格列本脲组合物在制备治疗脑含水量升高药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及药物用途领域，具体涉及格列本脲组合物在制备治疗或预防创伤性脑损伤引起的脑含水量升高药物中的应用。


背景技术：

2.创伤性脑损伤(traumatic brain injury,tbi)是由外力引起的脑部创伤性结构损伤或脑功能障碍，通过一系列神经化学分子和信号的改变引起神经功能的紊乱，从而导致患者在行为、认知和记忆方面的损害，是全球范围内主要的致死致残因素之一。
3.尽管对于tbi的研究投入了大量的人力财力，但由于其复杂的病理生理学机制，至今没有有效的治疗方案，如何提高这部分病人的生存率和减少后遗症对临床工作有重要意义。
4.近年来，脑损伤的发病机理、病理变化及其防治的实验研究越来越多，发病机理有若干学说：如兴奋性氨基酸毒性、细胞信号转导(包括ca
2+
超载和no损伤)、线粒体损伤、氧自由基大量生成、免疫炎症损伤等因素。
5.创伤性脑损伤会引起脑含水量升高、神经细胞凋亡、神经功能缺损等。发明人从事格列本脲制剂及治疗作用的研究，在研究中发现了格列本脲组合物在治疗或预防创伤性脑损伤引起的脑含水量升高、神经细胞凋亡、神经功能缺损中效果显著，可延长创伤性脑损伤患者的寿命和患者的生活质量。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于提供格列本脲环糊精组合物减少创伤性脑损伤引起的脑含水量、降低神经细胞凋亡、减轻神经功能缺损作用。
7.更具体的，本发明提供了格列本脲组合物在制备治疗或预防创伤性脑损伤引起的脑含水量升高药物中的应用。
8.本发明提供了格列本脲组合物在制备治疗或预防创伤性脑损伤引起的神经细胞凋亡药物中的应用。
9.本发明提供了格列本脲组合物在制备治疗或预防创伤性脑损伤引起的神经功能缺损药物中的应用。
10.在此将公开号为wo2018108111a1的发明内容引入本技术发明内容中。
11.优选的，所述格列本脲组合物为格列本脲环糊精注射用组合物。
12.优选的，所述格列本脲环糊精注射用组合物包括格列本脲、环糊精和附加剂。
13.优选的，格列本脲与环糊精的重量比为1:25～1000；优选为1:50～1000；优选为1:25～250；优选为1:25～50。
14.优选的，格列本脲与附加剂的重量比为1:0.5～100；优选为1:0.5～50，优选为1:0.5～25，优选为1:0.5～10。
15.优选的，所述附加剂为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠和/或葡甲胺；优选为碳酸钠、
氢氧化钠和葡甲胺；更优选为碳酸钠、葡甲胺
16.优选的，所述环糊精选自β-环糊精及药学上可接受的β-环糊精衍生物。
17.优选的，所述附加剂与环糊精的重量比为1:1～100，优选为1:5～50，优选为1:10～25。
18.优选的，所述格列本脲、附加剂和环糊精的重量比为1:0.5～50:25～250。
19.优选的，所述环糊精选自β-环糊精、二甲基-β-环糊精、2-羟乙基-β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、3-羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精和三甲基-β-环糊精。
20.优选的，所述环糊精选自2-羟丙基-β-环糊精和/或磺丁基醚-β-环糊精。
21.更优选的，所述环糊精选自2-羟丙基-β-环糊精。
22.本发明中，除特别说明外，羟丙基-β-环糊精指《中国药典》2020版收载的羟丙基倍他环糊精，即为2-羟丙基-β-环糊精。磺丁基醚-β-环糊精指磺丁基倍他环糊精钠(中国国家药品管理部门认可的药用辅料通用名称)。
23.优选的，所述格列本脲环糊精注射用组合物还包括ph调节剂和/或水。
24.优选的，组合物为粉针剂或溶液型注射剂。
25.优选的，所述药物组合物中所述环糊精浓度为0.5％～40％(w/v)，优选为2.5％～40％(w/v)，优选为5％～20％(w/v)，优选为1％～5％(w/v)。
26.优选的，所述药物组合物中所述附加剂浓度为0.01％～20％(w/v)，优选为0.01％～15％(w/v)，优选为0.01％～10％(w/v)，优选为0.01％～5％(w/v)，优选为0.1％～5％(w/v)。
27.优选的，所述药物组合物中所述格列本脲的浓度小于或等于该格列本脲在所述溶液型注射剂中的饱和浓度，优选为0.01～50mg/ml，优选为1～30mg/ml，优选为3～20mg/ml，优选为5～15mg/ml，优选为8～10mg/ml。
28.优选的，所述药物组合物ph为5～11，优选为6～10，优选为7～9，优选为8～8.5。
29.优选的，ph调节剂为盐酸溶液，更优选为0.1～2mol/l盐酸。
30.与现有技术相比，本发明的效果在于：提供了一种新的治疗或预防创伤性脑损伤引起的脑含水量升高、神经细胞凋亡、神经功能缺损药物中的格列本脲组合物，该用途是格列本脲、环糊精注射用组合物的新适应症，具有延长创伤性脑损伤患者的寿命和患者的生活质量的作用。
31.此外，建立理想的创伤性脑损伤动物模型能够更好地研究创伤性脑损伤发病机制，是进行创伤性脑损伤药理病理研究和药物开发的关键问题。本发明采用自由落体撞击法制作大鼠创伤性脑损伤模型(tbi)，该模型优点是：手术时间很短、仅需要25min左右，无须特殊设备、操作简便。本实验是基于改良的feeney氏法制备tbi模型，此法为经典的tbi模型制作方法。
32.从大鼠创伤性脑损伤(tbi)模型的药效学研究实验可知，本发明格列本脲环糊精注射用组合物各剂量能显著降低tbi大鼠的脑含水量，效果与丁苯酞(nbp)相当；且本发明剂量远远低于丁苯酞，具有预料不到的技术效果。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明
而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
34.在此将公开号为wo2018108111a1的实施例引入本发明实施例中。
35.实施例1格列本脲注射用组合物的制备(冻干粉针)
36.处方：
[0037][0038]
制备方法如下：按照处方，将无水碳酸钠和环糊精溶解在50～70ml体积的水中，再加入格列本脲粉末，搅拌溶解，获得第一溶液。向第一溶液中加入2mol/l盐酸溶液调节ph至8.0～8.5，定容至100ml，获得第二溶液。将第二溶液分装至西林瓶中，每个西林瓶3ml，对西林瓶中的第二溶液实施冷冻干燥，得到冻干粉针。按下表所述冻干程序冷冻干燥。
[0039]
冻干程序
[0040][0041]
实施例2：格列本脲注射用组合物的制备(冻干粉针)
[0042]
处方：
[0043][0044]
制备方法：先将无水碳酸钠和磺丁基醚-β-环糊精溶解在80ml体积的水中，再加入格列本脲粉末，搅拌溶解，获得第一溶液。向第一溶液中加入2mol/l盐酸溶调节溶液ph至8.0～8.5，定容至100ml，获得第二溶液。将第二溶液分装至西林瓶中，每个西林瓶3ml，对西林瓶中的第二溶液实施冷冻干燥(冻干程序同实施例1)，得到冻干粉针。
[0045]
实施例3：格列本脲注射用组合物的制备(冻干粉针)
[0046]
处方：
[0047][0048]
制备方法：先将葡甲胺和磺丁基醚-β-环糊精溶解在80ml体积的水中，再加入格列本脲粉末，搅拌溶解，获得第一溶液。向第一溶液中加入0.1m盐酸溶调节溶液ph至8.0～8.5，定容至100ml，获得第二溶液。将第二溶液分装至西林瓶中，每个西林瓶3ml，对西林瓶中的第二溶液实施冷冻干燥(冻干程序同实施例1)，得到冻干粉针。
[0049]
实施例4：大鼠创伤性脑损伤(tbi)模型的药效学研究
[0050]
(1)实验规范：本实验中所涉及到的所有动物实验操作，均按照实验机构的iacuc(实验动物使用与管理委员会，institutional animal care and use committee)规定来开展，并符合aaalac(国际实验动物评估和认可委员会，association for assessment and accreditation of laboratory animal care)原则。
[0051]
(2)实验动物：雄性sprague-dawley(sd)大鼠，清洁级，体重200～250g。动物饲养间的温度维持在20～24℃，湿度维持在30～70％；每天采用开灯12小时/关灯12小时循环(06：00am开，18：00pm关)。实验过程中，动物单笼饲养，自由饮水，自由采食。
[0052]
(3)受试药
[0053]
丁苯酞溶液：取定量丁苯酞先用dmso(《5％)溶液溶解，再加生理盐水，配制成浓度为11mg/ml溶液；
[0054]
格列本脲环糊精注射用组合物溶液：取实施例1格列本脲环糊精注射用组合物冻干粉针，加适量生理盐水，分别配制成浓度为3.3μg/ml、10μg/ml、33μg/ml、75μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的溶液；
[0055]
sham：假手术组；
[0056]
vehicle：参照实施例1制备的不含格列本脲空白制剂，加适量生理盐水配制；
[0057]
10％水合氯醛：称取10g水合氯醛，加定容生理盐水至100ml，配制成10％溶液。
[0058]
(4)实验设计
[0059]
1)tbi模型的建立
[0060]
雄性sd大鼠，体重200～250g左右，适应7天左右开始实验。实验当天，大鼠用10％水合氯醛0.35ml/100g腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧位固定，头部正中切开皮肤，冠状缝后2.5mm，矢状缝向右旁开2.5mm为中点于右侧脑部开直径为5mm的圆形骨窗，保持硬脑膜完好无损。将带活塞的自制打击器置于开口处，将20g砝码从30cm高处自由落体坠落打击活塞损伤脑部，活塞打击深度最高为2.5mm，造成右侧大脑顶部挫裂伤。钻下的颅骨放回原位，缝合头部皮肤，术后保持大鼠体温在37℃直到大鼠清醒。假手术组仅作右顶叶相应部位颅骨开窗，不致伤。术后护理：术后立刻将大鼠置于保温毯上，皮下注射美洛昔康(1-2mg/kg)镇痛，腹腔注射庆大霉素(4-8mg/kg)。
[0061]
2)动物的分组及给药
[0062]
本实验目标模型成功77只动物，术后随机进行分组。各组情况如下表：
[0063][0064]
备注：(1)丁苯酞组给药方式：共腹腔注射给药2次。造模手术后即刻给药1次，术后24h给药1次。(2)除丁苯酞组外，其他组给药方式：造模手术后即刻腹腔注射给药(ip)。同时背部皮下埋入alzet渗透压泵给药(sc)，给药体积1μl/h，100μl/渗透泵/鼠，持续给药48h。(3)渗透泵埋植：首先在肩胛骨间的皮肤处切一小口，然后用止血钳将皮肤和皮下结缔组织分开，形成一个小的袋，将渗透压泵插入，流量调节器朝里，缝合皮肤开口。
[0065]
3)监测指标
[0066]
①
24h和48h行为学测定；
[0067]
②
脑组织含水量；
[0068]
③
神经细胞凋亡检测。
[0069]
4)实验方法
[0070]
雄性sd大鼠，体重200～250g左右，适应7天左右开始实验。术前三天，进行行为学适应性训练，术前一天剔除行为学不合格的动物(转棒时间小于60s或大于200s的剔除)。实验当天，大鼠用10％水合氯醛0.35ml/100g腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧位固定，头部正中切开皮肤，冠状缝后2.5mm，矢状缝向右旁开2.5mm为中点于右侧脑部开直径为5mm的圆形骨窗，保持硬脑膜完好无损。将带活塞的自制打击器置于开口处，将20g砝码从30cm高处自由落体坠落打击活塞损伤脑部，活塞打击深度最高为2.5mm，造成右侧大脑顶部挫裂伤。钻下的颅骨放回原位，缝合头部皮肤，术后保持大鼠体温在37℃直到大鼠清醒。假手术组仅作右顶叶相应部位颅骨开窗，不致伤。
[0071]
术后护理：术后立刻将大鼠置于保温毯上，皮下注射美洛昔康(1-2mg/kg)镇痛，腹腔注射庆大霉素(4-8mg/kg)。
[0072]
术后24h和48h后，进行行为学测试。48h行为学测试后取血，离心分离上清，-80度保存。处死大鼠；取脑进行tunel神经细胞凋亡检测(n＝5-6)，另取大鼠7只/组，取脑烘干检测脑含水量。
[0073]
5)指标的测定
[0074]
转棒试验(rotarord test)：大鼠在手术前三天，放置于havard电动转棒仪进行适应性训练，将大鼠置于转棒上适应10s，启动转棒，速度设置为5min内匀速加速至40rpm，记录大鼠掉落时间作为指标。分别于术后24小时，48小时进行转棒试验测试。
[0075]
脑含水量(n＝7)：为梗死侧半脑含水量，采用干湿重法，大鼠co2吸入安乐死，直接断头后取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，分离左右大脑半球，立即称梗死侧湿重，然后放入100℃电烘箱中24h烤干，迅速称脑组织干重。计算脑含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重
×
100％。
[0076]
tunel神经细胞凋亡检测(n＝5-6)：取脑组织用4％多聚甲醛固定，脑组织制作石蜡切片，切片厚度为5-6μm，按tunel试剂盒要求进行检测，在挫伤组织周边的皮层组织进行拍照，统计出视野的平均凋亡神经细胞比例。
[0077]
取血浆：术后48h取血，edta-k2抗凝，4000r/min离心10min，分离血浆，-80℃保存。
[0078]
(5)数据处理
[0079]
所有的数据被录入到excel文档中，并以平均值
±
标准误的方式表示。实验数据统计采用单因素方差分析方法(one-way anova)加dunnett’s t test将各组数据进行分析比较。统计分析结果p《0.05认为有显著差异，用*和#表示；p《0.01，为非常显著性差异，用**和##表示；p《0.001，为极显著性差异，用***和###表示。两两比较采用非配对双尾t-test方法比较差异性。
[0080]
(6)实验结果
[0081]
1)格列本脲环糊精注射用组合物对tbi大鼠行为学的影响
[0082]
表1格列本脲环糊精注射组合物用对tbi大鼠行为学的影响
[0083][0084]
###p《0.001vs sham,*p《0.05vs vehicle by one-way anova post dunnett's test；δp《0.05by unpaired t test
[0085]
根据表1的结果显示，大鼠在24h、48h的转棒测试时间，sham组为108.50s、111.86s，vehicle组为28.41s、37.03s，vehicle组与sham组相比，转棒测试时间极显著下降(p《0.001)，说明tbi大鼠的运动持续能力显著降低。其他各组与vehicle组比，转棒测试时间都呈现一定程度的上降趋势，其中在24h转棒测试中，nbp组和格列本脲环糊精注射用组合物高剂量组与vehicle组相比有显著性差异(p《0.05)，说明nbp和格列本脲环糊精注射用
组合物高剂量能增强tbi大鼠的运动持续能力。
[0086]
2)格列本脲环糊精注射用组合物对tbi大鼠脑含水量的影响
[0087]
表2格列本脲环糊精注射用组合物对tbi大鼠脑含水量的影响
[0088][0089]
###p《0.001vs sham，*p《0.05**p《0.01***p《0.001vs vehicle by one-way anova post dunnett's test
[0090]
根据表2的结果显示，大鼠在48h的脑含水量测定，sham组为79.16％，vehicle组为81.46％，vehicle组与sham组相比有极显著性差异(p《0.001)，说明tbi大鼠的脑含水量显著升高。nbp能显著降低tbi大鼠的脑含水量(p《0.05,p《0.001)。同时，格列本脲环糊精注射用组合物各剂量组能显著降低tbi大鼠的脑含水量(p《0.05,p《0.01,p《0.001)，表明其可以改善tbi大鼠的脑水肿。
[0091]
3)格列本脲环糊精注射用组合物对tbi大鼠神经细胞凋亡的影响
[0092]
表3格列本脲环糊精注射用组合物对tbi大鼠神经细胞凋亡的影响
[0093][0094]
###p《0.001vs sham，***p《0.001vs vehicle by one-way anova post dunnett's test
[0095]
根据表3的结果显示，挫伤脑组织旁边的两侧皮层组织tunel染色，在sham组，皮层有少量的tunel阳性细胞(0.80％)，而vehicle组，可见有大量的tunel阳性细胞存在
(42.74％)，vehicle组与sham组相比阳性细胞显著增多(p《0.001)，说明tbi大鼠的神经细胞凋亡显著升高。nbp和格列本脲环糊精注射用组合物各剂量能显著降低tbi大鼠的tunel阳性细胞数(p《0.001)，表明其可以改善tbi大鼠的神经细胞凋亡。
[0096]
结果显示：
[0097]
(1)大鼠在24h、48h的转棒测试时间，vehicle组与sham组相比，转棒测试时间显著下降(108.50s vs 28.41s、111.86s vs 37.03s，p《0.001)，说明tbi大鼠的运动持续能力显著降低。其他各组与vehicle组比，转棒测试时间都呈现一定程度的上升趋势，其中在24h转棒测试中，nbp(丁苯酞)组和格列本脲环糊精注射用组合物高剂量组与vehicle组相比有显著性差异(p《0.05)；
[0098]
(2)大鼠在48h的脑含水量测定，vehicle组与sham组相比有显著性差异(81.46％vs 79.16％,p《0.001)，说明tbi大鼠的脑含水量显著升高。nbp能显著降低tbi大鼠的脑含水量(p《0.05,p《0.001)。同时，格列本脲环糊精注射用组合物各剂量均能显著降低tbi大鼠的脑含水量(p《0.05,p《0.01,p《0.001)；
[0099]
(3)挫伤脑组织旁边的两侧皮层组织tunel染色，vehicle组与sham组相比阳性细胞显著增多(42.74％vs 0.80％,p《0.001)，说明tbi大鼠的神经细胞凋亡显著升高。nbp和格列本脲环糊精注射用组合物各剂量均能显著降低tbi大鼠的tunel阳性细胞数(p《0.001)，并具有明显的量效关系。
[0100]
综合本次研究结果表明，格列本脲环糊精注射用组合物可以显著改善tbi大鼠的运动持续能力，减少脑含水量，减少神经细胞凋亡，减轻神经功能缺损，药物作用效果接近阳性药nbp。