猪流行性腹泻(PED)病毒疫苗组合物及其制备方法与流程

猪流行性腹泻(ped)病毒疫苗组合物及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒疫苗组合物，其包含具有seq id no：5所示氨基酸序列的猪流行性腹泻病毒s1蛋白作为活性成分等。
2.本技术要求于2019年4月16日提交的韩国专利申请号10
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2019
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0044008的优先权和权益，其公开内容通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.猪流行性腹泻(ped)是一种致命的、高传染性的猪肠道疾病，其特征是急性腹泻、呕吐和脱水，造成新生仔猪的高死亡率。这种疾病于1971年在英国首次报道，并迅速传播到整个欧洲，并被认为在20世纪80年代传播到亚洲大陆。最初命名为cv777的冠状病毒类似物于1978年在比利时被确定为病原体。
4.为了预防这种ped，需要开发一种亚单位疫苗，作为一种更安全、更经济且在疾病发作时起效更快的策略。亚单位疫苗通过在重组微生物(大肠杆菌或不同的表达系统)中大量生产构成病原微生物的具有已知抗原性的结构或非结构蛋白，用作疫苗的抗原蛋白。
5.在韩国，普遍使用ped减毒活疫苗，但这种疫苗最大的问题是，虽然减毒了，但病毒是活的，所以它们恢复毒性且成为致病性的，因此可能存在安全问题。另外，在疫苗研发中，对于减毒而言，在动物细胞中传代100次需要相对较长的时间，因此对突变率高的病毒难以快速反应，由于使用动物细胞培养疫苗研发成本也相对较高。
6.同时，由于蛋白质折叠或糖基化，用于预防此类疾病的疫苗通常使用动物细胞生产，而不是使用细菌。然而，由于使用动物细胞生产疫苗的方法需要大量成本用于大规模生产的设施扩建，疫苗生产并不容易，而且大多数疫苗价格昂贵。此外，使用动物细胞生产的灭活病毒疫苗不仅难以储存，而且存在极易被可感染动物的病毒污染的缺点。但是，与动物细胞不同的是，植物细胞被感染动物的病毒污染的可能性极低，只要保证培养面积，就可以随时大量生产，并长期保存在植物体内，预计稳定和廉价的疫苗生产是可能的。


技术实现要素：

7.技术问题
8.本发明是为了解决根据传统技术的上述问题而提出的，其目的在于提供一种重组ped病毒蛋白，其不仅能够利用植物体进行高效生产，而且显示高免疫原性和病毒中和能力，一种包含重组ped病毒蛋白的疫苗组合物以及制备该蛋白质的方法。
9.然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域普通技术人员通过以下描述将充分理解本文中未描述的其他问题。
10.技术方案
11.本发明提供一种ped病毒疫苗组合物，其包含具有seq id no：5所示氨基酸序列的ped病毒蛋白作为活性成分。ped病毒蛋白还可以包括本发明范围内seq id no：5所示氨基酸序列的功能等价物，所述功能等价物是指由于氨基酸的添加、取代或缺失，与氨基酸序列
具有至少60％或更多，优选70％或更多、更优选80％或更多、最优选90％或更多的序列同源性，并且表现出与seq id no：5表示的氨基酸序列基本相同的活性，只要是可以使用植物体稳定生产的ped病毒蛋白的氨基酸序列即可，本发明不限于此。
12.此外，本发明提供一种用于预防或治疗ped的饲料组合物，其包含ped病毒蛋白作为活性成分。
13.此外，本发明提供一种通过将ped病毒蛋白施用于个体来预防或治疗ped的方法。
14.此外，本发明提供了ped病毒蛋白用于预防或治疗ped的用途。
15.此外，本发明提供了ped病毒蛋白在制备ped疫苗或药物中的用途。
16.此外，本发明提供了一种表达ped病毒蛋白的载体，其包括编码seq id no：5所示氨基酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸优选为seq id no：1所示多核苷酸序列。
17.在本发明的一个实施方式中，在载体中，启动子基因和编码seq id no：5所示氨基酸序列的多核苷酸可以依次可操作地连接。
18.在本发明的另一个实施方式中，载体可以具有图1所示的结构，但本发明不限于此。
19.在本发明的又一实施方式中，载体还可以包括编码选自由内质网(er)信号肽、fc片段和分子伴侣结合蛋白(bip)组成的组中的一种或多种的基因，但本发明不限于此。
20.在本发明的又一个实施方式中，er信号肽可以是选自由kdel、hdel、sekdel、khedl、keel和sehedl表示的肽序列组成的组中的一种，但本发明不限于此。
21.在本发明的又一个实施方式中，启动子可以是花椰菜花叶病毒来源的35s启动子、花椰菜花叶病毒来源的19s rna启动子、植物肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、猿病毒40(sv40)启动子、呼吸道合胞病毒(rsv)启动子、延伸因子
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1α(ef
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1α)启动子、pemu启动子、mas启动子、组蛋白启动子或clp启动子，但本发明不限于此。
22.在本发明的又一个实施方式中，重组表达载体还可包括编码伴侣结合蛋白(bip)的多核苷酸、编码his
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asp
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glu
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leu(hdel)肽的基因和编码猪免疫球蛋白fc片段的基因。
23.此外，本发明提供了用该载体转化的转化体。
24.在本发明的一个实施方式中，转化体优选为微生物如大肠杆菌、芽孢杆菌、沙门氏菌或酵母，昆虫细胞、动物细胞(包括人细胞)、动物如小鼠、大鼠、狗、猴、猪、马或牛、根癌农杆菌或植物，更优选粮食作物如水稻、小麦、大麦、玉米、豆、马铃薯、红豆、燕麦或高粱；蔬菜作物如拟南芥、大白菜、白萝卜、红辣椒、草莓、番茄、西瓜、黄瓜、卷心菜、甜瓜、南瓜、大葱、洋葱或胡萝卜；特色作物如人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生或油菜籽；果树如苹果树、梨树、枣树、桃子、葡萄、橘子、柿子、李子、杏子或香蕉；以及花卉如玫瑰、康乃馨、菊花、百合、郁金香，只要转化体是可以用本发明的载体转化的生物，本发明不限于此。
25.此外，本发明提供了一种生产ped病毒蛋白的方法，包括：(a)培养转化体；(b)从转化体或培养液中分离纯化ped病毒蛋白。转化体优选为细胞本身、植物体或包含细胞的培养物，培养液优选为在细胞培养后除去细胞的培养液。只要培养液包含本发明的重组抗原，本发明不限于此。
26.在本发明的一个实施方式中，步骤(b)的纯化可以是使用水相部分的纯化，但本发明不限于此。
27.有益效果
28.本发明的重组ped病毒s1蛋白不仅在植物体内有效表达，而且水溶性高，易于分离纯化，在体内作为抗原发挥作用，从而表现出较高的免疫原性和病毒中和能力。因此，重组ped病毒s1蛋白预期广泛应用于各个领域。此外，由于在体内具有显著的免疫原性和病毒中和能力，重组ped病毒s1蛋白可作为新型ped疫苗组合物。
附图说明
29.图1示出了根据本发明的一个实施方式，在植物体中表达ped病毒s1(pedv
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s1)蛋白的基因排列。
30.图2示出了根据本发明的一个实施方式通过蛋白质印迹确认植物体中pedv s1蛋白表达的结果。
31.图3示出了根据本发明的一个实施方式分离和纯化pedv s1蛋白的结果。
32.图4示出了根据本发明的一个实施方式，在两次施用重组pedv s1蛋白的抗原后确认免疫原性的结果。
具体实施方式
33.在本发明中，使用由seq id no：1表示的ped病毒蛋白的基因，证实可以有效地生产和分离在植物体内具有高免疫原性的ped病毒蛋白。因此，由于本发明的ped病毒蛋白可以稳定有效地大量生产，因此预期提供廉价且稳定的ped疫苗。
34.本文所用的“抗原”是所有在体内引起免疫应答的物质的总称，优选病毒、化学品、细菌、花粉、癌细胞、虾或其部分肽或蛋白质，和只要能够在体内引起免疫应答的任何材料，本发明不限于此。
35.本文所用的“猪流行性腹泻病毒”属于冠状病毒科，以单链rna为基因组，长度约28kb，编码三种主要组成蛋白，如刺突蛋白、膜或包膜蛋白，以及核衣壳蛋白。本文所用术语“刺突蛋白”是ped病毒的主要组成蛋白，具有识别靶细胞和融合细胞膜与病毒的生物学重要功能。刺突蛋白的部分基因可作为减毒抗原决定簇(中和表位)，在成熟过程中，刺突蛋白经常被裂解为受体结合亚基s1和膜结合亚基s2。特别地，s蛋白的s1结构域可包括介导特异性结合细胞受体的受体结合结构域(rbd)。
36.本文所用的术语“疫苗”是包含引起生物体免疫反应的抗原的生物制剂，是指通过注射或口服给药到人或动物而在生物体内产生免疫以预防传染病的免疫原。动物为人或非人动物，非人动物是指猪、牛、马、狗、山羊或绵羊，但本发明不限于此。
37.本文所用的术语“表达载体”是指能够表达插入载体的异源核酸编码的肽或蛋白质的载体，优选为表达猪fc片段融合的靶抗原(在本发明，一种ped病毒蛋白)而制造的载体。“载体”是指用于在体外、离体或体内将碱基引入和/或转移到宿主细胞中的任何介质，并且可以是与不同dna片段结合以诱导结合片段复制的复制子，并且“复制子”是作为体内dna复制的自我单位的遗传单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体或病毒)，即可以通过自我控制复制。本发明的重组表达载体优选包括作为rna聚合酶结合的转录起始因子的启动子、用于调控转录的任选操纵基因序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译的终止的序列和终止子，更优选地，进一步包括用于提高蛋白质合成水平的m17 5'utr位点基因、用于将靶蛋白转移至内质网的bip基因、提高靶蛋白的表达水平和溶解度
的fc片段、最小化蛋白降解以使蛋白质在内质网中维持稳定的内质网信号肽(与er靶向序列含义相同)基因和克隆位点，更优选地，进一步包括标签基因用于轻松分离重组蛋白，标记基因用于选择抗生素抗性基因以选择转化体。
38.本文所用的“ped病毒蛋白”可以包括seq id no：5的氨基酸序列，优选地，由seq id no：5的氨基酸序列表示。根据本发明的一个实施方式，由于具有高溶解度，ped病毒蛋白易于分离和纯化，抑制重组蛋白的聚集，有效维持重组蛋白的生理或药理活性。
39.此外，本发明的蛋白质可以由seq id no：1表示的基因碱基序列编码。此外，基因变体也包含在本发明的范围内。具体地，该基因可以包括与seq id no：1的碱基序列具有70％或更多，更优选地，80％或更多，最优选地，90％或更多的序列同源性的碱基序列。例如，本发明的蛋白质包括具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性的多核苷酸。
[0040]“bip基因”是用于将表达的重组蛋白移动至内质网的bip序列的一部分，优选为包含seq id no:2碱基序列的基因，最优选为seq id no:2表示的基因，和由与seq id no:2的碱基序列具有80％或更多、更优选地90％或更多、再更优选地95％或更多的序列同源性的碱基序列组成。关于多核苷酸的“序列同源性百分比”是指通过对比比较区域与最佳比对序列来确定的，并且在比较区域中，多核苷酸序列的一部分与参考序列(没有添加或缺失)相比可能包括添加或缺失(即缺口)用于序列的最佳比对。“bip基因”用于将表达的重组蛋白移动到内质网，表达时部分序列缺失后可能仅具有一些氨基酸剩下。
[0041]“内质网信号肽”是指使内质网上的信号识别颗粒能够识别的蛋白质易位至内质网腔内的氨基酸序列。本发明对内质网信号肽的种类和氨基酸序列没有限制，只要是本领域普通技术人员已知的植物内质网信号肽即可。内质网信号肽的示例可以参考us 20130295065和wo2009158716中公开的内容。在本发明中，“内质网信号肽”优选为选自由kdel(seq id no：6)、hdel(seq id no：7)、sekdel(seq id no：8)、khedl(seq id no:9)、keel(seq id no:10)和sehedl(seq id no:11)组成的组中的任一种多肽，最优选，由hdel(his
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asp
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glu
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leu,seq id no:7)表示的多肽，由seq id no：4编码。此外，作为本发明的内质网信号肽，seq id no：4的变体也包括在本发明的范围内。具体地，该基因由与seq id no：4的碱基序列具有优选90％或更多，更优选95％或更多，最优选98％或更多序列同源性的碱基序列组成。关于多核苷酸的“序列同源性百分比”是通过对比比较区域与最佳比对序列来确定的，并且在比较区域中，与参考序列(没有添加或缺失)相比，多核苷酸序列的一部分可能包括添加或缺失(即缺口)以获得序列最佳比对。内质网信号肽的结合位点的特征在于被添加(或连接)到植物细胞中待表达或合成的蛋白质的c
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末端。
[0042]“fc片段”是指免疫球蛋白中没有抗原结合位点的部分，当免疫球蛋白被木瓜蛋白酶消化时，其只有重链(h链)通过ss键连接后保留，而本发明的fc片段优选为猪fc片段，更优选为由seq id no：3表示的猪fc片段。然而，没有限制，只要它是在与靶蛋白融合时增加靶蛋白的表达水平和溶解度的fc片段即可。此外，作为本发明的fc片段，seq id no：3的变体也包括在本发明的范围内。具体地，该基因由与seq id no：3的碱基序列具有优选90％或更多、更优选95％或更多、最优选98％或更多序列同源性的碱基序列组成。关于多核苷酸的“序列同源性百分比”是指通过对比比较区域与最佳比对序列来确定的，并且在比较区域
中，与参考序列(没有添加或缺失)相比，多核苷酸序列的一部分可能包括添加或缺失(即缺口)用于序列的最佳比对。
[0043]“克隆位点”包括用于连接/区分载体中基因的插入片段，优选为seq id no：12中“ggatcctg”或“ccccgggca”表示的区域，位于seq id no:13的第8至第10位的“ril，arg ile leu”，或位于seq id no:13的第727至729位的“pra，pro arg ala”，但本发明不限于此。
[0044]
在本发明中，病毒蛋白优选以与fc片段融合的形式提供。术语“融合”是指化学融合和基因融合，在本发明中优选地是指基因融合。“基因融合”是指通过编码蛋白质的dna序列的基因表达形成的线性共价键形成的连接。
[0045]
用于标签的基因可以包括，例如，avi标签、钙调素标签、聚谷氨酸标签、e标签、flag标签、ha标签、his标签、myc标签、s标签、sbp标签、igg
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fc标签、ctb标签、softag 1标签、softag 3标签、strep标签、tc标签、v5标签、vsv标签和xpress标签，并且igg
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fc标签可以衍生自人类、小鼠、兔子或猪。
[0046]
用于选择的标记基因可以是例如抗除草剂基因如草甘膦或草丁膦，抗抗生素基因如卡那霉素、g418、博来霉素、潮霉素或氯霉素，或aada基因，并且启动子可以是，例如，pemu启动子、mas启动子、组蛋白启动子、clp启动子、花椰菜花叶病毒来源的35s启动子、花椰菜花叶病毒来源的19s rna启动子、植物肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、猿猴病毒40(sv40)启动子、呼吸道合胞病毒(rsv)启动子或延伸因子
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1α(ef
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1α)启动子，并且终止子可以是例如胭脂碱合酶(nos)终止子、水稻淀粉酶ramy1a终止子、faceolin终止子、根癌农杆菌的章鱼碱基因终止子或大肠杆菌的rrnb1/b2终止子，但本发明不限于此。
[0047]
本文使用的“载体”可以具有图1所示的结构，但本发明不限于此。
[0048]
本文所用的“载体”优选为具有seq id no：13氨基酸序列，最优选为seq id no：13所示氨基酸序列的基因，和由与seq id no:13的序列具有80％或更多，优选90％或更多，更优选95％或更多的序列同源性的氨基酸序列组成。
[0049]
此外，氨基酸序列可由seq id no：12表示的基因序列编码，但本发明不限于此。具体地，该基因可以由与seq id no：12的碱基序列具有90％或更多、更优选95％或更多、最优选98％或更多序列同源性的碱基序列组成。关于多核苷酸的“序列同源性百分比”是指通过对比比较区域与最佳比对序列来确定的，并且在比较区域中，与参考序列(没有添加或缺失)相比，多核苷酸序列的一部分可能包括添加或缺失(即缺口)用于序列的最佳比对。
[0050]
本文所用的“转化”包括通过注入dna来改变生物体的遗传特性，“转基因生物体”是通过分子遗传学方法通过注入外部基因产生的生物体，优选地，通过本发明的重组表达载体转化的生物体。生物体是活的物体，例如微生物、真核细胞、昆虫、动物或植物，但不限于此，优选大肠杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、酵母、动物细胞、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、马、牛、根癌农杆菌或植物，但本发明不限于此。
[0051]
本文所用的“植物”是指能够大量产生蛋白质的植物，更具体地，可以选自由烟草、拟南芥、玉米、水稻、大豆、油菜、苜蓿、向日葵、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、马铃薯、生菜和胡椒组成的组，最好是烟草。本发明的烟草为烟草属植物，可过量表达蛋白质，但对烟草的种类没有特别限制，可以通过选择合适的物种进行转化方法和大量生产蛋白质的目的来实施本发明。例如，诸如nicotiana bethamiana l.或nicotiana tabacum cv.xanthi等物种
可以使用。
[0052]
转化体可以通过转化、转染、农杆菌介导的转化、粒子枪轰击、超声、电穿孔和聚乙二醇(peg)介导的转化来制备，但没有限制，只要转化体是通过注射本发明的载体的方法制备即可。
[0053]
本文所用的“溶解度”是指靶蛋白或肽在适合施用于人体的溶剂中溶解的程度。具体而言，溶解度表示溶质在特定温度下在给定溶剂中的饱和度。溶解度可以通过测定溶剂的饱和浓度来测定，例如，可以通过在溶剂中加入过量的溶质，搅拌并过滤溶液，并使用紫外分光光度计或hplc测定浓度来测定溶解度，但本发明不限于此。高溶解度优选用于重组蛋白的分离和纯化，具有抑制重组蛋白聚集、维持重组蛋白生理或药理活性的优点。
[0054]
本文所用的“预防”是指通过施用根据本发明的重组ped病毒蛋白来抑制或延迟ped发生的所有作用。
[0055]
本文使用的“治疗”是指通过施用根据本发明的蛋白质在改善或有益地改变ped症状的所有作用。
[0056]
本文所用的“个体”是指可以向其施用本发明的重组ped病毒蛋白的受试者，但该个体不限于此。
[0057]
本文使用的“疫苗组合物”可以配制成口服制剂，例如粉剂、颗粒、片剂、胶囊、混悬剂、乳剂、糖浆或气雾剂，或者根据常规方法的无菌注射液。疫苗组合物可以与稀释剂或赋形剂例如常规使用的填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂一起配制。用于口服给药的固体制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、颗粒或胶囊，并且这种固体制剂可以通过将至少一种赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶与卵磷脂类乳化剂混合而获得。此外，除简单的赋形剂外，还可使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。作为口服给药的液体制剂，使用悬浮剂、内服液体、乳剂或糖浆，并且除了常用的简单稀释剂如水或液体石蜡之外，还有各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂也包括在内。作为肠胃外给药的制剂，包括无菌水溶液、非水剂、悬浮剂、乳化剂或冷冻干燥剂。作为非水剂或悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、或可注射的酯如油酸乙酯。
[0058]
此外，本文所用的“佐剂”一般是指增加对抗原的体液和/或细胞免疫应答的任何材料。此处，本发明的疫苗组合物还可包含“佐剂”。佐剂可以是例如完全弗氏佐剂(cfa)，不完全弗氏佐剂(ifa)，明矾，油，脂质a，单磷酰脂质a、细菌剂如卡介苗(bcg)，核酸如cpg
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dna、dsrna，细菌成分剂如结核菌素，天然高分子材料如钥孔血蓝蛋白或酵母甘露聚糖，胞壁酰三肽或胞壁酰二肽或其衍生物，明矾，非离子嵌段共聚物，或细胞因子如白细胞介素2(il
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2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm
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csf)、干扰素
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α(ifn
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α)或干扰素
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β(ifn
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β)，以及至少其中一种或两种，并且在本发明的一个实施方式中，使用了ims1313油佐剂。
[0059]
本发明的疫苗组合物或药物组合物可以配制成口服制剂如粉剂、颗粒、片剂、胶囊、混悬剂、乳剂、糖浆或气雾剂，外用制剂，栓剂或无菌注射液。
[0060]
根据本发明的疫苗组合物的给药途径可包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠给药。优选口服或肠胃外给药。本文使用的术语“肠胃外”是指皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、囊内、胸骨内、硬膜内、病灶内和颅内注射技术。本发明的疫苗组合物可以以用于直肠给药的栓剂的形式给药。
[0061]
本发明的疫苗组合物或药物组合物的剂量选择考虑个体的年龄、体重、性别或身体状况。在没有单独副反应的情况下在个体中诱导免疫保护反应所需的量可以根据用作免疫原的任何重组蛋白和任何赋形剂的存在而变化。通常，每毫升无菌溶液中每剂含有0.1至1000μg，优选0.1至100μg本发明的重组蛋白。在疫苗组合物的情况下，如果需要，可以在初始剂量后任选地进行重复的抗原刺激。
[0062]
本文所用的“饲料组合物”是指含有本发明重组ped病毒s1蛋白的饲料，该饲料可以是猪肉、牛肉或鸡肉以及玉米、大米、普通稻草、野草、草、青贮饲料、干草或天然草的副产品，但本发明不限于此，只要是用于饲养家畜的饲料就没有限制。将本发明的重组ped病毒s1蛋白与这种饲料添加和混合的方法可以包括机械混合、吸附和封闭(occlusion)，但本发明不限于此。
[0063]
在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施例。然而，提供以下实施例只是为了更容易地理解本发明，并不用于限制本发明。
[0064]
[实施例]
[0065]
实施例1：重组ped病毒s1(pedv
‑
s1)蛋白植物表达载体的构建
[0066]
构建重组植物表达载体以在植物体内表达ped病毒s1蛋白，如图1所示。更具体地，确保了ped病毒s1蛋白的基因信息，并且合成了seq id no：1的基因作为用于在本氏烟草(nicotiana benthamiana)中表达优化的序列。ped病毒s1蛋白植物表达载体通过依次连接编码伴侣结合蛋白(bip)信号肽的多核苷酸(seq id no：2)、编码ped病毒s1蛋白的多核苷酸(seq id no：1)、编码pfc2(它是一个fc片段(猪免疫球蛋白fc片段(pfc))的多核苷酸(seq id no:3)，和编码在camv 35s启动子基因和pcambia1300载体的nos终止子之间的his
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asp
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glu
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leu(hdel)肽的多核苷酸(seq id no:4)来构建。
[0067]
实施例2：重组pedv s1蛋白表达的确认
[0068]
2.1.植物表达载体的瞬时表达
[0069]
通过电穿孔将实施例1中制备的植物表达载体转化到农杆菌菌株lba4404中。将转化的农杆菌在5ml酵母提取物蛋白胨(yep)液体培养基(10g酵母提取物、10g蛋白胨、5g nacl、50mg/l卡那霉素和25mg/l利福平)中在28℃振荡培养16小时，取原代培养液1ml接种于50ml新鲜yep培养基中，28℃振荡培养6小时。通过离心(7,000rpm，4℃，5分钟)收集培养的农杆菌，并重悬于渗透缓冲液(10mm mes(ph 5.7)、10mm mgcl2、200μm乙酰丁香酮)中至o.d.在600nm波长下为1.0。使用无针注射器将农杆菌悬浮液注入本氏烟草叶的背面以进行农杆菌渗入法。
[0070]
2.2.重组ped病毒s1蛋白在植物体内表达的确认
[0071]
从实施例2.1中制备的植物叶中提取蛋白质并离心，然后通过蛋白质印迹鉴定溶液中所含的水性级分(s)中的蛋白质和沉淀(p)级分中的蛋白质。更具体地说，将30μl的每个级分与sds样品缓冲液混合，然后加热。此外，将级分上样到10％sds
‑
page凝胶上用于电泳以按大小分离蛋白，并将分离的蛋白转移到pvdf膜上，用5％脱脂牛奶封闭，识别pfc2的抗猪二抗与膜结合，按照厂家提供的方法用ecl溶液处理，鉴定重组ped病毒s1蛋白的表达。结果示于图2。
[0072]
如图2所示，证实大部分表达的重组ped病毒s1蛋白存在于水性级分中。
[0073]
由以上结果证实，用于表达本发明的重组ped病毒s1蛋白的载体可以在植物体内
有效表达重组ped病毒s1蛋白，并且由于使用该载体制备的重组ped病毒s1蛋白具有高溶解度，易于分离和纯化，抑制重组蛋白的聚集，有效维持重组蛋白的生理或药理活性。
[0074]
实施例3：重组pedv s1蛋白的分离和纯化
[0075]
将200ml蛋白质提取溶液(50mm tris(ph 7.2)、150mm nacl、0.1％triton x
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100、1x蛋白酶抑制剂)加入到40g实施例2.1中制备的本氏烟草中，将混合物用搅拌器破碎组织，在4℃下以13,000rpm离心20分钟，回收蛋白质提取物。为了分离和纯化表达的重组ped病毒蛋白，用填充有蛋白a
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琼脂糖树脂的柱子进行亲和层析。用5ml树脂填充柱子，并用50ml洗涤溶液(50mm tris(ph 7.2)、150mm nacl)平衡。将回收的蛋白质提取物上柱后，用100ml洗涤液洗涤树脂，用洗脱液(0.1m柠檬酸钠(ph3.0)、150mm nacl)洗脱重组蛋白，然后通过添加中和溶液(1m tris(ph9.0))中和蛋白质洗脱液。用30kd大小的过滤器将含有重组蛋白的洗脱液更换为生理盐水(pbs)并浓缩，从而得到分离纯化的重组ped病毒蛋白。在sds
‑
page后通过考马斯染色确认分离和纯化的蛋白质(图3)。
[0076]
如图3所示，确认了大小约为120kd的重组蛋白被纯化。
[0077]
本发明的重组蛋白被很好地纯化，与常规蛋白没有大的差异。这样的结果表明，当蛋白质在植物中表达时，没有发现由于修饰的糖结构而可能降低生产效率的问题，并且根据本发明的蛋白质在植物中很好地生产。
[0078]
实施例4：植物中表达的pedv s1蛋白的免疫原性的确认
[0079]
为了确认重组ped病毒s1蛋白抗原是否在体内诱导抗体从而具有免疫原性，每组用5只6周龄雌性豚鼠进行实验。更具体地，对于阴性对照，施用生理盐水，对于阳性对照，施用市售的ped疫苗(joongang vaccine)，对于实验组，以150μg的剂量皮下施用重组ped病毒s1蛋白每三周两次。注射抗原后，混合并注射等量的ims1313佐剂(seppic)。抗原施用前和第二次施用后2周从颈静脉或心脏采血，分离血清，
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20℃冰箱保存。使用包被有his标签融合的pedv
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s1重组蛋白的elisa板鉴定每种血清中针对pedv s1蛋白的特异性抗体的产生，结果示于图4。
[0080]
如图4所示，证实未处理组的血清中未观察到对重组ped病毒s1蛋白的反应性，但在接种市售疫苗或重组抗原蛋白施用两次的组的血清中显示出对ped病毒s1蛋白的反应性，与市售疫苗接种组相比，重组抗原蛋白施用组显示出相对较高的特异性抗体产生率。
[0081]
实施例5：血液中中和抗体滴度的确认
[0082]
使用实施例4中制备的血清证实了通过施用重组抗原蛋白诱导的血液抗体是否具有ped病毒中和能力。更具体地，在中和抗体试验中，使用pedv qiap1401菌株病毒和作为感染宿主的vero细胞。从采集的血液中分离血清，57℃固定30分钟，然后用含有10μg/ml胰蛋白酶的最低必需培养基(mem)eagle稀释2倍。将等量的316tcid
50
/0.1ml pedv病毒与稀释血清混合，在37℃下中和90分钟。培养即将结束前，将96孔板中制备的单层vero细胞用pbs洗涤3次，加入100μl血清病毒混合物，37℃培养2小时。培养后加入100μl含2μg/ml胰蛋白酶的培养基，病毒在37℃培养3至5天，直至出现细胞病变效应(cpe)。中和抗体滴度是通过在显微镜下cpe显示之前立即观察孔的血清稀释倍数来测量的(表1)。
[0083]
结果表明，重组pedv
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s1抗原蛋白的中和抗体滴度平均为16.0(log2)，市售疫苗的中和抗体滴度为7.2(log2)，表明通过重组pedv
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s1抗原蛋白形成的中和抗体滴度高于市售疫苗。
[0084]
表1
[0085][0086]
由以上结果证实，本发明的重组ped病毒s1蛋白不仅在植物体内有效表达，而且水溶性高，因此蛋白易于分离和纯化，可作为体内抗原，从而显示出高免疫原性和病毒中和能力。因此，证实该蛋白质可用作新型ped疫苗组合物。
[0087]
以下对本发明的药物组合物和饲料组合物的制备实施例进行说明，但所提供的实施例仅用于具体说明本发明，并不用于限制本发明。
[0088]
制备例1.药物组合物的制备
[0089]
1.1.粉末的制备
[0090]
表2
[0091]
重组ped病毒s1蛋白20mg乳糖100mg滑石粉10mg
[0092]
通过混合上述组分并用该混合物填充密封袋来制备粉末。
[0093]
1.2.片剂的制备
[0094]
表3
[0095]
重组ped病毒s1蛋白10mg玉米淀粉100mg乳糖100mg硬脂酸镁2mg
[0096]
通过混合上述组分并根据制备片剂的常规方法混合该混合物来制备片剂。
[0097]
1.3胶囊的制备
[0098]
表4
[0099]
重组ped病毒s1蛋白10mg结晶纤维素3mg乳糖14.8mg硬脂酸镁0.2mg
[0100]
通过混合上述组分并根据制备胶囊的常规方法用混合物填充明胶胶囊来制备胶囊。
[0101]
1.4.注射剂的制备
[0102]
表5
[0103]
重组ped病毒s1蛋白10mg甘露醇180mg用于注射的无菌蒸馏水2,974mgna2hpo42h2o26mg
[0104]
根据制备注射剂的常规方法，以每安瓿(2ml)的上述组分含量制备注射剂。
[0105]
1.5.液体的制备
[0106]
表6
[0107]
重组ped病毒s1蛋白20mg异构化糖10g甘露醇5g纯净水q.s.
[0108]
将各组分加入纯净水中溶解，加入适量柠檬香精，并混合，加纯净水至总体积为100ml，然后将所得溶液倒入棕色瓶中，根据制备液体的常规方法对溶液进行消毒，制成液体。
[0109]
制备例2.饲料组合物的制备
[0110]
表7
[0111]
重组ped病毒s1蛋白100mg维他命e0.7mgl
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肉碱0.7mg
[0112]
饲料通过根据常规饲料制备方法混合上述组分来制备。
[0113]
本领域普通技术人员应当理解，本发明的以上描述是示例性的，并且本文所公开的示例性实施方式可以很容易地修改成其他特定形式，而不脱离本发明的技术精神或必要特征。因此，上述示例性实施方式应被解释为说明性的而在任何方面不是限制性的。
[0114]
工业实用性
[0115]
由于本发明的重组ped病毒s1蛋白可以在植物体内有效表达，并具有高水溶性，容易分离和纯化，并且还用作在体内显示出高免疫原性和病毒中和能力的抗原，因此可以预期在各种领域中使用。而且，由于在体内的显著免疫原性和病毒中和能力，所述蛋白质预期
被用作新颖的ped的疫苗组合物，并且因此在工业中可获得。