抗-CD45抗体药物缀合物(ADC)在细胞疗法中的用途的制作方法

抗
‑
cd45抗体药物缀合物(adc)在细胞疗法中的用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年1月7日提交的美国临时申请号62/789,462和于2019年5月9日提交的美国临时申请号62/845,829的优先权。每个优先权申请的内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明一般地涉及用于通过使用抗
‑
cd45抗体
‑
药物缀合物(adc)来在人受试者中促进表达嵌合抗原受体(car)的免疫细胞的接受的方法。
技术背景
4.嵌合抗原受体(car)疗法是一种免疫治疗，其使用来自患者或来自同种异体供体的淋巴细胞，被基因工程化以破坏表达与某种疾病(例如癌症)相关的特定抗原的细胞。在癌症中，例如，car疗法调动并且增强患者免疫系统攻击肿瘤的能力。在过去几年中，这种免疫疗法已成为一种有前途的突破性疗法。car疗法基于表达car的免疫细胞(例如t细胞)，car通常是一种跨膜融合蛋白，其结合了胞外抗原结合结构域(例如，scfv)以及向表面受体的细胞传导信号的细胞质活性信号传导和“共刺激”结构域。因此，当免疫细胞(例如t细胞)表达car时，免疫细胞能够识别并且杀伤表达由car的抗原结合结构域(例如，肿瘤相关抗原)靶向的抗原的细胞(geyer和brentjens(2016)cytotherapy 18(11):1393
–
1409)。
5.虽然car疗法是一项非常强大的技术，但是它确实伴随严重的潜在风险和不良副作用(kay和turtle(2017)drugs77(3):237
‑
245；hill等(2018)blood131:121
‑
130)。淋巴耗竭化疗通常与car疗法组合用作预处理治疗，以使接受治疗的患者对car表达细胞的排斥最小化(wei等(2017)exp hematol oncol.6:10)。例如，淋巴耗竭剂氟达拉滨和环磷酰胺的组合提高了受体患者中car
‑
t细胞的持续时间(turtle等(2016)j clinic invest126(6):2123；还参见us 20170368101)。虽然预处理疗法提高了car
‑
t细胞的功效，但是淋巴耗竭化疗通常产生严重的副作用。


技术实现要素：

6.本公开内容提供了一种可以与嵌合抗原受体(car)疗法一起使用以促进表达car的免疫细胞的接受的预处理方案。本文所述的方法可用于促进对自体的表达car的免疫细胞或同种异体的表达car的免疫细胞的接受。传统上，此类细胞的接受已经通过使用淋巴耗竭化疗治疗来实现。本文描述了用于在受体患者中促进car表达细胞的接受的改进方法。
7.在第一方面，本公开内容的特征在于一种用于在患有癌症或自身免疫病的人受试者中促进表达嵌合抗原受体(car)的免疫细胞的接受的方法，其通过(a)向患有癌症或自身免疫病的人受试者施用抗
‑
cd45抗体药物缀合物(adc)，其中所述抗
‑
cd45 adc包含通过接头与细胞毒素缀合的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段；以及(b)向所述人受试者施用治疗有效量的表达car的免疫细胞，其中所述car包含与细胞表面上表达的肿瘤抗原或细胞表面上
表达的与自身免疫病相关的抗原结合的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在一个实施方案中，在步骤(b)之前、同时或之后，所述人受试者未施用阿仑单抗。在另一个实施方案中，在步骤(b)之前、同时或之后，所述人受试者未施用淋巴耗竭化疗剂。在又另一些实施方案中，所述淋巴耗竭化疗剂是氟达拉滨、环磷酰胺、苯达莫司汀和/或喷司他丁。
8.在某些实施方案中，所述方法包括在步骤(b)之前向所述人受试者施用抗
‑
cd45 adc。
9.在另一些某些实施方案中，所述方法包括在步骤(b)前约12小时至约21天(例如，约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天或约21天)向人受试者施用抗
‑
cd45 adc。
10.在某些实施方案中，所述免疫细胞是同种异体细胞或自体细胞。在又另一个实施方案中，所述同种异体细胞是同种异体t细胞或同种异体nk细胞。
11.在某些实施方案中，表达car的同种异体细胞的治疗有效量为约1x104至约7.0x108细胞/kg(例如，约1x104至约1x108细胞/kg、约1x104至约1x107细胞/kg、约1x104至约1x106细胞/kg、约1x104至约1x105细胞/kg、约1x105至约1x108细胞/kg、约1x106至约1x108细胞/kg或约1x107至约1x108细胞/kg)。
12.在另一方面，本公开内容的特征在于一种用于治疗患有肿瘤的人患者的方法，其通过施用(i)抗
‑
cd45 adc，其中所述抗
‑
cd45 adc包含通过接头与细胞毒素缀合的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段，以及(ii)向人患者施用约1x106至约7x108基因工程化的car t细胞/kg(例如，约1x106至约2x106、约2x106至约3x106约、约3x106至约4x106、约4x106至约5x106、约5x106至约6x106、约6x106至约7x106、约7x106至约8x106、约8x106至约9x106、约9x106至约1x107、约1x107至约2x107、约2x107至约3x107、约3x107至约4x107、约4x107至约5x107、约5x107至约6x107、约6x107至约76x107、约8x107至约9x107、约9x107至约1x108、约1x106、约1x107或约1x108基因工程化的car t细胞/kg)的治疗有效量。在一个实施方案中，基因工程化的car t细胞的治疗有效量为约1x106或约2x106细胞/kg。在又另一个实施方案中，所述抗
‑
cd45 adc以单剂量或多剂量向患者施用。
13.在某些实施方案中，所述抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含分别具有如seq id no：1、2和3中所述的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3，并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含分别具有如seq id no：4、5和6中所述的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3。在另一个实施方案中，所述抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段是嵌合的或人源化的。在另一些实施方案中，所述抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段分别包含重链可变区，该重链可变区包含如seq id no：7中所述的氨基酸序列，并且轻链可变区，该轻链可变区包含如seq id no：8中所述的氨基酸序列。
14.在某些实施方案中，所述抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段是igg1同种型或igg4同种型。
15.在某些实施方案中，所述细胞毒素是抗有丝分裂剂、核糖体失活蛋白(rip)(例如，志贺氏毒素)或rna聚合酶抑制剂。在另一些实施方案中，实施rna聚合酶抑制剂是鹅膏蕈毒素。在另一个实施方案中，所述rna聚合酶抑制剂是鹅膏蕈碱。在另一个实施方案中，所述鹅
膏蕈碱选自α
‑
鹅膏蕈碱、β
‑
鹅膏蕈碱、γ
‑
鹅膏蕈碱、ε
‑
鹅膏蕈碱、鹅膏素、鹅膏素酰胺、鹅膏无毒环肽、鹅膏无毒环肽酸、前鹅膏无毒环肽及其衍生物。
16.在任何上述方面的一些实施方案中，所述细胞毒素是鹅膏蕈毒素，并且所述抗体或其抗原结合片段通过接头和化学部分与鹅膏蕈毒素缀合以形成由式ab
‑
zl
‑
am表示的adc，其中ab是抗体或其抗原结合片段，l是接头，z是化学部分，am是鹅膏蕈毒素。在一些实施方案中，鹅膏蕈毒素与接头缀合。在一些实施方案中，鹅膏蕈毒素
‑
接头缀合物am
‑
l
‑
z由式(i)表示：
[0017][0018]
其中r1是h、oh、or
a
或or
c
；
[0019]
r2是h、oh、or
b
或or
c
；
[0020]
r
a
和r
b
，当存在时，与它们所结合的氧原子一起，结合形成任选经取代的5元杂环烷基；
[0021]
r3是h、r
c
或r
d
；
[0022]
r4是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0023]
r5是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0024]
r6是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0025]
r7是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0026]
r8是oh、nh2、or
c
、or
d
、nhr
c
或nr
c
r
d
；
[0027]
r9是h、oh、or
c
或or
d
；
[0028]
x是
‑
s
‑
、
‑
s(o)
‑
或
‑
so2‑
；
[0029]
r
c
是
‑
l
‑
z；
[0030]
r
d
是任选经取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)、任选经取代的杂烷基(例如，c1‑
c6杂烷基)、任选经取代的烯基(例如，c2‑
c6烯基)、任选经取代的杂烯基(例如，c2‑
c6杂烯基)、任选经取代的炔基(例如，c2‑
c6炔基)、任选经取代的杂炔基(例如，c2‑
c6杂炔基)、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的芳基或任选经取代的杂芳基；
[0031]
l是接头，例如任选经取代的亚烷基(例如，c1‑
c6亚烷基)；任选经取代的杂亚烷基(c1‑
c6杂亚烷基)；任选经取代的亚烯基(例如，c2‑
c6亚烯基)；任选经取代的杂亚烯基(例如，c2‑
c6杂亚烯基)；任选经取代的亚炔基(例如，c2‑
c6亚炔基)；任选经取代的杂亚炔基(例如，c2‑
c6杂亚炔基)；任选经取代的环亚烷基；任选经取代的杂环亚烷基；任选经取代的亚芳
基；任选经取代的杂亚芳基；肽(例如，二肽)；
‑
(c＝o)
‑
；二硫化物；腙；
‑
(ch2ch2o)
p
‑
基团，其中p为1
‑
6的整数；((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
–
基团，其中n和每个m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；及其组合；并且
[0032]
z是由l上存在的反应性取代基z'与结合cd45的抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基之间的缀合反应形成的化学部分。
[0033]
在又另一个实施方案中，所述抗有丝分裂剂是美登素或澳瑞他汀。在另一些实施方案中，所述澳瑞他汀是单甲基澳瑞他汀f(mmaf)或单甲基澳瑞他汀e(mmae)。在又另一个实施方案中，所述抗有丝分裂剂是吡咯并苯二氮卓(pbd)或卡奇霉素。
[0034]
在某些实施方案中，所述adc的接头，与反应性取代基z'一起，是n
‑
β
‑
马来酰亚胺丙基
‑
val
‑
ala
‑
对氨基苄基(bmp
‑
val
‑
ala
‑
pab)。
[0035]
在某些实施方案中，所述adc的血清半衰期为3天或更短。
[0036]
在某些实施方案中，所述car的胞外结构域包含scfv抗体或单链t细胞受体(sctcr)。
[0037]
在某些实施方案中，所述胞外结构域包含非免疫球蛋白支架蛋白。
[0038]
在某些实施方案中，所述肿瘤抗原是选自以下项的抗原：cd19、cd22、cd30、cd7、bcma、cd137、cd22、cd20、afp、gpc3、muc1、间皮素、cd38、pd1、egfr(例如，egfrviii)、mg7、bcma、taci、cea、psca、cea、her2、muc1、cd33、ror2、nkr
‑
2、psca、cd28、taa、nkg2d或cd123。
[0039]
在某些实施方案中，所述car的胞质结构域包含cd28细胞质信号传导结构域、cd3ζ细胞质信号传导结构域、ox40细胞质信号传导结构域和/或cd137(4
‑
1bb)胞质信号传导结构域。
[0040]
在某些实施方案中，所述car的胞质结构域包含cd3ζ细胞质信号传导结构域。
[0041]
在一个实施方案中，在car疗法之前以治疗有效量向所述受试者施用所述抗
‑
cd45 adc，使得在所述患者中维持造血干细胞(hsc)水平同时淋巴细胞被耗竭。在一个实施方案中，所述受试者中hsc的水平是所述受试者在抗
‑
cd45 adc治疗之前的hsc水平的70％或更高。在一个实施方案中，所述受试者中hsc的水平是所述受试者在抗
‑
cd45 adc治疗之前的hsc水平的80％或更高。在一个实施方案中，所述受试者中hsc的水平是所述受试者在抗
‑
cd45 adc治疗之前的hsc水平的90％或更高。
[0042]
在某些实施方案中，患有癌症的人受试者患有选自以下项的癌症：白血病、成人晚期癌症、胰腺癌、不可切除性胰腺癌、结肠直肠癌、转移性结肠直肠癌、卵巢癌、三阴性乳腺癌、造血/淋巴癌、结肠癌肝转移、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、b细胞淋巴瘤、复发性或难治性b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、复发性或难治性弥漫性大细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤、复发性纵隔、难治性纵隔大b细胞淋巴瘤、大b细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、复发性或难治性非霍奇金淋巴瘤、难治性侵袭性非霍奇金淋巴瘤、b细胞非霍奇金淋巴瘤、难治性非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、胃癌、胰腺癌，三阴性浸润性乳腺癌、肾细胞癌、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌、膀胱上皮癌、白血病、b细胞白血病、b细胞急性淋巴细胞白血病、b细胞急性淋巴母细胞白血病、成人急性淋巴母细胞白血病、b细胞幼淋巴细胞白血病、儿童急性淋巴母细胞白血病、难治性儿童急性淋巴母细胞白血病、急性白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、复发性浆细胞骨髓瘤、难治性
浆细胞骨髓瘤、多发性骨髓瘤、复发性或难治性多发性骨髓瘤、骨多发性骨髓瘤、脑恶性胶质瘤、骨髓增生异常综合征、egfr阳性结肠直肠癌、多形性胶质母细胞瘤、肿瘤、母细胞浆细胞样树突状细胞肿瘤、肝转移、实体瘤、晚期实体瘤、间皮素阳性肿瘤、血液恶性肿瘤及其他晚期恶性肿瘤。
[0043]
在任何上述方面的某些实施方案中，所述抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段包含如下表4中所述的cdr(即cdr
‑
h1、cdr
‑
h2、cdr
‑
h3、cdr
‑
l1、cdr
‑
l2、和cdr
‑
l3区)的组合。在某些实施方案中，所述抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段包含如下表4中所述的重链可变区和轻链可变区的组合。
[0044]
在任何上述方面的某些实施方案中，以治疗有效量向受试者施用抗
‑
cd45adc，使得在所述患者中维持造血干细胞(hsc)水平。在一个实施方案中，所述受试者中hsc的水平是所述受试者在抗
‑
cd45 adc治疗之前的hsc水平的70％或更高。在一个实施方案中，所述受试者中hsc的水平是所述受试者在抗
‑
cd45 adc治疗之前的hsc水平的70％或更高。在一个实施方案中，所述受试者中hsc的水平是所述受试者在抗
‑
cd45 adc治疗之前的hsc水平的70％或更高。
[0045]
在任何上述方面的某些实施方案中，所述抗
‑
cd45 adc治疗与t细胞耗竭疗法组合施用。在一个实施方案中，在施用所述抗
‑
cd45 adc治疗之前、同时或之后施用t细胞耗竭疗法。在一个实施方案中，所述t细胞耗竭疗法包括与在人t细胞的细胞表面上表达的抗原结合的药剂。在一个实施方案中，所述t细胞耗竭疗法包括与在活化的人t细胞的细胞表面上表达的抗原结合的药剂。在一个实施方案中，所述t细胞耗竭疗法包括抗
‑
cd4抗体。在一个实施方案中，所述t细胞耗竭疗法包括抗
‑
cd8抗体。在一个实施方案中，所述t细胞耗竭疗法包括抗
‑
cd137抗体。
[0046]
在一个实施方案中，所述t细胞耗竭疗法包括抗
‑
cd52抗体。在一个实施方案中，所述t细胞耗竭疗法包括抗
‑
cd4抗体、抗
‑
cd8抗体、抗
‑
cd137抗体和/或抗
‑
cd52抗体。在一个实施方案中，所述抗
‑
cd52抗体是阿仑单抗。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
[0047]
在一个实施方案中，所述t细胞耗竭疗法包括抗胸腺细胞球蛋白(atg)。在一个实施方案中，所述atg是兔atg(ratg)。在一个实施方案中，所述atg是马atg(eatg)。
[0048]
在一个实施方案中，所述t细胞耗竭疗法包括全身照射(tbi)。
[0049]
在一个实施方案中，施用淋巴耗竭量的所述抗
‑
cd45 adc。
[0050]
在一个实施方案中，在施用表达car的免疫细胞之后，所述人受试者未发展中性粒细胞减少症。在某些实施方案中，中性粒细胞减少症被定义为绝对嗜中性粒细胞计数(anc)小于约1500/微升(例如，小于约1500/μl、小于约1400/μl、小于约1300/μl、小于约1200/μl、小于约1100/μl、小于约1000/μl、小于约900/μl、小于约800/μl、小于约700/μl或小于约600/μl)的人患者。
[0051]
在一个实施方案中，在施用表达car的免疫细胞之后，人受试者未发展严重的中性粒细胞减少症。在某些实施方案中，严重的中性粒细胞减少被定义为anc小于约500/μl(例如，小于约500/μl、小于约450/μl、小于约400/μl、小于约350/μl、小于约小于约300/μl、小于约250/μl、小于约200/μl、小于约150/μl或小于约100/μl)。
[0052]
在一个实施方案中，施用抗
‑
cd45 adc有效增加人受试者中一种或更多种car
‑
t移植细胞因子的水平。在某些实施方案中，car
‑
t移植细胞因子是il
‑
15或il
‑
7。
[0053]
在一个实施方案中，施用抗
‑
cd45 adc施用基本上不增加人受试者中一种或更多种细胞因子释放综合征(crs)
‑
细胞因子的水平。在某些实施方案中，一种或更多种crs
‑
细胞因子是ifnγ、il
‑
10、il
‑
6、il
‑
8、mip
‑
1α、mip
‑
1β或il
‑
10。
附图说明
[0054]
图1a和1b通过图表描绘了使用抗
‑
cd45 adc和同种型adc对照的细胞杀伤测定的结果。图1a通过图表描绘了人pbmc杀伤测定的结果，其中pbmc活力被测量为在抗
‑
cd45
‑
鹅膏蕈毒素adc(“cd45
‑
am”)或同种型
‑
鹅膏蕈毒素adc对照(同种型
‑
am)存在下活细胞的百分比(y轴)作为抗
‑
cd45
‑‑
鹅膏蕈毒素adc或对照浓度(x轴)的函数。两种adc的dar均为2。图1b通过图表描绘了体外细胞杀伤测定的结果，该测定测量活人骨髓cd34+细胞及其在抗
‑
cd45
‑
鹅膏蕈毒素adc(“cd45
‑
am”)或同种型
‑
鹅膏蕈毒素adc对照(同种型
‑
am)存在下的活力。两种adc的dar均为2。
[0055]
图2a和2b通过图表描绘了使用抗
‑
cd45 adc的体外细胞杀伤测定的结果。图2a通过图表描绘了体外细胞杀伤测定的结果，其示出了通过celltiter glo(ctg)测定确定的人pbmc活力(与抗
‑
cd45
‑
鹅膏蕈毒素adc(“cd45
‑
am”)或同种型
‑
鹅膏蕈毒素adc对照(同种型
‑
am)孵育4天后在发光(rlu)中测量的(y轴)。两种adc的dar均为2。图2b通过图表描绘了体外细胞杀伤测定的结果，该测定测量活人骨髓cd90+cd34+细胞及其在抗
‑
cd45
‑
鹅膏蕈毒素adc(“cd45
‑
am”)或同种型
‑
鹅膏蕈毒素adc对照(同种型
‑
am)存在下的活力。两种adc的dar均为2。
[0056]
图3提供了多种细胞亚群上cd45表达的facs图谱。
[0057]
图4通过图表描绘了检测淋巴细胞计数(103/μl)的测定的结果，作为adc 1(0.3mg/kg)相对于对照(即pbs)的初始剂量施用后天数的函数。
[0058]
图5通过图表描绘了检测中性粒细胞计数(103/μl)的测定的结果，作为adc 1(0.3mg/kg)相对于对照(即pbs)的初始剂量施用后天数的函数。
[0059]
图6通过图表描绘了测量adc 1的平均血浆浓度的测定的结果，作为adc 1(0.3mg/kg)剂量施用后小时数的函数。
[0060]
图7a
‑
7c通过图表描绘了检测血浆丙氨酸氨基转移酶(alt；以u/l计)(图7a)、总胆红素水平(mg/dl)(图7b)和血小板计数(103/μl)(图7c)的测定结果，作为adc 1(0.3mg/kg)相对于对照(pbs)施用后小时数的函数。
[0061]
图8a和8b通过图表描绘了测量il
‑
15(pg/ml)(图8a)和il
‑
7(pg/ml)(图8b)水平的测定的结果，作为adc 1后小时数的函数。
[0062]
图9通过图表描绘了在adc 1后72小时测量某些crs细胞因子(x轴)的血浆浓度(pg/ml；y轴)的测定的结果。
[0063]
图10通过图表描绘了测量骨髓(bm)预处理效率的测定的结果。
[0064]
图11通过图表描绘了在3周时确定供体嵌合现象的测定的结果。
[0065]
图12a
‑
12c通过图表描绘了体内淋巴耗竭测定的结果，其测量在施用指定剂量的抗
‑
cd45 adc(“cd45
‑
am”，包括两种鹅膏蕈毒素中的一种，注释为鹅膏蕈毒素“a”或“b”)或同种型
‑
adc(“同种型
‑
am”，包括鹅膏蕈毒素“a”)后14天在hnsg小鼠中t细胞耗竭(图12a)、b细胞耗竭(图12b)和骨髓细胞耗竭(图12c)的水平。
[0066]
图13a和13b通过图表描绘了体内耗竭测定的结果，其测量在施用指定剂量的抗
‑
cd45 adc(“cd45
‑
am”，包含两种鹅膏蕈毒素中的一种，注释为鹅膏蕈毒素“a”或“b”)或同种型
‑
adc(“同种型
‑
am”，包含鹅膏蕈毒素“a”)后14天在hnsg小鼠骨髓中t细胞(图13a)和hsc(图13b)的数量。
具体实施方式
[0067]
本公开内容提供了用于通过向接受car疗法的患者施用抗
‑
cd45抗体药物缀合物(adc)来在接受car疗法的患者中促进表达嵌合抗原受体(car)的免疫细胞(自体或同种异体的)的接受的方法。本文公开的方法可用于提高对自体或同种异体免疫细胞(例如，t细胞)的接受，而不依赖(或可替代地减少使用)通常用作预处理疗法以减少对表达car的免疫细胞的排斥的淋巴耗竭化疗。
[0068]
i.定义
[0069]
如本文所用，术语“约”是指高于或低于所述值5％以内的值。
[0070]
如本文所用，术语“同种异体的”，当在移植的上下文中使用时，用于定义从供体移植到相同物种但不是同一受试者的受体的细胞(或组织或器官)。
[0071]
如本文所用，术语“自体的”是指其中供体和受体是同一受试者的细胞或移植物。
[0072]
如本文所用，术语“异种的”是指其中供体和受体物种不同的细胞。
[0073]
如本文所用，术语“免疫细胞”旨在包括但不限于造血来源并在免疫反应中起作用的细胞。免疫细胞包括但不限于t细胞和自然杀伤(nk)细胞。自然杀伤细胞是本领域众所周知的。在一个实施方案中，自然杀伤细胞包括细胞系，例如nk
‑
92细胞。nk细胞系的另外实例包括nkg、yt、nk
‑
ys、hank
‑
1、yts细胞和nkl细胞。免疫细胞可以是同种异体的或自体的。在一个实施方案中，免疫细胞是t细胞。
[0074]“基因工程化的细胞”意指通过添加或修饰基因、dna或rna序列、或蛋白质或多肽而被修饰、转化或操纵的任何生物体的任何细胞。本公开内容的分离的细胞、宿主细胞和基因工程化的细胞包括分离的免疫细胞，例如含有编码car的dna或rna序列并且在细胞表面上表达car的nk细胞和t细胞。分离的宿主细胞和基因工程化的细胞可用于例如增强nk细胞活性或t淋巴细胞活性、癌症治疗和自身免疫病治疗。在一个实施方案中，基因工程化的细胞包括免疫细胞，例如t细胞或自然杀伤细胞(nk细胞)。表达嵌合抗原受体(car)的细胞是基因工程化的细胞的实例。
[0075]
如本文所用，术语“抗体”是指与特定抗原特异性结合或免疫反应的免疫球蛋白分子。抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、异源缀合的抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体和四特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体)和抗体片段(即抗体的抗原结合片段)，包括例如fab’、f(ab’)2、fab、fv、rlgg和scfv片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
[0076]
本公开内容的抗体通常是分离的或重组的。“分离的”，当在本文中使用时，是指多肽，例如抗体，其已经从表达它的细胞或细胞培养物中鉴定、分离和/或回收。通常，分离的抗体通过至少一个纯化步骤制备。因此，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，特异性结合cd45的分离抗体基本上不含特异性结合除cd45之外抗原的抗体。
[0077]
通常，抗体包括含有抗原结合区的两条重链和两条轻链。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为hcvr或vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区域可以进一步细分为高度可变区，称为互补性决定区(cdr)，其被那些更保守的称为框架结构区(fr)的区域分隔开。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序设置：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区各自包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq)。
[0078]
如本文所用，术语“互补性决定区”(cdr)是指在抗体的轻链和重链可变结构域中发现的高度可变区。
[0079]
可变结构域中更高度保守的部分被称为框架区(fr)。根据上下文和本领域已知的各种定义，描述抗体高度可变区的氨基酸位置可以变化。可变结构域内的一些位置可以被视为杂交高度可变位置，因为在一组标准下这些位置可以被认为是在高度可变区内，而在另一组标准下被认为是在高度可变区外。这些位置中的一个或更多个也可以在扩展的高度可变区中发现。本文所述的抗体可以在这些杂交高度可变位置包含修饰。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个框架区，主要采用β
‑
折叠构型，由三个cdr连接，形成连接β
‑
折叠结构的环，并且在一些情况下，形成β
‑
折叠结构的一部分。每个链中cdr由fr1
‑
cdr1
‑
fr2
‑
cdr2
‑
fr3
‑
cdr3
‑
fr4顺序的框架区紧密保持在一起，并且与来自其他抗体链的cdr一起，有助于抗体的靶结合位点的形成(参见kabat等,sequences of proteins of immunological interest,national institute of health,bethesda,md.,1987)。在某些实施方案中，除非另有说明，否则免疫球蛋白氨基酸残基的编号是根据kabat等的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行的，(尽管可以使用任何抗体编号方案，包括但不限于imgt和chothia)。
[0080]
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体的一个或更多个保持特异性结合靶抗原的能力的部分。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段实现。抗体片段可以是例如fab、f(ab’)2、scfv、双抗体、三抗体、抗体结合体、纳米体、适体或结构域抗体。术语抗体的“抗原结合片段”涵盖的结合片段的实例包括但不限于:(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，在铰链区含有通过二硫键连接两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(v)包括vh和vl结构域的dab；(vi)由vh结构域组成的dab片段(参见例如，ward等,nature 341:544
‑
546,1989)；(vii)由vh或vl结构域组成的dab；(viii)分离的互补性决定区(cdr)；和(ix)两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)分离的cdr的组合，其可以任选地通过合成接头连接。此外，虽然fv片段的两个结构域，vl和vh，是由独立的基因编码的，但是它们可以使用重组方法通过使它们成为单个蛋白质链的接头连接，其中vl和vh区域配对形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如，bird等,science 242:423
‑
426,1988和huston等,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879
‑
5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整的抗体相同的方式筛选片段的实用性。抗原结合片段可以通过重组dna技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生，或者在某些情况下，通过本领域已知的化学肽合成程序产生。在一个实施方案中，抗体的抗原结
合片段包含fc区。
[0081]
如本文所用，术语“双抗体”是指包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过接头连接v
h
和v
l
结构域，该接头太短(例如，由五个氨基酸组成的接头)以致不能允许用于v
h
和v
l
结构域在同一肽链上的分子内关联。该构型迫使每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对以形成同源二聚体结构。因此，术语“三抗体”是指含有三条肽链的三价抗体，每条肽链含有通过接头连接的一个v
h
结构域和一个v
l
结构域，该接头极其短(例如，由1
‑
2个氨基酸组成的接头)以致不能允许v
h
和v
l
结构域在同一肽链内的分子内关联。为了折叠成它们的天然结构，以这种方式配置的肽通常三聚化以便将相邻肽链的v
h
和v
l
结构域定位在空间上彼此接近(参见，例如，holliger等,proc.natl.acad.sci.usa 90:6444
‑
48,1993)。
[0082]
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指例如单克隆抗体，例如脱免疫的或人源化的抗体，其能够结合至少两种不同的抗原或两种不同的表位(它们可以是相同或不同抗原上的)。例如，一种结合特异性可以针对造血干细胞表面抗原(例如cd45)上的表位，并且另一种可以特异性结合不同细胞表面抗原或另一种细胞表面蛋白上的表位，例如参与增强细胞生长的信号转导途径的受体或受体亚基等。在一些实施方案中，结合特异性可以针对相同靶抗原上独特的非重叠的表位(即双特异性抗体)。
[0083]
如本文所用，“完整”或“全长”抗体是指具有通过二硫键相互连接的两个重链(h)多肽和两个轻链(l)多肽的抗体。每个重链由重链可变区(在本文中缩写为hcvr或vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区域可以进一步细分为高度可变区，称为互补性决定区，其被那些更加保守的称为框架结构区(fr)的区域分隔开。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序设置：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
[0084]
还提供了本文所述的seq id no中所述的序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码的或含有该氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。此类保守序列修饰包括保守核苷酸和氨基酸取代，以及核苷酸和氨基酸添加和缺失。例如，可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和pcr介导的诱变，将修饰引入本文所述的seq id no。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β
‑
支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗
‑
cd45抗体中预测的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替换。用于鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域众所周知的(参见，例如，brummell等,biochem.32:1180
‑
1187(1993)；kobayashi等protein eng.12(10):879
‑
884(1999)；和burks等proc.natl.acad.sci.usa 94:412
‑
417(1997))。
[0085]
如本文所用，术语“抗
‑
cd45抗体”或“结合cd45的抗体”或“抗
‑
cd45adc”或“结合cd45的adc”是指特异性结合人cd45的抗体或adc。cd45发现在细胞(例如淋巴细胞)的细胞表面上。抗
‑
cd45抗体(或抗
‑
cd45 adc)的人cd45的氨基酸序列。
[0086]
如本文所用，术语“特异性结合”是指抗体(或adc)识别和结合特定蛋白质结构(表位)而不是一般的蛋白质的能力。如果抗体对表位“a”具有特异性，则在含有经标记的“a”和抗体的反应中，含有表位a(或游离的、未经标记的a)的分子的存在减少与抗体结合的经标记的a的量。通过示例的方式，如果抗体在被标记时可以被相应的未经标记抗体竞争离开其靶标，则抗体“特异性结合”靶标。在一个实施方案中，抗体特异性结合靶标，例如cd45，如果该抗体对靶的解离常数(k
d
)为至少约10
‑4m或更小、约10
‑5m或更小、约10
‑6m或更小、约10
‑7m或更小、约10
‑8m或更小、约10
‑9m或更小、约10
‑
10
m或更小、约10
‑
11
m或更小、约10
‑
12
m或更小(更小意指小于10
‑
12
的数，例如10
‑
13
)。在一个实施方案中，如本文所用，术语“特异性结合cd45”或“特异性结合cd45”是指抗体或结合cd45并且具有1.0x10
‑7m或更小的解离常数(k
d
)，如通过表面等离子共振确定的。在一个实施方案中，根据标准生物层干涉测量法(bli)确定k
d
。然而，应理解，抗体可能能够特异性结合两种或更多种序列相关的抗原。例如，在一个实施方案中，抗体可以特异性结合cd45的人和非人(例如，小鼠或非人灵长类)直系同源物。
[0087]
在一些实施方案中，抗
‑
cd45抗体能够特异性结合人cd45的各种同种型(例如，cd45ra(uniprot登录号：p08575
‑
8；seq id no：20)、cd45ro(ncbi登录号：np_563578.2；seq id no：21)、cd45rb(ncbi登录号：xp_006711537.1；seq id no：22)、cd45rab(ncbi登录号：xp_006711535.1；seq id no：23)、cd45rbc(ncbi登录号：xp_006711536.1；seq id no：24)和cd45rbc(ncbi登录号np_002829.3；seq id no：25))中每一种的胞外结构域。因此，在某些实施方案中，本文中的抗体是泛特异性抗
‑
cd45抗体(即，与所有六种人cd45同种型的胞外区特异性结合的抗体)。
[0088]
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指通过本领域可用或已知的任何方式的源自单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体。用于本公开内容的单克隆抗体可以使用本领域已知的各种各样技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。除非另有说明，否则术语“单克隆抗体”(mab)意指包括能够与靶蛋白特异性结合的完整分子以及抗体片段(包括，例如，fab和f(ab')2片段)。
[0089]
如本文所用，术语“嵌合”抗体是指具有源自非人免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和人免疫球蛋白恒定区(通常选自人免疫球蛋白模板)的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如morrison,1985,science 229(4719):1202
‑
7；oi等,1986,biotechniques 4:214
‑
221；gillies等,1985,j.immunol.methods 125:191
‑
202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397。
[0090]
如本文所用，“药物
‑
抗体比”或“dar”是指与抗体缀合的细胞毒素(例如，鹅膏蕈毒素)的平均数。通常，adc的dar的范围为约1至约8，尽管根据抗体上连接位点的数量，更高的负载也是可能的，但是。因此，在某些实施方案中，本文所述的抗
‑
cd45 adc的dar为1、2、3、4、5、6、7或8。
[0091]
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白。通常，人源化抗体包含基本上所有的至少一个(通常两个)可变结构域，其中所有
或基本上所有的cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的fr区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白共有序列的至少一部分。抗体人源化的方法是本领域已知的。参见例如，riechmann等,1988,nature 332:323
‑
7；queen等的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370；ep239400；pct公开wo 91/09967；美国专利号5,225,539；ep592106；ep519596；padlan,1991,mol.immunol.,28:489
‑
498；studnicka等,1994,prot.eng.7:805
‑
814；roguska等,1994,proc.natl.acad.sci.91:969
‑
973；和美国专利号5,565,332。
[0092]
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”是指包含至少能够特异性结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域的重组多肽。通常，car是一种基因工程化的受体，其将免疫效应细胞的细胞毒性重定向至呈递给定抗原的细胞。car是这样的分子：将基于抗体的对期望抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性与t细胞受体活化细胞内结构域组合以生成嵌合蛋白，该嵌合蛋白表现出特定的细胞免疫活性。在一些特定的实施方案中，car包含胞外结构域(也被称为结合结构域或抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域和胞内(胞质)信号传导结构域。car的抗原结合结构域与靶细胞表面上的靶抗原的结合导致car聚集并且向含car的细胞提供活化刺激。car的主要特征是其重定向免疫效应细胞特异性的能力，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或分子产生，这些分子可以利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力，以主要组织相容性(mhc)独立的方式介导表达靶抗原的细胞的细胞死亡。在各种实施方案中，car包含特异性结合人cd45的胞外结合结构域；跨膜结构域；和一个或更多个胞内信号传导结构域。
[0093]
如本文所用，术语“car疗法”是指向人受试者施用已经基因工程化以表达car的免疫细胞用以治疗给定疾病，例如癌症或自身免疫病。car疗法是指使用基因工程化的免疫细胞对患者进行特定治疗，并且不旨在包括通常与car细胞治疗(例如，淋巴耗竭化疗)结合使用的疗法。值得注意的是，在通篇使用术语“细胞”的情况下，除非另有说明，否则该术语也包括细胞群。例如，由于car疗法需要施用基因工程化的细胞群。
[0094]
如本文所用，术语“组合”或“组合疗法”是指在单个人患者中使用两种(或更多种)疗法。这些术语不旨在是指组合组合物。例如，本文描述了组合疗法，包括施用抗
‑
cd45 adc和car疗法。
[0095]
术语“预处理(conditioning)”是指为需要car疗法的患者准备适合的条件。本文所用的预处理包括但不限于在t细胞疗法之前减少内源性淋巴细胞的数量、去除细胞因子汇、增加一种或更多种稳态细胞因子或促炎因子的血清水平、增强在预处理之后施用的t细胞的效应子功能、增强抗原呈递细胞活化和/或可用性或其任何组合。
[0096]
在抗
‑
cd45抗体或adc对cd45表达细胞的影响的上下文中，术语“耗竭”是指cd45表达细胞数量的减少或消除。
[0097]
短语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”在本文中可互换使用，是指治疗剂(例如抗
‑
cd45 adc)的量或剂量，其在向患者施用单剂量或多剂量提供期望的治疗时，足以达到期望的结果或对自身免疫病或癌症产生影响。治疗剂的“治疗有效量”可以根据因素(例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重)而变化，使得该量能够在个体中引起期望的反应。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。当指示治疗量时，本发明的组合物的
要施用的精确量可以由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)状况的个体差异来确定。在一个实施方案中，抗
‑
cd45 adc的治疗有效量是淋巴耗竭剂量。
[0098]
如本文所用，词语“淋巴耗竭剂量”是指治疗剂(例如抗
‑
cd45抗体或抗
‑
cd45 adc)的有效耗竭受试者中的淋巴细胞而基本上不耗竭受试者中的造血干细胞(hsc)的量。
[0099]
如本文所用，术语“半衰期”是指在受试者(例如，人受试者)中身体中的抗体药物的血浆浓度降低一半或50％所需的时间。该血清浓度降低50％反映了药物循环的量。
[0100]
如本文所用，术语“fc”、“fc区”、“fc结构域”和“igg fc结构域”是指免疫球蛋白的部分，例如igg分子，其与通过木瓜蛋白酶消化igg分子获得的可结晶片段相关。fc区包含通过二硫键连接的两条igg分子重链的c末端半部分。它没有抗原结合活性，但是含有碳水化合物部分和补体及fc受体(包括fcrn受体)的结合位点(参见下文)。例如，fc结构域包含第二恒定结构域ch2(例如，人igg1的eu位置231
‑
340处的残基)和第三恒定结构域ch3(例如，人igg1的eu位置341
‑
447处的残基)。如本文所用，fc结构域包含“下铰链区”(例如，igg1的eu位置233
‑
239处的残基)。
[0101]
fc可以单独是指该区域，或者在抗体、抗体片段或fc融合蛋白的上下文中是指该区域。已经在fc结构域的多个位置处观察到多态性，包括但不限于eu位置270、272、312、315、356和358，并且因此在本技术中呈现的序列与本领域已知的序列之间可能存在微小差异。因此，“野生型igg fc结构域”或“wt igg fc结构域”是指任何天然存在的igg fc区(即任何等位基因)。人igg1、igg2、igg3和igg4的重链序列可以在许多序列数据库中发现，例如，在uniprot数据库(www.uniprot.org)中分别在登录号p01857
[0102]
(ighg1_human)、p01859(ighg2_human)、p01860(ighg3_human)、和p01861(ighg1_human)下。
[0103]
如本文所用，术语“经修饰的fc区”或“变体fc区”是指包含一个或更多个在fc区内任何位置处引入的氨基酸取代、缺失、插入或修饰的igg fc区。在某些方面，与不包含一个或更多个氨基酸取代的野生型fc结构域相比，变体igg fc结构域包含一个或更多个氨基酸取代，导致对fcγr和/或c1q的结合亲和力降低或消失。此外，fc结合相互作用是多种效应子功能和下游信号传导事件必不可少的，包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)。因此，在某些方面，相对于具有相同氨基酸序列但不包含一个或更多个氨基酸取代、缺失、插入或修饰的相应抗体，例如如在fc区的相应位置处包含天然存在的氨基酸残基的未经修饰的fc区，包含变体fc结构域(例如抗体、融合蛋白或缀合物)的抗体可以对至少一种或更多种fc配体(例如fcγr)表现出改变的结合亲和力。
[0104]
变体fc结构域是根据组成它们的氨基酸修饰定义的。对于本文讨论的所有关于fc区的氨基酸取代，编号总是根据如kabat中的eu索引。因此，例如，d265c是一种fc变体，相对于亲本fc结构域，其在eu位置265处的天冬氨酸(d)被半胱氨酸(c)取代。同样，例如d265c/l234a/l235a定义了一种变体fc变型，相对于亲本fc结构域，其在eu位置265(d至c)、234(l至a)和235(l至a)处具有取代。变体也可以根据其在突变的eu氨基酸位置的最终氨基酸组成来指定。例如，l234a、l235a突变体可以被称为“lala”。作为另一个实例，e233p.l234v.l235a.delg236(缺失236)突变体可以被称为“eplvladelg”。作为又一个实例，i253a.h310a.h435a突变体可以被称为“ihh”。注意的是，取代提供的顺序是任意的。
[0105]
如本文所用，术语“fcγ受体”或“fcγr”是指结合igg抗体fc区并且由fcγr基因
编码的蛋白质家族的任何成员。在人中，该家族包括但不限于fcγri(cd64)，包括同种型fcγria、fcγrib和fcγric；fcγrii(cd32)，包括同种型fcγriia(包括同种异型h131和r131)、fcγriib(包括fcγriib
‑
1和fcγriib
‑
2)和fcγriic；和fcγriii(cd16)，包括同种型fcγriiia(包括同种异型v158和f158)和fcγriiib(包括同种异型fcγriiib
‑
na1和fcγriiib
‑
na2)，以及任何未发现的人fcγrs或fcγr同种型或同种异型。fcγr可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠fcγrs包括但不限于fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)和fcγriii
‑
2(cd16
‑
2)以及任何未发现的小鼠fcγrs或fcγr同种型或同种异型。
[0106]
如本文所用，术语“效应子功能”是指fc结构域与fc受体相互作用产生的生化事件。效应子功能包括但不限于adcc、adcp和cdc。如本文所用，“效应细胞”意指免疫系统中表达一种或更多种fc受体并且介导一种或更多种效应子功能的细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、b细胞、大颗粒淋巴细胞、langerhan细胞、自然杀伤(nk)细胞和γδt细胞，并且可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
[0107]
如本文所用，术语“沉默的(“silent”、“silenced”或“silencing”)”是指具有本文所述的经修饰的fc区的抗体，相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体与fcγr的结合，其与fcγ受体(fcγr)的结合降低(例如，如通过例如bli测量的，相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体与fcγr的结合，与fcγr的结合降低至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)。在一些实施方案中，fc沉默的抗体没有可检测的与fcγr的结合。具有经修饰的fc区的抗体与fcγr的结合可以使用本领域已知的各种技术确定，例如但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(elisa)；kinexa,rathanaswami等analytical biochemistry,第373:52
‑
60卷,2008；或放射免疫测定(ria))，或通过表面等离子体共振测定或其他机制的基于动力学的测定(例如，biacore
tm
分析或octet
tm
分析(fortebio))以及其他方法，例如间接结合测定、竞争性结合测定、荧光共振能量转移(fret)、凝胶电泳和色谱法(例如凝胶过滤)。这些方法和其他方法可以利用被检查的一种或更多种组分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。关于结合亲和力和动力学的详细描述可以在paul,w.e.,编辑,fundamental immunology,第4版,lippincott
‑
raven,philadelphia(1999)(其集中于抗体
‑
免疫原的相互作用)中发现。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，包括在递增量的未经标记的抗原的存在下，将经标记的抗原与目标抗体一起孵育，并且检测与经标记的抗原结合的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和力和结合偏离率可以通过scatchard图分析从数据中确定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫测定来确定。在这种情况下，在递增量的未经标记的第二抗体的存在下，将抗原用与标记化合物缀合的目标抗体一起孵育。
[0108]
如本文所用，术语“包含未经修饰的fc区的相同抗体”是指这样的抗体，缺乏所述氨基酸取代(例如d265c、l234a、l235a和/或h435a)，但除此之外，具有与其进行比较的fc修饰抗体相同的氨基酸序列。
[0109]
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指接受本文所述的特定疾病或病症治疗的生物体，例如人。
[0110]
如本文所用，术语“内源性”描述在特定生物体(例如人患者)中天然存在的物质，
例如分子、细胞、组织或器官(例如，cd45+免疫细胞，例如内源性淋巴细胞)。
[0111]
如本文所用，术语“样品”是指取自受试者的样本(例如，血液、血液组分(例如，血清或血浆)、尿、唾液、羊水、脑脊液、组织(例如，胎盘或皮肤)、胰液、绒膜绒毛取样和细胞)。
[0112]
如本文所用，词语“基本上从血液中清除”是指当从患者分离的血液样品中的治疗剂的浓度是这样的使得治疗剂不可通过常规方式检测(例如，使得在用于检测治疗剂的装置或测定的噪声阈值之上，治疗剂不可检测)时，向患者施用治疗剂(例如，抗cd117抗体或其抗原结合片段)后的时间点。本领域已知的多种技术可用于检测抗体、抗体片段和蛋白质配体，例如本领域已知或本文所述的基于elisa的检测测定。可用于检测抗体或抗体片段的另外的测定包括免疫沉淀技术和免疫印迹测定以及本领域已知的其他测定。
[0113]
如本文所用，“治疗(treat或treatment)”是指疾病的任何后果的任何改善，例如延长的存活期、较低的发病率和/或作为替代治疗方式的副产物的副作用的减轻；如本领域中容易理解的，完全消除疾病是优选的，但是尽管如此不是治疗行为的要求。有益的或期望的临床结果包括但不限于促进接受表达car的免疫细胞(同种异体或自体的——这两者可以在接受car疗法的患者中引起免疫反应)。就本公开内容的方法涉及预防病症而言，应理解，术语“预防”不要求疾病状态被完全阻断。相反，如本文所用，术语预防是指技术人员鉴定易患病症的群体的能力，使得本公开内容的化合物的施用可以在疾病发作之前进行。该术语不意味着疾病状态被完全避免。
[0114]
如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，例如质粒、dna载体、质粒、rna载体、病毒或其他合适的复制子。本文所述的表达载体可以包含多核苷酸序列以及例如用于蛋白质表达和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的另外的序列元件。可用于表达car和抗体的某些载体包括质粒，其含有调控序列，例如启动子和增强子区域，其指导基因转录。用于car和抗体表达的其他有用载体包含多核苷酸序列，其提高了这些基因的翻译速率或改善了由基因转录产生的mrna的稳定性或核输出。这些序列元件可以包括例如5’和3’非翻译区和聚腺苷酸化信号位点，以指导表达载体上携带的基因的有效转录。本文所述的表达载体还可以包含编码用于选择包含此种载体的细胞的标志物的多核苷酸。合适的标志物的实例包括编码抗生素(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素和诺尔丝菌素)抗性的基因。
[0115]
如本文所用，术语“抗体药物缀合物”或“adc”是指与细胞毒素连接的抗体。adc是通过一种分子(例如抗体或其抗原结合片段)的反应性官能团与另一种分子(例如本文所述的细胞毒素)的适当反应性官能团的化学键合而形成的。缀合物可以包含两个彼此结合的分子之间的接头，例如抗体与细胞毒素之间的接头。可用于形成缀合物的接头的实例包括含肽的接头，例如含有天然存在或非天然存在氨基酸的接头，例如d
‑
氨基酸。这些接头可以使用本文所述或本领域已知的多种策略来制备。根据其中的反应组分，接头可以被切割，例如通过酶水解、光解、酸性条件下的水解、碱性条件下的水解、氧化、二硫化物还原、亲核切割或有机金属切割(参见例如，leriche等,bioorg.med.chem.,20:571
‑
582,2012)。
[0116]
如本文所用，术语“微管结合剂”是指通过破坏细胞中有丝分裂和间期细胞功能所必需的微管网络起作用的化合物。微管结合剂的实例包括，但不限于，美登素、美登木素及其衍生物，例如本文所述或本领域已知的那些；长春花生物碱，例如长春碱、硫酸长春碱、长春新碱、硫酸长春新碱、长春地辛和长春瑞滨；紫杉烷，例如多西他赛和紫杉醇；大环内酯
类，例如圆皮海绵内酯、秋水仙碱和埃博霉素；及其衍生物，例如埃博霉素b或其衍生物。
[0117]
如本文所用，术语“鹅膏蕈毒素”是指由鬼笔鹅膏(amanita phalloides)产生的肽的鹅膏蕈毒素家族的成员，或其衍生物，例如其能够抑制rna聚合酶ii活性的变体或衍生物。还包括合成鹅膏蕈毒素(参见，例如美国专利号9676702，通过引用并入本文中)。与本文所述的组合物和方法结合使用的鹅膏蕈毒素包括这样的化合物，例如但不限于式(iii)、(iiia)、(iiib)和(iiic)的鹅膏蕈毒素，(例如，α
‑
鹅膏蕈碱、β
‑
鹅膏蕈碱、γ
‑
鹅膏蕈碱、ε
‑
鹅膏蕈碱、鹅膏素、鹅膏素酰胺、鹅膏无毒环肽、鹅膏无毒环肽酸或前鹅膏无毒环肽及其衍生物)。如本文所述，鹅膏蕈毒素可以与抗体或其抗原结合片段缀合，例如通过接头部分(l)(因此形成adc)。此类adc由式ab
‑
z
‑
l
‑
am表示，其中ab是抗体或其抗原结合片段，l是接头，z是化学部分，并且am是鹅膏蕈毒素。在一些实施方案中，鹅膏蕈毒素与接头缀合。在一些实施方案中，鹅膏蕈毒素
‑
接头缀合物am
‑
lz由式(i)或(ia)、(ib)、(iv)、(iva)或(ivb)表示。用于此类过程的鹅膏蕈毒素缀合的示例性方法和接头在下文进行描述。根据组合物和方法，可用于与抗体或抗原结合片段缀合的示例性含接头的鹅膏蕈毒素也在本文进行描述。
[0118]
如本文所用，术语“酰基”是指
‑
c(＝o)r，其中r是氢(“醛”)、烷基(例如，c1‑
c
12
烷基)、烯基(例如，c2‑
c
12
烯基)、炔基(例如，c2‑
c
12
炔基)、碳环基(例如，c3‑
c7碳环基)、芳基(例如，c6‑
c
20
芳基)、杂芳基(例如，5
‑
10元杂芳基)或杂环基(例如，5
‑
10元杂环基)，如本文所定义。非限制性实例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基和丙烯酰基。
[0119]
如本文所用，术语“烷基”是指具有1至12个碳原子的直链或支化的饱和烃。代表性的c1‑
c
12
烷基包括，但不限于，
‑
甲基、
‑
乙基、
‑
正丙基、
‑
正丁基、
‑
正戊基和
‑
正己基；而支化的c1‑
c
12
烷基包括，但不限于，
‑
异丙基、
‑
仲丁基、
‑
异丁基、
‑
叔丁基、
‑
异戊基和2
‑
甲基丁基。c1‑
c
12
烷基可以是未经取代的或经取代的。
[0120]
如本文所用，术语“烯基”是指含有具有至少一个不饱和位点的正、仲或叔碳原子的c2‑
c
12
烃，即碳
‑
碳sp2双键。实例包括但不限于：乙烯或乙烯基、
‑
烯丙基、
‑1‑
丁烯基、
‑2‑
丁烯基、
‑
异丁烯基、
‑1‑
戊烯基、
‑2‑
戊烯基、
‑3‑
甲基
‑1‑
丁烯基、
‑2‑
甲基
‑2‑
丁烯基、
‑
2,3
‑
二甲基
‑2‑
丁烯基等。烯基可以是未经取代的或经取代的。
[0121]
如本文所用，“炔基”是指包含具有至少一个不饱和位点的正、仲或叔碳原子的c2‑
c
12
烃，即碳
‑
碳sp三键。实例包括但不限于乙炔和丙炔。炔基可以是未经取代的或经取代的。
[0122]
如本文所用，“芳基”是指c6‑
c
20
碳环芳香族基团。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。芳基可以是未经取代的或经取代的。
[0123]
如本文所用，“芳基烷基”是指无环烷基，其中键合到碳原子(通常是末端或sp3碳原子)上的氢原子之一被芳基取代。典型的芳基烷基包括但不限于苄基、2
‑
苯基乙
‑1‑
基、2
‑
苯基乙
‑1‑
基、萘基甲基、2
‑
萘基乙
‑1‑
基、2
‑
萘基乙
‑1‑
基、萘苄基、2
‑
萘基乙
‑1‑
基等。芳基烷基包含6至20个碳原子，例如芳基烷基的烷基部分(包括烷基、烯基或炔基)为1至6个碳原子，芳基部分为5至14个碳原子。烷芳基可以是未经取代的或经取代的。
[0124]
如本文所用，“环烷基”是指饱和碳环基团，其可以是单环或双环的。环烷基包括具有3至7个碳原子的单环或7至12个碳原子的双环的环。单环环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。环烷基可以是未经取代的或经取代的。
[0125]
如本文所用，“环烯基”是指不饱和碳环基团，其可以是单环或双环的。环烯基包括具有3至6个碳原子的单环或7至12个碳原子的双环的环。单环环烯基的实例包括1
‑
环戊
‑1‑
烯基、1
‑
环戊
‑2‑
烯基、1
‑
环戊
‑3‑
烯基、1
‑
环己
‑1‑
烯基、1
‑
环己
‑2‑
烯基和1
‑
环己
‑3‑
烯基。环烯基可以是未经取代的或经取代的。
[0126]
如本文所用，“杂芳烷基”是指无环烷基，其中键合到碳原子(通常是末端或sp3碳原子)上的氢原子之一被杂芳基取代。典型的杂芳基烷基包括但不限于2
‑
苯并咪唑基甲基、2
‑
呋喃基乙基等。杂芳基烷基包含6至20个碳原子，例如杂芳基烷基的烷基部分(包括烷基、烯基或炔基)为1至6个碳原子，杂芳基部分为5至14个碳原子和选自n、o、p和s的1至3个杂原子。杂芳基烷基的杂芳基部分可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和选自n、o、p和s的1至3个杂原子)的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。
[0127]
如本文所用，“杂芳基”和“杂环烷基”分别是指芳香族或非芳香族环系统，其中一个或更多个环原子是杂原子，例如氮、氧和硫。杂芳基或杂环烷基包含2至20个碳原子和选自氮、氧、磷和硫的1至3个杂原子。杂芳基或杂环烷基可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子和选自n、o、p和s的1至3个杂原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和选自n、o、p和s的1至3个杂原子)的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。杂芳基和杂环芳基可以未经取代的或经取代的。
[0128]
杂芳基和杂环烷基在paquette,leo a.；"principles of modern heterocyclic chemistry"(w.a.benjamin,new york,1968),特别是第1、3、4、6、7和9章；"the chemistry of heterocyclic compounds,a series of monographs"(john wiley&sons,new york,1950to present),特别是第13、14、16、19和28卷；和j.am.chem.soc.(1960)82:5566中进行了描述。
[0129]
杂芳基的实例包括，作为实例而非限制，吡啶基、噻唑基、四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、indolenyl、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲哚嗪基、异吲哚基、3h
‑
吲哚基、1h
‑
吲唑基、嘌呤基、4h
‑
喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、肉桂啉基、蝶啶基、4ah
‑
咔唑基、咔唑基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋吖基、吩噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、苯并三唑基、苯并异噁唑基和靛红基(isatinoyl)。
[0130]
杂环烷基的实例包括，作为实例而非限制，二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、四氢噻吩基、哌啶基、4
‑
哌啶基、吡咯烷基、2
‑
吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、双
‑
四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、哌嗪基、奎宁环基和吗啉基。
[0131]
作为实例而非限制，碳键合的杂芳基和杂环烷基在吡啶的2、3、4、5或6位处，在哒嗪的3、4、5或6位处，在嘧啶的2、4、5或6位处，在吡嗪的2、3、5或6位处，在呋喃、四氢呋喃、硫代呋喃(thiofuran)、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位处，在噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位处，在异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位处，在氮丙啶的2或3位处，在氮杂环丁烷的2、3或4位处，在喹啉的2、3、4、5、6、7或8位处，或者在异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位处键合。更通常，碳键合的杂环包括2
‑
吡啶基、3
‑
吡啶基、4
‑
吡啶基、5
‑
吡啶基、6
‑
吡啶基、3
‑
哒嗪基、4
‑
哒嗪基、5
‑
哒嗪基、6
‑
哒嗪基、2
‑
嘧啶基、4
‑
嘧啶基、5
‑
嘧啶基、6
‑
嘧啶基、2
‑
吡嗪基、3
‑
吡嗪基、5
‑
吡嗪基、6
‑
吡嗪基、2
‑
噻唑基、4
‑
噻唑基或5
‑
噻唑基。
[0132]
作为示例而非限制，氮键合的杂芳基和杂环烷基在氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡
咯烷、2
‑
吡咯啉、3
‑
吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2
‑
咪唑啉、3
‑
咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2
‑
吡唑啉、3
‑
吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1h
‑
吲唑的1位处，在异吲哚或异吲哚啉的2位处、在吗啉的4位处和在咔唑或β
‑
咔啉的9位处键合。更通常，氮键合的杂环包括1
‑
氮丙啶基、1
‑
氮杂环丁烷基、1
‑
吡咯基、1
‑
咪唑基、1
‑
吡唑基和1
‑
哌啶基。
[0133]
如本文所用以及应用于任何上述烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、杂芳基、杂环基等的“经取代的”意指一个或更多个氢原子各自独立地被取代基取代。典型的取代基包括，但不限于，
‑
x、
‑
r、
‑
oh、
‑
or、
‑
sh、
‑
sr、nh2、
‑
nhr、
‑
n(r)2、
‑
n
+
(r)3、
‑
cx3、
‑
cn、
‑
ocn、
‑
scn、
‑
nco、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、
‑
n3、
‑
nc(＝o)h、
‑
nc(＝o)r、
‑
c(＝o)h、
‑
c(＝o)r、
‑
c(＝o)nh2、
‑
c(＝o)n(r)2、
‑
so3‑
、
‑
so3h、
‑
s(＝o)2r、
‑
os(＝o)2or、
‑
s(＝o)2nh2、
‑
s(＝o)2n(r)2、
‑
s(＝o)r、
‑
op(＝o)(oh)2、
‑
op(＝o)(or)2、
‑
p(＝o)(or)2、
‑
po3、
‑
po3h2、
‑
c(＝o)x、
‑
c(＝s)r、
‑
co2h、
‑
co2r、
‑
co2‑
、
‑
c(＝s)or、
‑
c(＝o)sr、
‑
c(＝s)sr、
‑
c(＝o)nh2、
‑
c(＝o)n(r)2、
‑
c(＝s)nh2、
‑
c(＝s)n(r)2、
‑
c(＝nh)nh2和
‑
c(＝nr)n(r)2；其中每个x在每种情况下独立地选自f、cl、br和i；并且每个r在每种情况下独立地选自c1‑
c
12
烷基、c6‑
c
20
芳基、c3‑
c
14
杂环烷基或杂芳基、保护基团和前药部分。当基团被描述为“任选经取代的”时，该基团在每种情况下可以独立地被一个或更多个上述取代基取代。取代可以包括这样的情况，其中相邻取代基经历环闭合，例如邻位官能取代基的环闭合，以形成例如通过环闭合形成的内酰胺、内酯、环酸酐、缩醛、半缩醛、硫缩醛、缩醛胺和半缩醛胺，例如以提供保护基团。
[0134]
应理解，根据上下文，某些基团命名惯例可以包括单基团或双基团。例如，当取代基需要与分子的其余部分的两个附接点时，应理解该取代基是双基团。例如，被鉴定为需要两个附接点的烷基的取代基包括双基团，例如
‑
ch2‑
、
‑
ch2ch2‑
、
‑
ch2ch(ch3)ch2‑
等。其他基团命名惯例清楚地表明该基团是双基团，例如“亚烷基”、“亚烯基”、“亚芳基”、“杂环亚烷基”等。
[0135]“异构”或“异构体”是指具有相同分子式但原子的键合顺序或其原子在空间中的排列不同的化合物。其原子在空间中的排列不同的异构体被称为“立体异构体”。彼此不是镜像的立体异构体被称为“非对映异构体”，并且彼此不可重叠的镜像的立体异构体被称为“对映异构体”，或有时被称为“光学异构体”。
[0136]
与四个不同取代基键合的碳原子被称为“手性中心”。“手性异构体”意指具有至少一个手性中心的化合物。具有多于一个手性中心的化合物可以作为单独的非对映异构体或作为非对映异构体的混合物(被称为“非对映异构混合物”)存在。当存在一个手性中心时，立体异构体的特征可能在于该手性中心的绝对构型(r或s)。绝对构型是指与手性中心附接的取代基在空间中的排列。所考虑的与手性中心附接的取代基是根据cahn、ingold和prelog的顺序规则排列。(cahn等，angew.chem.inter.edit.1966,5,385；勘误表511；cahn等,angew.chem.inter.edit.1966,5,385；errata 511；cahn等,angew.chem.1966,78,413；cahn和ingold,j.chem.soc.1951(london),612；cahn等,experientia 1956,12,81；cahn,j.chem.educ.1964,41,116)。含有等量的相反手性的单个对映体形式的混合物被称为“外消旋混合物”。
[0137]
本说明书和权利要求书中公开的化合物可以包含一个或更多个不对称中心，并且每种化合物可能存在不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中任何化合物的描述意指包括所有对映异构体、非对映异构体及其混合物。
此外，除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中任何化合物的描述意指包括单个对映异构体以及对映异构体的任何混合物、外消旋或其他形式。当化合物的结构被描述为特定对映异构体时，应理解，本技术的公开内容不限于该特定对映异构体。因此，本文中考虑了本公开内容的每个结构式的对映异构体、光学异构体和非对映异构体。在本说明书中，为了方便起见，在一些情况下，化合物的结构式表示某种异构体，但是本公开内容包括所有异构体，例如几何异构体、基于不对称碳的光学异构体、立体异构体、互变异构体等，应理解，并非所有异构体都具有相同水平的活性。化合物可以以不同的互变异构形式存在。除非另有说明，否则根据本公开内容的化合物意指包括所有互变异构形式。当化合物的结构被描述为特定互变异构体时，应理解本技术的公开内容不限于该特定互变异构体。
[0138]
如果适用，本文所述的任何式的化合物包括化合物自身，以及其盐和其溶剂化物。例如，盐可以在阴离子与本公开内容的化合物上带正电荷的基团(例如，氨基)之间形成。合适的阴离子包括氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硫酸氢盐、氨基磺酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、三氟醋酸盐、谷氨酸盐、葡糖醛酸盐、戊二酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、水杨酸盐、乳酸盐、萘磺酸盐和醋酸盐(例如，三氟醋酸盐)。术语“药学上可接受的阴离子”是指适合于形成药学上可接受的盐的阴离子。同样，也可以在阳离子与本公开内容的化合物上带负电荷的基团(例如，羧酸盐)之间形成盐。合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵阳离子(例如，四甲基铵离子)。一些合适的经取代的铵离子的实例是衍生自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、甲葡胺和氨丁三醇，以及氨基酸(例如赖氨酸和精氨酸)。本公开内容的化合物还包括含有季氮原子的那些盐。
[0139]
合适的无机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和磷。合适的有机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下有机酸的那些：2
‑
乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、依地酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘羧酸、羟基乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、甲苯磺酸和戊酸。合适的聚合有机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下聚合酸的那些：丹宁酸、羧甲基纤维素。
[0140]
另外，本公开内容的化合物，例如化合物的盐，可以以水合或非水合(无水)形式或作为与其他溶剂分子的溶剂化物存在。水合物的非限制性实例包括一水合物、二水合物等。溶剂合物的非限制性实例包括乙醇溶剂化物、丙酮溶剂化物等。“溶剂化物”意指含有化学计量或非化学计量量的溶剂的溶剂加成形式。一些化合物倾向于在结晶固态中捕获固定摩尔比的溶剂分子，从而形成溶剂化物。如果溶剂是水，则形成的溶剂化物是水合物；如果溶剂是醇，则形成的溶剂化物是醇化物。水合物是由一个或更多个水分子与一分子物质结合形成的，其中水保持其分子状态为h2o。水合物是指例如一水合物、二水合物、三水合物等。
[0141]
另外，由本文公开的式表示的化合物或其盐可能存在晶体多态性。应注意，任何晶型、晶型混合物或其酸酐或水合物均包括在本公开内容的范围内。
[0142]
无论取代基被描述为双基团(即，具有与分子的其余部分的两个附接点)，应理解，除非另有说明，否则该取代基可以以任何方向构型连接。
[0143]
以下部分提供了基于向人患者施用抗
‑
cd45 adc以在car疗法中促进表达car的免疫细胞的的接受的方法的描述。
[0144]
ii.抗
‑
cd45抗体药物缀合物(adc)和嵌合抗原受体(car)细胞治疗方法
[0145]
嵌合抗原受体(car)疗法的一个挑战是确定人受体可以接受基因工程化的car表达细胞(例如，car
‑
t细胞)的方式。基因工程化的免疫细胞的此种接受可能影响治疗功效，并且还可能对患者产生不良副作用。
[0146]
淋巴耗竭化疗是抑制受体免疫系统以提高接受的传统方法，但是通常具有不良副作用。本文描述了在接受car疗法的人患者中促进表达car的免疫细胞的接受的方法。本文所述的方法特异性靶向正在接受car疗法的人患者中的cd45+细胞，例如cd45+淋巴细胞(例如，t细胞)并且消融cd45+细胞。本文公开的方法比淋巴耗竭化疗更有靶向性，并且提供了可以使用自体或同种异体细胞的方式。本文公开的方法的一个优点是治疗是对有此需要的患者(即，需要car疗法的患者)进行淋巴耗竭，而不是基本上耗竭hsc。例如，本文公开的方法可以能够在不诱导骨髓消融，例如需要hsc移植以恢复患者的造血系统的骨髓抑制的情况下对有此需要的患者进行淋巴耗竭。
[0147]
本文描述了施用抗
‑
cd45抗体
‑
药物缀合物(adc)以耗竭接受car疗法的患者内的cd45特异性细胞(例如，淋巴细胞)群以促进表达car的免疫细胞的接受和功效的方法。该免疫系统中的特定cd45表达细胞的选择性耗竭提高了患者总体和无复发存活率，同时降低了对用于治疗自身免疫病或癌症的表达car的免疫细胞排斥的风险。
[0148]
在施用car细胞疗法之后，对表达car的免疫细胞排斥的风险仍然很高。本文公开的方法和组合物可用于在人患者中抑制或预防对car细胞的排斥。抗
‑
cd45 adc可用于在要接受car细胞疗法的患者中选择性靶向淋巴细胞。如本文所述，抗
‑
cd45 adc还可用于通过在已经接受car细胞疗法的人患者中靶向和耗竭cd45阳性细胞来降低对car细胞排斥的风险。
[0149]
本文所述的组合物和方法可用于耗竭与car细胞疗法排斥相关的cd45+细胞，例如淋巴细胞。本公开内容的方法促进了在人受试者，例如患有癌症或自身免疫病的人受试者中表达car的免疫细胞的接受。在一个实施方案中，该方法包括向要进行或已经进行car疗法的人受试者施用抗
‑
cd45抗体药物缀合物(adc)，并且向人受试者施用治疗有效量的表达car的免疫细胞。表达car的免疫细胞可以是同种异体的或自体的。
[0150]
可以在施用car细胞疗法之前、同时或之后向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45 adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之前(例如，前约1至约10天、前约1至约5天、前约1至约3天、前约3天、前约2天、后约12小时)向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45 adc。可以在施用car细胞疗法之前、之后或同时向人患者施用单剂量的抗
‑
cd45 adc，其中此种单剂量足以预防或降低耗竭表达car的免疫细胞的风险。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之前约3天向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之前约2天向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之前约1天向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之前约20小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之前约18小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之前约15小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car
细胞疗法之前约12小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之前约6小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之前约4小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之前约2小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法同时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之后约2小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之后约4小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之后约6小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。在一个实施方案中，在施用car细胞疗法之后约12小时向有此需要的人患者施用抗
‑
cd45adc。
[0151]
在一个实施方案中，在向有此需要的人患者施用表达car的免疫细胞之前施用抗
‑
cd45 adc。在一个实施方案中，与car疗法组合向人患者施用抗
‑
cd45 adc，其中在施用表达car的免疫细胞之前约12小时至约21天向人受试者施用抗
‑
cd45 adc。在一个实施方案中，与car疗法组合向人患者施用抗
‑
cd45 adc，其中在施用表达car的免疫细胞之前约18小时至约20天向人受试者施用抗
‑
cd45 adc。在一个实施方案中，与car疗法组合向人患者施用抗
‑
cd45 adc，其中在施用表达car的免疫细胞之前约20小时至约18天向人受试者施用抗
‑
cd45 adc。在一个实施方案中，与car疗法组合向人患者施用抗
‑
cd45 adc，其中在施用表达car的免疫细胞之前约1天至约15天向人受试者施用抗
‑
cd45 adc。在一个实施方案中，与car疗法组合向人患者施用抗
‑
cd45 adc，其中在施用表达car的免疫细胞之前约1天至约10天向人受试者施用抗
‑
cd45 adc。在一个实施方案中，与car疗法组合向人患者施用抗
‑
cd45 adc，其中在施用表达car的免疫细胞之前约2天至约8天向人受试者施用抗
‑
cd45 adc。在一个实施方案中，与car疗法组合向人患者施用抗
‑
cd45 adc，其中在施用表达car的免疫细胞之前约3天至约6天向人受试者施用抗
‑
cd45 adc。
[0152]
在一个实施方案中，施用淋巴耗竭量的抗
‑
cd45 adc。可以在施用抗
‑
cd45 adc之后测试来自人患者的生物样品中淋巴细胞的总体水平，其中相对于施用之前的水平，在施用抗
‑
cd45 adc之后人患者中的淋巴细胞总体数量的降低说明抗
‑
cd45 adc预防排斥car细胞疗法的功效。在一个实施方案中，相对于就在施用抗
‑
cd45 adc之前来自人患者的生物样品(相同类型的，例如血液)中淋巴细胞的水平，来自人患者的生物样品中内源性淋巴细胞的水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％或至少约20％。在一个实施方案中，相对于就在施用抗
‑
cd45 adc之前来自人患者的生物样品(相同类型的，例如血液)中淋巴细胞的水平，来自人患者的生物样品中内源性淋巴细胞的水平降低约5％至25％、约5％至20％、约5％至15％或约5％至10％。在一个实施方案中，在施用抗
‑
cd45 adc之前一天或更短时间确定内源性淋巴细胞的水平。
[0153]
淋巴细胞的水平可以根据本领域已知的标准方法确定，包括但不限于荧光活化细胞分选(fac)分析或血液分析仪。
[0154]
需要正常水平的中性粒细胞来预防感染。当血液中的中性粒细胞水平异常低时，发展中性粒细胞减少症，导致对感染的易感性增加(参见，例如schwartzberg,lee s."neutropenia:etiology and pathogenesis."clinical cornerstone 8(2006):s5
‑
s11，其通过引用整体并入本文)。中性粒细胞减少症通常由化疗治疗、药物不良反应或自身免疫病症引起。测量受试者血液中的绝对嗜中性粒细胞计数(anc)的方法是本领域已知的(参见，
例如amundsen,erik k.,等american journal of clinical pathology.137.6(2012):862
‑
869)，其整体通过引用并入本文)。
[0155]
在本文公开的方法的一个实施方案中，在施用表达car的免疫细胞之后，人受试者未发展中性粒细胞减少症。在某些实施方案中，中性粒细胞减少症被定义为血液中的绝对嗜中性粒细胞计数(anc)小于约1500/微升(例如小于约1500/μl、小于约1400/μl、小于约1300/μl、小于约1200/μl、小于约1100/μl、小于约1000/μl、小于约900/μl、小于约800/μl、小于约700/μl、或小于约600/μl)。
[0156]
严重的中性粒细胞减少症或粒细胞缺乏症(临床上被定义为绝对嗜中性粒细胞计数小于500/μl血液)可能导致感染的发病率和死亡率。在一个实施方案中，在施用表达car的免疫细胞之后，人受试者未发展严重的中性粒细胞减少症。在本文公开的方法的某些实施方案中，严重的中性粒细胞减少症被定义为血液中的anc小于约500/μl(例如，小于约500/μl、小于约450/μl、小于约400/μl、小于约350/μl、小于约300/μl、小于约250/μl、小于约200/μl、小于约150/μl或小于约100/μl)。
[0157]
在一个实施方案中，例如相对于参考水平，施用(例如，以淋巴耗竭剂量)adc有效增加人受试者中一种或更多种car
‑
t移植细胞因子(即有益于car
‑
t移植并且与car
‑
t扩增和功效相关的细胞因子)的水平。例如，在某些实施方案中，相对于在施用adc之前人受试者中一种或更多种car
‑
t移植细胞因子的水平或相对于预确定的阈值水平，施用adc有效增加人受试者中一种或更多种car
‑
t移植细胞因子的水平。在某些实施方案中，car
‑
t移植细胞因子的水平等于用氟达拉滨/环磷酰胺化学预处理治疗的患者中car
‑
t移植细胞因子的水平(参见，例如，kochehnderfer等clin oncol.35:1803
‑
13中公开的患者数据)。在某些实施方案中，car
‑
t移植细胞因子是il
‑
15和/或il
‑
7(参见，例如实施例4)。
[0158]
在一个实施方案中，例如相对于参考水平，施用(例如，以淋巴耗竭剂量)抗
‑
cd45 adc基本上不增加人受试者中一种或更多种细胞因子释放综合征(crs)
‑
细胞因子的水平。crs和crs相关的细胞因子在例如lee,daniel w.,等blood.124.2(2014):188
‑
195中进行了描述。在某些实施方案中，相对于例如在施用抗
‑
cd45 adc之前人受试者中一种或更多种crs
‑
细胞因子的水平或相对于预确定的阈值水平，施用抗
‑
cd45 adc不显著增加人受试者中一种或更多种crs
‑
细胞因子的水平。在某些实施方案中，crs
‑
细胞因子是ifnγ、il
‑
10、il
‑
6、il
‑
8、mip
‑
1α、mip
‑
1β或il
‑
10。
[0159]
在一些实施方案中，施用(例如，以淋巴耗竭剂量)adc有效增加人受试者中一种或更多种car
‑
t移植细胞因子(即有益于car
‑
t移植并且与car
‑
t扩增和功效相关的细胞因子)的水平，但不增加人受试者中一种或更多种细胞因子释放综合征(crs)
‑
细胞因子的水平。
[0160]
如上所述，本文所述的方法的优点之一是可以减少淋巴耗竭化疗剂的量或在向已经或计划进行car疗法的人患者的预处理方案中不包括淋巴耗竭化疗剂。淋巴耗竭化疗剂例如但不限于氟达拉滨、环磷酰胺、苯达莫司汀和/或喷司他丁，通常用作抗排斥剂以在接受car疗法的人中促进car表达细胞的接受。在某些实施方案中，与施用表达car的免疫细胞(例如t细胞)组合(例如在施用表达car的免疫细胞(例如t细胞)之前)向人患者施用抗
‑
cd45 adc，使得在施用表达car的免疫细胞之前、同时，或者在施用表达car的免疫细胞之前、同时、之后，人患者不接受淋巴耗竭化疗剂，例如氟达拉滨和/或环磷酰胺。
[0161]
在某些实施方案中，与另一种疗法组合使用抗
‑
cd45 adc以促进表达car的免疫细
adc疗法组合使用的car
‑
t细胞的实例包括但不限于cd19 car
‑
t(例如，cart
‑
19
‑
01,02,03(福建医科大学)；daopeicart(河北森朗生物科技有限公司)；im19cart/001、ymcart201702(北京免疫医疗科技有限公司)；cart
‑
cd19
‑
02,03(武汉西安医疗科技有限公司)；universal cd19
‑
cart/shbycl001,002(上海邦耀生物科技有限公司)；unicartherapy201701(上海优卡迪生物医药科技有限公司)；genechem/nct02672501(上海基因化学有限公司)；senl_19(河北森朗生物科技有限公司)；pcar
‑
019(persongen biotherapeutics(苏州))；icar19(免疫细胞公司)；wm
‑
cart
‑
02(sinobioway cell therapy co.)；henanch080,109,152(河南省肿瘤医院/普瑞金(深圳)生物技术有限公司)；im19
‑
cd28和im19
‑
41bb car
‑
t细胞(北京免疫医药科技有限公司)；ctl019/it1601
‑
cart19(北京三水生物科技有限公司)；ctl019/cctl019c2201(诺华制药)；cd19:4
‑
1bb:cd28:cd3/firstshenzhen01(深圳市第二人民医院/北京普瑞金科技公司)；mb
‑
cart19.1(上海儿童医学中心/美天一生物科技有限公司)；pz01car
‑
t细胞(品泽生命科技有限公司)；ymcart201701(北京免疫医疗科技有限公司)；2016yjz12(北京大学/马里诺生物技术公司)；egfrt/19
‑
28z/4
‑
1bblcar t细胞(纪念斯隆凯特琳癌症中心/朱诺治疗公司)；doing
‑
002(北京多英生物医药有限公司)；pcar
‑
019(百盛生物治疗(苏州)有限公司)；c
‑
car011(北京协和医院/细胞生物医药集团有限公司)；ipd1cd19 ecart细胞(北京大学/马里诺生物技术公司)；2013
‑
1018/nct02529813(m.d.安德森癌症中心/齐奥医药/intrexon corp.)；henanchcar2
‑
1(河南省肿瘤医院/普瑞金(深圳)生物科技有限公司)；jcar015(朱诺治疗公司)；jcar017/017001,004,006(朱诺治疗公司)；jcar017(新基)；tbi
‑
1501(宝生物株式会社)；jmu
‑
cd19car(自治医科大学)；kte
‑
c19(kite，吉利德公司)；tricar
‑
t
‑
cd19(timmune biotech inc.)；pf
‑
05175157(弗雷德哈钦森癌症研究中心))；cd22/cd30/cd7/bcma/cd123(例如，2016040/nct03121625(河北森朗生物科技有限公司))；cd22(例如，ruijin
‑
car
‑
01(瑞金医院/上海优卡迪生物医药科技有限公司)；auto
‑
pa1,db1(autolus limited))、cd20(例如，doing
‑
006(北京多英生物医药有限公司))；或cd20/cd22/cd30(例如，sz5601(苏州大学第一附属医院上海/优卡迪生物医药科技有限公司))。
[0168]
car构建体
[0169]
本公开内容包括car疗法与抗
‑
cd45免疫抑制adc组合的用途。本公开内容通常不限于特定的car构建体，例如特定的抗原结合区或细胞内信号传导结构域，因为本公开内容基于以下发现：抗
‑
cd45 adc可以通过促进car表达细胞的接受用作car疗法的预处理剂，其通过消融内源性cd45+免疫细胞(例如内源性淋巴细胞)。本文中考虑了特定的car，例如cd19特定性car并且包括在本文公开的方法中，但是并不意指是限制性的。
[0170]
car构建体是本领域已知的并且通常包含(a)包含抗原结合结构域的胞外区域、(b)跨膜结构域和(c)胞质信号传导结构域。示例性的car配置是本领域已知的，并且任何合适的配置可以用于本文所述的方法。例如，car可以是第一代、第二代或第三代car，例如，如guedan等molecular therapy
‑
methods&clinical development.12:145
‑
156(2019)或sadelain等cancer discovery 3.4:388
‑
398(2013)中描述的，其全部内容通过引用并入本文。简而言之，“第一代”car可以包含(a)胞外抗原结合结构域、(b)跨膜结构域、(c)一种或更多种胞内信号传导结构域、以及任选(d)将抗原结合结构域连接到跨膜结构域的铰链区。“第二代”car可以包含元件(a)、(b)、(c)和任选的(d)，并且还包含共刺激结构域，例如cd28
或4
‑
1bb的共刺激结构域。“第三代”car可以包含元件(a)、(b)、(c)和任选的(d)，并且还包含多种共刺激结构域，例如cd28和4
‑
1bb的共刺激结构域，或cd28和ox40的共刺激结构域。以下详细描述每个上述元件。应理解，在一些实施方案中，由以下示例性的非限制排列描述的car分子从左到右是car的n
‑
末端到c
‑
末端。如本公开内容所述的car可以包含或还包含如本文所述的元件的任何其他组合。其他示例性嵌合抗原受体构建体在美国专利号9,328,156；美国专利号9,783,591；美国专利号9,714,278；美国专利号9,765,156；美国专利号10,117,896；美国专利号9,573,988；美国专利号10,308,717；美国专利号10,221,245；美国专利号10,040,865；美国专利公开号2018/0256712a1；美国专利公开号2018/0271907a1；美国专利公开号2016/0046724a1；美国专利公开号2018/0044424a1；美国专利公开号2018/0258149a1；美国专利公开号2019/0151363a1；和美国专利公开号2018/0273601a1中公开；前述专利和专利出版物中的每一个的内容通过引用整体并入本文。
[0171]
在本文公开的方法中使用的car包含胞外抗原结合结构域。胞外抗原结合结构域可以是结合抗原的任何分子，包括但不限于人抗体、人源化抗体或其任何功能片段。在某些实施方案中，抗原结合结构域是scfv。在另一些实施方案中，胞外抗原结合结构域是非免疫球蛋白支架蛋白。在另一些实施方案中，car的胞外结合结构域包含单链t细胞受体(sctcr)。如美国专利号5,359,046、5,686,281和6,103,521号中所述，胞外结构域也可以从任何与配体结合和/或信号转导相关的多种胞外结构域或分泌蛋白获得。
[0172]
胞外结合结构域的分子靶标(抗原)的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域来识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标志物的配体。因此，在一方面，car介导的免疫细胞(例如，t细胞)反应可以通过将特异性结合期望抗原的胞外抗原结合结构域基因工程化到car中来导向目标抗原。例如，可以选择抗原结合结构域来识别在与特定疾病状态(例如癌症或自身免疫病)相关的靶细胞上充当细胞表面标志物的配体。因此，可以充当car中抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与癌细胞和其他形式的患病细胞(例如自身免疫病细胞和病原体感染细胞)相关的那些。在一些实施方案中，通过将与肿瘤细胞上的抗原特异性结合的期望抗原结合结构域基因工程化来将car基因工程化为靶向目标肿瘤抗原。在本公开内容的上下文中，“肿瘤抗原”是指特定的过度增殖性病症(例如癌症)所共有的抗原。在一个实施方案中，抗原是肿瘤抗原，其实例包括但不限于cd19、cd22、cd30、cd7、bcma、cd137、cd22、cd20、afp、gpc3、muc1、间皮素、cd38、pd1、egfr(例如，egfrviii)、mg7、bcma、taci、cea、psca、cea、her2、muc1、cd33、ror2、nkr
‑
2、psca、cd28、taa、nkg2d或cd123。在一个实施方案中，car包含结合cd19、cd22、cd30、cd7、bcma、cd137、cd22、cd20、afp、gpc3、muc1、间皮素、cd38、pd1、egfr(例如，egfrviii)、mg7、bcma、taci、cea、psca、cea、her2、muc1、cd33、ror2、nkr
‑
2、psca、cd28、taa、nkg2d或cd123的scfv。
[0173]
在一个实施方案中，car结合bcma，如美国专利申请公开号20190388528(bluebird bio)中描述的，其与car相关的内容通过引用并入本文。
[0174]
在另一方面，car的胞外结合结构域结合以下抗原：afp(例如，etch17afpcar01(颐昂生物科技(上海)有限公司/优瑞科生物技术公司))、gpc3(例如genechem gpc
‑
3cart(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)；302gpc3
‑
cart(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)；肝癌的car
‑
t(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)；car
‑
gpc3t细胞(科济生物))、
qplslrpeac rpaaggavht rgldfaprki evmypppyld neksngtiih vkgkhlcpsp lfpgpskp(seq id no：10)连接的胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。
[0179]
跨膜结构域可以由促成胞外抗原结合结构域的蛋白质、促成效应子功能信号传导结构域的蛋白质、促成增殖信号传导部分的蛋白质或由完全不同的蛋白质促成。对于大多数，使跨膜结构域与car的其他结构域之一天然相关是方便的。在一个实施方案中，所用的跨膜结构域和胞质结构域是cd28序列的连续部分。因此，任何跨膜结构域都被考虑用于本文，只要该结构域能够将包含抗原结合结构域的car锚定到细胞膜上即可。
[0180]
跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本公开内容中特别使用的跨膜结构域可以延生自t细胞受体、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd2、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、lfa
‑
1t细胞共同受体、cd2 t细胞共同受体/黏附分子、cd8α及其片段的α、β或ζ链(例如，至少包含其跨膜结构域)。跨膜结构域可以使用本领域已知的或本文所述的任何方法来鉴定，例如通过使用uniprot数据库。
[0181]
在一些实施方案中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成跨膜结构域的每一端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选地长度为2至10个氨基酸，可以形成跨膜结构域与car的胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸
‑
丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
[0182]
在一些实施方案中，本公开内容的car中的跨膜结构域是cd8跨膜结构域。用于此目的的cd8序列在pct公开号w02014/055771中教导。
[0183]
在一些实施方案中，car中的跨膜结构域是cd8跨膜结构域或其功能部分。例如，car可以包含具有氨基酸序列ldpklcylld gilfiygvil talflrvk(seq id no：11)的cd3跨膜结构域或其功能部分，例如lcylldgilf iygviltalf l(seq id no：12)。
[0184]
在一些实施方案中，本公开内容的car中的跨膜结构域是cd28跨膜结构域。以下提供了示例性的cd28序列，以及示例性的跨膜结构域序列。在一些实施方案中，cd28跨膜结构域包含以下示例性的跨膜结构域序列或其能够将包含该序列的car锚定到细胞膜上的片段或变体。因此，在一些实施方案中，car的跨膜结构域是包含以下氨基酸序列的cd28跨膜结构域：fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv(seq id no：13)。在一个实施方案中，car的跨膜结构域是包含以下氨基酸序列的cd28跨膜结构域：ievmypppyl dneksngtii hvkgkhlcps plfpgpskpf wvlvvvggvl acysllvtva fiifwv(seq id no：14)，或其功能片段，例如seq id no：13。
[0185]
除了胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之外，car还包含胞内(或胞质)信号传导结构域。
[0186]
已知的是仅通过内源性tcr生成的信号不足以完全活化t细胞并且可能还需要次级或共刺激信号。因此，t细胞活化可以由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过tcr(初级细胞质信号传导序列)启动抗原依赖性初级活化的那些序列，和以不依赖抗原的方式起作用以提供次级或共刺激信号(次级细胞质信号传导序列)的那些序列。
[0187]
如本文所用的术语，“胞内信号传导结构域”或“胞质信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域可以生成促进含car的免疫细胞(例如car
‑
t细胞或表达
car的nk细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的实例，例如在cart细胞或表达car的nk细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域转导效应子功能信号并且指导细胞进行特定功能。虽然可以使用整个细胞内信号传导结构域，但是在许多情况下没有必要使用整个链。到使用胞内信号传导结构域的截短部分的程度，此种截短部分可用于代替完整链，只要它转导效应子功能信号即可。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包含足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
[0188]
在一个实施方案中，car的胞内信号传导结构域包含如seq id no：15中所述的cd3ζ信号传导区或其信号传导部分。
[0189]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no：15)
[0190]
胞质信号传导结构域还可以包括但不限于衍生自cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cds、cd22、cd79a、cd79b、cd278(“icos”)、fc∈ri、cd66d、dap10和dap12的那些。
[0191]
car还可以包含“胞内共刺激结构域”，其是衍生自增强细胞因子产生的共刺激蛋白(例如cd28和4
‑
1bb)的胞内信号传导结构域的多肽链。
[0192]
示例性的共刺激信号传导区包括4
‑
1bb、cd21、cd28、cd27、cd127、icos、il
‑
15rα和ox40。
[0193]
在某些实施方案中，car的胞质共刺激结构域包含4
‑
1bb信号传导结构域自身或与在car的上下文中有用的任何其他期望的胞质结构域组合。4
‑
1bb是tnfr超家族的成员，其中氨基酸序列提供为genbank登录号aaa62478.2，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基；“4
‑
1bb共刺激结构域”被定义为genbank登录号aaa62478.2,的的氨基酸残基214
‑
255，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。
[0194]
在一个实施方案中，car的胞内共刺激信号传导结构域是4
‑
1bb(cd137)共刺激信号传导区，或其信号传导部分：
[0195]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq id no：16)
[0196]
在一个实施方案中，car的共刺激信号传导结构域是car的cd28共刺激信号传导区序列，如下：
[0197]
胞内结构域：cd28共刺激信号传导区域，或其信号传导部分：
[0198]
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no：17)
[0199]
因此，car的胞质结构域包含与在本公开内容的car的上下文中有用的任何其他期望的胞质结构域组合的cd3
‑
ζ信号传导结构域。在某些实施方案中，car的胞质结构域可以包含cd3ζ结构域和共刺激信号传导区，包括但不限于4
‑
1bb、cd28和cd27。
[0200]
本公开内容的car的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或指定顺序彼此连接。任选地，可以在胞质结构域之间插入短的寡肽或多肽接头或间隔物，优选长度为5至20个氨基酸。ggggs(seq id no：18)或(ggggs)
×
3(seq id no：19)提供了特别合适的接头。
[0201]
在一个实施方案中，本文所用的car包含含有抗cd19单克隆抗体的单链可变结构域的胞外结构域、含有cd8α的铰链和跨膜结构域的跨膜结构域以及含有cd3ζ的信号传导结构域和4
‑
1bb的信号传导结构域的胞质结构域。示例性car包含胞外结构域，包含在
nicholson i c等,mol immunol34:1157
‑
1165(1997)中描述的抗
‑
cd19单克隆抗体，以及cd8α的21个氨基酸信号肽(从genbank登录号nm_001768的位置26
‑
88处的63个核苷酸翻译的)。cd8α铰链和跨膜结构域由从genbank登录号nm_001768的位置815
‑
1021处的207个核苷酸翻译的69个氨基酸组成。优选实施方案的cd3ζ信号传导结构域包含从genbank登录号nm_000734的位置1022
‑
1360处的339个核苷酸翻译的112个氨基酸。
[0202]
在car的胞外结构域(包含抗原结合结构域)与跨膜结构域之间，或在car的胞质结构域与跨膜结构域之间，可以并入间隔物或铰链结构域。如本文所用，术语“间隔物”通常意指起到将跨膜结构域连接到多肽链中的胞外结构域和/或胞质结构域的作用的任何寡肽或多肽。如本文所用，铰链结构域通常意指起到为car或其结构域提供柔性和/或防止car或其结构域的空间位阻的作用的任何寡肽或多肽。在一些实施方案中，间隔物或铰链结构域可以包含至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选5至20个氨基酸。还应理解，car的其他区域中可以包含一个或更多个间隔物，因为本公开内容的方面在这方面不受限制。
[0203]
应理解，car可以包含具有本文提供的序列的区域(例如，抗原结合结构域、跨膜结构域、胞质结构域、信号传导结构域、安全结构域和/或接头，或其任何组合)或其变体或其任一者的片段(例如，保留car活性所需功能的变体和/或片段)，可以包含在本文所述的car蛋白中。在一些实施方案中，变体相对于所示序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。在一些实施方案中，变体具有与所示序列至少80％、至少85％、至少90％、90％
‑
95％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，片段比本文提供的序列短1
‑
5、5
‑
10、10
‑
20、20
‑
30、30
‑
40或40
‑
50个氨基酸。在一些实施方案中，片段在所提供序列的n
‑
末端、c
‑
末端或两个末端区域较短。在一些实施方案中，片段包含本文提供的序列中氨基酸数量的80％
‑
85％、85％
‑
90％、90％
‑
95％或95％
‑
99％。
[0204]
在另一些实施方案中，本公开内容包含编码本文公开的氨基酸序列的核酸序列。
[0205]
在一些实施方案中，以上示例性的非限制排列从左到右是car的n
‑
末端到c
‑
末端。car可以包含或还包含如本文所述的元件的任何其他组合。
[0206]
一旦鉴定了car构建体及其各个部分，就会产生表达car的免疫细胞，从而免疫细胞表达car。该方法包括用本文所述的核酸分子(例如，rna分子，例如，mrna)或包含编码car(例如，本文所述的car)的核酸分子的载体引入(例如转导)免疫细胞中。本公开内容还提供了一种生成细胞群(例如，瞬时表达外源rna的rna基因工程化细胞)的方法。该方法包括将本文所述的rna(例如，体外转录的rna或合成rna；编码本文所述的car多肽的mrna序列)引入细胞中。在一些实施方案中，rna瞬时表达car多肽。在一个实施方案中，细胞是如本文所述的细胞，例如免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞，或细胞群)。
[0207]
可以以基于细胞/千克(细胞/kg)施用这些细胞的受试者体重的剂量施用表达car的免疫细胞。例如，在一些实施方案中，向受试者施用约1x106至约1x108细胞/kg(例如，约1x106至约2x106、约2x106至约3x106about、约3x106至约4x106、约4x106至约5x106、约5x106至约6x106、约6x106至约7x106、约7x106至约8x106、约8x106至约9x106、约9x106至约1x107、约1x107至约2x107、约2x107至约3x107、约3x107至约4x107、约4x107至约5x107、约5x107至约6x107、约6x107至约76x107、约8x107至约9x107、约9x107至约1x108、约1x106、约1x107或约1x108细胞/kg)。在一个实施方案中，向受试者施用约1x106至约2x106细胞/kg的基因工程化car t细胞(例如，约1x106、约1.1x106、约1.2x106、约1.3x106、约1.4x106、约1.5x106、约
1.6x106、约1.7x106、约1.8x106、约1.9x106或约2x106细胞/kg)。
[0208]
在一些实施方案中，表达car的免疫细胞剂量为约104至约10
10
细胞/kg体重，例如约105至约109、约105至约108、约105至约107或约105至106，取决于施用的方式和位置。通常，在全身施用的情况下，使用比局部施用更高的剂量，其中将本发明的免疫细胞施用在肿瘤区域中。示例性剂量范围包括但不限于1
×
104至1
×
108、2
×
104至1
×
108、3
×
104至1
×
108、4
×
104至1
×
108、5
×
104至1
×
108、6
×
104至1
×
108、7
×
104至1
×
108、8
×
104至1
×
108、9
×
104至1
×
108、1
×
105至1
×
108，例如1
×
105至9
×
107、1
×
105至8
×
107、1
×
105至7
×
107、1
×
105至6
×
107、1
×
105至5
×
107、1
×
105至4
×
107、1
×
105至3
×
107、1
×
105至2
×
107、1
×
105至1
×
107、1
×
105至9
×
106、1
×
105至8
×
106、1
×
105至7
×
106、1
×
105至6
×
106、1
×
105至5
×
106、1
×
105至4
×
106、1
×
105至3
×
106、1
×
105至2
×
106、1
×
105至1
×
106、2
×
105至9
×
107、2
×
105至8
×
107、2
×
105至7
×
107、2
×
105至6
×
107、2
×
105至5
×
107、2
×
105至4
×
107、2
×
105至3
×
107、2
×
105至2
×
107、2
×
105至1
×
107、2
×
105至9
×
106、2
×
105至8
×
106、2
×
105至7
×
106、2
×
105至6
×
106、2
×
105至5
×
106、2
×
105至4
×
106、3
×
105至3
×
106细胞/kg等。示例性剂量范围还可以包括但不限于5
×
105至1
×
108，例如6
×
105至1
×
108、7
×
105至1
×
108、8
×
105至1
×
108、9
×
105至1
×
108、1
×
106至1
×
108、1
×
106至9
×
107、1
×
106至8
×
107、1
×
106至7
×
107、1
×
106至6
×
107、1
×
106至5
×
107、1
×
106至4
×
107、1
×
106至3
×
107细胞/kg等。示例性细胞剂量包括但不限于在约104至约10
10
细胞/kg范围内的约1
×
104、约2
×
104、约3
×
104、约4
×
104、约5
×
104、约6
×
104、约7
×
104、约8
×
104、约9
×
104、约1
×
105、约2
×
105、约3
×
105、约4
×
105、约5
×
105、约6
×
105、约7
×
105、约8
×
105、约9
×
105、约1
×
106、约2
×
106、约3
×
106、约4
×
106、约5
×
106、约6
×
106、约7
×
106、约8
×
106、约9
×
107、约1
×
107、约2
×
107、约3
×
107、约4
×
107、约5
×
107、约6
×
107、约7
×
107、约8
×
107、约9
×
107、约1
×
108、约2
×
108、约3
×
108、约4
×
108、约5
×
108、约6
×
108、约7
×
108、约8
×
108、约9
×
108、约1
×
109等的剂量。
[0209]
在一些实施方案中，表达car的免疫细胞(例如car
‑
t细胞)的剂量是非基于重量的确定，而是基于施用的细胞总数。例如，在一些实施方案中，向受试者施用约1x107至约9x108细胞的总剂量(例如，约1x107至约9x108、约1x107至约8x108、约1x107至约7x108、约1x107至约6x108、约1x107至约5x108、约1x107至约4x108、约1x107至约3x108、约1x107至约2x108、约1x107至约1x108、约2x107至约9x108、3x107至约8x108、约4x107至约7x108、约5x107至约6x108、约6x107至约6x108细胞)。在一些实施方案中，向受试者施用约9x108细胞或更少(例如，约9x108或更少、约8x108或更少、约7x108或更少、约6x108或更少、约5x108或更少、约4x108或更少、约3x108或更少、约2x108或更少、约1x108或更少、约9x107或更少、约8x107或更少、约7x107或更少、约6x107或更少、约5x107或更少、约4x107或更少、约3x107或更少、约2x107或更少或约1x107或更少的细胞)。
[0210]
在一个实施方案中，表达car的免疫细胞是阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)，一种cd19导向的经基因修饰的自体t细胞免疫疗法。因此，在一些实施方案中，在施用(例如，通过灌注)治疗有效量的阿基仑赛之前，受试者用淋巴耗竭剂量的抗
‑
cd45抗体药物缀合物(adc)预处理，其中抗
‑
cd45 adc包含通过接头与细胞毒素缀合的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，在施用阿基仑赛之前大约1小时。受试者用对乙酰氨基酚(例如，650mg po)和h1
‑
抗组胺药(例如，苯海拉明12.5mg静脉内或po)预先医治。在某些实施方案中，向受试者施用全身皮质甾类。
[0211]
在一些实施方案中，阿基仑赛的给药是基于嵌合抗原受体(car)阳性活t细胞的数量。在某些实施方案中，向受试者施用一剂阿基仑赛，包含2x106car阳性活t细胞/kg体重，最大值为2
×
108car阳性活t细胞。
[0212]
在一些实施方案中，施用阿基仑赛的受试者是具有复发性或难治性大b细胞淋巴瘤的成年受试者。在某些实施方案中，b细胞淋巴瘤是未另外指定的弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、高级别b细胞淋巴瘤和源自滤泡性淋巴瘤的dlbcl。在一些实施方案中，受试者之前已经接受过两线或更多线全身疗法。在一些实施方案中，受试者不患有原发性中枢神经系统淋巴瘤。
[0213]
在另一个实施方案中，在施用阿基仑赛之前，受试者未施用淋巴耗竭化疗剂，例如氟达拉滨或环磷酰胺。
[0214]
在一个实施方案中，表达car的免疫细胞是tisagenlecleucel，一种cd19导向的经基因修饰的自体t细胞免疫疗法。因此，在一些实施方案中，在施用(例如，通过灌注)治疗有效量的tisagenlecleucel之前，受试者用淋巴耗竭剂量的抗
‑
cd45抗体药物缀合物(adc)预处理，其中抗
‑
cd45 adc包含通过接头与细胞毒素缀合的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，在施用tisagenlecleucel之前大约30分钟至60分钟，受试者用对乙酰氨基酚和h1
‑
抗组胺药(例如，苯海拉明)预先医治。在某些实施方案中，受试者未施用全身皮质甾类。
[0215]
在一些实施方案中，tisagenlecleucel的剂量是基于嵌合抗原受体(car)阳性活t细胞的数量。在某些实施方案中，受试者患有小儿或年轻成人b细胞all并且年龄至多25岁。在一些此类实施方案中，如果受试者体重为50kg或更少，则向患有小儿或年轻成人b细胞all的受试者施用包含以下的一剂tisagenlecleucel：(i)如果患者体重为50kg或更少，则静脉内0.2至5.0x106car阳性活t细胞/kg体重，或(ii)如果患者体重超过50kg，则静脉内0.1至2.5x108总car阳性活t细胞(非基于体重)。
[0216]
在一些实施方案中，施用tisagenlecleucel的受试者是具有复发性或难治性大b细胞淋巴瘤的成年受试者。在一些实施方案中，向患有成人复发性或难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤的受试者静脉内施用一剂包含0.6至6.0x108car阳性活t细胞的tisagenlecleucel。在某些实施方案中，b细胞淋巴瘤是是未另外指定的弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、高级别b细胞淋巴瘤和源自滤泡性淋巴瘤的dlbcl。在一些实施方案中，受试者之前已经接受过两线或更多线全身疗法。在一些实施方案中，受试者不患有原发性中枢神经系统淋巴瘤。
[0217]
在另一个实施方案中，在施用tisagenlecleucel之前，人受试者未施用淋巴耗竭化疗剂，例如氟达拉滨、环磷酰胺或苯达莫司汀。
[0218]
还可以调整表达car的免疫细胞的剂量，以考虑要施用单剂量还是要施用多剂量。什么被认为是有效剂量的精确确定可以是基于每个受试者个体的因素，包括他们的大小、年龄、性别、体重和特定受试者的状况，如上所述。剂量可以通过本领域技术人员基于本文的公开内容和本领域的知识容易地确定。
[0219]
可以以任何合适的方式进行向受试者施用表达car的免疫细胞。在一些实施方案中，向患者皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、静脉内(例如，通过灌注)或腹膜内施用细胞。在一个实施方案中，向患者通过皮下注射施用细胞。在另一个实施方案中，静脉内施用细
胞。在某些实施方案中，可以将细胞直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。任选地，可以在施用细胞之前、期间或之后向受试者施用扩增剂和/或分化剂以在体内增加细胞的产生。
[0220]
iii.抗
‑
cd45抗体药物缀合物(adc)
[0221]
如本文所述，抗
‑
cd45 adc可以与car疗法组合使用以在人患者中治疗癌症或自身免疫病。更具体地，抗
‑
cd45 adc可用于在也接受car疗法的人受试者中耗竭cd45+细胞(例如，cd45+淋巴细胞)。抗
‑
cd45 adc靶向内源性淋巴细胞并且杀伤这些细胞，使得患者的免疫系统不攻击施用到受试者的表达car的免疫细胞(自体或同种异体的)。因此，抗
‑
cd45 adc与car疗法组合用作预处理步骤以在受体患者中促进基因工程化的表达car的免疫细胞的接受。使用抗
‑
cd45 adc作为预处理方案的一个优点是相对于更传统的car疗法预处理方法(其中向受试者施用一般的淋巴耗竭化疗剂)，表达cd45的内源性淋巴细胞可以被特异性地靶向以耗竭。
[0222]
抗
‑
cd45抗体
[0223]
能够结合cd45的adc可用作治疗剂以通过预防或降低对表达car的免疫细胞排斥的风险来在人患者中促进表达car的免疫细胞的接受。
[0224]
本文所述的抗
‑
cd45 adc包含与细胞毒素连接的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合部分。
[0225]
cd45是一种对t和b细胞抗原受体介导的信号传导必不可少的造血细胞特异性跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶。cd45包含大的胞外结构域和含有磷酸酶的胞质结构域。根据刺激的性质和所涉及的细胞类型，cd45可以充当正调节和负调节。尽管cd45基因中可能存在大量置换，但是传统上在人中仅鉴定出六种同种型。这些同种型是ra(uniprot登录号：p08575
‑
8；seq id no：20)、ro(ncbi登录号：np_563578.2；seq id no：21)、rb(ncbi登录号：xp_006711537.1；seq id no：22)、rab(ncbi登录号：xp_006711535.1；seq id no：23)、rbc(ncbi登录号：xp_006711536.1；seq id no：24)和rabc(ncbi登录号：np_002829.3；seq id no：25)(hermiston等.2003“cd45:a critical regulator of signaling thresholds inimmune cells.”annu rev immunol.2:107
‑
137)。cd45ra在幼稚t细胞上表达，cd45ro在活化和记忆t细胞、一些b细胞亚群、活化的单核细胞/巨噬细胞和粒细胞上表达。cd45rb在外周b细胞、幼稚t细胞、胸腺细胞上表达，在巨噬细胞和树突细胞上表达较弱。
[0226]
在一个实施方案中，本文提供了抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段，其包含结合区(例如cdr)、可变区(对应于ab1的那些)。ab1的重链可变区(vh)氨基酸序列在seq id no：7中阐述(参见表4)。ab1的vh cdr结构域氨基酸序列在seq id no：1(cdr
‑
h1)；seq id no：2(cdr
‑
h2)和seq id no：3(cdr
‑
h3)中阐述。ab1的轻链可变区(vl)氨基酸序列在seq id no：8中描述(参见表4)。ab1的vlcdr结构域氨基酸序列中seq id no:4(cdr
‑
l1)；seq id no：5(cdr
‑
l2)和seq id no：6(cdr
‑
l3)中阐述。因此，在一个实施方案中，本公开内容提供了可以与本文所述的组合物和方法结合使用的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段，其包括具有一种或更多种或全部的以下cdr的那些：
[0227]
a.具有氨基酸序列ftfnnywmt(seq id no：1)的cdr
‑
h1；
[0228]
b.具有氨基酸序列sisssggsiyypdsvkg(seq id no：2)的cdr
‑
h2；
[0229]
c.具有氨基酸序列arderwagamda(seq id no：3)的cdr
‑
h3；
[0230]
d.具有氨基酸序列kasqninknld(seq id no：4)的cdr
‑
l1；
[0231]
e.具有氨基酸序列etnnlqt(seq id no：5)的cdr
‑
l2；和
[0232]
f.具有氨基酸序列yqhnsrft(seq id no：6)的cdr
‑
l3。
[0233]
在某些实施方案中，本公开内容提供了可以与本文所述的组合物和方法结合使用的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段，其包括具有一种或更多种或全部的以下重链和轻链可变区的那些：
[0234]
ab1重链(hc)可变区(cdr加下划线)：
[0235]
evqlvesggdrvqpgrsltlscvtsgftfnnywmtwirqvpgkglewvasisssggsiyypdsvkgrftisrdnakntlylqmnslrsedtatyycarderwagamdawgqgtsvtvss(seq id no：7)；和
[0236]
ab1轻链(lc)可变区(cdr加下划线)：
[0237]
diqmtqsppvlsasvgdrvtlsckasqninknldwyqqkhgeapklliyetnnlqtgipsrfsgsgsgtdytltisslqpedvatyycyqhnsrftfgsgtkleik(seq id no：8)。
[0238]
在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链(hc)可变区，其包含含有seq id no：7或seq id no：7变体的hc可变结构域，该变体(i)在1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失上不同于seq id no：7；(ii)在至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失上不同于seq id no：7；(iii)在1
‑
5、1
‑
3、1
‑
2、2
‑
5或3
‑
5个氨基酸取代、添加或缺失上不同于seq id no：7和/或(iv)包含与seq id no：7至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)
‑
(iv)的任一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中相对于seq id no：7的生物活性，经修饰的重链可变区具有增强的生物活性。
[0239]
在某些实施方案中，抗体包含经修饰的轻链(lc)可变区，其包含含有seq id no：8或seq id no：8的变体的lc可变结构域，该变体(i)在1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失上不同于seq id no：8；(ii)在至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失上不同于seq id no：8；(iii)在1
‑
5、1
‑
3、1
‑
2、2
‑
5或3
‑
5个氨基酸取代、添加或缺失上不同于seq id no：8和/或(iv)包含与seq id no：8至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)
‑
(iv)的任一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中相对于seq id no：8的生物活性，经修饰的重链可变区具有增强的生物活性。
[0240]
在某些实施方案中，抗
‑
cd45抗体包含本文所述的cdr(seq id no：1至3和4至6)，其中cdr包含保守氨基酸取代(或2、3、4或5个氨基酸取代)。
[0241]
本文还考虑了与被ab1结合的人cd45上的表位(或具有ab1结合区的抗体)结合的抗
‑
人cd45抗体或其片段。还考虑了与ab1(或具有ab1结合区的抗体)竞争的抗
‑
人cd45抗体或其抗原结合片段。
[0242]
在一些实施方案中，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段在包含氨基酸序列rngpheryhleveagnt(seq id no：27)的区域与人cd45特异性结合。例如，在某些实施方案中，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段在seq id no：26(对应于np_002829的cd45同种型的片段)的氨基酸残基486r、493y和502t处与人cd45特异性结合，或在其他人cd45同种型中包含序列rngpheryhleveagnt(seq id no：27；粗体残基表示结合位点)的区域中与其相对应的残基处与人cd45特异性结合。在一些实施方案中，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段与人cd45的纤连蛋白结构域(例如，纤连蛋白d4结构域)特异性结合。
[0243]
在一个实施方案中，分离的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合部分与包含seq id no：26
的残基486r、493y和502t的人cd45的表位特异性结合，并且还与食蟹猴和/或恒河猴cd45结合。
[0244]
在一个实施方案中，分离的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合部分与包含氨基酸序列rngpheryhleveagnt(seq id no：27)的人cd45的表位特异性结合，并且还与食蟹猴和/或恒河猴cd45结合。
[0245]
在一个实施方案中，分离的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合部分与包含氨基酸序列crpprdrngpheryhleveagntlvrneshk(seq id no：28)的人cd45的表位特异性结合，并且还与食蟹猴和/或恒河猴cd45结合。
[0246]
在一个实施方案中，分离的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合部分与包含seq id no：26的残基486r、493y和502t的人cd45的表位特异性结合；与包含rngpheryhleveagnt(seq id no：27)的肽中的至少一个另外的氨基酸、至少两个另外的氨基酸、至少三个另外的氨基酸、至少四个另外的氨基酸或至少五个另外的氨基酸结合，其中另外的氨基酸残基不是seq id no：26的残基486r、493y和502t；并且还与食蟹猴和恒河猴cd45结合。
[0247]
在一些实施方案中，抗
‑
cd45抗体能够结合人cd45的各种同种型的胞外结构域。因此，在某些实施方案中，本文中的抗体是泛特异性抗
‑
cd45抗体(即，结合所有六种人cd45同种型的抗体)。此外，ab1(或具有该抗体的结合区或特异性的抗体)还可以与食蟹猴cd45结合。
[0248]
在一些示例性实施方案中，与本文所述的预处理方法结合使用的抗
‑
cd45抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段、多克隆抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、全人抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、双可变免疫球蛋白结构域、单链fv分子(scfv)、双抗体、三抗体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、fv片段、fab片段、f(ab’)2分子或串联di
‑
scfv。以下提供了可以全部或部分用于本文所述的adc或方法的其他示例性抗
‑
cd45抗体。
[0249]
在一个实施方案中，抗
‑
cd45抗体是或衍生自克隆hi30(其可从(san diego,ca)商购获得)或其人源化变体。抗体的人源化可以通过根据本领域已知的程序(如例如以下实施例7中所述)用种系人抗体的框架残基和恒定区残基替换非人抗体的框架残基和恒定区残基来进行。可以与本文所述的方法结合使用的另外的抗
‑
cd45抗体包括抗
‑
cd45抗体ab10558、ep322y、mem
‑
28、ab10559、0.n.125、f10
‑
89
‑
4、hie
‑
1、2b11、yth24.5、pd7/26/16、f10
‑
89
‑
4、1b7、ab154885、b
‑
a11、荧光体s1007、ab170444、ep350、y321、ga90、d3/9、x1 6/99和lt45(其可从(cambridge,ma)商购获得)及其人源化变体。可以与本文所述的患者预处理程序结合使用的另外的抗
‑
cd45抗体包括抗
‑
cd45抗体hpa000440(其可从(st.louis,mo)商购获得)及其人源化变体。可以与本文所述的患者预处理方法结合使用的另外的抗
‑
cd45抗体包括鼠单克隆抗体bc8(其例如在matthews等,blood 78:1864
‑
1874,1991中被描述，由于它涉及抗
‑
cd45抗体，其公开内容通过引用并入本文)及其人源化变体。可以与本文所述的方法结合使用的另外的抗
‑
cd45抗体包括单克隆抗体yaml568(其例如在glatting等,j.nucl.med.8:1335
‑
1341,2006中被描述，由于它涉及抗
‑
cd45抗体，其公开内容通过引用并入本文)及其人源化变体。可以与本文所述的患者预处理程序结合使用的另外的抗
‑
cd45抗体包括单克隆抗体yth54.12和
yth25.4(其例如在brenner等,ann.n.y.acad.sci.996:80
‑
88,2003中被描述，由于它涉及抗
‑
cd45抗体，其公开内容通过引用并入本文)及其人源化变体。用于本文所述的患者预处理方法的另外的抗
‑
cd45抗体包括uchl1、2h4、sn130、md4.3、mbi和mt2(其例如在brown等,immunology64:331
‑
336,1998中被描述，由于它涉及抗
‑
cd45抗体，其公开内容通过引用并入本文)及其人源化变体。可以与本文所述的方法结合使用的另外的抗
‑
cd45抗体包括由美国典型培养物保藏中心(atcc)登录号ra3
‑
6132、ra3
‑
2c2和tib122产生和释放的那些，以及单克隆抗体c363.16a和13/2(其例如在johnson等,j.exp.med.169:1179
‑
1184,1989中被描述，由于它涉及抗
‑
cd45抗体，其公开内容通过引用并入本文)及其人源化变体。可以与本文所述的患者预处理方法结合使用的另外的抗
‑
cd45抗体包括单克隆抗体ahn
‑
12.1、ahn
‑
12、ahn
‑
12.2、ahn
‑
12.3、ahn
‑
12.4、hle
‑
1和kc56(t200)(其例如在harvath等,j.immunol.146:949
‑
957,1991中被描述，由于它涉及抗
‑
cd45抗体，其公开内容通过引用并入本文)及其人源化变体。
[0250]
可以与本文所述的患者预处理方法结合使用的另外的抗
‑
cd45抗体包括在例如在美国专利号7,265,212(其描述了例如抗
‑
cd45抗体39e11、16c9和1g10等)中描述的那些克隆)；7,160,987(其描述了例如由atcc登录号hb
‑
11873产生和释放的抗
‑
cd45抗体，例如单克隆抗体6g3)；和6,099,838(其描述了例如抗
‑
cd45抗体mt3，以及由atcc登录号hb220(也称为mb23g2)和hb223产生和释放的抗体)，以及us 2004/0096901和us2008/0003224(其描述了例如由atcc登录号pta
‑
7339产生和释放的抗
‑
cd45抗体，例如单克隆抗体17.1)中描述的那些，由于它们涉及抗
‑
cd45抗体，其中每一篇的公开内容通过引用并入本文。
[0251]
可以与本文所述的患者预处理方法结合使用的另外的抗
‑
cd45抗体包括由atcc登录号mb4b4、mb23g2、14.8、gap 8.3、74
‑9‑
3、i/24.d6、9.4、4b2、m1/9.3.4.hl.2产生和释放的抗体，以及其人源化和/或亲和力成熟的变体。亲和力成熟可以例如使用本文所述或本领域已知的体外展示技术(例如噬菌体展示)进行，如以下实施例6中所述。
[0252]
可以与本文所述的患者预处理方法结合使用的另外的抗
‑
cd45抗体包括抗
‑
cd45抗体t29/33，其例如在morikawa等,int.j.hematol.54:495
‑
504,1991中被描述，因为它涉及抗
‑
cd45抗体，其公开内容通过引用并入本文。
[0253]
在某些实施方案中，抗
‑
cd45抗体选自艾妥单抗(也称为90y
‑
bc8、iomab
‑
b、bc8；如在例如us20170326259、wo2017155937和orozco等.blood.127.3(2016):352
‑
359)或bc8
‑
b10(如例如在li等.plos one 13.10(2018):e0205135.中所述)，其中每一篇通过引用并入。其他抗
‑
cd45抗体已经例如在wo2003/048327、wo2016/016442、us2017/0226209、us2016/0152733、us9,701,756；us2011/0076270或us7,825,222中被描述，其中每一篇通过引用整体并入。
[0254]
例如，在一个实施方案中，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段包含结合区(例如cdr)、可变区(对应于艾妥单抗的那些)。艾妥单抗的重链可变区(vh)氨基酸序列在seq id no：31中阐述(参见表4)。艾妥单抗的轻链可变区(vl)氨基酸序列在seq id no：32中被描述(参见表4)。在另一些实施方案中，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no：31中所述的氨基酸残基的可变重链和如在seq id no：32中所述的的轻链可变区。在一个实施方案中，抗
‑
cd45抗体包含含有艾妥单抗的cdr1、cdr2和cdr3的重链，和含有艾妥单抗的cdr1、cdr2和cdr3的轻链可变区。
[0255]
在一个实施方案中，抗
‑
cd45抗体包含本文所述的抗
‑
cd45抗体的重链和本文所述的抗
‑
cd45抗体的轻链可变区。在一个实施方案中，抗
‑
cd45抗体包含含有本文所述的抗
‑
cd45抗体的cdr1、cdr2和cdr3的重链和含有包含本文所述的抗
‑
cd45抗体的cdr1、cdr2和cdr3的轻链可变区。
[0256]
在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含与本文的抗
‑
cd45抗体具有至少95％同一性，例如与本文的抗
‑
cd45抗体具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链(hc)可变区，其包含本文的抗
‑
cd45抗体或其变体的hc可变结构域，该变体(i)在1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失上不同于抗
‑
cd45抗体；(ii)在至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失上不同于抗
‑
cd45抗体；(iii)在1
‑
5、1
‑
3、1
‑
2、2
‑
5或3
‑
5个氨基酸取代、添加或缺失上不同于抗
‑
cd45抗体和/或(iv)包含与抗
‑
cd45抗体至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)
‑
(iv)的任一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中相对于抗
‑
cd45抗体的重链可变区，经修饰的重链可变区可以具有增强的生物活性，同时保留抗体的cd45结合特异性。
[0257]
在一个实施方案中，本文公开的方法和组合物包含与人cd45(和可能来自一种或更多种非人物种的cd45)特异性结合但基本上不与非
‑
cd45蛋白结合的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段。在实施方案中，抗体或其片段以1x10
‑7m或更小的k
d
、5x10
‑8m或更小的k
d
、3x10
‑8m或更小的k
d
、1x10
‑8m或更小的k
d
、5x10
‑9m或更小的k
d
、1x10
‑
10
m或更小的k
d
、或1x10
‑
11
m或更小的k
d
结合人cd45。
[0258]
此外，在某些实施方案中，抗
‑
cd45 adc在人受试者中的血清半衰期为约3天或更短。在某些实施方案中，本文所述的抗
‑
cd45的半衰期(例如，在人中)等于或小于约24小时、等于或小于约23小时、等于或小于约22小时、等于或小于约21小时、等于或小于约20小时、等于或小于约19小时、等于或小于约18小时、等于或小于约17小时、等于或小于约16小时、等于或小于约15小时、等于或小于约14小时、等于或小于小于约13小时，等于或小于约12小时，或等于或小于约11小时。
[0259]
在一个实施方案中，本文所述的抗
‑
cd45抗体的半衰期(例如，在人中)为约1
‑
5小时、约5
‑
10小时、约10
‑
15小时、约15
‑
20小时或约20至25小时。
[0260]
可用于本文所述的adc的另外的抗
‑
cd45抗体可以使用本领域已知的技术(例如杂交瘤产生)来鉴定。杂交瘤可以使用鼠系统制备。免疫和随后分离用于融合的脾细胞的协议是本领域已知的。融合配偶体和杂交瘤生成的程序也是已知的。可替代地，可以使用humab
‑
或xenomouse
tm
生成抗
‑
cd45抗体。在制备另外的抗
‑
cd45抗体中，cd45抗原被分离和/或纯化。cd45抗原可以是来自cd45胞外结构域的cd45片段。动物的免疫可以通过本领域已知的任何方法进行。参见，例如harlow和lane,antibodies:a laboratory manual,new york:cold spring harbor press,1990。用于免疫动物(例如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马)的方法是本领域众所周知的。参见，例如，harlow和lane，同上，以及美国专利号5,994,619。cd45抗原可以与佐剂一起施用以刺激免疫反应。本领域已知的佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、ribi(胞壁酰二肽)或iscom(免疫刺激复合物)。在用cd45抗原免疫动物之后，从免疫动物中分离的细胞制备产生抗体的永生化细胞系。免疫后，动物被处死，并通过本领域已知的方法使淋巴结和/或脾b细胞永生化(例如致癌基因转移、致癌病毒转导、暴露
于致癌物质或突变化合物、与永生化细胞融合(例如骨髓瘤细胞)和灭活肿瘤抑制基因。参见，例如harlow和lane，同上。可以选择、克隆和进一步筛选杂交瘤用于期望的特征，包括强健生长、高抗体产生和期望的抗体特征。
[0261]
用于本文所述的抗
‑
cd45 adc的抗
‑
cd45抗体还可以使用高通量筛选抗体或抗体片段文库中能够结合cd45的分子来鉴定。此类方法包括本领域已知的体外展示技术，例如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、核糖体展示、mrna展示和cdna展示等。使用噬菌体展示来分离抗体、抗原结合片段或结合生物相关分子的配体已经在例如felici等,biotechnol.annual rev.1:149
‑
183,1995；katz,annual rev.biophys.biomol.struct.26:27
‑
45,1997；和hoogenboom等,immunotechnology 4:1
‑
20,1998中概述，由于它们涉及体外展示技术，其中每一篇的公开内容通过引用并入本文。已经构建了随机组合肽文库来选择结合细胞表面抗原的多肽，如kay,perspect.drug discovery des.2:251
‑
268,1995和kay等,mol.divers.1:139
‑
140,1996中所述，由于它们涉及抗原结合分子的发现，其中每一篇的公开内容通过引用并入本文。蛋白质(例如多聚体蛋白质)已经成功地噬菌体展示为功能分子(参见，例如ep 0349578；ep 4527839；和ep 0589877，以及chiswell和mccafferty,trends biotechnol.10:80
‑
84 1992，由于它们涉及使用体外展示用于发现抗原结合分子，其中每一篇的公开内容通过引用并入本文。另外，功能抗体片段(例如fab和scfv片段)已经以体外展示形式表达(参见，例如mccafferty等,nature 348:552
‑
554,1990；barbas等,proc.natl.acad.sci.usa88:7978
‑
7982,1991；和clackson等,nature 352:624
‑
628,1991，由于它们涉及用于发现抗原结合分子的体外展示平台，其中每一篇的公开内容通过引用并入本文)。
[0262]
除了体外展示技术之外，可以使用计算建模技术来计算机设计和鉴定抗
‑
cd45抗体或抗体片段，例如，使用us 2013/0288373中所述的程序，由于它涉及用于识别抗
‑
cd45抗体的分子建模方法，其公开内容并入本文。例如，使用计算建模技术，本领域技术人员可以计算机筛选抗体或抗体片段文库中能够结合cd45上的特定表位(例如cd45的细胞外表位)的分子。
[0263]
在一个实施方案中，用于本文所述的adc的抗
‑
cd5抗体能够内化到细胞中。在鉴定抗
‑
cd5抗体(或其片段)时，可以使用另外的技术来鉴定在细胞(例如，淋巴细胞)表面上结合cd5并且还能够被细胞内化(例如，通过受体介导的内吞作用)的抗体或抗原结合片段。例如，上述体外展示技术可适于筛选在造血干细胞表面上结合cd5并随后内在化的抗体或其抗原结合片段。噬菌体展示代表了一种可以与这种筛选模式结合使用的技术。为了鉴定结合cd5并随后内在化为cd5+细胞的抗
‑
cd5抗体或其片段，本领域技术人员可以使用williams等,leukemia 19:1432
‑
1438,2005中所述的噬菌体展示技术，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0264]
抗
‑
cd5抗体或其片段的内在化能力可以例如使用本领域已知的放射性核素内在化测定来评估。例如，使用本文所述或本领域已知的体外展示技术鉴定的抗
‑
cd5抗体或其片段可以通过并入放射性同位素来功能化，例如
18
f、
75
br、
77
br、
122
i、
123
i、
124
i、
125
i、
129
i、
131
i、
211
at、
67
ga、
111
in、
99
tc、
169
yb、
186
re、
64
cu、
67
cu、
177
lu、
77
as、
72
as、
86
y、
90
y、
89
zr、
212
bi、
213
bi或
225
ac。例如，放射性卤素，例如
18
f、
75
br、
77
br、
122
i、
123
i、
124
i、
125
i、
129
i、
131
i、
211
at，可以使用包含亲电子卤素试剂(例如，碘化珠，thermo fisher scientific,inc.,cambridge,ma)的珠
(例如，聚苯乙烯珠)并入到抗体、其片段或配体中。经放射性标记的抗体或其片段可以与造血干细胞一起孵育足以允许内在化的时间。内在化的抗体或其片段可以通过与回收的洗涤缓冲液发出的辐射(例如γ
‑
辐射)比较，检测所得造血干细胞发出的辐射(例如，γ
‑
辐射)来鉴定。前述内在化测定还可用于表征adc。
[0265]
在一些实施方案中，抗
‑
cd5抗体(或其片段)具有明确的血清半衰期。例如，抗
‑
cd5抗体(或其片段)在人患者中的血清半衰期可以为约1
‑
24小时。例如，含有此种抗
‑
cd5抗体的adc在人患者中的血清半衰期也可以为约1
‑
24小时。通过测量血清水平的药代动力学分析可以通过本领域已知的测定来进行。
[0266]
为了重组产生抗
‑
cd5抗体，分离编码抗体的核酸(例如如上所述)，并将其插入一种或更多种载体中，用以进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此种核酸。
[0267]
适用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和fc效应子功能时。关于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523(还参见charlton,methods in molecular biology,第248卷(b.k.c.lo,编辑,humana press,totowa,n.j.,2003),第245
‑
254页，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从细菌细胞糊中在可溶性级分中分离出抗体，并且可以进一步纯化。
[0268]
还可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由sv40(cos
‑
7)转化的猴肾cv1细胞系；人胚胎肾系(293或293细胞，如例如在graham等,j.gen virol.36:59(1977)中所述的)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠足细胞((tm4细胞，如例如在mather,biol.reprod.23:243
‑
251(1980)中所述的)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero
‑
76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck)；水牛鼠肝细胞(brl 3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hep g2)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562)；tri细胞，如例如在mather等,annals n.y.acad.sci.383:44
‑
68(1982)中所述的；mrc 5细胞；和fs4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr
‑
cho细胞(urlaub等,proc.natl.acad.sci.usa 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，例如y0、ns0和sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如，yazaki和wu,methods in molecular biology,第248卷(b.k.c.lo,编辑,humana press,totowa,n.j.),第255
‑
268页(2003)。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴细胞(例如，y0、ns0、sp20细胞)。
[0269]
fc修饰的抗体
[0270]
本公开内容部分基于如下发现，抗体或其抗原结合片段，具有允许fc沉默的fc修饰，能够结合由例如淋巴细胞表达的抗原，例如cd45，可以单独用作治疗剂或作为adc以(i)治疗癌症和自身免疫病；(ii)促进在需要移植治疗的患者中植入移植的造血干细胞。这些治疗活性可以例如由抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段(其与由细胞(例如淋巴细胞)表达的cd45结合)的结合引起。
[0271]
本文所述的抗体或结合片段还可以包含改变抗体和/或片段特性的修饰和/或突变，例如增加半衰期或增加或减少adcc的那些。
[0272]
在一个实施方案中，抗
‑
cd45抗体或其结合片段包含经修饰的fc区，其中所述经修饰的fc区包含相对于野生型fc区的至少一个氨基酸修饰，使得所述分子具有改变的亲和力用于或结合fcgammar(fcγr)。通过晶体学研究知道了fc区内的某些氨基酸位置以与fcγr直接接触。具体地，氨基酸234
‑
239(铰链区)、氨基酸265
‑
269(b/c环)、氨基酸297
‑
299(c'/e环)和氨基酸327
‑
332(f/g)环。(参见sondermann等，2000nature，406：267
‑
273)。在一些实施方案中，本文所述的抗体可以包含变体fc区，所述变体fc区包含基于结构和晶体学分析与fcγr直接接触的至少一个残基的修饰。在一个实施方案中，根据如kabat等,sequences of proteins of immunological interest,第5版.public health service,nh1,md(1991)，抗
‑
cd45抗体(或其片段)的fc区包含氨基酸265处的氨基酸取代，通过引用明确并入本文。“kabat中的eu索引”是指人igg1 eu抗体的编号。在一个实施方案中，fc区包含d265a突变。在一个实施方案中，fc区包含d265c突变。在一些实施方案中，根据如kabat中的eu索引，抗体(或其片段)的fc区包含氨基酸234处的氨基酸取代。
[0273]
在一个实施方案中，fc区包含d265、v205、h435、i253和/或h310的氨基酸位置处的突变。例如，这些位置处的特定突变包括d265c、v205c、h435a、i253a和/或h310a。
[0274]
在一个实施方案中，fc区包含l234a突变。在一些实施方案中，根据kabat中的eu索引，抗
‑
cd45抗体(或其片段)的fc区包含氨基酸235处的氨基酸取代。在一个实施方案中，fc区包含l235a突变。在又一个实施方案中，fc区包含l234a和l235a突变。在另一个实施方案中，fc区包含d265c、l234a和l235a突变。在又一个实施方案中，fc区包含d265c、l234a、l235a和h435a突变。在另一个实施方案中，fc区包含d265c和h435a突变。
[0275]
在又一个实施方案中，fc区包含l234a和l235a突变(在本文中也称为“l234a.l235a”或“lala”)。在另一个实施方案中，fc区包含l234a和l235a突变，其中fc区不包含p329g突变。在另一个实施方案中，fc区包含d265c、l234a和l235a突变(在本文中也称为“d265c.l234a.l235a”)。在另一个实施方案中，fc区包含d265c、l234a和l235a突变，其中fc区不包含p329g突变。在又一个实施方案中，fc区包含d265c、l234a、l235a和h435a突变(在本文中也称为“d265c.l234a.l235a.h435a”)。在另一个实施方案中，fc区包含d265c、l234a、l235a和h435a突变，其中fc区不包含p329g突变。在另一个实施方案中，fc区包含d265c和h435a突变(在本文中也称为“d265c.h435a”)。在又一个实施方案中，fc区包含d265a、s239c、l234a和l235a突变(在本文中也称为“d265a.s239c.l234a.l235a”)。在又一个实施方案中，fc区包含d265a、s239c、l234a和l235a突变，其中fc区不包含p329g突变。在另一个实施方案中，fc区包含d265c、n297g和h435a突变(在本文中也称为“d265c.n297g.h435a”)。在另一个实施方案中，fc区包含d265c、n297q和h435a突变(在本文中也称为“d265c.n297q.h435a”)。在另一个实施方案中，fc区包含e233p、l234v、l235a和delg236(缺失236)突变(在本文中也称为“e233p.l234v.l235a.delg236”或称为“eplvladelg”)。在另一个实施方案中，fc区包含e233p、l234v、l235a和delg236(缺失236)突变，其中fc区不包含p329g突变。在另一个实施方案中，fc区包含e233p、l234v、l235a、delg236(缺失236)和h435a突变(在本文中也称为“e233p.l234v.l235a.delg236.h435a”或称为“eplvladelg.h435a”)。在另一个实施方案中，fc区包含e233p、l234v、l235a、delg236(缺失236)和h435a突变，其中fc区不包含p329g突变。在另一个实施方案中，fc区包含l234a、l235a、s239c和d265a突变。在另一个实施方案中，fc区包含l234a、l235a、s239c和
d265a突变，其中fc区不包含p329g突变。在另一个实施方案中，fc区包含h435a、l234a、l235a和d265c突变。在另一个实施方案中，fc区包含h435a、l234a、l235a和d265c突变，其中fc区不包含p329g突变。
[0276]
在一些实施方案中，抗体具有经修饰的fc区，使得在体外效应子功能测定中抗体降低效应子功能，相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体与fcr的结合，与fc受体(fc r)的结合减少。在一些实施方案中，抗体具有经修饰的fc区，使得抗体在体外效应子功能测定中降低效应子功能，相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体与fcγr的结合，与fcγ受体(fc r)的结合减少。在一些实施方案中，fcγr是fcγr1。在一些实施方案中，fcγr是fcγr2a。在一些实施方案中，fcγr是fcγr2b。在另一些实施方案中，fcγr是fcγr2c。在一些实施方案中，fcγr是fcγr3a。在一些实施方案中，fcγr是fcγr3b。在另一些实施方案中，结合的减少是相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体与fcγr的结合，与fcγr结合的抗体减少至少70％、减少至少80％、减少至少90％、减少至少95％、减少至少98％、减少至少99％或减少100％。。在另一些实施方案中，结合的减少是相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体与fcγr的结合，与fcγr结合的抗体减少至少70％至100％、减少至少80％至100％、减少至少90％至100％、减少至少95％至100％或减少至少98％至100％。
[0277]
在一些实施方案中，抗体具有经修饰的fc区，使得在体外细胞因子释放测定中抗体减少细胞因子释放，相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体的细胞因子释放，细胞因子释放减少至少50％。在一些实施方案中，细胞因子释放的减少是相对于包含未修饰fc区的相同抗体的细胞因子释放，细胞因子释放减少至少70％、减少至少80％、减少至少90％、减少至少95％、减少至少98％、减少至少99％或减少100％。在一些实施方案中，细胞因子释放的减少是相对于包含未修饰fc区的相同抗体的细胞因子释放，细胞因子释放减少至少70％至100％、减少至少80％至100％、减少至少90％至100％、减少至少95％至100％。在某些实施方案中，细胞因子释放是通过免疫细胞。
[0278]
在一些实施方案中，抗体具有经修饰的fc区，使得在体外肥大细胞脱颗粒测定中抗体减少肥大细胞脱颗粒，相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体的肥大细胞脱颗粒，肥大细胞脱颗粒减少至少50％。在一些实施方案中，肥大细胞脱颗粒的减少是相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体的肥大细胞脱颗粒，肥大细胞脱颗粒减少至少70％、减少至少80％、减少至少90％、减少至少95％、减少至少98％、减少至少99％或减少100％。在一些实施方案中，肥大细胞脱颗粒的减少是相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体的肥大细胞脱颗粒，肥大细胞脱颗粒减少至少为70％至100％、减少至少80％至100％、减少至少90％至100％或减少至少95％至100％。
[0279]
在一些实施方案中，抗体具有经修饰的fc区，使得在体外抗体依赖性细胞吞噬作用测定中，抗体降低或防止抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)，相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体的adcp，adcp降低至少50％。在一些实施方案中，adcp的降低是相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体的细胞因子释放，细胞因子释放降低至少70％、降低至少80％、降低至少90％、降低至少95％、降低至少98％、降低至少99％或降低100％。
[0280]
在一些实施方案中，本文所述的抗hc抗体(例如，抗
‑
cd45抗体)包含fc区，该fc区包含以下修饰之一或这些修饰的组合：d265a、d265c、d265c/h435a、d265c/lala、d265c/lala/h435a、d265a/s239c/l234a/l235a/h435a、d265a/s239c/l234a/l235a、d265c/n297g、
d265c/n297g/h435a、d265c(eplvladelg*)、d265c(eplvladelg)/h435a、d265c/n297q/h435a、d265c/n297q、eplvladelg/h435a、eplvladelg/d265c、eplvladelg/d265a、n297a、n297g或n297q。在一些实施方案中，本文的抗
‑
cd45抗体包含fc区，该fc区包含以下修饰之一或这些修饰的组合：d265a、d265c、d265c/h435a、d265c/lala、d265c/lala/h435a、d265c/n297g、d265c/n297g/h435a、d265c(igg2*)、d265c(igg2)/h435a、d265c/n297q/h435a、d265c/n297q、eplvladelg/h435a、n297a、n297g或n297q。
[0281]
经修饰的fc区与fcγ受体之间的结合或亲和力可以使用本领域已知的多种技术确定，例如但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(elisa)；kinexa，rathanaswami等analytical biochemistry,第373:52
‑
60卷,2008；或放射免疫测定(ria))、或通过表面等离子体共振测定或基于动力学的测定的其他机制(例如，biacore.rtm分析或octet
tm
分析(fortebio))以及其他方法，例如间接结合测定、竞争性结合测定法、荧光共振能量转移(fret)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤)。这些和其他方法可以利用一种或更多种被检查的组分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。关于结合亲和力和动力学的详细描述可以在paul,w.e.,编辑,fundamental immunology,第4版,lippincott
‑
raven,philadelphia(1999)中发现，其聚焦于抗体
‑
免疫原的相互作用。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在递增量的未经标记的抗原的存在下，将经标记的抗原与目标抗体一起孵育，并且检测与经标记的抗原结合的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和力和结合解离率可以通过scatchard图分析从数据中确定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫测定来确定。在这种情况下，在递增量的未经标记的第二抗体的存在下，将抗原与与标记化合物缀合的目标抗体一起孵育。
[0282]
在一个实施方案中，相对于包含未经修饰的fc区的相同抗体与fcγ受体的结合，具有本文所述fc修饰的抗体(例如，d265c、l234a、l235a和/或h435a)与fcγ受体的结合减少至少70％、减少至少80％、减少至少90％、减少至少95％、减少至少98％、减少至少99％或减少100％(例如，如通过生物层干涉术(bli)评估)。
[0283]
不希望受任何理论的束缚，据信fc区与fcγ受体的结合相互作用是多种效应子功能和下游信号传导事件必不可少的，包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)。因此，在某些方面，包含经修饰的fc区(例如，包含l234a、l235a和/或d265c突变)的抗体具有显著减低或消除的效应子功能。效应子功能可以使用本领域已知的多种方法来测定，例如，通过测量对目标抗体的细胞响应(例如，肥大细胞脱颗粒或细胞因子释放)。例如，使用本领域的标准方法，可以测定fc修饰的抗体的触发肥大细胞脱颗粒的能力或触发细胞因子释放的能力，例如通过人外周血单核细胞。
[0284]
因此，在一个实施方案中，fc区包含导致半衰期减少(例如，相对于具有经未修饰的fc区的抗体)的突变。在其中预期抗体起短寿命治疗剂作用的某些情况(例如，本文所述的预处理步骤，其中在施用抗体之后car疗法)下，具有短半衰期的抗体可能是有利的。理想地，抗体在递送car疗法之前基本上被清除，car疗法通常也表达靶抗原(例如，cd45)，但是不是抗
‑
cd45抗体的靶标，不同于内源性干细胞。在一个实施方案中，fc区包含435位(根据kabat的eu索引)处的突变。在一个实施方案中，突变是h435a突变。
[0285]
在一个实施方案中，本文所述的抗
‑
cd45抗体的半衰期(例如，在人中)等于或小于约24小时、等于或小于约23小时、等于或小于约22小时、等于或小于约21小时、等于或小于
约20小时、等于或小于约19小时、等于或小于约18小时、等于或小于约17小时、等于或小于约16小时、等于或小于约15小时、等于或小于约14小时、等于或小于约13小时、等于或小于约12小时、或等于或小于约11小时。
[0286]
在一个实施方案中，本文所述的抗
‑
cd45抗体的半衰期(例如，在人中)为约1
‑
5小时、约5
‑
10小时、约10
‑
15小时、约15
‑
20小时或约20
‑
25小时。在一个实施方案中，抗
‑
hc抗体的半衰期为约5
‑
7小时；约5
‑
9小时；约5
‑
11小时；约5
‑
13小时；约5
‑
15小时；约5
‑
20小时；约5
‑
24小时；约7
‑
24小时；约9
‑
24小时；约11
‑
24小时；约12
‑
22小时；约10
‑
20小时；约8
‑
18小时；或约14
‑
24小时。
[0287]
在一些方面，fc区包含两个或更多个突变，这些突变赋予抗体减少的半衰期和降低的效应子功能。在一些实施方案中，fc区包含导致半衰期减少的突变和至少一个可以与fcγr直接接触的残基的突变(例如，基于结构和晶体学分析)。在一个实施方案中，fc区包含h435a突变、l234a突变和l235a突变。在一个实施方案中，fc区包含h435a突变和d265c突变。在一个实施方案中，fc区包含h435a突变、l234a突变、l235a突变和d265c突变。
[0288]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段通过抗体或其抗原结合片段的fc结构域中的半胱氨酸残基与细胞毒素(例如，鹅膏蕈毒素)缀合。在一些实施方案中，半胱氨酸残基通过抗体或其抗原结合片段的fc结构域中的突变引入。例如，半胱氨酸残基可以选自cys118、cys239和cys265。在一个实施方案中，抗
‑
cd45抗体(或其片段)的fc区包含氨基酸265(根据如kabat中的eu索引)处的氨基酸取代。在一个实施方案中，fc区包含d265c突变。在一个实施方案中，fc区包含d265c和h435a突变。在一个实施方案中，fc区包含d265c、l234a和l235a突变。在一个实施方案中，fc区包含d265c、l234a、l235a和h435a突变。在一个实施方案中，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段的fc区包含氨基酸239(根据如kabat中的eu索引)处的氨基酸取代。在一个实施方案中，fc区包含s239c突变。在一个实施方案中，fc区包含l234a突变、l235a突变、s239c突变和d265a突变。在另一个实施方案中，fc区包含s239c和h435a突变。在另一个实施方案中，fc区包含l234a突变、l235a突变和s239c突变。在又一个实施方案中，fc区包含h435a突变、l234a突变、l235a突变和s239c突变。在又一个实施方案中，fc区包含h435a突变、l234a突变、l235a突变、s239c突变和d265a突变。
[0289]
值得注意的是，除非另有说明，否则fc氨基酸位置参照eu编号索引。
[0290]
可以与本文所述的组合物和方法结合使用的抗体和抗原结合片段包括上述抗体及其抗原结合片段，以及上述那些非人抗体和抗原结合片段的人源化变体和结合与上述那些相同的表位的抗体或抗原结合片段，如例如通过竞争性抗原结合测定评估的。
[0291]
本公开内容的抗体可以通过引入另外的fc突变进一步基因工程化以进一步调整抗体半衰期，例如在(dall'acqua等(2006)j biol chem 281:23514
‑
24)、(zalevsky等(2010)nat biotechnol 28:157
‑
9)、(hinton等(2004)j biol chem279:6213
‑
6)、(hinton等(2006)j immunol 176:346
‑
56)、(shields等(2001)jbiol chem 276:6591
‑
604)、(petkova等(2006)int immunol 18:1759
‑
69)、(datta
‑
mannan等(2007)drug metab dispos 35:86
‑
94)、(vaccaro等(2005)nat biotechnol 23:1283
‑
8)、(yeung等(2010)cancer res 70:3269
‑
77)和(kim等(1999)eur j immunol 29:2819
‑
25)中描述的那些，并且包括250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435位。可以单独或组合制备的示例性突变是t250q、m252y、1253a、s254t、t256e、p2571、t307a、d376v、e380a、m428l、
h433k、n434s、n434a、n434h、n434f、h435a和h435r突变。
[0292]
用于将抗体基因工程化以包含本文中任何fc修饰的方法是本领域众所周知的。这些方法包括但不限于通过对编码抗体或至少抗体恒定区的制备的dna分子进行定点(或寡核苷酸介导的)诱变、pcr诱变和盒诱变的制备。定点诱变是本领域众所周知的(参见例如，carter等,nucleic acids res.,13:4431
‑
4443(1985)和kunkel等,proc.natl.acad.sci.usa,82:488(1987))。pcr诱变也适用于制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见higuchi,在pcr协议中,第177
‑
183页(academic press,1990)；和vallette等,nuc.acids res.17:723
‑
733(1989)。另一种用于制备序列变体的方法盒诱变是基于由威尔斯等,gene,34:315
‑
323(1985)所述的技术。
[0293]
细胞毒素
[0294]
多种细胞毒素可以通过用于本文所述的疗法组合的接头与抗
‑
cd45抗体缀合。特别地，抗
‑
cd45抗体包括与细胞毒性部分(或细胞毒素)缀合(即，通过接头共价附接)的抗体(或其抗原结合片段)。在多个实施方案中，当结合在缀合物中时，细胞毒性部分表现出降低的细胞毒性或没有细胞毒性，但是在从接头切割后恢复细胞毒性。在多个实施方案中，细胞毒性部分保持细胞毒性而不从接头切割。在一些实施方案中，细胞毒性分子与如本文公开的细胞内在化的抗体或其抗原结合片段缀合，使得在细胞摄取抗体或其片段之后，细胞毒素可以到达其细胞内靶标，并且例如介导t细胞死亡。
[0295]
本文所述的抗体、其抗原结合片段和配体(例如，识别并结合cd45的抗体、其抗原结合片段和可溶性配体)可以与细胞毒素缀合(或连接)。
[0296]
因此，本公开内容的adc可以具有通式ab
‑
(z
‑
l
‑
d)
n
，其中抗体或其抗原结合片段(ab)通过化学部分(z)与接头(l)缀合(共价连接)到细胞毒性部分(“药物”，d)。“n”表示与抗体连接的药物数量，一般范围为1至8。
[0297]
因此，抗体或其抗原结合片段可以与由整数n表示的多个药物部分缀合，整数n表示每个抗体的细胞毒素的平均数量，其范围可以为例如约1至约20。在一些实施方案中，n为1至4。在一些实施方案中，n为1。通过缀合反应制备的adc中每个抗体的药物部分的平均数量可以通过常规方式(例如质谱、elisa测定和hplc)来表征。也可以确定adc在n方面的定量分布。在一些情况下，可以通过例如反相hplc或电泳的方式实现均相adc的分离、纯化和表征，其中n为来自其他药物负载的adc的某个值。
[0298]
对于一些抗
‑
cd45 adc，每个抗体的细胞毒素的平均数量可能受到抗体上附接位点数量的限制。例如，当附接是半胱氨酸硫醇时，抗体可以仅具有一个或数个半胱氨酸硫醇基团，或者可以仅具有一个或数个足够反应性的硫醇基团，通过这些基团可以附接接头和化学部分。通常，抗体不含许多可以与药物部分连接的游离和反应性半胱氨酸硫醇基团；主要地，抗体中的半胱氨酸硫醇残基以二硫键存在。在某些实施方案中，抗体可以在部分或全部还原条件下用还原剂(例如二硫苏糖醇(dtt)或三羰基乙基膦(tcep))还原，以生成反应性半胱氨酸硫醇基团。在某些实施方案中，较高的药物负载，例如n>5，可能导致某些抗体
‑
药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或细胞渗透性的丧失。
[0299]
在某些实施方案中，在缀合反应期间，少于理论最大的药物部分与抗体缀合。抗体可以包含例如不与药物
‑
接头中间体或接头试剂反应的赖氨酸残基，如下所讨论。仅最具反应性的赖氨酸基团可以与胺反应性接头试剂反应。在某些实施方案中，抗体经受变性条件
以显出反应性亲核基团，例如赖氨酸或半胱氨酸。
[0300]
adc的负载(药物/抗体比)可以以不同方式控制，例如通过：(i)限制药物
‑
接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件，(iv)通过重组技术将抗体的氨基酸序列基因工程化，使得半胱氨酸残基的数量和位置被修饰用以控制接头
‑
药物附接的数量和/或位置。
[0301]
适用于本文所述的组合物和方法的细胞毒素包括dna嵌入剂(例如蒽环类)、能够破坏有丝分裂纺锤体的试剂(例如长春花生物碱、美登素、美登木素生物碱及其衍生物)、rna聚合酶抑制剂(例如鹅膏蕈毒素，例如α
‑
鹅膏蕈碱及其衍生物)和能够破坏蛋白质生物合成的试剂(例如，表现出rrna n
‑
糖苷酶活性的试剂，例如皂草素和蓖麻毒素a链)以及本领域已知的其他物质。
[0302]
在一些实施方案中，细胞毒素是微管结合剂(例如，美登素或美登木素生物碱)、鹅膏蕈毒素、假单胞菌外毒素a、debouganin、白喉毒素、皂草素、奥瑞他汀、蒽环类、加里刹霉素、伊立替康、sn
‑
38、倍癌霉素、吡咯并苯二氮卓类、吡咯并苯二氮卓类二聚体、吲哚并苯二氮卓类、吲哚并苯二氮卓类二聚体、吲哚并苯二氮卓类假二聚体或其变体，或本文所述或本领域已知的另一种细胞毒性化合物。
[0303]
以下描述了关于可用于用于本公开内容的方法的抗
‑
cd45 adc的细胞毒素的另外细节。
[0304]
鹅膏蕈毒素
[0305]
在一些实施方案中，抗体
‑
药物缀合物的细胞毒素是rna聚合酶抑制剂。
[0306]
在一些实施方案中，rna聚合酶抑制剂是鹅膏蕈毒素或其衍生物。在一些实施方案中，如本文公开的抗体
‑
药物缀合物的细胞毒素是鹅膏蕈毒素或其衍生物，例如α
‑
鹅膏蕈碱、β
‑
鹅膏蕈碱、γ
‑
鹅膏蕈碱、ε
‑
鹅膏蕈碱、鹅膏素、鹅膏素酰胺、鹅膏无毒环肽、鹅膏无毒环肽酸、前鹅膏无毒环肽或其衍生物。各种天然存在的鹅膏蕈毒素的结构由式ii和所附表1表示，并且在例如zanotti等,int.j.peptide protein res.30,1987,450
‑
459中公开。
[0307][0308]
表1.鹅膏蕈毒素结构表
[0309][0310]
鹅膏蕈毒素可以从多种蘑菇物种(例如，死亡帽(amanita phalloides)、纹缘盔孢伞(galerina marginata)、肉褐麟小伞(lepiota brunneo
‑
incarnata))中分离，或者可以半合成或合成制备。该家族的成员α
‑
鹅膏蕈碱在wieland,int.j.pept.protein res.1983,22(3):257
‑
276中被描述。鹅膏蕈毒素的衍生物可以通过对天然存在的化合物(“半合成”)进行化学修饰获得，或者可以从完全合成的来源获得。多种鹅膏蕈毒素衍生物的合成路线在例如，美国专利号9,676,702和perrin等,j.am.chem.soc.2018,140,p.6513
‑
6517中公开，关于用于制备和衍生化鹅膏蕈毒素的合成方法，其中每一篇都通过引用整体并入本文。
[0311]
鹅膏蕈毒素或其衍生物上的许多位置可以用作共价键合连接部分l并且因此共价键合抗体或其抗原结合片段的位置。在一些实施方案中，如本文公开的adc中的细胞毒素是由式(iii)表示的鹅膏蕈毒素或其衍生物：
[0312]
[0313]
其中r1是h、oh或or
a
；
[0314]
r2是h、oh或or
b
；
[0315]
r
a
和r
b
，当存在时，与它们所结合的氧原子一起，结合形成任选经取代的5元杂环烷基；
[0316]
r3是h或r
d
；
[0317]
r4是h、oh、or
d
或r
d
；
[0318]
r5是h、oh、or
d
或r
d
；
[0319]
r6是h、oh、or
d
或r
d
；
[0320]
r7是h、oh、or
d
或r
d
；
[0321]
r8是oh、nh2或or
d
；
[0322]
r9是h、oh或or
d
；
[0323]
x是
‑
s
‑
、
‑
s(o)
‑
或
‑
so2‑
；并且
[0324]
r
d
是任选经取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)、任选经取代的杂烷基(例如，c1‑
c6杂烷基)、任选经取代的烯基(例如，c2‑
c6烯基)、任选经取代的杂烯基(例如，c2‑
c6杂烯基)、任选经取代的炔基(例如，c2‑
c6炔基)、任选经取代的杂炔基(例如，c2‑
c6杂炔基)、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的芳基或任选经取代的杂芳基。
[0325]
例如，在一个实施方案中，可用于本文所述的组合物和方法结合的鹅膏毒素包括根据式(iiia)的化合物。
[0326][0327]
其中r4、r5、x和r8各自如上所定义。
[0328]
例如，在一个实施方案中，可用于本文所述的组合物和方法结合的鹅膏蕈毒素包括根据以下式(iiib)的化合物：
[0329][0330]
其中r1是h、oh或or
a
；
[0331]
r2是h、oh或or
b
；
[0332]
r
a
和r
b
，当存在时，与它们所结合的氧原子一起，结合形成任选经取代的5元杂环烷基；
[0333]
r3是h或r
d
；
[0334]
r4是h、oh、or
d
或r
d
；
[0335]
r5是h、oh、or
d
或r
d
；
[0336]
r6是h、oh、or
d
或r
d
；
[0337]
r7是h、oh、or
d
或r
d
；
[0338]
r8是oh、nh2或or
d
；
[0339]
r9是h、oh或or
d
；
[0340]
x是
‑
s
‑
、
‑
s(o)
‑
或
‑
so2‑
；并且
[0341]
r
d
是任选经取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)、任选经取代的杂烷基(例如，c1‑
c6杂烷基)、任选经取代的烯基(例如，c2‑
c6烯基)、任选经取代的杂烯基(例如，c2‑
c6杂烯基)、任选经取代的炔基(例如，c2‑
c6炔基)、任选经取代的杂炔基(例如，c2‑
c6杂炔基)、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的芳基或任选经取代的杂芳基。
[0342]
在一个实施方案中，可用于本文所述的组合物和方法结合的鹅膏蕈毒素还包括根据以下式(iiic)的化合物：
[0343][0344]
其中r1是h、oh或or
a
；
[0345]
r2是h、oh或or
b
；
[0346]
r
a
和r
b
，当存在时，与它们所结合的氧原子一起，结合形成任选经取代的5元杂环烷基；
[0347]
r3是h或r
d
；
[0348]
r4是h、oh、or
d
或r
d
；
[0349]
r5是h、oh、or
d
或r
d
；
[0350]
r6是h、oh、or
d
或r
d
；
[0351]
r7是h、oh、or
d
或r
d
；
[0352]
r8是oh、nh2或or
d
；
[0353]
r9是h、oh或or
d
；
[0354]
x是
‑
s
‑
、
‑
s(o)
‑
或
‑
so2‑
；并且
[0355]
r
d
是任选经取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)、任选经取代的杂烷基(例如，c1‑
c6杂烷基)、任选经取代的烯基(例如，c2‑
c6烯基)、任选经取代的杂烯基(例如，c2‑
c6杂烯基)、任选经取代的炔基(例如，c2‑
c6炔基)、任选经取代的杂炔基(例如，c2‑
c6杂炔基)、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的芳基或任选经取代的杂芳基。
[0356]
在一个实施方案中，细胞毒素是鹅膏蕈碱。
[0357]
如本文所述，鹅膏蕈毒素可以与抗体或其抗原结合片段缀合，例如，通过接头部分。在标题为“用于化学缀合的结构”的部分以及下表1中描述了可用于此类方法的鹅膏蕈毒素缀合的示例性方法和接头。根据本文所述的组合物和方法，可用于与抗
‑
cd45抗体或抗原结合片段缀合的示例性含有接头的鹅膏蕈毒素示于本文记载的结构式(i)、(ia)、(ib)、(iv)、(iva)和(ivb)中。
[0358]
例如，本文所述的抗体或抗原结合片段可以与鹅膏蕈毒素结合以形成由式ab
‑
zl
‑
am表示的缀合物，其中ab是抗体或其抗原结合片段，l是接头，z是化学部分，am是鹅膏蕈毒素。鹅膏蕈毒素或其衍生物上的许多位置可以用作共价键合连接部分l并且因此共价键合抗体或其抗原结合片段的位置。在一些实施方案中，鹅膏蕈毒素
‑
接头缀合物am
‑
l
‑
z由式(i)表示：
[0359][0360]
其中r1是h、oh、or
a
或or
c
；
[0361]
r2是h、oh、or
b
或or
c
；
[0362]
r
a
和r
b
，与它们所结合的氧原子一起，结合形成任选经取代的5元杂环烷基；
[0363]
r3是h、r
c
或r
d
；
[0364]
r4是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0365]
r5是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0366]
r6是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0367]
r7是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0368]
r8是oh、nh2、or
c
、or
d
、nhr
c
或nr
c
r
d
；
[0369]
r9是h、oh、or
c
或or
d
；
[0370]
x是
‑
s
‑
、
‑
s(o)
‑
或
‑
so2‑
；
[0371]
r
c
是l
‑
z；
[0372]
r
d
是任选经取代的c1‑
c6烷基、任选经取代的c1‑
c6杂烷基、任选经取代的c2‑
c6烯基、任选经取代的c2‑
c6杂烯基、任选经取代的c2‑
c6炔基、任选经取代的c2‑
c6杂炔基、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的芳基或任选经取代的杂芳基；
[0373]
l是接头，例如任选经取代的c1‑
c6亚烷基；任选经取代的c1‑
c6杂亚烷基；任选经取代的c2‑
c6亚烯基；任选经取代的c2‑
c6杂亚烯基；任选经取代的c2‑
c6亚炔基；任选经取代的c2‑
c6杂亚炔基；任选经取代的环亚烷基；任选经取代的杂环亚烷基；任选经取代的亚芳基；任选经取代的杂亚芳基；肽(例如二肽)；
‑
(c＝o)
‑
；二硫化物；腙；
‑
(ch2ch2o)
p
‑
基团，其中p为1
‑
6的整数；((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
–
基团，其中n和每个m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；及其组合；并且
[0374]
z是由l上存在的反应性取代基z'与结合cd45的抗体、其抗原结合片段或可溶性配体内存在的反应性取代基之间的缀合反应形成的化学部分。
[0375]
在一些实施方案中，细胞毒素包含一个r
c
取代基。
[0376]
在一些实施方案中，r
a
和r
b
，与它们所结合的氧原子一起，结合形成：
[0377]
[0378]
其中y是
‑
(c＝o)
‑
、
‑
(c＝s)
‑
、
‑
(c＝nr
e)
‑
或
‑
(cr
e
r
e’)
‑
；并且
[0379]
r
e
和r
e’各自独立地是任选经取代的c1‑
c6亚烷基
‑
r
c
、任选经取代的c1‑
c6杂亚烷基
‑
r
c
、任选经取代的c2‑
c6亚烯基
‑
r
c
、任选经取代的c2‑
c6杂亚烯基
‑
r
c
、任选经取代的c2‑
c6亚炔基
‑
r
c
、任选经取代的c2‑
c6杂亚炔基
‑
r
c
、任选经取代的环亚烷基
‑
r
c
、任选经取代的杂环亚烷基
‑
r
c
、任选经取代的亚芳基
‑
r
c
或任选经取代的杂亚芳基
‑
r
c
。
[0380]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z由式(i)表示，其中
[0381]
r1是h、oh、or
a
或or
c
；
[0382]
r2是h、oh、or
b
或or
c
；
[0383]
r
a
和r
b
，与它们所结合的氧原子一起，结合形成：
[0384][0385]
r3是h或r
c
；
[0386]
r4是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0387]
r5是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0388]
r6是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0389]
r7是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0390]
r8是oh、nh2、or
c
或nhr
c
；
[0391]
r9是h或oh；并且
[0392]
其中r
c
和r
d
各自如上所定义。
[0393]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z由式(i)表示，
[0394]
其中
[0395]
r1是h、oh、or
a
或or
c
；
[0396]
r2是h、oh、or
b
或or
c
；
[0397]
r
a
和r
b
，与它们所结合的氧原子一起，结合形成：
[0398][0399]
r3是h或r
c
；
[0400]
r4和r5各自独立地是h、oh、or
c
、r
c
或or
d
；
[0401]
r6和r7各自是h；
[0402]
r8是oh、nh2、or
c
或nhr
c
；
[0403]
r9是h或oh；并且
[0404]
其中x和r
c
如上所定义。
[0405]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z由式(i)表示：
[0406]
其中r1是h、oh或or
a
；
[0407]
r2是h、oh或or
b
；
[0408]
r
a
和r
b
，与它们所结合的氧原子一起，结合形成：
[0409][0410]
r3、r4、r6和r7各自是h；
[0411]
r5是or
c
；
[0412]
r8是oh或nh2；
[0413]
r9是h或oh；并且
[0414]
其中r
c
如上所定义。此类鹅膏蕈毒素缀合物例如在美国专利申请公开号2016/0002298中被描述，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0415]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z由式(i)表示，其中：
[0416]
r1和r2各自独立地是h或oh；
[0417]
r3是r
c
；
[0418]
r4、r6和r7各自是h；
[0419]
r5是h、oh或oc1‑
c6烷基；
[0420]
r8是oh或nh2；
[0421]
r9是h或oh；并且
[0422]
其中r
c
如上所定义。
[0423]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z由式(i)表示，
[0424]
其中
[0425]
r1和r2各自独立地是h或oh；
[0426]
r3、r6和r7各自是h；
[0427]
r4和r5各自独立地是h、oh、or
c
或r
c
；
[0428]
r8是oh或nh2；
[0429]
r9是h或oh；并且
[0430]
其中r
c
如上所定义。此类鹅膏蕈毒素缀合物例如在美国专利申请公开号2015/0218220中被描述，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0431]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z由式(i)表示，其中，
[0432]
r1和r2各自独立地是h或oh；
[0433]
r3、r6和r7各自是h；
[0434]
r4和r5各自独立地是h或oh；
[0435]
r8是oh、nh2、or
c
或nhr
c
；
[0436]
r9是h或oh；并且
[0437]
其中r
c
如上所定义。此类鹅膏蕈毒素缀合物例如在美国专利号9,233,173和9,399,681中被描述，其中每一篇的公开内容通过引用整体并入本文。
[0438]
在一些实施方案中，接头l和化学部分z(一起作为l
‑
z)是
[0439][0440]
其中s是表示抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基的硫原子，其结合cd45(例如，来自半胱氨酸残基的
‑
sh基团)。
[0441]
在一些实施方案中，l
‑
z是
[0442][0443]
在一些实施方案中，l
‑
z是
[0444][0445]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z由式(ia)表示
[0446][0447]
其中：
[0448]
r1是h、oh、or
a
或or
c
；
[0449]
r2是h、oh、or
b
或or
c
；
[0450]
r
a
和r
b
，当存在时，与它们所结合的氧原子一起，结合形成任选经取代的5元杂环烷基；
[0451]
r3是h、r
c
或r
d
；
[0452]
r4是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0453]
r5是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0454]
r6是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0455]
r7是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0456]
r8是oh、nh2、or
c
、or
d
、nhr
c
或nr
c
r
d
；
[0457]
r9是h、oh、or
c
或or
d
；
[0458]
x是
‑
s
‑
、
‑
s(o)
‑
或
‑
so2‑
；
[0459]
r
c
是
‑
l
‑
z；
[0460]
r
d
是任选经取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)、任选经取代的杂烷基(例如，c1‑
c6杂烷基)、任选经取代的烯基(例如，c2‑
c6烯基)、任选经取代的杂烯基(例如，c2‑
c6杂烯基)、任选经取代的炔基(例如，c2‑
c6炔基)、任选经取代的杂炔基(例如，c2‑
c6杂炔基)、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的芳基或任选经取代的杂芳基；
[0461]
l是接头，例如任选经取代的亚烷基(例如，c1‑
c6亚烷基)；任选经取代的杂亚烷基(c1‑
c6杂亚烷基)；任选经取代的亚烯基(例如，c2‑
c6亚烯基)；任选经取代的杂亚烯基(例如，c2‑
c6杂亚烯基)；任选经取代的亚炔基(例如，c2‑
c6亚炔基)；任选经取代的杂亚炔基(例如，c2‑
c6杂亚炔基)；任选经取代的环亚烷基；任选经取代的杂环亚烷基；任选经取代的亚芳基；任选经取代的杂亚芳基；肽(例如二肽)；
‑
(c＝o)
‑
；二硫化物；腙；
‑
(ch2ch2o)
p
‑
基团，其中p为1
‑
6的整数；((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
–
基团，其中n和每个m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；及其组合；并且；
[0462]
z是由l上存在的反应性取代基z'与结合cd45的抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基之间的缀合反应形成的化学部分；并且
[0463]
其中am包含恰好一个r
c
取代基。
[0464]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z由式(ib)表示
[0465][0466]
其中：
[0467]
r1是h、oh、or
a
或or
c
；
[0468]
r2是h、oh、or
b
或or
c
；
[0469]
r
a
和r
b
，当存在时，与它们所结合的氧原子一起，结合形成任选经取代的5元杂环烷基；
[0470]
r3是h、r
c
或r
d
；
[0471]
r4是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0472]
r5是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0473]
r6是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0474]
r7是h、oh、or
c
、or
d
、r
c
或r
d
；
[0475]
r8是oh、nh2、or
c
、or
d
、nhr
c
或nr
c
r
d
；
[0476]
r9是h、oh、or
c
或or
d
；
[0477]
x是
‑
s
‑
、
‑
s(o)
‑
或
‑
so2‑
；
[0478]
r
c
是
‑
l
‑
z；
[0479]
r
d
是任选经取代的烷基(例如，c1‑
c6烷基)、任选经取代的杂烷基(例如，c1‑
c6杂烷基)、任选经取代的烯基(例如，c2‑
c6烯基)、任选经取代的杂烯基(例如，c2‑
c6杂烯基)、任选经取代的炔基(例如，c2‑
c6炔基)、任选经取代的杂炔基(例如，c2‑
c6杂炔基)、任选经取代的环烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的芳基或任选经取代的杂芳基；
[0480]
l是接头，例如任选经取代的亚烷基(例如，c1‑
c6亚烷基)；任选经取代的杂亚烷基(c1‑
c6杂亚烷基)；任选经取代的亚烯基(例如，c2‑
c6亚烯基)；任选经取代的杂亚烯基(例如，c2‑
c6杂亚烯基)；任选经取代的亚炔基(例如，c2‑
c6亚炔基)；任选经取代的杂亚炔基(例如，c2‑
c6杂亚炔基)；任选经取代的环亚烷基；任选经取代的杂环亚烷基；任选经取代的亚芳基；任选经取代的杂亚芳基；二肽；
‑
(c＝o)
‑
；肽；二硫化物；腙；
‑
(ch2ch2o)
p
‑
基团，其中p为1
‑
6的整数；((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
–
基团，其中n和每个m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；及其组合；并且
[0481]
z是由l上存在的反应性取代基z'与结合cd45的抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基之间的缀合反应形成的化学部分；并且
[0482]
其中am包含恰好一个r
c
取代基。
[0483]
在一些实施方案中，接头包含
‑
(ch)
2n
‑
单元，其中n为2
‑
6的整数。在一些实施方案中，接头包含
‑
((ch2)
n
，其中n为6。
[0484]
在一些实施方案中，接头l和化学部分z(一起作为l
‑
z)是
[0485][0486]
其中s是表示抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基的硫原子，其结合cd45(例如，来自半胱氨酸残基的
‑
sh基团)。
[0487]
在一些实施方案中，l
‑
z是
[0488][0489]
在一些实施方案中，l
‑
z是
[0490]
[0491]
在一些实施方案中，缀合物am
‑
l
‑
z
‑
ab由以下结构式中的任一种表示：
[0492][0493]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z
‑
ab由以下结构式表示：
[0494][0495]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z’(其中am
‑
l
‑
z’是am
‑
l
‑
z
‑
ab的前体)是
[0496][0497]
其中马来酰亚胺(反应性取代基z')与抗体中的半胱氨酸上发现的硫醇基团反应。
[0498]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z由式(iv)、式(iva)或式(ivb)表示：
[0499]
[0500][0501]
其中x是s、so或so2；r1是h或通过化学部分z与抗体或其抗原结合片段共价结合的接头，由接头上存在的反应性取代基z'与抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基之间的偶联反应形成；r2是h或通过化学部分z与抗体或其抗原结合片段共价结合的接头，由接头上存在的反应性取代基z'与抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基之间的偶联反应形成；其中当r1是h时，r2是接头，并且当r2是h时，r1是接头。
[0502]
在一些实施方案中，接头包含
‑
(ch2)
n
‑
单元，其中n为2
‑
6的整数。在一些实施方案中，r1是接头并且r2是h，并且接头和化学部分(一起作为l
‑
z)是
[0503][0504]
在一些实施方案中，r1是接头并且r2是h，并且接头和化学部分(一起作为l
‑
z)是
[0505][0506]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z
‑
ab是
[0507][0508]
在一些实施方案中，ab
‑
z
‑
l
‑
am是
[0509][0510]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z
‑
ab是：
[0511][0512]
在一些实施方案中，am
‑
l
‑
z
‑
ab前体(即am
‑
l
‑
z’)是以下之一：
[0513][0514]
其中马来酰亚胺与在cd
‑
45抗体中的半胱氨酸上发现的硫醇基团反应。
[0515]
根据本文所述的组合物和方法，可用于与抗体或其抗原结合片段缀合的另外的鹅膏蕈毒素例如在wo 2016/142049；wo 2016/071856；和wo2017/046658中被描述，其中每一篇的公开内容通过引用整体并入本文。例如，识别并结合cd45的抗体、其抗原结合片段和配体可以与α
‑
鹅膏蕈碱或其变体缀合，如us 2015/0218220中所述，因为它涉及例如针对鹅膏蕈毒素，例如α
‑
鹅膏蕈碱及其变体以及可用于共价缀合的共价接头，其公开内容通过引用并入本文。用于制备鹅膏蕈毒素的合成方法在例如美国专利号9,676,702中被描述，其关于其中公开的合成方法通过引用并入本文。
[0516]
接头l可以在数个可能的位置中的任一个(例如，r1‑
r9中的任一个)附接到鹅膏蕈毒素(例如，式iii、iiia、iiib或iiic的鹅膏蕈毒素)以提供式i、ia、ib、iv、iva或ivb的鹅膏蕈毒素
‑
接头缀合物。
[0517]
在一些实施方案中，接头附接在位置r1处。在一些实施方案中，接头附接在位置r2处。在一些实施方案中，接头附接在位置r3处。在一些实施方案中，接头附接在位置r4处。在一些实施方案中，接头附接在位置r5处。在一些实施方案中，接头附接在位置r6处。在一些实施方案中，接头附接在位置r7处。在一些实施方案中，接头附接在位置r8处。在一些实施方案中，接头附接在位置r9处。
[0518]
在一些实施方案中，细胞毒素是α
‑
鹅膏蕈碱。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val
‑
ala和val
‑
cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基(pab)。在一些实施方案中，接头包括部分pab
‑
cit
‑
val。在一些实施方案中，接头包括部分pab
‑
ala
‑
val。在一些实施方案中，接头包括
–
((c＝o)(ch2)
n
–
单元，其中n为1
‑
6的整数。
[0519]
在一些实施方案中，接头包含
‑
(ch2)
n
单元，其中n为2
‑
6的整数。在一些实施方案中，接头是
–
pab
‑
cit
‑
val
‑
((c＝o)(ch2)
n
–
。在一些实施方案中，接头是
–
pab
‑
ala
‑
val
‑
((c＝o)(ch2)
n
–
。在一些实施方案中，接头l和化学部分z(一起作为l
‑
z)是
[0520][0521]
奥瑞他汀
[0522]
本文所述的抗
‑
cd45抗体及其抗原结合片段可以与奥瑞他汀的细胞毒素缀合(美国专利号5,635,483；5,780,588)。奥瑞他汀是抗有丝分裂剂，其干扰微管动力学、gtp水解以及细胞核和细胞分裂(woyke等(2001)antimicrob.agents and chemother.45(12):
3580
‑
3584)并且具有抗癌(美国专利号5,663,149)和抗真菌活性(pettit等(1998)antimicrob.agents chemother.42:2961
‑
2965)。(美国专利号5,635,483；5,780,588)。奥瑞他汀药物部分可以通过肽药物部分的n(氨基)末端或c(羧基)末端附接到抗体(wo 02/088172)。
[0523]
示例性的奥瑞他汀实施方案包括n
‑
末端连接的单甲基奥瑞他汀药物部分de和df(分别为mmae和mmaf)，在senter等,proceedings of the american association for cancer research,第45卷,摘要编号623,2004年3月28日提交中公开，其公开内容明确地通过引用整体并入。
[0524]
一个示例性的奥瑞他汀实施方案是mmae：
[0525][0526]
其中波浪线表示与抗体
‑
接头缀合物(如本文所述的
‑
l
‑
z
‑
ab)的接头的共价附接点。
[0527]
另一个示例性的奥瑞他汀实施方案是mmaf：
[0528][0529]
其中波浪线表示与抗体
‑
接头缀合物(如本文所述的
‑
l
‑
z
‑
ab)的接头共价附接的点，如us 2005/0238649中公开的。
[0530]
奥瑞他汀可以根据以下方法制备：美国专利号5,635,483；美国专利号5,780,588；pettit等(1989)j.am.chem.soc.111:5463
‑
5465；pettit等(1998)anti
‑
cancer drug design 13:243
‑
277；pettit,g.r.等synthesis,1996,719
‑
725；pettit等(1996)j.chem.soc.perkin trans.15:859
‑
863；和doronina(2003)nat.biotechnol.21(7):778
‑
784。
[0531]
美登木素生物碱
[0532]
本文所述的抗体及其抗原结合片段可以与微管结合剂的细胞毒素缀合。在一些实施方案中，微管结合剂是美登素、美登木素生物碱或美登木素生物碱类似物。美登木素生物碱是有丝分裂抑制剂，其结合微管并通过抑制微管蛋白聚合起作用。美登素最早是从东非灌木maytenus serrata中分离的(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生美登木素生物碱，例如美登醇和c
‑
3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物例如在美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,
663；和4,371,533中公开。美登木素生物碱药物部分是抗体药物缀合物中有吸引力的药物部分，因为它们是:(i)相对容易通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生化来制备，(ii)可用适用于通过非二硫键与抗体缀合的官能团衍生化，(iii)在血浆中稳定，以及(iv)对多种肿瘤细胞系有效。
[0533]
合适的美登木素生物碱的实例包括美登醇的酯、合成美登醇以及美登醇类似物和衍生物。本文包括抑制微管形成并且对哺乳动物细胞具有高度毒性的任何细胞毒素，如美登木素生物碱、美登醇和美登醇类似物以及其衍生物。
[0534]
合适的美登醇酯的实例包括具有经修饰的芳香族环的那些和在其他位置具有修饰的那些。此类合适的美登木素生物碱在美国专利号4,137,230；4,151,042；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,322,348；4,362,663；4,371,533；5,208,020；5,416,064；5,475,092；5,585,499；5,846,545；6,333,410；7,276,497；和7,473,796中公开，其中每一篇的公开内容通过引用并入本文中，因为它们涉及美登木素生物碱及其衍生物。
[0535]
在一些实施方案中，本公开内容的抗体
‑
药物缀合物(adc)利用含硫醇的美登木素生物碱(dm1)(正式称为n2
′‑
脱乙酰基
‑
n2
′‑
(3
‑
巯基
‑1‑
氧代丙基)
‑
美登素)作为细胞毒性剂。dm1由以下结构式表示：
[0536][0537]
在另一个实施方案中，本公开内容的缀合物利用含硫醇的美登木素生物碱n2′‑
脱乙酰基
‑
n2′
(4
‑
甲基
‑4‑
巯基
‑1‑
氧代戊基)
‑
美登素(例如，dm4)作为细胞毒性剂。dm4由以下结构式表示：
[0538][0539]
另一种包含含有空间位阻硫醇键的侧链的美登木素生物碱是n2′‑
脱乙酰基
‑
n2′
(4
‑
巯基
‑1‑
氧代戊基)
‑
美登素(称为dm3)，由以下结构式表示：
[0540][0541]
美国专利号5,208,020和7,276,497中教导的每一种美登木素生物碱也可用于本公开内容的缀合物中。在这方面，5,208,020和7,276,697的全部公开内容通过引用并入本文。
[0542]
美登木素生物碱上的许多位置可以用作共价键合连接部分，并且共价键合因此抗体或其抗原结合片段(
‑
l
‑
z
‑
ab或
‑
l
‑
z’，如本文所述)的位置。例如，具有羟基的c
‑
3位、经羟甲基修饰的c
‑
14位、经羟基修饰的c
‑
15位和具有羟基的c
‑
20位预期都是有用的。在一些实施方案中，c
‑
3位用作共价键合接头部分的位置，并且在一些特定的实施方案中，美登醇的c
‑
3位用作共价键合连接部分的位置。在制备抗体
‑
美登木素生物碱缀合物的领域中有许多已知的连接基团，包括例如在美国专利号5,208,020、6,441,163和欧洲专利号0425235b1；chari等,cancer research 52:127
‑
131(1992)；和u.s.2005/0169933a1中公开的那些，其公开内容通过引用明确地并入本文中。本文描述并例示了另外的连接基团。
[0543]
本公开内容还包括美登木素生物碱和缀合物的各种异构体和混合物。本公开内容的某些化合物和缀合物可以以各种立体异构体、对映异构体和非对映异构体形式存在。用于产生此类抗体
‑
美登木素生物碱缀合物的数个描述在美国专利号5,208,020；5,416,064；6,333,410；6,441,163；6,716,821；和7,368,565中提供，其中每一篇整体并入本文。
[0544]
蒽环类
[0545]
在另一些实施方案中，本文所述的抗体及其抗原结合片段可以与蒽环类分子的细胞毒素缀合。蒽环类是表现出细胞毒性活性的抗生素化合物。研究表明，蒽环类可以通过多种不同的机制杀伤细胞，包括：1)将药物分子嵌入细胞的dna中，从而抑制dna依赖性核酸合成；2)通过药物产生自由基，然后使其与细胞大分子反应，以引起细胞损伤，或3)药物分子与细胞膜相互作用[参见例如，c.peterson等,"transport and storage of anthracycline in experimental systems and human leukemia"in anthracycline antibiotics in cancer therapy；n.r.bachur,"free radical damage"id.第97
‑
102页]。由于蒽环类的细胞毒性潜力，它们已被用于治疗多种癌症，例如白血病、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和肉瘤[参见例如，p.h
‑
wiernik,in anthracycline:current status and new developments第11页]。常用的蒽环类包括阿霉素、表柔比星、伊达比星和柔红霉素。在一些实施方案中，细胞毒素是选自柔红霉素、多柔比星、表柔比星和伊达比星的蒽环霉素。蒽环类的代表性实例包括但不限于柔红霉素(cerubidine；bedford laboratories)、多柔比星(adriamycin；bedford laboratories；也称为盐酸多柔比星、羟基柔红霉素和rubex)、表柔比星(ellence；pfizer)和idarubicin(伊达霉素；辉瑞公司)
[0546]
蒽环类类似物阿霉素(adriamycino)被认为是通过嵌入和抑制拓扑异构酶ii的进程与dna相互作用，拓扑异构酶ii将dna解链用以转录。阿霉素在拓扑异构酶ii复合物破坏dna链进行复制后稳定它，防止dna双螺旋被重新密封，从而停止复制过程。阿霉素和柔红霉素(daunomycin)是蒽环类化疗药物的原型细胞毒性天然产物(sessa等,(2007)cardiovasc.toxicol.7:75
‑
79)。
[0547]
适用于本文的蒽环类的一个非限制性实例是pnu
‑
159682(“pnu”)。相对于母体奈莫霉素，pnu表现出超过3000倍的细胞毒性(quintieri等，clinical cancer research 2005,11,1608
‑
1617)。pnu由以下结构式表示：
[0548][0549]
蒽环类(例如pnu)上的多个位置可用作共价键合连接部分，并且因此共价键合与本文所述的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段的位置。例如，可以通过对羟甲基酮侧链进行修饰来引入接头。
[0550]
在一些实施方案中，细胞毒素是由以下结构式表示的pnu衍生物：
[0551][0552]
其中波浪线表示与本文所述的adc接头的共价附接点。
[0553]
在一些实施方案中，细胞毒素是由以下结构式表示的pnu衍生物：
[0554][0555]
其中波浪线表示与本文所述的adc接头的共价附接点。
[0556]
吡咯并苯二氮卓类(pbd)
[0557]
在另一些实施方案中，本文所述的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段可以与吡咯并苯二氮卓类(pbd)的细胞毒素或包含pbd的细胞毒素缀合。pbd是由某些放线菌产生的天然
产物，并且已表明是序列选择性的dna烷基化化合物。pbd细胞毒素包括但不限于蒽霉素、二聚pbd以及在例如hartley,ja(2011)the development of pyrrolobenzodiazepines as antitumour agents.expert opin inv drug,20(6),733
‑
744和antonow d,thurston de(2011)synthesis of dna
‑
interactive pyrrolo[2,1
‑
c][1,4]benzodiazepines(pbds).chem rev 111:2815
–
2864中公开的那些。
[0558]
在一些实施方案中，细胞毒素是由以下式表示的吡咯并苯二氮卓类二聚体：
[0559][0560]
其中波浪线表示接头的附接点。
[0561]
在一些实施方案中，细胞毒素通过马来酰亚胺己酰基接头与抗体或其抗原结合片段缀合。
[0562]
在一些实施方案中，接头包含以下中的一种或更多种：肽、寡糖、
‑
(ch2)
p
‑
、
‑
(ch2ch2o)
q
‑
、
‑
(c＝o)(ch2)
r
‑
、
‑
(c＝o)(ch2ch2o)
t
‑
、
‑
(nhch2ch2)
u
‑
、
‑
pab、val
‑
cit
‑
pab、val
‑
ala
‑
pab、val
‑
lys(ac)
‑
pab、phe
‑
lys
‑
pab、phe
‑
lys(ac)
‑
pab、d
‑
val
‑
leu
‑
lys、gly
‑
gly
‑
arg、ala
‑
ala
‑
asn
‑
pab或ala
‑
pab，其中p、q、r、t和u中的每一个为1
‑
12的整数，每个出现时独立地选择。
[0563]
在一些实施方案中，接头具有以下式的结构：
[0564][0565]
其中r1是ch3(ala)或(ch2)3nh(co)nh2(cit)。
[0566]
在一些实施方案中，在与抗体缀合之前并且包含反应性取代基z’的接头(一起作为l
‑
z’)具有以下结构：
[0567][0568]
其中波浪线表示与细胞毒素(例如，pbd)的附接点。在某些实施方案中，r1是ch3。
[0569]
在一些实施方案中，在与抗体缀合之前并且包含反应性取代基z’的细胞毒素
‑
接头缀合物(一起作为cy
‑
l
‑
z’)具有以下结构式：
[0570][0571]
该特定的细胞毒素
‑
接头缀合物称为tesirine(sg3249)，并且已经在例如howard等,acs med.chem.lett.2016,7(11),983
‑
987中被描述，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0572]
在一些实施方案中，细胞毒素可以是由以下式表示的吡咯并苯二氮卓二聚体：
[0573][0574]
其中波浪线表示接头的附接点。
[0575]
在一些实施方案中，在与抗体缀合之前并且包含反应性取代基z’的细胞毒素
‑
接头缀合物(一起作为cy
‑
l
‑
z’)具有以下结构式：
[0576][0577]
该特定的细胞毒素
‑
接头缀合物称为他立林，并且已经例如结合adc他立林
‑
伐达妥昔单抗(sgn
‑
cd33a)，在mantaj等,angewandte chemie international edition english 2017,56,462
‑
488中被描述，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0578]
在一些实施方案中，细胞毒素是具有以下结构式的吲哚并苯二氮卓类二聚体：
[0579][0580]
其中波浪线表示接头的附接点。
[0581]
在一些实施方案中，，在与抗体缀合之前并且包含反应性取代基z’的细胞毒素
‑
接头缀合物(一起作为cy
‑
l
‑
z’)具有以下结构式：
[0582][0583]
其包括在例如国际专利申请公开号wo2017004026中公开的adc imgn632，其通过引用并入本文。
[0584]
卡奇霉素
[0585]
在另一些实施方案中，本文所述的抗体及其抗原结合片段可以与烯二炔类抗肿瘤抗生素(例如卡奇霉素、奥佐米星)的细胞毒素缀合。抗生素卡奇霉素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链dna断裂。关于卡奇霉素家族缀合物的制备，参见美国专利号5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；和5,877,296(全部属于美国cyanamid company)。可以使用的卡奇霉素的结构类似物包括，但不限于，在例如hinman等,cancer research 53:3336
‑
3342(1993)；lode等,cancer research58:2925
‑
2928(1998)和前述美国cyanamid的美国专利中公开的那些。
[0586]
示例性的卡奇霉素指定为γ1，其在本文中简称为γ，并且具有以下结构式：
[0587][0588]
在一些实施方案中，卡奇霉素是γ
‑
卡奇霉素衍生物或n
‑
乙酰基γ
‑
卡奇霉素衍生
物。可以使用的卡奇霉素的结构类似物包括，但不限于，在例如hinman等,cancer research 53:3336
‑
3342(1993)；lode等,cancer research58:2925
‑
2928(1998)和前述美国专利中公开的那些。卡奇霉素包含甲基三硫化物部分，该部分可以与适当的硫醇反应形成二硫化物，同时引入官能团，该官能团可用于通过接头将卡奇霉素衍生物附接到本文所述的抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段上。关于卡奇霉素家族缀合物的制备，参见美国专利号5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；和5,877,296(全部属于美国cyanamid company)。可以使用的卡奇霉素的结构类似物包括，但不限于，在例如hinman等,cancer research 53:3336
‑
3342(1993)；lode等,cancer research 58:2925
‑
2928(1998)和前述美国cyanamid的美国专利中公开的那些。
[0589]
在一个实施方案中，如本文公开的adc的细胞毒素可以是由以下式表示的卡奇霉素二硫化物衍生物：
[0590][0591]
其中波浪线表示接头的附接点。
[0592]
核糖体失活蛋白(rip)
[0593]
在一些实施方案中，与抗
‑
cd45抗体缀合的细胞毒素是核糖体失活蛋白(rip)。核糖体失活蛋白是蛋白质合成抑制剂，其通常不可逆地作用于核糖体。rip在植物以及细菌中被发现。rip的实例包括但不限于皂草素、蓖麻毒素、相思豆毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素(或外毒素a)、天花粉蛋白、丝瓜素、凝集素和白喉毒素。
[0594]
可用于本文公开的adc和方法的rip的另一个实例是志贺氏毒素(stx)或志贺样毒素(slt)。志贺氏毒素(stx)是一种在痢疾志贺氏菌1(shigella dysenteriae 1)和大肠杆菌(escherichia coli)的一些血清群(包括血清型o157:h7和o104:h4)中发现的有效的细菌毒素(在大肠杆菌中称为stx1)。除了stx1之外，一些大肠杆菌菌株产生第二类型的stx(stx2)，其具有与stx/stx1相同的作用方式，但抗原性不同。slt是由大肠杆菌产生的相似或相同毒素的历史术语。由于每种毒素的亚型已经确定，每组的原型毒素现在指定为stx1a或stx2a。stx1a和stx2a表现出对各种细胞类型的细胞毒性不同，与受体类似物或模拟物的结合不同，诱导不同的趋化因子反应，并具有数个独特的结构特征。
[0595]
志贺氏毒素家族的成员是指天然存在的蛋白质毒素家族的任何成员，其在结构和功能上相关，值得注意的是从痢疾志贺氏菌和大肠杆菌中分离的毒素((johannes l,romer w,nat rev microbiol 8:105
‑
16(2010))。例如，志贺氏毒素家族涵盖从痢疾志贺氏菌血清型1中分离的真正志贺氏毒素(stx)、从肠出血性大肠杆菌血清型中分离的志贺样毒素1变体(slt1或stx1或slt
‑
1或slt
‑
i)、和从肠出血性大肠杆菌的血清型中分离的志贺样毒素2
变体(slt2或stx2或slt
‑
2)。slt1与stx仅相差一个残基，两者都被称为维罗细胞毒素或维罗毒素(vt)(o'brien a等,curr top microbiol immunol 180:65
‑
94(1992))。尽管据报道slt1和slt2变体在氨基酸序列水平上彼此仅约53％
‑
60％相似，但是它们具有志贺氏毒素家族成员共有的酶活性和细胞毒性机制(johannes,nat rev microbiol 8:105
‑
16(2010))。
[0596]
志贺氏毒素家族的成员有两个亚基；a亚基和b亚基。毒素的b亚基与称为糖脂球三糖基神经酰胺(gb3)的细胞膜组分结合。亚基b与gb3的结合导致窄管膜内陷的诱导，这驱动形成内膜小管用以细菌摄取进入细胞。志贺氏毒素(非成孔毒素)通过高尔基体网络和er转移到胞液中。从高尔基体毒素被交换到er。志贺氏毒素通过类似于蓖麻毒素的机制起抑制靶细胞内的蛋白质合成作用(sandvig和van deurs(2000)embo j 19(220:5943))。在进入细胞之后，毒素的a亚基切割来自核糖体60s亚基的28s rna的特定的腺嘌呤核碱基，从而停止蛋白质合成(donohue
‑
rolfe等(2010)reviews of infectious diseases 13 suppl.4(7):s293
‑
297)。
[0597]
如本文所用，提及志贺氏家族毒素是指在结构上和功能上相关的天然存在的蛋白质毒素(例如，从痢疾志贺氏菌和大肠杆菌中分离的毒素)的志贺氏毒素家族的任何成员。例如，志贺氏毒素家族涵盖从痢疾志贺氏菌血清型1中分离的真正志贺氏毒素(stx)、从肠出血性大肠杆菌血清型中分离的志贺样毒素1变体(slt1或stx1或slt
‑
1或slt
‑
i)、和从肠出血性大肠杆菌的血清型中分离的志贺样毒素2变体(slt2或stx2或slt
‑
2)。如本文所用，“志贺氏家族毒素的a亚基”或“志贺氏家族毒素a亚基”是指志贺氏毒素家族的任何成员的a亚基，包括志贺氏毒素或志贺样毒素。
[0598]
在一个实施方案中，抗
‑
cd45 adc包含与具有细胞毒性活性(即核糖体抑制活性)的志贺氏家族毒素a亚基或志贺氏家族毒素a亚基的部分缀合的抗
‑
cd45抗体。志贺氏毒素a亚基细胞毒性活性包括例如核糖体失活、蛋白质合成抑制、n
‑
糖苷酶活性、多核苷酸:腺苷糖苷酶活性、rna酶活性和dna酶活性。志贺氏毒素效应子活性测定的非限制性实例测量蛋白质合成抑制活性、脱嘌呤活性、细胞生长抑制、细胞毒性、超螺旋dna松弛活性和核酸酶活性。
[0599]
在某些实施方案中，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段与志贺氏家族毒素a亚基或其具有核糖体抑制活性的片段缀合。志贺氏家族毒素a亚基的一个实例是志贺样毒素1a亚基(slt
‑
1a)，其氨基酸序列如下：
[0600]
keftldfstaktyvdslnvirsaigtplqtissggtsllmidsgsgdnlfavdvrgidpeegrfnnlrlivernnlyvtgfvnrtnnvfyrfadfshvtfpgttavtlsgdssyttlqrvagisrtgmqinrhslttsyldlmshsgtsltqsvaramlrfvtvtaealrfrqiqrgfrttlddlsgrsyvmtaedvdltlnwgrlssvlpdyhgqdsvrvgrisfgsinailgsvalilnchhhasrvarmasdefpsmcpadgrvrgithnkilwdsstlgailmrrtiss(seq id no：33)。
[0601]
志贺氏家族毒素a亚基的另一个实例是志贺氏毒素a亚基(stxa)，其氨基酸序列提供如下：
[0602]
keftldfstaktyvdslnvirsaigtplqtissggtsllmidsgtgdnlfavdvrgidpeegrfnnlrlivernnlyvtgfvnrtnnvfyrfadfshvtfpgttavtlsgdssyttlqrvagisrtgmqinrhslttsyldlmshsgtsltqsvaramlrfvtvtaealrfrqiqrgfrttlddlsgrsyvmtaedvdltlnwgrlssvlpdyhgqdsvr
vgrisfgsinailgsvalilnchhhasrvarmasdefpsmcpadgrvrgithnkilwdsstlgailmrrtiss(seq id no：34)。
[0603]
志贺氏家族毒素a亚基的另一个实例是志贺样毒素2a亚基(slt
‑
2a)，其氨基酸序列提供如下：
[0604]
deftvdfssqksyvdslnsirsaistplgnisqggvsvsvinhvlggnyislnvrgldpyserfnhlrlimernnlyvagfintetnifyrfsdfshisvpdvitvsmttdssysslqriadlertgmqigrhslvgsyldlmefrgrsmtrassramlrfvtviaealrfrqiqrgfrpalseasplytmtaqdvdltlnwgrisnvlpeyrgeegvrigrisfnslsailgsvavilnchstgsysvrsvsqkqktecqivgdraaikvnnvlweantiaallnrkpqdltepnq(seq id no：35)。
[0605]
在某些情况下，天然存在的志贺氏家族毒素a亚基可以包含在其氨基末端含有约22个氨基酸的信号序列的前体形式，这些信号序列被除去以产生成熟的志贺氏家族毒素a亚基并且是技术人员可识别的。志贺氏家族毒素a亚基的细胞毒性片段或截短形式也可用于本文公开的adc和方法。
[0606]
在某些实施方案中，志贺氏家族毒素a亚基与天然存在的志贺氏毒素a亚基相差多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个氨基酸残基(但不超过其保留至少85％、90％、95％、99％或更多的氨基酸序列同一性的残基)。在一些实施方案中，志贺氏家族毒素a亚基与天然存在的志贺氏家族毒素a亚基相差多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个氨基酸残基(但不超过其保留至少85％、90％、95％、99％或更多的氨基酸序列同一性的残基)。因此，衍生自志贺氏毒素家族成员的a亚基的多肽区域可以包含原始序列的添加、缺失、截断或其他改变，只要保持与天然存在的志贺氏家族毒素a亚基至少85％、90％、95％、99％或更多的氨基酸序列同一性。
[0607]
因此，在某些实施方案中，志贺氏家族毒素a亚基包含具有与天然存在的志贺氏家族毒素a亚基(例如slt
‑
1a(seq id no：33)、stxa(seq id no：34)和/或slt
‑
2a(seq id no：35))至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％的总体序列同一性的氨基酸序列或基本上由其组成。
[0608]
合适的志贺氏毒素和适合作为细胞毒素的rip在例如us20180057544中公开，其通过引用整体并入本文。
[0609]
另外的细胞毒素
[0610]
在另一些实施方案中，本文所述的抗体及其抗原结合片段可以与不同于上文公开的那些细胞毒素或除了其之外的细胞毒素缀合。适用于本文所述的组合物和方法的另外的细胞毒素包括，但不限于，5
‑
乙炔基尿嘧啶、阿比特龙、酰基富烯、腺环戊醇、阿多来新、阿地白介素、六甲蜜胺、安巴司丁、amidox、阿米斯丁、氨基
‑
γ
‑
酮戊酸、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿纳托唑、穿心莲内酯、血管生成抑制剂、安雷利克斯、抗背化形态发生蛋白
‑
1、抗雄激素物质、前列腺癌、抗雌激素、抗肿瘤物质、反义寡核苷酸、甘氨酸阿非迪霉素、细胞凋亡基因调制剂、细胞凋亡调节剂、脱嘌呤核酸、asulacrine、阿他美坦、阿曲氮芥、axinastatin1、axinastatin 2、axinastatin 3、阿扎司琼、阿扎毒素、重氮酪氨酸、浆果赤霉素iii衍生物、balanol、巴马司他、bcr/abl拮抗剂、苯并二氢扑酚(benzochlorins)、苯甲酰星形孢菌素、β
‑
内酰胺衍生物、β
‑
alethine、β
‑
clamycin b、桦木酸、bfgf抑制剂、比卡鲁胺、比生群、双吖丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)、双奈法德、bistratene a、比折来
新、breflate、博来霉素a2、博来霉素b2、溴匹利明、布多替钛、丁硫氨酸亚砜胺、钙泊三醇、卡弗他丁c、喜树碱衍生物(例如10
‑
羟基
‑
喜树碱)、卡培他滨、羧酰胺
‑
氨基
‑
三唑、羧胺三唑、卡折来新、酪蛋白激酶抑制剂、澳粟精胺、杀菌肽b、西曲瑞克、绿素类、氯代喹喔啉磺酰胺、西卡前列素、顺
‑
卟啉、克拉屈滨、氯米芬及其类似物、克霉唑、collismycin a、collismycin b、考布他汀a4、考布他汀类似物、conagenin、crambescidin 816、克立那托、念珠藻素、cryptophycin a类似物、curacin、环戊蒽醌、cycloplatam、塞普霉素、阿糖胞苷烷磷酯、溶细胞因子、磷酸己烷雌酚、达昔单抗、地西他滨、脱氢膜海鞘素b、2'脱氧助间型霉素(dcf)、地洛瑞林、右异环磷酰胺、右丙亚胺、右维拉帕米、地吖醌、膜海鞘素b、didox、二氢
‑5‑
氮杂胞啶、二氢紫杉醇、二草霉素、二苯基螺莫司汀、圆皮海绵内酯、二十二醇、多拉司琼、去氧氛尿苷、屈洛昔芬、屈大麻酚、倍癌霉素sa、依布硒啉、依考莫司汀、依地福新、依决可单抗、依洛尼塞、榄烯、乙嘧替氟、埃坡霉素、epithilone、依立雄胺、雌氮芥及其类似物、依托泊苷、依托泊苷4
’‑
磷酸酯(也称为依托泊福司etopofos)、依西美坦、法倔唑、法扎拉滨、芬维a胺、非格司亭、非那雄胺、夫拉平度、氟卓斯汀、fluasterone、氟达拉滨、盐酸氟代柔红霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)、福酚美克、福美坦、福司曲星、福替目丁、莫特沙芬钆、硝酸镓、加洛他滨、加尼瑞克、白明胶酶抑制剂、吉西他滨、谷胱甘肽抑制剂、hepsulfam、高三尖杉酯碱(hht)、金丝桃素、伊班膦酸、碘昔芬、伊决孟酮、依莫佛新、伊洛马司他、咪唑并吖啶酮、咪喹莫特、免疫刺激肽、碘苄胍、碘多柔比星、甘薯苦醇、伊立替康、伊罗普拉、伊索拉定、异本格唑、jasplakinolide、kahalalide f、片螺素
‑
n三乙酸酯、兰瑞肽、雷拉霉素、来诺拉提、蘑菇多糖硫酸酯、莱托斯汀、来曲唑、亲脂性铂化合物、lissoclinamide 7、洛铂、洛美曲索、氯尼达明、洛索蒽醌、罗唑利宾、勒托替康、莫特沙芬镥、利索茶碱、马丙考、乳腺丝抑蛋白(maspin)、基质金属蛋白酶抑制剂、美诺立尔、rnerbarone、美替瑞林、蛋氨酸酶、甲氧氯普胺、mif抑制剂、米非司酮(ifepristone)、米替福新、米立司亭、光辉霉素、丙双脒腙、二溴卫矛醇、米托萘胺、米托蒽醌、莫法罗汀、莫拉司亭、mycaperoxide b、myriaporone、n
‑
乙酰地那林、n
‑
取代的苯甲酰胺、那法瑞林、那瑞替喷(nagrestip)、纳帕英(napavin)、naphterpin、那托司亭、奈达铂、奈莫柔比星、奈立膦酸、尼鲁米特、nisamycin、nitrullyn、奥曲肽、okicenone、奥那司酮、奥坦西隆、oracin、奥马铂、奥沙利铂、oxaunomycin、紫杉醇及其类似物、帕劳胺、palmitoylrhizoxin、帕米膦酸、人参三醇、帕诺米芬、parabactin、帕折普汀、天门冬酰胺酶、培得星、戊聚糖多硫酸钠、喷司他丁、戊唑、潘氟隆、过磷酰胺、phenazinomycin、溶链菌、吡柔比星、吡曲克辛、鬼臼毒素、紫杉醇核苷、嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂、雷替曲塞、根霉素、洛太米特、罗希吐碱、卢比格酮b1、ruboxyl、沙芬戈、saintopin、sarcophytol a、沙莫司亭、索布佐生、索纳明、膦门冬酸、穗霉素d(spicamycin d)、螺莫司汀、stipiamide、磺胺肌苷、他莫司汀、替加氟、替莫唑胺、替尼泊苷、thalblastine、噻可拉林、替拉扎明、托泊替康、topsentin、曲西立滨、曲美沙特、藜芦明、长春瑞滨、vinxaltine、伏氯唑、折尼拉汀和zilascorb等。
[0611]
接头
[0612]
多种接头可用于将本文所述的抗体或其抗体片段和配体(例如，识别和结合cd45的的抗体、其抗原结合片段和可溶性配体)与细胞毒性分子缀合。
[0613]
如本文所用，术语“接头”意指包含共价键或原子链的二价化学部分，其将抗体或其片段(ab)共价附接到药物缀合物(d)以形成本公开内容的抗体药物缀合物(adc；ab
‑
z
‑
l
‑
d，其中d是细胞毒素)。合适的接头具有两个反应性末端，一个用于与抗体缀合，另一个用于与细胞毒素缀合。接头的抗体缀合反应性末端(反应性部分，z)通常是能够通过抗体上的半胱氨酸硫醇或赖氨酸胺基团与抗体缀合的位点，并且因此通常是硫醇反应性基团(例如双键(如马来酰亚胺))或离去基团(例如氯、溴、碘或r
‑
磺酰基)，或胺反应性基团(例如羧基)；而接头的细胞毒素缀合反应性末端通常是能够与细胞毒素缀合的位点。接头
‑
细胞毒素缀合的非限制性实例包括例如分别通过接头上的羧基或碱性胺基团与细胞毒素上的碱性胺或羧基形成酰胺键，或者通过例如接头上的离去基团，通过细胞毒素上的oh基团的烷基化，形成醚等。在一些实施方案中，细胞毒素
‑
接头缀合是通过与细胞毒素上的碱性胺或羧基形成酰胺键，因此接头上的反应性取代基分别是羧基或碱性胺基团。当术语“接头”用于描述缀合形式的接头时，由于接头和/或细胞毒素之间以及接头和/或抗体或其抗原结合片段之间的键的形成，一个或两个反应性末端将不存在(例如反应性部分z，已经转化为化学部分z)或不完整(例如仅仅是羧酸的羰基)。此类缀合反应以下进一步描述。
[0614]
在一些实施方案中，接头在细胞内条件下是可切割的，使得接头的切割在细胞内环境中从抗体中释放药物单元。在又一些实施方案中，接头单元是不可切割的，并且药物例如通过抗体降解释放。用于本发明的adc的接头优选在细胞外稳定，防止adc分子的聚集，并且保持adc在水性介质中自由溶解并处于单体状态。在运输或递送到细胞中之前，adc优选是稳定的并且保持完整，即抗体保持与药物部分连接。接头在靶细胞外是稳定的，并且可以在细胞内以某种有效速率被切割。有效的接头:(i)保持抗体的特异性结合特性；(ii)允许缀合物或药物部分的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整，即不切割，直到缀合物已被递送或运输到其靶向位点；和(iv)保持细胞毒性部分的细胞毒性、细胞杀伤作用或细胞抑制作用。adc的稳定性可以通过标准分析技术来测量，例如质谱、hplc和分离/分析技术lc/ms。抗体和药物部分的共价附接需要接头具有两个反应性官能团，即在反应性意义上的二价性。可用于附接两个或更多个功能性或生物活性部分的二价接头试剂(例如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原和报告基团)是已知的，并且已经描述了其所得缀合物的方法(hermanson,g.t.(1996)bioconjugate techniques；academic press:new york,第234
‑
242页)。
[0615]
接头包括可以例如通过酶水解、光解、酸性条件下的水解、碱性条件下的水解、氧化、二硫化物还原、亲核切割或有机金属切割来切割的接头(参见例如，leriche等,bioorg.med.chem.,20:571
‑
582,2012，其公开内容通过引用并入本文中，因为它涉及适用于共价缀合的接头)。
[0616]
在酸性条件下可水解的接头包括例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等。(参见例如，美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；dubowchik和walker,1999,pharm.therapeutics 83:67
‑
123；neville等,1989,biol.chem.264:14653
‑
14661，其中每一篇的公开内容通过引用整体并入本文中，因为它涉及适用于共价缀合的接头。此类接头在中性ph条件(例如在血液中的那些)下相对稳定，但是在低于ph 5.5或5.0(溶酶体的近似ph)下不稳定。
[0617]
在还原条件下可切割的接头包括例如，二硫化物。多种二硫键接头是本领域已知的，包括例如可以使用以下形成的那些：sata(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑
s
‑
乙酰硫代乙酸酯)、spdp(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丙酸酯)、spdb(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丁酸酯)和smpt(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑
氧羰基
‑
α
‑
甲基
‑
α
‑
(2
‑
吡啶基
‑
二硫代)甲苯)、spdb和
smpt(参见例如，thorpe等,1987,cancer res.47:5924
‑
5931；wawrzynczak等,in immunoconjugates:antibody conjugates in radioimagery and therapy of cancer(c.w.vogel编辑,oxford u.press,1987)。还参见美国专利号4,880,935，其中每一篇的公开内容通过引用并入本文中，因为它涉及适用于共价缀合的接头。
[0618]
在酸性条件下可水解的接头包括例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等。(参见例如，美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；dubowchik和walker,1999,pharm.therapeutics 83:67
‑
123；neville等,1989,biol.chem.264:14653
‑
14661，其中每一篇的公开内容通过引用整体并入本文中，因为它涉及适用于共价缀合的接头。此类接头在中性ph条件(例如在血液中的那些)下相对稳定，但是在低于ph 5.5或5.0(溶酶体的近似ph)下不稳定。
[0619]
在还原条件下可切割的接头包括例如，二硫化物。多种二硫键接头是本领域已知的，包括例如可以使用以下形成的那些：sata(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑
s
‑
乙酰硫代乙酸酯)、spdp(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丙酸酯)、spdb(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丁酸酯)和smpt(n
‑
琥珀酰亚胺基
‑
氧羰基
‑
α
‑
甲基
‑
α
‑
(2
‑
吡啶基
‑
二硫代)甲苯)、spdb和smpt(参见例如，thorpe等,1987,cancer res.47:5924
‑
5931；wawrzynczak等,in immunoconjugates:antibody conjugates inradioimagery and therapy of cancer(c.w.vogel编辑,oxford u.press,1987)。还参见美国专利号4,880,935，其中每一篇的公开内容通过引用并入本文中，因为它涉及适用于共价缀合的接头。
[0620]
对酶水解敏感的接头可以是例如被细胞内肽酶或蛋白酶切割的含肽接头，包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点是当缀合时，药剂通常被减弱，并且缀合物的血清稳定性通常较高。在一些实施方案中，肽基接头是至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。示例性的氨基酸接头包括二肽、三肽、四肽、五肽。合适的肽的实例包括含有氨基酸(例如缬氨酸、丙氨酸、瓜氨酸(cit)、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸)的那些。包含氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，例如瓜氨酸。示例性的二肽包括缬氨酸
‑
瓜氨酸(vc或val
‑
cit)和丙氨酸
‑
苯丙氨酸(af或ala
‑
phe)。示例性的三肽包括甘氨酸
‑
缬氨酸
‑
瓜氨酸(gly
‑
val
‑
cit)和甘氨酸
‑
甘氨酸
‑
甘氨酸(gly
‑
gly
‑
gly)。在一些实施方案中，接头包括二肽，例如val
‑
cit、ala
‑
val或phe
‑
lys、val
‑
lys、ala
‑
lys、phe
‑
cit、leu
‑
cit、ile
‑
cit、phe
‑
arg、或rp
‑
cit。含有二肽的接头(例如val
‑
cit或phe
‑
lys)在例如美国专利号6,214,345中被公开，其公开内容通过引用整体并入本文，因为它涉及适用于共价缀合的接头。在一些实施方案中，接头包括选自val
‑
ala和val
‑
cit的二肽。
[0621]
适用于将本文所述的抗体或其抗体片段与细胞毒性分子缀合的接头包括能够通过1,6
‑
消除过程释放细胞毒素的那些。能够进行该消除过程的化学部分包括对氨基苄基(pab)基团、6
‑
马来酰亚氨基环己烷酸、对ph敏感的碳酸盐和其他试剂，如在jain等,pharm.res.32:3526
‑
3540,2015中所述的，其公开内容通过引用整体并入本文中，因为它涉及适用于共价缀合的的接头。
[0622]
在一些实施方案中，接头包括“自杀式”基团，例如前述的pab或pabc(对氨基苄氧羰基)，其在例如carl等,j.med.chem.(1981)24:479
‑
480；chakravarty等(1983)j.med.chem.26:638
‑
644；us 6214345；us20030130189；us20030096743；us6759509；
us20040052793；us6218519；us6835807；us6268488；us20040018194；w098/13059；us20040052793；us6677435；us5621002；us20040121940；w02004/032828中公开。能够进行该过程的其他此类化学部分(“自杀式接头”)包括亚甲基氨基甲酸酯和杂芳基，例如氨基噻唑、氨基咪唑、氨基嘧啶等。包含此类杂环自杀式基团的接头在例如美国专利公开号20160303254和20150079114以及美国专利号7,754,681；hay等(1999)bioorg.med.chem.lett.9:2237；us 2005/0256030；de groot等(2001)j.org.chem.66:8815
‑
8830；和us 7223837中公开。在一些实施方案中，二肽与自杀式接头组合使用。
[0623]
在一些实施方案中，接头包括自杀式基团，例如前述pab或pabc(对氨基苄氧基羰基)，其在例如carl等,j.med.chem.(1981)24:479
‑
480；chakravarty等(1983)j.med.chem.26:638
‑
644；us20030130189；us20030096743；us6759509；us20040052793；us6218519；us6835807；us6268488；us20040018194；w098/13059；us20040052793；us6677435；us5621002；us20040121940；w02004/032828)中公开。能够进行该过程的其他此类化学部分(“自杀式接头”)包括氨基甲酸亚甲基酯和杂芳基，例如氨基噻唑、氨基咪唑、氨基嘧啶等。含有此类杂环自杀式基团的接头在例如美国专利公开号20160303254和20150079114以及美国专利号7,754,681；hay等(1999)bioorg.med.chem.lett.9:2237；us 2005/0256030；e groot等(2001)j.org.chem.66:8815
‑
8830；和us 7223837中公开。
[0624]
适用于本文的接头还可以包括选自以下的一种或更多种基团：c1‑
c6亚烷基、c1‑
c6杂亚烷基、c2‑
c6亚烯基、c2‑
c6杂亚烯基、c2‑
c6亚炔基、c2‑
c6杂亚炔基、c3‑
c6亚环烷基、杂环亚烷基、亚芳基、杂亚芳基及其组合，其中每一种可以任选被取代。此类基团的非限制性实例包括(ch2)
p
、(ch2ch2o)
p
和
–
(c＝o)(ch2)
p
–
单元，其中p为1
‑
6的整数，在每种情况下独立选择。
[0625]
在一些实施方案中，每个c1‑
c6亚烷基、c1‑
c6杂亚烷基、c2‑
c6亚烯基、c2‑
c6杂亚烯基、c2‑
c6亚炔基、c2‑
c6杂亚炔基、c3‑
c6亚环烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基可以任选被在每种情况下独立选自以下的1至5个取代基取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧基羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤甲基、氰基、羟基、巯基和硝基。
[0626]
在一些实施方案中，每个c1‑
c6亚烷基、c1‑
c6杂亚烷基、c2‑
c6亚烯基、c2‑
c6杂亚烯基、c2‑
c6亚炔基、c2‑
c6杂亚炔基、c3‑
c6亚环烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基可以任选地被由一个或更多个选自o、s和n的杂原子中断。
[0627]
在一些实施方案中，每个每个c1‑
c6亚烷基、c1‑
c6杂亚烷基、c2‑
c6亚烯基、c2‑
c6杂亚烯基、c2‑
c6亚炔基、c2‑
c6杂亚炔基、c3‑
c6亚环烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基可以任选地被由一个或更多个选自o、s和n的杂原子中断，并且可以任选地被在每种情况下独立选自以下的1至5个取代基取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧基羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤甲基、氰基、羟基、巯基和硝基。
[0628]
合适的接头可以包含具有提高溶解度特性的基团。例如，包含(ch2ch2o)
p
单元(例如聚乙二醇，peg，其中p为1
‑
6的整数)和((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
–
单元的接头可以提高溶解度，如经氨基、磺酸、膦酸或磷酸残基取代的烷基链可以的。包含此类部分的接头在例如美国专利
号8,236,319和9,504,756中公开，其中每一篇的公开内容都通过引用整体并入本文，因为它涉及适用于共价缀合的接头。另外的提高溶解度基团包括例如，酰基和氨基甲酰基磺酰胺基团，其具有以下结构：
[0629][0630]
其中a为0或1；并且
[0631]
r
10
选自氢、c1‑
c
24
烷基、c3‑
c
24
环烷基、c1‑
c
24
(杂)芳基、c1‑
c
24
烷基(杂)芳基和c1‑
c
24
(杂)芳基烷基、c1‑
c
24
烷基、c3‑
c
24
环烷基、c2‑
c
24
(杂)芳基、c3‑
c
24
烷基(杂)芳基和c3‑
c
24
(杂)芳基烷基，其中每一个可以任选被选自o、s和nr
11
r
12
的一个或更多个杂原子取代和/或任选被其中断，其中r
11
和r
12
独立地选自氢和c1‑
c4烷基；或者r
10
是细胞毒素，其中细胞毒素任选通过间隔部分与n连接。包含此类基团的接头例如在美国专利号9,636,421和美国专利申请公开号2017/0298145中被描述，其公开内容通过引用整体并入本文，因为它们涉及适用于细胞毒素和抗体或其抗原结合片段共价缀合的接头。
[0632]
在一些实施方案中，接头可以包括以下中的一种或更多种：肼、二硫化物、硫醚、二肽、对氨基苄基(pab)基团、杂环自杀式基团、任选经取代的c1‑
c6烷基、任选经取代的c1‑
c6杂烷基、任选经取代的c2‑
c6烯基、任选经取代的c2‑
c6杂烯基、任选经取代的c2‑
c6炔基、任选经取代的c2‑
c6杂炔基、任选经取代的c3‑
c6环烷基、任选经取代的杂环烷基、任选经取代的芳基、任选经取代的杂芳基、提高溶解度基团、酰基、
‑
(c＝o)
‑
或
‑
(ch2ch2o)
p
‑
基团(其中p为1
‑
6的整数)。本领域技术人员认识到，所列的一种或更多种基团可以以二价(双自由基)物质的形式存在，例如c1‑
c6亚烷基等。在一些实施方案中，接头l包含部分*
‑
l1l2
‑
**，其中：
[0633]
l1不存在或是
‑
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
‑
、
[0634][0635]
l2不存在或是
‑
(ch2)
m
‑
、
‑
nr
13
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)(ch2)
m
‑
、
‑
x4、
‑
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)x4、
‑
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)
‑
、
‑
((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
‑
、
‑
((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
x3(ch2)
m
‑
、
‑
nr
13
((ch2)
m
o)
n
x3(ch2)
m
‑
、
‑
nr
13
((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
x3(ch2)
m
‑
、
‑
x1x2c(＝o)(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)(ch2)
m
x3(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
(ch2)
m
c(＝o)x2x1c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
c(＝o)x2x1c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
x3(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
nr
13
c(＝o)(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
‑
、
‑
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
(ch2)
m
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
x3(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
x3((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
x3(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
nr
13
c(＝o)(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
c(＝o)
‑
、
‑
((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)(ch2)
m
nr
13
c(＝o)(ch2)
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
c(＝o)nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
x3‑
、
‑
c(r
13
)2(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
c(r
13
)2nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)x2x1c(＝o)
‑
、
‑
c(r
13
)2(ch2)
m
nr
13
c(＝o)(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
c(r
13
)2nr
13
‑
、
‑
c(r
13
)2(ch2)
m
x3(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
c(r
13
)2nr
13
‑
、
‑
c(r
13
)2(ch2)
m
oc(＝o)nr
13
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)o(ch2)
m
c(r
13
)2nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
nr
13
‑
、
‑
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
nr
13
‑
、
‑
(ch2ch2o)
n
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
(och2ch2)n；
‑
(ch2)
m
o(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
s(＝o)2‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
s(＝o)2‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
s(＝o)2‑
、
‑
(ch2)
m
x2x1c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
c(＝o)x2x1c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
x2x1c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
x2x1c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
x2x1c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
c(＝o)x2x1c(＝o)nr
13
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
x3(o(ch2)
m
)
n
c(＝o)
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
(o(ch2)
m
)
n
c(＝o)nr
13
(ch2)
m
‑
、
‑
(ch2)
m
nr
13
c(＝o)nr
13
(ch2)m
‑
或
‑
(ch2)
m
x3(ch2)
m
nr
13
c(＝o)
‑
；
[0636]
其中，
[0637]
x1是
[0638][0639]
x2是
[0640][0641]
x3是
[0642]
并且
[0643]
x4是
[0644][0645]
其中，
[0646]
r
13
在每种情况下独立地选自h和c1‑
c6烷基；
[0647]
m在每种情况下独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
[0648]
n在每种情况下独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14；并且
[0649]
其中单星号(*)表示与细胞毒素(例如鹅膏蕈毒素)的附接点，并且双星号(**)表示与反应性取代基z'或化学部分z的连接点，前提是l1和l2都不存在。
[0650]
在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基(pab)。在一个实施方案中，对氨基苄基位于细胞毒性药物与接头中的蛋白酶切割位点之间。在一个实施方案中，对氨基苄基是对氨基苄基氧羰基单元的一部分。在一个实施方案中，对氨基苄基是对氨基苄基酰氨基单元的一部分。
[0651]
在一些实施方案中，接头包含pab、val
‑
cit
‑
pab、val
‑
ala
‑
pab、val
‑
lys(ac)
‑
pab、phe
‑
lys
‑
pab、phe
‑
lys(ac)
‑
pab、d
‑
val
‑
leu
‑
lys、gly
‑
gly
‑
arg、ala
‑
ala
‑
asn
‑
pab或ala
‑
pab。
[0652]
在一些实施方案中，接头包含以下中一种或更多种的组合：肽、寡糖、
‑
(ch2)
p
‑
、
‑
(ch2ch2o)
p
‑
、pab、val
‑
cit
‑
pab、val
‑
ala
‑
pab、val
‑
lys(ac)
‑
pab、phe
‑
lys
‑
pab、phe
‑
lys(ac)
‑
pab、d
‑
val
‑
leu
‑
lys、gly
‑
gly
‑
arg、ala
‑
ala
‑
asn
‑
pab或ala
‑
pab。
[0653]
在一些实施方案中，接头包含((ch2)
m
o)
n
(ch2)
m
–
基团(其中n和每个m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10)；和杂芳基，其中杂芳基是三唑。在一些实施方案中，((ch2)mo)n(ch2)m
‑
基团和三唑一起包含：
[0654][0655]
其中n为1至10，波浪线表示另外的接头组分、化学部分z或鹅膏蕈毒素的附接点。
[0656]
在一些实施方案中，接头包括选自val
‑
ala和val
‑
cit的二肽。在一些实施方案中，二肽与自杀式接头组合使用。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基(pab)。在一个实施方案中，对氨基苄基位于细胞毒性药物与接头中的蛋白酶切割位点之间。在一个实施方案中，对氨基苄基是对氨基苄氧羰基单元的一部分。在一个实施方案中，对氨基苄基是对氨基苄基酰氨基单元的一部分。
[0657]
在一些实施方案中，接头包含
‑
(c＝o)(ch2)
p
‑
单元，其中p为1
‑
6的整数。
[0658]
在一些实施方案中，接头包含
‑
(ch2)
n
单元，其中n为2至6的整数。
[0659]
在一个特定的实施方案中，接头包含以下结构：
[0660][0661]
其中波浪线表示细胞毒素与反应性部分z的附接点。在另一个特定的实施方案中，接头包含以下结构：
[0662][0663]
其中波浪线表示细胞毒素与反应性部分z的附接点。此类pab
‑
二肽
‑
丙酰基接头在例如专利申请公开号wo2017/149077中公开，其全部内容通过引用整体并入本文。此外，wo2017/149077中公开的细胞毒素通过引用并入本文。
[0664]
在某些实施方案中，adc的接头包括n
‑
β
‑
马来酰亚胺丙基
‑
val
‑
ala
‑
对氨基苄基(bmp
‑
val
‑
ala
‑
pab。在某些实施方案中，adc的接头是n
‑
β
‑
马来酰亚胺丙基
‑
val
‑
ala
‑
对氨基苄基(bmp
‑
val
‑
ala
‑
pab)。
[0665]
在某些实施方案中，adc的接头是马来酰亚胺己酰基
‑
val
‑
ala
‑
对
‑
氨基苄基(mc
‑
val
‑
ala
‑
pab)。
[0666]
在某些实施方案中，adc的接头是马来酰亚胺己酰基
‑
val
‑
cit
‑
对氨基苄基(mc
‑
vc
‑
pab)。
[0667]
在一些实施方案中，接头包含以下之一：
[0668][0669]
其中接头的gem
‑
二甲基末端附接到例如卡奇霉素衍生物的二硫化物部分，其通过卡奇霉素三硫化物基团的还原产生。此类接头在例如国际专利申请公开号wo2016/172273中公开，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0670]
在一些实施方案中，接头包含4
‑
(4'
‑
乙酰基苯氧基)丁酸部分。在一些实施方案中，接头包含腙。在一些实施方案中，接头包含由下式表示的4
‑
(4'
‑
乙酰基苯氧基)丁酸部分和腙，由以下式表示：
[0671][0672]
其中接头的二甲基末端附接到例如卡奇霉素衍生物的二硫化物部分，其通过卡奇霉素三硫化物基团的还原产生。此类接头在例如美国专利号5,606,040中公开，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0673]
在一些实施方案中，接头包含mcc(4
‑
[n
‑
马来酰亚胺甲基]环己烷
‑1‑
羧酸酯)。
[0674]
可用于将抗体、其抗原结合片段或配体与细胞毒性剂缀合的接头包括在接头的一端与细胞毒性剂共价结合并且在接头的另一端含有通过接头上存在的反应性取代基与cd45的抗体、其抗原结合片段或配体内存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分。可存在于结合cd45的抗体、其抗原结合片段或配体内的反应性取代基包括但不限于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基部分；赖氨酸残基的氨基部分；天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基部分；和半胱氨酸残基的硫醇部分，以及非天然存在的氨基酸的炔丙基、叠氮基、卤代芳基(例如氟芳基)、卤代杂芳基(例如氟杂芳基)、卤代烷基和卤代杂烷基部分。可用于合成adc的接头的实例包括含有亲电子试剂的那些，例如迈克尔受体(例如，马来酰亚胺)、活化酯、缺电子羰基化合物和醛等，除了适用于与抗体或抗原结合片段内存在的亲核取代基反应之外的(例如胺和硫醇部分)。例如，适用于合成adc的接头包括但不限于4
‑
(n
‑
马来酰亚胺甲基)
‑
环己烷
‑
l
‑
羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)、n
‑
琥珀酰亚胺碘乙酸酯(sia)、磺基
‑
smcc、间马来酰亚胺苯甲酰基
‑
n
‑
羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)、磺基
‑
mbs和琥珀酰亚胺碘乙酸酯，例如liu等,18:690
‑
697,1979，其公开内容通过引用并入本文，因为它涉及用于化学缀合的接头。
[0675]
本领域技术人员认识到，本文公开的化学基团、部分和特征中的任一种或更多种可以以多种方式组合，以形成可用于如本文公开的抗体与细胞毒素缀合的接头。另外的可用于与本文公开的组合物和方法结合使用的接头例如在美国专利申请公开号2015/0218220中被描述，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0676]
在某些实施方案中，作为接头前体的中间体在适当的条件下与药物部分反应。在某些实施方案中，在药物和/或中间体或接头上使用反应性基团。药物与中间体或衍生药物之间的反应的产物随后在适当的条件下与抗体或抗原结合片段反应。可替代地，接头或中间体可以首先与抗体或衍生抗体反应，并且然后与药物或衍生药物反应。现在将更全面地描述此类缀合反应。
[0677]
许多不同的反应可用于接头或药物
‑
接头缀合物与抗体或其抗原结合片段的共价附接。抗体分子上合适的附接点包括赖氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团、半胱氨酸的巯基和芳香族氨基酸的各种部分。例如，可以使用碳二亚胺反应将化合物上的羧基(或氨基)连接到抗体部分上的氨基(或羧基)来进行非特异性共价附接。另外，双官能试剂(例如二醛或酰亚胺酯)也可用于将化合物上的氨基与抗体部分上的氨基连接。希夫碱反应也可用于药物与结合剂的附接。这种方法包括对含有乙二醇或羟基的药物进行高碘酸盐氧化，从而形成醛，然后将其与结合剂反应。通过与结合剂的氨基形成席夫碱发生附接。异硫氰酸酯也可用作偶联剂用以将药物与结合剂共价附接。其他技术是技术人员已知的，并且在本公开内容的范围内。
[0678]
可用于与如本文所述的抗体或抗原结合片段缀合的接头包括但不限于含有通过偶联反应形成的化学部分z的接头，如下表2所示。曲线分别表示抗体或抗原结合片段与细胞毒性分子的附接点。
[0679]
表2.在形成抗体
‑
药物缀合物中通过偶联反应形成的示例性化学部分z
[0680]
[0681]
[0682]
[0683][0684]
本领域技术人员认识到，附接到接头上的反应性取代基z和抗体或其抗原结合片段上的反应性取代基参与共价偶联反应以产生化学部分z，并且认识到反应性部分z’。因此，可用于与本文所述的方法结合的抗体
‑
药物缀合物可以通过抗体或其抗原结合片段与接头或细胞毒素
‑
接头缀合物的反应形成，如本文所述，接头或细胞毒素
‑
接头缀合物包括反应性取代基z’，适用于与抗体或其抗原结合片段上的反应性取代基反应，以形成化学部分z。
[0685]
在一些实施方案中，z'是
‑
nr
13
c(＝o)ch＝ch2、
‑
n3、
‑
sh、
‑
s(＝o)2(ch＝ch2)、
‑
(ch2)2s(＝o)2(ch＝ch2)、
‑
nr
13
s(＝o)2(ch＝ch2)、
‑
nr
13
c(＝o)ch2r
14
、
‑
nr
13
c(＝o)ch2br、
‑
nr
13
c(＝o)ch2i、
‑
nhc(＝o)ch2br、
‑
nhc(＝o)ch2i、
‑
onh2、
‑
c(o)nhnh2、
‑
co2h、
‑
nh2、
‑
nh(c＝o)、
‑
nc(＝s)、
[0686]
[0687][0688]
其中
[0689]
r
13
在每种情况下独立地选自h和c1
‑
c6烷基；
[0690]
r
14
是
‑
s(ch2)
n
chr
15
nhc(＝o)r
13
；
[0691]
r
15
为r
13
或
‑
c(＝o)or
13
；
[0692]
r
16
在每种情况下独立地选自h、c1‑
c6烷基、f、cl和
‑
oh；
[0693]
r
17
在每种情况下独立地选自h、c1
‑
c6烷基、f,cl,
‑
nh2,
‑
och3,
‑
och2ch3,
‑
n(ch3)2,
‑
cn,
‑
no2和
‑
oh；和
[0694]
r
18
在每种情况下独立地选自h、f、经
‑
c(＝o)oh取代的苄氧基、经
‑
c(＝o)oh取代的苄基、经
‑
c(＝o)oh取代的c1‑
c4烷烷氧基和经
‑
c(＝o)oh取代的c1‑
c4烷基；
[0695]
m在每种情况下独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；并且
[0696]
n在每种情况下独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
[0697]
如表2所示，接头和抗体或其抗原结合片段上适当的反应性取代基的实例包括亲核试剂/亲电子试剂对(例如，硫醇/卤代烷基对、胺/羰基对或硫醇/α,β
‑
不饱和羰基对等)、二烯/二烯亲和物对(例如，叠氮化物/炔对、或二烯/α,β
‑
不饱和羰基对等)等。反应性取代基之间形成化学部分z的偶联反应包括但不限于硫醇烷基化、羟基烷基化、胺烷基化、胺或羟胺缩合、肼形成、酰胺化、酯化、二硫化物形成、环加成(例如，[4+2]diels
‑
alder环加成、[3+2]huisen环加成等)、亲核芳香族取代、亲电子芳香族取代及本领域已知或本文所述的其他反应形式。优选地，接头包含用于与抗体或其抗原结合片段上的亲核官能团反应的亲电子官能团。
[0698]
如本文公开的，抗体或其抗原结合片段内可以存在的反应性取代基包括但不限于亲核基团，例如(i)n
‑
末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸；和(iv)糖羟基或氨基，其中抗体被糖基化。如本文公开的，抗体或其抗原结合片段内可以存在的反应性取代基包括但不限于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基部分；赖氨酸残基的氨基部分；天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基部分；和半胱氨酸残基的硫醇部分；以及非天然存在的氨基酸的炔丙基、叠氮基、卤代芳基(例如氟代芳基)、卤代杂芳基(例如氟代杂芳基)、卤代烷基和卤代杂烷基部分。在一些实施方案中，如本文公开的，抗体或其抗原结合片段内存在的反应性取代基是胺或硫醇部分。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。通过用还原剂(例如dtt(二硫苏糖醇))处理，可以使抗体对与接头试剂的缀合具有反应性。理论上，因此每个半胱氨酸桥形成两个反应性硫醇亲核试剂。另外的亲核基团可以通过赖氨酸与2
‑
亚氨基硫代硅烷(traut试剂)的反应引入抗体中，导致胺转化为硫醇。可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，制备包含一个或更多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)将反应性硫醇基团引入抗体(或其片段)中。美国专利号7,521,541号教导了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸来基因工程化抗体。
[0699]
在一些实施方案中，附接到接头上的反应性部分z’是亲核基团，其与抗体上存在的亲电子基团反应。抗体上有用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电基团反应，并且与抗体形成共价键。可用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、羟基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸盐和芳基酰肼。
[0700]
在一些实施方案中，z是抗体或其抗原结合片段(例如胺和硫醇部分)内存在的反应性亲核取代基与反应性亲电子取代基z’之间的反应产物。例如，z’可以是迈克尔受体(例如马来酰亚胺)、活化酯、缺电子羰基化合物和醛等。
[0701]
表3中提供了反应性取代基和所得化学部分的数个代表性的非限制性实例。
[0702]
表3.互补的反应性取代基和化学部分
[0703][0704]
例如，适用于合成adc的接头包括但不限于，反应性取代基z，例如马来酰亚胺或卤代烷基。这些可以通过试剂附接到接头上，例如琥珀酰亚胺基4
‑
(n
‑
马来酰亚胺甲基)
‑
环己烷
‑
l
‑
羧酸酯(smcc)、n
‑
琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(sia)、磺基
‑
smcc、间马来酰亚氨基苯甲酰基
‑
n
‑
羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)、磺基
‑
mbs和琥珀酰亚胺基碘乙酸酯，除了在例如刘等,18:690
‑
697,1979中所述的其他试剂之外，其公开内容通过引用并入本文中，因为它涉及用于化学缀合的接头。
[0705]
在一些实施方案中，附接到接头l上的反应性取代基z’是马来酰亚胺、叠氮化物或炔烃。含有马来酰亚胺的接头的实例是不可切割的基于马来酰亚氨基的接头，它对微管破坏剂(例如澳瑞他汀)的缀合特别有用。此类接头被doronina等,bioconjugate chem.17:14
‑
24,2006描述，其公开内容通过引用并入本文中，因为它涉及用于化学缀合的接头。
[0706]
在一些实施方案中，反应性取代基z'是
–
(c＝o)
‑
或
‑
nh(c＝o)
‑
，使得接头可以通过酰胺或脲部分分别连接到抗体或其抗原结合片段，由
–
(c＝o)
‑
或
‑
nh(c＝o)
‑
基团与抗体或其抗原结合片段的氨基反应产生。
[0707]
在一些实施方案中，反应性取代基z'是n
‑
马来酰亚胺基、卤化n
‑
烷基酰氨基、磺酰氧基n
‑
烷基酰氨基、碳酸酯基、磺酰基卤化物基团、硫醇基团或其衍生物、包含内部碳
‑
碳三键的炔基、(杂
‑
过)环炔基、双环[6.1.0]非
‑4‑
炔
‑9‑
基、包含内部碳
‑
碳双键的烯基、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、腈氧化物基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(o
‑
烷基)羟基氨
基、肼基、卤化n
‑
马来酰亚胺基、1,1
‑
双(磺酰基甲基)甲基羰基或其消除衍生物、羰基卤化物基团或联烯基酰胺(allenamide)，其中每一个可以任选被取代。在一些实施方案中，反应性取代基包含环烯基、环炔基或任选经取代的(杂)环炔基。
[0708]
与本文所述的方法结合使用的示例性抗体
‑
药物缀合物和配体
‑
药物缀合物可以通过抗体、其抗原结合片段或配体与鹅膏毒素的反应形成，该鹅膏毒素缀合至含有适合于的取代基的接头。与抗体、其抗原结合片段或配体上的反应性残基反应。含有适用于与抗体或其抗原结合片段上的反应性残基反应的反应性取代基z
′
的鹅膏蕈毒素
‑
接头缀合物的非限制性实例包括但不限于，7’c
‑
(4
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0709]7’
c
‑
(4
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0710]7’
c
‑
(4
‑
(6
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)己酰基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0711]7’
c
‑
(4
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷羰基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0712]7’
c
‑
(4
‑
(6
‑
(4
‑
(马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0713]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0714]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(6
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)己酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0715]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0716]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(6
‑
(4
‑
(马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基(己酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0717]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(3
‑
羧丙酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0718]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(2
‑
溴乙酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0719]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(3
‑
(吡啶
‑2‑
基二磺酰基)丙酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0720]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(4
‑
(马来酰亚氨基)丁酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0721]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(马来酰亚氨基)乙酰基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0722]7’
c
‑
(4
‑
(3
‑
(马来酰亚氨基)丙酰基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0723]7’
c
‑
(4
‑
(4
‑
(马来酰亚氨基)丁酰基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0724]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(6
‑
(4
‑
(马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基(己酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0725]7’
c
‑
(3
‑
((6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)甲基)吡咯烷
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0726]7’
c
‑
(3
‑
((6
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)己酰氨基)甲基)吡咯烷
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0727]7’
c
‑
(3
‑
((4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)甲基)吡咯烷
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0728]7’
c
‑
(3
‑
((6
‑
((4
‑
(马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰氨基)甲基)吡咯烷
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0729]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(6
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)己酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0730]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(4
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)丁酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0731]7’
c
‑
(4
‑
(4
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)丁酰基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0732]7’
c
‑
(4
‑
(6
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)己酰基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0733]7’
c
‑
((4
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0734]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0735]7’
c
‑
((4
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0736]
(r)
‑7’
c
‑
((3
‑
((6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)甲基)吡咯烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0737]
(s)
‑7’
c
‑
((3
‑
((6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)甲基)吡咯烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0738]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(6
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)己酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0739]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0740]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(6
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0741]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)乙基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0742]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(6
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)己酰氨基)乙基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0743]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)乙基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0744]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(6
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰氨基)乙基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0745]7’
c
‑
((3
‑
((6
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)己酰氨基)
‑
s
‑
甲基)吡咯烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0746]7’
c
‑
((3
‑
((6
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)己酰氨基)
‑
r
‑
甲基)吡咯烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0747]7’
c
‑
((3
‑
((4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)
‑
s
‑
甲基)吡咯烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0748]7’
c
‑
((3
‑
((4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)
‑
r
‑
甲基)吡咯烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0749]7’
c
‑
((3
‑
((6
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰氨基)甲基)吡咯烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0750]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(3
‑
羧丙酰氨基)乙基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0751]7’
c
‑
((4
‑
(6
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)己酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0752]7’
c
‑
((4
‑
(6
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0753]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(马来酰亚氨基)乙酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0754]7’
c
‑
((4
‑
(3
‑
(马来酰亚氨基)丙酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0755]7’
c
‑
((4
‑
(4
‑
(马来酰亚氨基)丁酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0756]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(2
‑
(马来酰亚氨基)乙酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0757]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(4
‑
(马来酰亚氨基)丁酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0758]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(6
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0759]7’
c
‑
((3
‑
((6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)甲基)氮杂环丁烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0760]7’
c
‑
((3
‑
(2
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)乙基)氮杂环丁烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0761]7’
c
‑
((3
‑
((4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)甲基)氮杂环丁烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0762]7’
c
‑
((3
‑
(2
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)乙基)氮杂环丁烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0763]7’
c
‑
((3
‑
(2
‑
(6
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰氨基)乙基)氮杂环丁烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0764]7’
c
‑
(((2
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)
‑
n
‑
甲基己酰氨基)乙基)(甲基)氨基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0765]7’
c
‑
(((4
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)
‑
n
‑
甲基己酰氨基)丁基(甲基)氨基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0766]7’
c
‑
((2
‑
(2
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)乙基)氮丙啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0767]7’
c
‑
((2
‑
(2
‑
(6
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰氨基)乙基)氮丙啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0768]7’
c
‑
((4
‑
(6
‑
(6
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)己酰氨基)己酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0769]7’
c
‑
((4
‑
(1
‑
(氨氧基)
‑2‑
氧代
‑
6,9,12,15
‑
四氧杂
‑3‑
氮杂十七碳
‑
17
‑
酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0770]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)乙酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0771]7’
c
‑
((4
‑
(3
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)丙酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0772]7’
c
‑
((4
‑
(4
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)丁酰基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0773]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(6
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)己酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0774]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(2
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0775]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(4
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)丁酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0776]7’
c
‑
((4
‑
(20
‑
(氨氧基)
‑
4,19
‑
二氧代
‑
6,9,12,15
‑
四氧杂
‑
3,18
‑
diazaicosyl)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0777]7’
c
‑
(((2
‑
(6
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)
‑
n
‑
甲基己酰氨基)乙基)(甲基)氨基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0778]7’
c
‑
(((4
‑
(6
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)
‑
n
‑
甲基己酰氨基)丁基)(甲基)氨基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0779]7’
c
‑
((3
‑
((6
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰氨基)甲基)吡咯烷
‑1‑
基)
‑
s
‑
甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0780]7’
c
‑
((3
‑
((6
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己酰氨基)
‑
r
‑
甲基)吡咯烷
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0781]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(2
‑
溴乙酰氨基)乙基)哌嗪
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0782]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(2
‑
溴乙酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0783]7’
c
‑
((4
‑
(2
‑
(3
‑
(吡啶
‑2‑
基二磺酰基)丙酰氨基)乙基)哌啶
‑1‑
基)甲基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0784]6’‑
o
‑
(6
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)己基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0785]6’
o
‑
(5
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)戊基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0786]6’
o
‑
(2
‑
((6
‑
(马来酰亚氨基)己基)氧)
‑2‑
氧代乙基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0787]6’
o
‑
((6
‑
(马来酰亚氨基)己基)氨基甲酰基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0788]6’
o
‑
((6
‑
(4
‑
((马来酰亚氨基)甲基)环己烷甲酰氨基)己基)氨基甲酰基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0789]6’‑
o
‑
(6
‑
(2
‑
溴乙酰胺基)己基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0790]7’
c
‑
(4
‑
(6
‑
(叠氮基)己酰氨基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0791]7’
c
‑
(4
‑
(己
‑5‑
酰基氨基)哌啶
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0792]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)乙基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0793]7’
c
‑
(4
‑
(2
‑
(6
‑
(6
‑
(马来酰亚氨基)己酰氨基)己酰氨基)乙基)哌嗪
‑1‑
基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0794]6’
o
‑
(6
‑
(6
‑
(11,12
‑
二脱氢
‑
5,6
‑
二氢
‑
二苯并[b，f]azocin
‑5‑
基)
‑6‑
氧代己酰氨基)己基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0795]6’‑
o
‑
(6
‑
(己
‑5‑
酰基氨基)己基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0796]6’‑
o
‑
(6
‑
(2
‑
(氨氧基)乙酰氨基)己基)
‑
鹅膏蕈毒素；
[0797]6’
o
‑
((6
‑
氨基氧基)己基)
‑
鹅膏蕈毒素；和6
’‑
o
‑
(6
‑
(2
‑
碘乙酰氨基)己基)
‑
鹅膏蕈毒素。
[0798]
在一些实施方案中，adc包含通过接头和化学部分z与如本文公开的式iii、iiia或iiib中任一种的鹅膏蕈毒素缀合的抗
‑
cd45抗体。在一些实施方案中，接头包括肼、二硫化物、硫醚或二肽。在一些实施方案中，接头包括二肽。在一些实施方案中，接头包括选自val
‑
ala和val
‑
cit的二肽。在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基(pab)。在一些实施方案中，接头包括pab
‑
cit
‑
val部分。在一些实施方案中，接头包括pab
‑
ala
‑
val部分。在一些实施方案中，接头包含
–
((c＝o)(ch2)
n
–
单元，其中n为1
‑
6的整数。在一些实施方案中，接头是
–
pab
‑
cit
‑
val
‑
((c＝o)(ch2)
n
–
。
[0799]
在一些实施方案中，接头包含
‑
(ch2)
n
–
单元，其中n为2
‑
6的整数。在一些实施方案中，接头是
–
pab
‑
cit
‑
val
‑
((c＝o)(ch2)
n
–
。在一些实施方案中，接头是
–
pab
‑
ala
‑
val
‑
((c＝o)(ch2)
n
–
。在一些实施方案中，接头是
‑
(ch2)
n
–
。在一些实施方案中，接头是
‑
((ch2)
n
–
，其中n为6。
[0800]
在一些实施方案中，化学部分z选自表2。在一些实施方案中，化学部分z是
[0801][0802]
其中s是表示抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基的硫原子，其结合cd45(例如，来自半胱氨酸残基的
‑
sh基)。
[0803]
在一些实施方案中，接头l和化学部分z(一起作为l
‑
z)是
[0804][0805]
本领域技术人员认识到，在与抗体或其抗原结合片段缀合之前，接头反应性取代基结构包含作为基团z的马来酰亚胺。前述接头部分和鹅膏蕈毒素
‑
接头缀合物，以及与本文所述的组合物和方法结合使用的其他物质例如在美国专利申请公开号2015/0218220和专利申请公开号wo2017/149077中被描述，其中每一篇的公开内容通过引用整体并入本文。
[0806]
在一些实施方案中，在与抗体或其抗原结合片段缀合之前，接头反应性取代基结构l
‑
z'是：
[0807][0808]
在一些实施方案中，本文公开的鹅膏蕈毒素与具有下式的接头反应性部分
‑
l
‑
z
′
缀合：
[0809][0810]
其中波浪线表示与鹅膏蕈毒素的附接点。
[0811]
在一些实施方案中，本文公开的鹅膏蕈毒素与具有下式的接头反应性取代基
‑
l
‑
z'缀合：
[0812][0813]
其中波浪线表示与鹅膏蕈毒素的附接点。
[0814]
前述接头部分和鹅膏蕈毒素
‑
接头缀合物，以及与本文所述的组合物和方法结合使用的其他物质例如在美国专利申请公开号2015/0218220和专利申请公开号wo2017/149077中被描述，其中每一篇的公开内容通过引用整体并入本文。
[0815]
抗体
‑
药物缀合物的制备
[0816]
在本公开内容的式(i)和(ii)adc中，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段通过如本文公开的接头l和化学部分z与一个或更多个细胞毒性药物部分(d)缀合，例如每个抗体约1至约20个药物部分。本公开内容的adc可以通过数种途径制备，采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，包括:(1)抗体或其抗原结合片段的反应性取代基与二价连接试剂反应，以形成如上所述的ab
‑
z
‑
l，随后与药物部分d反应；或(2)药物部分的反应性取代基与二价连接试剂反应以形成d
‑
l
‑
z’，随后与如上文所述的抗体或其抗原结合片段的反应性取代基反应。本文描述了用于制备adc的另外的方法。
[0817]
在另一方面，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段具有一个或更多个赖氨酸残基，其可被化学修饰以引入一个或更多个巯基。然后，如上所述，通过经由巯基的硫原子缀合形成adc。可用于修饰赖氨酸的试剂包括但不限于，n
‑
琥珀酰亚胺基s
‑
乙酰硫代乙酸酯(sata)和2
‑
亚氨基硫环戊烷盐酸盐(traut试剂)。
[0818]
在另一方面，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段可以具有一个或更多个碳水化合物基团，其可以被化学修饰以具有一个或更多个巯基。然后，如上所述，通过经由巯基的硫原子缀合形成adc。
[0819]
在又一方面，抗
‑
cd45抗体或其抗原结合片段可以具有一个或更多个碳水化合物基团，其可以被氧化以提供醛基(
‑
cho)(参见，例如，laguzza等,j.med.chem.1989,32(3),548
‑
55)。然后，如上所述，通过经由相应的醛缀合形成adc。其他用于细胞毒素附接或缔合的蛋白质修饰的协议在coligan等.,current protocols inproteinscience,vol.2,johnwiley&sons(2002)中被描述，通过引用并入本文。
[0820]
用于将接头
‑
药物部分与细胞靶向蛋白(例如抗体、免疫球蛋白或其片段)缀合的方法在例如美国专利号5,208,020；美国专利号6,441,163；wo2005037992；wo2005081711；和wo2006/034488中发现，其全部在此通过引用整体明确地并入本文。
[0821]
可替代地，可以制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白，例如通过重组技术或肽合成。dna的长度可以包含编码缀合物的两个部分的各自区域，这两个部分彼此相邻，或者被编码不会破坏缀合物的期望特性的接头肽的区域隔开。
[0822]
治疗用途
[0823]
如上所述，施用的adc量应足以耗竭排斥car细胞疗法的淋巴细胞。在一个实施方案中，抗
‑
cd45adc的治疗有效剂量低于用于抗
‑
cd45adc预处理的剂量。治疗有效剂量的确定在本领域从业者的能力范围内，然而，作为一个实例，在本文所述的方法的实施方案中，利用全身施用adc来治疗免疫疾病或癌症，有效人剂量可以为约0.001至约150mg/kg，例如约0.1至约150mg/kg(例如，约5mg/kg、约10mg/kg、约25mg/kg、约50mg/kg、约75mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg等)。在一个实施方案中，在人患者的car疗法之前用于治疗的抗
‑
cd45 adc的治疗有效剂量是耗竭受试者中的淋巴细胞同时通常不耗竭受试者中的hsc的剂量。在更高的剂量下，例如用于干细胞移植疗法的预处理，抗
‑
cd45adc可用于耗竭人hsc(参见，例如，wo 2017/219025)。如以下实施例中所述，抗
‑
cd45 adc可用于耗竭淋巴细胞，其中
在更高的剂量下，抗
‑
cd45 adc可用于耗竭淋巴细胞和hsc。因此，在受试者的car疗法之前用于淋巴耗竭的抗
‑
cd45adc的治疗有效剂量是维持患者的总体hsc存活率同时耗竭淋巴细胞的剂量。例如，在一些实施方案中，在受试者的car疗法之前用于淋巴耗竭的抗
‑
cd45 adc的治疗有效剂量可以是基本上维持患者的总体hsc存活率同时基本上耗竭淋巴细胞的剂量。
[0824]
本文所述的抗
‑
cd45adc的有效剂量的范围可以为例如约0.001至约100mg/kg体重/单次(例如，单次给药剂量)施用、多次施用或连续给药，或达到抗
‑
cd45 adc的最佳血清浓度(例如，约0.0001至约5000μg/ml的血清浓度)。一剂抗
‑
cd45 adc可以每天、每周或每月在递送抗
‑
cd45adc后的时间点向已经、同时接受或将接受car疗法的人受试者施用一次或更多次(例如，2
‑
10次)。抗
‑
cd45adc可以向人患者施用一次或作为多剂量施用。在一个实施方案中，抗
‑
cd45 adc可以以足以在car疗法之前减少宿主反应性淋巴细胞的数量的量施用，例如减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
[0825]
在一个实施方案中，向人患者施用的通过接头与鹅膏蕈毒素缀合的抗
‑
cd45抗体的剂量为约0.1mg/kg至约0.3mg/kg。
[0826]
在一个实施方案中，向人患者施用的通过接头与鹅膏蕈毒素缀合的抗
‑
cd45抗体的剂量为约0.15mg/kg至约0.3mg/kg。
[0827]
在一个实施方案中，向人患者施用的通过接头与鹅膏蕈毒素缀合的抗
‑
cd45抗体的剂量为约0.15mg/kg至约0.25mg/kg。
[0828]
在一个实施方案中，向人患者施用的通过接头与鹅膏蕈毒素缀合的抗
‑
cd45抗体的剂量为约0.2mg/kg至约0.3mg/kg。
[0829]
在一个实施方案中，向人患者施用的通过接头与鹅膏蕈毒素缀合的抗
‑
cd45抗体的剂量为约0.25mg/kg至约0.3mg/kg。
[0830]
在一个实施方案中，向人患者施用的通过接头与鹅膏蕈毒素缀合的抗
‑
cd45抗体的剂量为约0.1mg/kg。
[0831]
在一个实施方案中，向人患者施用的通过接头与鹅膏蕈毒素缀合的抗
‑
cd45抗体的剂量为约0.2mg/kg。
[0832]
在一个实施方案中，向人患者施用的通过接头与鹅膏蕈毒素缀合的抗
‑
cd45抗体的剂量为约0.3mg/kg。
[0833]
在一个实施方案中，向人患者施用的本文所述的抗
‑
cd45抗体的剂量为约0.001mg/kg至10mg/kg、约0.01mg/kg至9.5mg/kg、约0.1mg/kg至9mg/kg、约0.1mg/kg至8.5mg/kg、约0.1mg/kg至8mg/kg、约0.1mg/kg至7.5mg/kg、约0.1mg/kg至7mg/kg、0.1mg/kg至6.5mg/kg、0.1mg/kg至6mg/kg、0.1mg/kg至5.5mg/kg、约0.1mg/kg至5mg/kg、约0.1mg/kg至4.5mg/kg、约0.1mg/kg至4mg/kg、约0.5mg/kg至3.5mg/kg、约0.5mg/kg至3mg/kg、约1mg/kg至10mg/kg、约1mg/kg至9mg/kg、约1mg/kg至8mg/kg、约1mg/kg至7mg/kg、约1mg/kg至6mg/kg、约1mg/kg至5mg/kg、约1mg/kg至4mg/kg、或约1mg/kg至3mg/kg。
[0834]
在一个实施方案中，向人患者施用本文所述的抗
‑
cd45抗体的半衰期等于或小于24小时、等于或小于22小时、等于或小于20小时、等于或小于18小时、等于或小于16小时、等于或小于14小时、等于或小于13小时、等于或小于12小时、等于或小于11小时、等于或小于
10小时、等于或小于9小时、等于或小于8小时、等于或小于7小时、等于或小于6小时、或等于或小于5小时。在一个实施方案中，抗
‑
cd45抗体的半衰期为5小时至7小时；为5小时至9小时；为15小时至11小时；为5小时至13小时；为5小时至15小时；为5小时至20小时；为5小时至24小时；为7小时到24小时；为9小时到24小时；为11小时至24小时；12小时至22小时；10小时至20小时；8小时至18小时；或14小时至24小时。
[0835]
在一个实施方案中，本文公开的方法使接受adc患者的肝毒性最小化用以预处理。例如，在某些实施方案中，本文公开的方法导致患者的肝标志物水平保持低于已知毒性水平超过24小时、48小时、72小时或96小时。在另一些实施方案中，本文公开的方法导致患者的肝标志物水平保持在参考范围内超过24小时、48小时、72小时或96小时。在某些实施方案中，本文公开的方法导致肝标志物水平在超过24小时、48小时、72小时或96小时内升高不超过参考范围的1.5倍、不超过参考范围的3倍、不超过参考范围的5倍或不超过参考范围的10倍。可用于毒性测试的肝标志物的实例包括丙氨酸氨基转移酶(alt)、乳酸脱氢酶(ldh)和天冬氨酸氨基转移酶(ast)。在某些实施方案中，如本文所述的adc的施用，即其中施用两个剂量而不是单个剂量，导致肝标志物(例如，ast、ldh和/或alt)的瞬时增加。在一些情况下，可以达到指示毒性的肝标志物的升高水平，但是在某个时间段内，例如，约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、3天以上、约3.5天、约4天、约4.5天、约5天、约5.5天、约6天、约6.5天、约7天、约7.5天或不到一周，肝标志物水平恢复到与肝脏毒性无关的正常水平。例如，在人(平均成年男性)中，alt的正常无毒水平为每升7至55单位(u/l)；并且正常无毒水平为8至48u/l。在某些实施方案中，在向患者施用adc的第一剂量与施用第一剂量后14天之间，患者血液ast、alt或ldh水平中的至少一种没有达到毒性水平，例如，可以向患者施用第一剂量，随后施用第二剂量、第三剂量、第四剂量或更多剂量，例如，施用第一剂量的5、10或14天，但是在向患者施用adc的第一剂量与施用第一剂量后14天之间，患者的血液ast、alt或ldh水平中的至少一种没有达到毒性水平。
[0836]
在某些实施方案中，患者的血液ast、alt或ldh水平中的至少一种没有升高到正常水平以上，没有升高超过正常水平的1.5倍，没有升高超过正常水平的3倍，没有升高超过正常水平的5倍，或者没有升高超过正常水平的10倍。
[0837]
施用途径可能影响推荐剂量。根据所采用的施用方式，考虑重复的全身剂量以维持有效水平，例如以降低car
‑
t细胞排斥的风险。
[0838]
本文所述的抗
‑
cd45抗体可以通过多种途径施用，例如经口、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、眼内或胃肠外。在任何给定情况下，最合适的施用途取决于特定adc、患者、药物制剂方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、患者年龄、体重、性别、要治疗疾病的严重程度、患者的饮食和患者的排泄率。
[0839]
如上所述，本文所述的adc可以以多种剂型施用到患者(例如，遭受免疫疾病或癌症的人患者)中。例如，本文所述的adc可以以水溶液(例如含有一种或更多种药学上可接受的赋形剂的水溶液)的形式施用到遭受免疫疾病或癌症的患者中。用于本文所述的组合物和方法的合适的药学上可接受的赋形剂包括粘度调节剂。可以使用本领域已知的技术对水溶液进行灭菌。
[0840]
包含本文所述的抗
‑
cd45抗体的药物制剂通过将此种adc与一种或更多种任选的药学上可接受的载体混合(雷明顿药学科学第16版，osol,a.ed.(1980))，以冻干制剂或水
溶液的形式来制备。药学上可接受的载体在使用的剂量和浓度下通常对受体无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；羟苯甲酸烷基酯，例如羟苯甲酸甲酯或羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3
‑
戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属复合物(例如，zn
‑
蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。
[0841]
实施例
[0842]
提出以下实施例，从而向本领域普通技术人员提供如何使用、制备和；评价本文所述的组合物和方法的描述，并且旨在纯粹作为本发明的示例，而不是旨在限制发明人认为其发明的范围。
[0843]
实施例1.使用体外细胞杀伤测定对抗
‑
cd45
‑
鹅膏蕈毒素抗体药物缀合物(adc)进行体外分析
[0844]
以下实施例中使用的抗
‑
cd45adc是与鹅膏蕈碱缀合的ab1(即抗
‑
cd45
‑
am；快速半衰期变体d265c、h435a，dar为2；即adc1)。ab1的序列在seq id no：1至7中阐述。该实施例中使用的鹅膏蕈毒素由具有r8连接的式(i)表示。
[0845]
对于使用人pbmc的体外杀伤测定，在抗
‑
cd45
‑
am或对照的存在下培养pbmc。通过(图1a和2a)测量细胞活力。对于使用人hsc(即cd34+或cd34+cd90+细胞)的体外杀伤测定，将人bmc与抗
‑
cd45
‑
am或对照一起培养。通过流式细胞术测定活细胞计数。测量细胞的杀伤并且结果示出图1b和图2b中。
[0846]
图1a和2a中的结果表明抗
‑
cd45
‑
am在杀伤人pbmc方面高度有效(图1a；ic
50
＝55pm；图2a；ic
50
＝7pm)。抗
‑
cd45
‑
am在杀伤人和食蟹猴pbmc方面显示出相似的效率(约2倍差异；结果未示出)。另外，抗
‑
cd45
‑
am还在杀伤人骨髓cd34+细胞(图1b；ic
50
＝914pm)和人骨髓cd34+cd90+细胞(图2b；ic
50
＝186pm)方面有效。然而，这些数据表明与人hsc(图2b；ic
50
＝186pm)相比，对人淋巴细胞的不同毒性(图2a；ic
50
＝7pm)，这导致人淋巴细胞的优先耗竭。
[0847]
实施例2.使用抗
‑
cd45
‑
鹅膏蕈毒素抗体药物缀合物(adc)的体内研究
[0848]
以下实施例中使用的抗
‑
cd45 adc是与由具有r8连接的式(i)表示的鹅膏菌素缀合的ab1(与实施例1中描述的adc相同)。在t＝0时向一群猴施用抗
‑
cd45 adc(0.3mg/kg)或对照(pbs)。此后使用流式细胞术分析细胞。图3通过图表描绘了细胞的表型分析。图4通过图表描绘了用adc 1或对照处理的猴的外周淋巴细胞的耗竭。图5通过图表描绘了用adc 1或对照处理的猴的嗜中性粒细胞的水平。
[0849]
图3中的结果表明，adc 1的靶标表达谱允许给药耗竭淋巴细胞，同时放过hsc。图4和图5中的结果表明，单剂量的adc 1(0.3mg/kg)导致外周淋巴细胞快速耗竭(即实现快速且深度的淋巴耗竭；图4)，而在淋巴耗竭剂量下在猴中未观察到中性粒细胞减少症；图5)。
[0850]
实施例3.抗
‑
cd45
‑
鹅膏菌素抗体药物缀合物(adc)的药代动力学分析
[0851]
以下实施例中使用的抗
‑
cd45adc与上述实施例1中的adc相同。在t＝0时向一群猴
施用抗
‑
cd45 adc(0.3mg/kg)或对照(pbs)。测量抗
‑
cd45adc的平均血浆浓度并且通过图表描绘了时间的函数(即，施用后的小时数)(图6)。使用血液学分析仪测量alt(丙氨酸氨基转移酶；图7a)和胆红素(图7b)的血浆水平并且通过图表表示为施用后天数的函数，如图7a和7b所示。使用血液学分析仪测量血小板细胞计数，并且通过图表表示为施用后天数的函数，如图7c所示。这些结果表明adc对血小板细胞计数或alt或胆红素的血浆水平没有影响。
[0852]
图6中的结果表明，在施用后48小时内清除了淋巴耗竭剂量的adc 1(快速半衰期)，使得在car
‑
t灌注的潜在窗口期间无法检测到adc。图7a
‑
7c中的结果表明，淋巴耗竭剂量的adc 1(快耗竭半衰期)具有良好的耐受性，没有观察到血小板减少症，其中肝和肾功能的临床化学值都在淋巴耗竭剂量的控制参数内。
[0853]
实施例4.在使用淋巴耗竭剂量的抗
‑
cd45
‑
鹅膏蕈碱抗体药物缀合物(adc)后细胞因子水平的分析
[0854]
以下实施例中使用的抗
‑
cd45adc与上述实施例1中的adc相同。在t＝0时向一群猴施用抗
‑
cd45 adc(0.3mg/kg)或对照(pbs)。测量il
‑
15(pg/ml；图8a)的水平和il
‑
7的水平(pg/ml；图8b)并且通过图表描绘了时间的函数(施用adc 1后的小时数)。还在施用adc1后72小时测量了某些其他细胞因子释放综合征(crs)相关的细胞因子的水平，并且在图9中通过图表描绘。
[0855]
图8a和图8b中的结果表明，与氟达拉滨/环磷酰胺化学预处理相比，淋巴耗竭剂量的adc 1增加了il
‑
15水平(图8a)和il
‑
7水平(图8b)，并且提供了等效水平的car
‑
t植入细胞因子(即il
‑
15和il
‑
7)(参见，例如kochehnderfer等clin oncol.35:1803
‑
13中公开的患者数据)。il
‑
15和il
‑
7的增加与car
‑
t扩增和功效相关。结果还表明，淋巴耗竭剂量的adc 1不会提高关键crs细胞因子的水平(图9)，例如ifnγ、il
‑
10、il
‑
6、il
‑
8、mip
‑
1α、mip
‑
1β和il
‑
10。
[0856]
实施例5.用于同种异体移植的抗
‑
cd45adc和t细胞耗竭的组合疗法
[0857]
在用cd45 adc(与pbd缀合的cd45)或照射作为对照进行预处理之后，在b6小鼠中进行同种异体移植(2x10
7 balb/c cd45.1 tcr bm
→
b6)。通过施用全身照射(tbi)、3mg/kg剂量的cd45
‑
pbd adc、1mg/kg剂量的cd45
‑
pbd adc、3mg/kg cd45
‑
pbdadc和t细胞耗竭疗法(抗
‑
cd4和cd8抗体)的组合、或初始对照进行预处理。
[0858]
在图10和11中提供实验结果。在用cd45
‑
pbdadc作为单一试剂预处理之后观察到少于10％的供体嵌合现象(在排斥之前存活3周)。相反，在用与t细胞耗竭疗法(例如，抗
‑
cd4和cd8 mab)组合的cd45
‑
pbd结合进行预处理之后实现了完全供体嵌合。图10和11中提供的结果表明，通过将cd45adc疗法与t细胞耗竭疗法(例如抗
‑
cd4抗体、抗
‑
cd8抗体、抗
‑
胸腺细胞球蛋白(“atg”)(例如兔atg、马atg及其组合)、抗
‑
cd52抗体(例如阿仑单抗)、tbi及其组合)组合可以提高用cd45
‑
pbd作为单一试剂进行的t细胞耗竭的水平。在一些实施方案中，t细胞耗竭疗法可以是单克隆抗体。
[0859]
实施例6.在施用抗
‑
cd45adc后在hnsg小鼠中淋巴耗竭和骨髓耗竭的体内分析
[0860]
以下实施例中使用的抗
‑
cd45adc是与由式(i)表示的具有r8连接(a)或r5连接(b)的两种鹅膏蕈毒素(在该实施例中称为“a”和“b”)中的一种缀合的ab1。以指定的剂量水平(1mg/kg、3mg/kg或6mg/kg)向人源化nsg(hnsg)小鼠施用与鹅膏蕈碱(“cd45
‑
am”)缀合的同种型和抗
‑
cd45抗体。为了测量adc施用后小鼠中的t细胞、b细胞和骨髓细胞的水平，通过流
式细胞术对外周血(第7天和第14天)和骨髓(第14天)进行采样和分析。
[0861]
如图12a
‑
12c所示，以1mg/kg剂量水平施用后14天，cd45
‑
am adc介导人淋巴细胞(t和b)的延长耗竭，而人骨髓系仅瞬时耗竭。此外，在所有剂量水平下，cd45
‑
am adc介导了骨髓中人t细胞的大量耗竭(图13a)。相反，在1mg/kg下，未观察到cd45
‑
amadc对hnsg小鼠bm中的hsc的影响(图13b)。在>3mg/kg下，cd45
‑
amadc介导了hnsg小鼠bm中的hsc的大量耗竭(13b)。
[0862]
这些结果表明，在hnsg小鼠中，在非清髓剂量的cd45
‑
am下，可以在外周血和骨髓中实现延长的淋巴耗竭。
[0863]
表4.序列总结
[0864]
[0865]
[0866]
[0867]
[0868]
[0869]
[0870]
[0871]
[0872]
[0873][0874]
其他实施方案
[0875]
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文中，如同每个独立的出版物或专利申请都被具体地和单独地指出通过引用并入。
[0876]
虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应理解，本发明能够进一步修改，并且本技术旨在覆盖本发明的任何变化、使用或修改，这些变化、使用或修改一般地遵循本发明的原理，并且包括在本发明所属领域的已知或习惯实践内的对本发明的偏离，并且可以应用于上文阐述的基本特征，并且在权利要求书的范围内。