生物凝胶的制备方法及制得的生物凝胶与流程

1.本发明涉及组织工程与生物医用材料领域，特别涉及生物凝胶的制备方法及制得的生物凝胶。


背景技术：

2.可注射水凝胶在组织工程与再生医学等方面有着广泛的用途。水凝胶是亲水的聚合物网络，含有大量的水分，其由于聚合物链间的物理交联和化学交联作用而不会溶解于水中而只能溶涨且保持一定的形状。水凝胶具有良好的生物相容性、水渗透性，这些性质使水凝胶在生物医学领域获得了广泛的应用。可注射水凝胶可用于生物活性分子控释、细胞的递送以及用作组织支架材料等不同方面。水凝胶在体内原位形成，这样就可避免外科手术过程中的高度创伤性，加速愈合、减少患者痛苦、降低医疗费用。因此，可注射水凝胶已成为生物医用材料应用发展的重要方向之一。
3.水凝胶材料按照其来源可分为天然和合成两大类。天然水凝胶主要包括明胶、胶原、纤维蛋白、透明质酸盐、海藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖等。天然来源水凝胶材料具有良好的生物相容性，然而其由于成分单一，难以发挥类似细胞外基质的生物学功能，组织修复能力有限。因此，开发更为仿生的可注射水凝胶材料是近年来生物医用材料领域的热点方向。
4.细胞外基质是结构蛋白和功能蛋白的复杂复合物，包含多种纤维蛋白，如胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖等组分，其组分在不同物种间相对保守。细胞外基质作为细胞生长支架，在细胞粘附、增殖和分化方面发挥着重要作用。在组织工程研究领域，为了更好的模拟天然细胞外基质的三维微环境，近年来，研究人员开发了系列通过脱细胞技术得到脱细胞基质生物支架材料的技术与方法。
5.脱细胞策略主要是指利用脱细胞技术(物理、化学、酶解等方法)去除组织中各种细胞成分以及遗传物质从而获得天然生物支架材料。脱细胞基质材料相对于传统生物支架材料来说具有诸多优势，主要包括，1)细胞外基质的三维结构保留完整；2)天然细胞外基质组成成分得以保留，利于细胞生长及功能发挥；3)脱细胞支架材料中含有天然细胞外基质中的细胞因子和信号分子，可以增强细胞的功能并促进生物学功能；4)脱细胞过程能够降低细胞外基质免疫原性，利于异种来源的组织的治疗性应用，扩展了供体的来源；5)脱细胞基质具有生物可降解性，不引发炎性反应。正是由于以上优势，脱细胞基质生物支架材料研究近年来得到了国内外研究人员的广泛关注并取得系列突破性进展，成功应用于组织工程各个领域。目前，人们已经能够从多种组织中得到脱细胞基质支架材料，如小肠、皮肤、血管、角膜以及更为复杂心、肺、肝、肾等。
6.大网膜是腹膜的一种，是存在于高等动物腹腔中的一层黏膜，是由结缔组织形成的膜状组织。大网膜是连接胃大弯至横结肠的腹膜。大网膜富有极强的弹性以及高度血管化的结构，这些优点使其在组织工程与再生医学领域中具有广泛的应用前景。大网膜脱细胞相关研究刚刚起步，还存在诸多问题亟待解决。目前，网膜脱细胞基质凝胶的制备主要是利用胃酶消化网膜脱细胞基质，制备脱细胞基质悬液，随后通过调节ph使其形成凝胶。该方
法由于胃酶发挥消化作用时需要将ph维持在酸性环境，极易造成细胞外基质中的活性细胞因子成分失活。因此，目前需要开发一种更为优化的网膜脱细胞基质生物凝胶制备方法，使其不但能够保持脱网膜脱细胞基质生物凝胶中各类细胞因子的活性，还能使其具有良好的温度敏感性。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了生物凝胶的制备方法及制得的生物凝胶。该方法条件温和，获得的网膜脱细胞基质生物凝胶能够良好的保持各类活性细胞因子的含量，且具有良好的温度敏感性，在37℃条件下5～10分钟即可由液态转变为凝胶态，因此能够作为可注射性载体材料应用于不同疾病的细胞治疗。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供了生物凝胶的制备方法，取网膜经清洗、脱细胞、消化后制得生物凝胶；
10.所述脱细胞包括化学脱细胞、生物脱细胞和/或物理脱细胞；所述化学脱细胞的试剂包括十二烷基硫酸钠；所述生物脱细胞的试剂包括dna酶；所述物理脱细胞包括震荡；
11.所述消化包括生物消化和/或物理消化；所述生物消化的试剂包括消化酶溶液，所述物理消化包括搅拌。
12.在本发明的一些具体实施方案中，所述脱细胞采用含十二烷基硫酸钠与dna酶的缓冲液浸泡所述网膜，震荡；
13.所述脱细胞包括第一脱细胞和第二脱细胞；
14.所述第一脱细胞的缓冲液中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5～3.5％重量比、优选1.5～2.5％重量比、更优选1.8～2.2％重量比、最优选2.0％重量比；dna酶的浓度为3500～4500u/l、优选3600～4400u/l、更优选3800～4200u/l、最优选4000u/l，ph为7.2～7.4；
15.所述第二脱细胞的缓冲液中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.6～1.5％重量比、优选0.7～1.3％重量比、更优选0.8～1.2％重量比、最优选1.0％重量比；dna酶的浓度为2500～3500u/l、优选2600～3400u/l、更优选2800～3200u/l、最优选3000u/l，ph为7.2～7.4。
16.在本发明的一些具体实施方案中，所述脱细胞还包括第三脱细胞；
17.所述第三脱细胞的缓冲液中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1～0.6％重量比、优选0.2～0.6％重量比、更优选0.4～0.6％重量比、最优选0.5％重量比；dna酶的浓度为1500～2500u/l、优选1600～2400u/l、更优选1800～2200u/l、最优选2000u/l，ph为7.2～7.4。
18.在本发明的一些具体实施方案中，所述脱细胞的时间为4～12h，所述脱细胞的震荡频率为100～200r/min。
19.在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗采用磷酸盐缓冲液；所述消化为：取脱细胞后的网膜基质与消化液混合，搅拌，终止消化；以g/ml计，脱细胞后的网膜基质与消化液的重量体积比为(10～20)：100。
20.在本发明的一些具体实施方案中，所述消化液包括胰酶、胶原酶、dispaseii和pbs溶液；其中，胰酶、胶原酶、dispaseii的质量比为2：2：(1～2)；
21.胰酶的酶活为6000～8000baee units/mg；胶原酶的酶活为125～150cdu/mg；dispaseii的酶活为10～20units/mg；
22.胰酶、胶原酶与dispaseii在pbs溶液的浓度分别为0.05～0.25％，ph为7.2～7.4。
23.在本发明的一些具体实施方案中，所述搅拌的转速为60～100rpm，所述消化为于37℃，5％co2消化30～45min；所述终止消化采用血清，血清与消化液的体积比为(1～2)：10。
24.在本发明的一些具体实施方案中，所述脱细胞之前还包括脱脂的步骤；所述脱脂包括化学脱脂和/或物理脱脂；所述化学脱脂采用体积比为1：1：(0.2～1)、优选1：1：(0.4～0.7)、更优选1：1：0.5的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行，所述化学脱脂的时间为18～30h；所述物理脱脂采用震荡的方法；所述震荡的频率为150～250r/min。
25.在本发明的一些具体实施方案中，所述制得生物凝胶为调整浓度为10～20mg/ml，于37℃5～10min，即得所述生物凝胶。
26.在本发明的一些具体实施方案中，所述网膜来源于哺乳动物；所述细胞包括皮肤成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪间充质干细胞、软骨细胞或心肌细胞中的一种或多种。
27.在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的制备方法制得的生物凝胶。
28.更重要的是，本发明还提供了所述的生物凝胶在制备医用材料中的应用。
29.本发明提供的生物凝胶的制备方法使用含十二烷基硫酸钠与dna酶的缓冲液浸泡网膜进行脱细胞处理的步骤；利用组合的消化酶液结合加有转子的消化瓶消化脱细胞网膜组织，以及制得的网膜脱细胞基质生物凝胶。本发明采用组合的消化酶液及其特殊的消化方法进行脱细胞基质生物凝胶的制备，与现有方法相比，该方法条件温和，获得的网膜脱细胞基质生物凝胶能够良好的保持各类活性细胞因子的含量，且具有良好的温度敏感性，在37℃条件下5～10分钟即可由液态转变为凝胶态，因此能够作为可注射性载体材料应用于不同疾病的细胞治疗。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
31.图1示温度敏感性网膜脱细胞基质生物凝胶的大体观察：凝胶态生物凝胶；
32.图2示网膜脱细胞基质生物凝胶中vegf的含量(*p<0.01)；
33.图3示网膜脱细胞基质生物凝胶中bfgf的含量(*p<0.01)。
具体实施方式
34.本发明公开了生物凝胶的制备方法及制得的生物凝胶，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
35.在本申请中，缩写词的含义如下：
36.sds：十二烷基硫酸钠；
37.pbs：磷酸盐缓冲液；
38.dna酶：脱氧核糖核酸酶；
39.min：分钟。
40.本发明的目的在于提供优化的网膜脱细胞基质生物凝胶制备方法。利用该方法得到的网膜脱细胞基质生物凝胶不但能够保持其中各类细胞因子的活性，还能使其具有良好的温度敏感性。
41.根据本发明的一个方面，提供了网膜脱细胞基质生物凝胶的制备方法，其包括：1)：网膜脱细胞处理：使用含十二烷基硫酸钠与dna酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；2)利用组合的消化酶液结合加有转子的消化瓶消化脱细胞网膜组织。
42.根据本发明的一个方面，提供了网膜脱细胞基质生物凝胶的制备方法，其包括使用含十二烷基硫酸钠与dna酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤。
43.在某些实施方案中，在进行脱细胞处理的步骤中还进行震荡。
44.在某些实施方案中，还包括脱脂处理的步骤。在示例性实施方案中，脱脂处理的步骤在脱细胞处理的步骤之前进行。在某些优选的实施方案中，该脱脂处理的步骤使用体积比为1：1：0.2
‑
1的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行。在某些更优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1：1：0.4
‑
0.7。在最优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1：1：0.5。
45.在某些实施方案中，脱细胞处理的步骤是分梯度进行的，所述梯度包括至少第一梯度和第二梯度。
46.在某些优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5
‑
3.5％重量比，dna酶的浓度为3500
‑
4500u/l，ph为7.2
‑
7.4。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5
‑
2.5％重量比，dna酶的浓度为3600
‑
4400u/l。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.8
‑
2.2％重量比，dna酶的浓度为3800
‑
4200u/l。在最优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为2.0％重量比，dna酶的浓度为4000u/l。
47.在某些优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.6
‑
1.5％重量比，dna酶的浓度为2500
‑
3500u/l，ph为7.2
‑
7.4。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.7
‑
1.3％重量比，dna酶的浓度为2600
‑
3400u/l。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.8
‑
1.2％重量比，dna酶的浓度为2800
‑
3200u/l。在最优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.0％重量比，dna酶的浓度为3000u/l。
48.在某些优选的实施方案中，所述梯度还包括第三梯度，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1
‑
0.6％重量比，dna酶的浓度为1500
‑
2500u/l，ph为7.2
‑
7.4。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.2
‑
0.6％重量比，dna酶的浓度为1600
‑
2400u/l。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.4
‑
0.6％重量比，dna酶的浓度为1800
‑
2200u/l。在最优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5％重量比，dna酶的浓度为2000u/l。
49.根据本发明的另一方面，提供了网膜脱细胞基质生物凝胶的制备方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：
50.(1)脱脂溶液的配制
51.将甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1：1：0.2
‑
1的比例混匀；
52.(2)脱细胞液的配制
53.1)脱细胞液i：称取十二烷基硫酸钠及dna酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为1.5
‑
3.5％重量比，dna酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为3500
‑
4500u/l,ph为7.2
‑
7.4，过滤除菌；
54.2)脱细胞液ii：称取十二烷基硫酸钠及dna酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.6
‑
1.5％重量比，dna酶在pbs中的浓度为2500
‑
3500u/l,ph为7.2
‑
7.4，过滤除菌；
55.3)脱细胞液iii：称取十二烷基硫酸钠及dna酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1
‑
0.6％重量比，dna酶在pbs中的浓度为1500
‑
2500u/l,ph为7.2
‑
7.4，过滤除菌；
56.(3)网膜脱细胞基质消化液的制备
57.将胰酶、胶原酶、dispaseii以质量比2：2：1
‑
2的比例溶于pbs溶液中，其中，胰酶、胶原酶与dispaseii在pbs溶液的浓度均为0.05
‑
0.25％，完全溶解后，调解ph至7.2
‑
7.4，获得网膜脱细胞基质消化液。
58.(4)大网膜脱细胞处理
59.1)取新鲜的大网膜组织，于磷酸盐缓冲液中清洗，将清洗后的组织震荡浸泡于所述脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18
‑
30h，震荡频率为150
‑
250r/min；
60.2)将去除脂肪的所述大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液i中处理，浸泡时间为4
‑
12h，震荡频率为100
‑
200r/min；
61.3)将经脱细胞液i处理后的所述大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于脱细胞液ii中处理，浸泡时间为4
‑
12h，震荡频率为100
‑
200r/min；
62.4)将经脱细胞液ii处理后的大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液iii中处理，浸泡时间为4
‑
12h，震荡频率为100
‑
200r/min；
63.5)pbs洗净，获得网膜脱细胞基质。
64.(5)网膜脱细胞基质生物凝胶的制备
65.将清洗并剪碎的网膜脱细胞基质加入到含有上述消化液的消化瓶中，每100毫升消化液加入10
‑
20克网膜脱细胞基质，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为60
‑
100rpm，于37℃，5％co2的孵箱中消化30
‑
45min(消化时间根据消化酶浓度不同适当调节)，然后以血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为1
‑
2：10。收集消化液，获得液态网膜脱细胞基质生物凝胶。将网膜脱细胞基质浓度调整为10
‑
20mg/ml，在37℃环境下5
‑
10分钟即可形成凝胶状网膜脱细胞基质生物凝胶。其中，所述消化瓶中装有磁力搅拌转子。
66.在某些实施方案中，新鲜的大网膜组织来源于猪、牛、羊等哺乳类动物。
67.在本申请中，大网膜组织是可商购的，可以购自例如屠宰场。
68.根据本发明的另一方面，提供了根据上述方法获得的网膜脱细胞基质生物凝胶。
69.本发明的方法采用的网膜脱细胞基质生物凝胶制备方法，与现有的胃酶消化法相比，该方法得到的网膜脱细胞基质生物凝胶不但能够保持其中各类细胞因子的活性，还能使其具有良好的温度敏感性；本方法还具有操作简单、可实施性强的优点。
70.现将通过以下实施例对本发明做详细描述，然而以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。
71.以下实施例中使用的大网膜脱细胞处理及其鉴定所需试剂的配制：
72.1)pbs：称取8gnacl，0.2g kcl，3.491gna2hpo4·
12h2o，0.2g kh2po4，溶解于1l超纯水中，调节ph值为7.2
‑
7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
73.2)脱脂溶液：将400ml甲醇、400ml氯仿与200ml乙醚混匀。
74.3)脱细胞液i：称取20g sds溶解于pbs中，添加dna酶并定容于1l，使dna酶浓度达到4000u/l,调节ph至7.2
‑
7.4，过滤除菌后常温保存。
75.4)脱细胞液ii：称取10g sds溶解于pbs中，添加dna酶并定容于1l，使dna酶浓度达到3000u/l,调节ph至7.2
‑
7.4，过滤除菌后常温保存。
76.5)脱细胞液iii：称取5g sds溶解于pbs中，添加dna酶并定容于1l，使dna酶浓度达到2000u/l,调节ph至7.2
‑
7.4，过滤除菌后常温保存。
77.6)网膜脱细胞基质消化液：将胰酶0.05克、胶原酶0.1g、dispase ii 0.1克，溶解于100mlpbs溶液中，调节ph值为7.2
‑
7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。使用前现配制，用于网膜脱细胞基质的消化。
78.7)消化瓶：200ml有盖柱形玻璃瓶，内置一个的磁力搅拌器用转子(直径
×
长：6
×
20mm)。
79.本发明提供的生物凝胶的制备方法及制得的生物凝胶中所用原料及试剂均可由市场购得。
80.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
81.实施例1小型猪来源大网膜的脱细胞处理
82.取新鲜的小型猪腹膜大网膜组织(购自屠宰场)，于pbs中清洗3遍。将清洗后的组织震荡浸泡于2l脱脂溶液中处理24h，震荡频率为200r/min。随后，将去除脂肪的大网膜组织于pbs中清洗3遍，并震荡浸泡于1l脱细胞液i中处理8h，震荡频率为150r/min。随后，将经脱细胞液i处理后的大网膜组织于pbs中清洗3遍，并震荡浸泡于1l脱细胞液ii中处理8h，震荡频率150r/min。随后，将经脱细胞液ii处理后的大网膜组织于pbs中清洗3遍，并震荡浸泡于1l脱细胞液iii中处理8h，震荡频率为150r/min。最后，将经脱细胞液iii处理后的大网膜组织经pbs洗净，4℃保存。
83.实施例2网膜脱细胞基质生物凝胶的制备
84.将清洗并剪碎的网膜脱细胞基质10g加入到含有上述消化液的消化瓶中，随后加入100毫升消化液，加盖后放在磁力搅拌器上以100rpm的转速进行搅动，磁力搅拌器和消化瓶一同置于37℃孵箱中，连续消化30
‑
45min，然后加入2ml血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为0.1
‑
0.2：10。收集消化液，获得液态网膜脱细胞基质生物凝胶。将网膜脱细胞基质浓度调整为20mg/ml，在37℃环境下5
‑
10分钟即可形成凝胶状网膜脱细胞基质生物凝胶(图1)。
85.实施例3网膜脱细胞基质生物凝胶的细胞因子含量检测
86.通过酶联免疫反应测定法(elisa)检测并比较利用本发明的方法得到的网膜脱细胞基质生物凝胶(实验组)以及常规胃酶消化法，浓度为1mg/ml获得的网膜脱细胞基质生物凝胶(对照组)中细胞因子vegf与bfgf的表达水平。分别称取100mg左右上述两种液态网膜脱细胞基质生物凝胶，设置空白对照组，标准品组，样品组。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl；用封板膜封板后置37
℃温育30min；随后，小心揭掉封板膜，弃去液体、甩干、每孔加满洗涤液、静置30s后弃去，如此反复5次、拍干。然后每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；经温育、洗涤后，每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min；最后，每孔加入终止液50μl终止反应；以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光值。绘制标准曲线，计算样品标准浓度，乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
87.结果发现，实验组中细胞因子vegf与bfgf的表达水平均显著高于对照组(图2，图3，表1，p<0.05)，表明本发明中采用的网膜脱细胞基质生物凝胶制备方法，与现有的胃酶消化法相比，得到的网膜脱细胞基质生物凝胶能够保持其中各类细胞因子的活性。
88.表1.生长因子含量比较
[0089] bfgf含量(μg/g)vegf含量(μg/g)实验组29.5*609.3*对照组7.6186.9
[0090]
注：*表示与对照组相比，差异显著p<0.05。
[0091]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。