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。