包含细菌菌株副干酪乳杆菌和透明质酸的组合物及其治疗皮肤的用途的制作方法

包含细菌菌株副干酪乳杆菌和透明质酸的组合物及其治疗皮肤的用途
1.本发明涉及包含益生菌(活且有活力的或灭活的细菌菌株)和透明质酸或其盐的组合物，其用于预防、治疗(治疗性或美容性治疗)或减轻与皮肤老化、皮肤免疫防御的减少或皮肤的炎症/感染(例如由uv射线诱导或引起的炎症)相关或者由它们引起的至少一种体征或症状。


背景技术：

2.皮肤是人体的最外层，它构成了身体抵抗外部侵害的第一道防线，这是鉴于它充当抵抗潜在病原体和可能的有害物质的解剖学屏障。皮肤变化可促进皮肤疾病、特别是由病原体引起的皮肤疾病的发作。例如，随着皮肤老化，皮肤变得更薄和更脆弱，这是由于细胞再生变得更慢并且从正常的3至4周变为4周或甚至6周。皮肤随着时间的推移经历结构变化，这是由几个不同来源的因素引起的，这些因素决定了皮肤含水量的丧失、微皱的发生、弹性的丧失、角化过度和色素沉着斑的形成。
3.此外，在对抗皮肤病原体(例如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes))的粘附和发展中发挥重要且有用的功能的定殖于人类皮肤的丰富微生物组可能面临由于各种因素引起的不平衡或生态失调。
4.当皮肤中发生生态失调时，益生菌可充当调节剂，在皮肤微生物群水平上恢复平衡。在过去十年中，新技术的使用促进了皮肤微生物群的分类学分析，其细菌种群可达到约1010种微生物，属于超过25个门，其中最有代表性的是放线菌门(actinobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)和变形菌门(proteobacteria)。多种皮肤病与皮肤微生物组的改变有关，例如痤疮丙酸杆菌被认为是与皮肤痤疮相关的致病菌。因此，维持皮肤微生物群的稳态状况或在微生物群生态失调后恢复所述稳态对于预防或治疗皮肤病而言是基本的，特别是皮肤感染或炎症，甚至更特别是由于病原体(例如细菌或病毒)以及由于uv线对皮肤的照射或由于皮肤暴露于不利条件而引起的感染或炎症。
5.通常这些问题用抗菌剂来解决，即，使用消毒剂和局部抗生素。一方面，尽管毋庸置疑其是有效的，但除了消除有益细菌之外，抗生素还具有致敏和潜在不良事件的风险，特别是在长期使用广谱抗生素的情况下。
6.此外，用于防止由于uv射线照射皮肤而引起的损伤或皮肤老化问题的常规方法是使用反射或吸收uv射线的乳膏或皮肤产品，通常称为防晒剂。所谓的“化学”防晒剂中的活性成分(水杨酸盐、肉桂酸盐、氧苯酮、氰双苯丙烯酸辛酯等)凭借其结构而能够吸收uv光。另一方面，二氧化钛和氧化锌是具有强覆盖能力的惰性矿物质，它们物理地反射阳光并因此包括在所谓的物理性防晒剂中。
7.然而，所述防晒剂仅允许防止uv射线与皮肤的相互作用，但在由可能未被防晒剂完全屏蔽的uv射线引起的生态失调或感染或炎症的情况下，它们并不刺激皮肤微生物群稳态的维持，也不恢复所述稳态。
8.在大量的研发活动之后，本技术人通过提供包含混合物(简称本发明的混合物)的新型组合物(简称本发明的组合物)来处理和解决上述技术问题，所述混合物包含被鉴定为副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760的属于副干酪乳杆菌物种的活且有活力的或灭活的细菌菌株和透明质酸或其盐(简称ha)，或由该细菌菌株和ha组成。


技术实现要素：

9.本发明的第一方面涉及包含益生菌和透明质酸或其盐的组合物用于预防、减轻或治疗自然皮肤老化或因暴露于外部因素(例如uv射线)而引起的皮肤老化的用途。
10.本发明的第二方面涉及包含益生菌和透明质酸或其盐的组合物用于预防、减轻或治疗与皮肤免疫防御减少相关的或由皮肤免疫防御减少引起的至少一种体征或症状的用途。
11.本发明的第三方面涉及包含益生菌和透明质酸或其盐的组合物用于预防、减轻或治疗与皮肤炎症/感染相关的或由皮肤炎症/感染引起的至少一种体征或症状的用途。
12.对于实现本发明的目的特别有效的益生菌是属于乳杆菌属的细菌，优选属于副干酪乳杆菌物种，例如菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760。
13.本技术人实际发现包含益生菌(优选属于乳杆菌属的细菌)和透明质酸的组合物能够通过促进皮肤释放抗微生物肽和趋化因子来增强免疫防御、增强表皮分化和细胞更替的正常过程、并强化真皮结构。
14.此外，本技术人发现包含透明质酸和益生菌(优选属于乳杆菌属的细菌)的组合物的使用能够发挥抗炎作用并防止由uv射线诱导或引起的炎症的活化。
15.特别是，本发明的组合物和混合物能够：
[0016]-诱导皮肤防御和/或愈合的机制，特别是免疫调节机制；
[0017]-预防和/或治疗炎性或感染性皮肤病症，特别是由uv照射(uv-a和uv-b)诱导的皮肤病症；
[0018]-对抗皮肤致病细菌的增殖；
[0019]-维持或恢复皮肤的稳态状况和/或皮肤微生物群的平衡；
[0020]-有利于、便于、促进和/或加速伤口愈合过程和/或再上皮化和/或瘢痕形成过程；
[0021]-对抗和/或减缓皮肤老化。
[0022]
此外，本发明的组合物能够短期和长期诱导和/或促进所述正面效果。
[0023]
此外，本发明的混合物和组合物没有显著的不良作用，并且它们可以施用于所有受试者，特别是儿科受试者和孕妇或哺乳期妇女。
[0024]
最后，本发明的混合物和/或组合物易于制备且具有成本效益。
[0025]
本发明的混合物和组合物(含有所述混合物)由于所附权利要求中要求保护的技术特征而达到了这些和其他目的，这些和其他目的将从以下详细描述中变得清楚。
附图说明
[0026]
下面将参考附图详细描述和举例说明本发明，其中：
[0027]
图1显示分别用盐水溶液(a)和用包含菌株lpc-s01的组合物(b)处理的组织学组织切片用masson三色染色标记后的20
×
和40
×
放大图像；
[0028]
图2显示分别用包含透明质酸的组合物(a)和用包含菌株lpc-s01+透明质酸的组合物(b)处理的组织学组织切片用masson三色染色标记后的20
×
和40
×
放大图像；
[0029]
图3显示了暴露于uv照射并用包含菌株lpc-s01的组合物(p1)、包含菌株lpc-s01+透明质酸的组合物(p2)和包含透明质酸的组合物(p3)处理的组织中nfκb的核易位定量；
[0030]
图4显示了分别用盐水溶液(a)、包含菌株lpc-s01的组合物(b)、包含透明质酸的组合物(c)和包含菌株lpc-s01和透明质酸的组合物(d)处理的组织学组织切片在uv损伤后4小时用苏木精-伊红染色标记后的20
×
放大图像；
[0031]
图5显示了分别用盐水溶液(a)、包含菌株lpc-s01的组合物(b)、包含透明质酸的组合物(c)和包含菌株lpc-s01和透明质酸的组合物(d)处理的组织学组织切片在uv损伤24小时后用苏木精-伊红染色标记后的20
×
放大图像。
[0032]
图6a，6b，6c，6d：在24小时时(6a：24小时时的nc，6b：24小时时的p3-i)和48小时时(6c：48小时时的nc，6d：48小时时的p3-i)在稳态模型中借助于h&e染色的组织形态学分析的显微镜下采集的图像。
[0033]
图7：对于p1-i、p2-i、p3-i产物，在稳态模型中在24小时时的基因表达结果(qrt-pcr)(用24小时时的nc计算的rq＝1；rq《0.5下调，rq》2上调)。
[0034]
图8：用包含灭活菌株的本发明的组合物对“擦伤”的组织的预处理方案(针对uv照射)。
[0035]
图9：用包含灭活菌株的本发明的组合物对“擦伤”的组织的后处理方案(针对uv照射)。
[0036]
图10和11显示了在实验条件(分别为排除模型和竞争模型)下体外皮肤插入物上以log10 cfu表示的病原体痤疮丙酸杆菌dms1897的活力降低。
[0037]
定义
[0038]
在本发明的上下文中，术语“皮肤”用于表示相对于外部环境的第一道防线；特别是，通过分散在外皮肤层(表皮)中的角质形成细胞的作用来进行防御，在表皮中它们可以诱导细胞因子和趋化因子的分泌以将警告信息传递到皮肤的深层，从而产生炎症反应。
[0039]
在本发明的上下文中，表述“皮肤老化”用于表示不可逆的演化过程；它表现于一组生理学变化，所述生理学变化决定皮肤含水量的丧失、微皱的出现、弹性的丧失、角化过度和色素沉着斑(称为“老年斑”)的形成。
[0040]
在本发明的上下文中，术语“益生菌”根据fao和who给出的定义用于表示：“活的微生物，当以足够的量施用时赋予宿主健康益处”。换句话说，益生菌是微生物(细菌菌株)，一旦以适当的量服用，其自身就能够对生物体发挥有益的功能。
[0041]
在本发明的上下文中，表述“透明质酸”用于表示由键合在一起的葡糖胺和葡糖醛酸的重复单元组成的糖胺聚糖，或者，通过糖苷键β1
→
4和β1
→
3以及通过分子内氢键(稳定其构象)结合在一起。
具体实施方式
[0042]
本发明的一个目的在于一种组合物(简称本发明的组合物或组合物)，该组合物包含(i)一种混合物m，其包含被鉴定并保藏为副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760(活且有活力的，或灭活的，或其衍生物)的属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株以及透明质酸或其盐，或
者由所述细菌菌株和透明质酸或其盐组成；和(ii)至少一种可接受的制药或化妆品或食品级添加剂和/或赋形剂。
[0043]
本发明的一个目的在于本发明的所述组合物或混合物m，其包含被鉴定并保藏为副干酪乳杆菌菌株lpc-s01 dsm26760的属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株以及透明质酸或其盐，或者由所述细菌菌株和透明质酸或其盐组成(根据所述实施方式中的任一个)，其用作药物。
[0044]
本发明的第一方面涉及一种组合物(本发明的组合物)，其包含益生菌(副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm26760，有活力的或灭活的或其衍生物)(优选益生细菌)和透明质酸或其盐，用于治疗(治疗性或美容性)、预防或减轻与皮肤老化(内在老化或外在老化，如下文所定义)相关的或由其引起的至少一种体征或症状。
[0045]
所述皮肤老化的体征或症状与通常导致皮肤结构变薄和/或变软的一系列修饰有关。
[0046]
优选地，所述老化是内在的时间性的老化，其基本上取决于遗传(或内在)因素。原则上，内在老化通常在25岁后开始。优选地，与内在皮肤老化相关的或由内在皮肤老化引起的所述体征或症状选自：皱纹、皮肤松弛、皮肤完整性丧失或降低、缺乏皮肤弹性、缺乏肤色、皮肤变薄、皮肤脱屑和皮肤脱水、形成黑斑或皮肤色素沉着过度(也称为“老年斑”)。
[0047]
因此，本发明的一个目的在于本发明的组合物或混合物m的美容用途，所述组合物或混合物m包含被鉴定并保藏为副干酪乳杆菌菌株lpc-s01 dsm26760的属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株和透明质酸或其盐以及可选的第一物质和/或第二物质(根据所述实施方式中的任一个)，或者由所述细菌菌株和透明质酸或其盐以及可选的第一物质和/或第二物质组成，所述用途为维持皮肤的稳态，和/或作为皮肤的抗老化剂，例如用于针对皱纹、皮肤弹性丧失(日光性弹性组织变性)、干燥或脱水皮肤、粗糙皮肤、光老化、皮肤发红、脸颊、鼻和/或耳上存在毛细血管扩张、太阳斑、皮肤的异常或不均匀的色素沉着或色素沉着过度的美容治疗，或使皮肤更亮和更自然。
[0048]
或者，所述皮肤老化是外在的，即由外部环境因素(外在因素)引起。外在老化例如由外部试剂和/或环境因素的侵袭引起，例如uv照射(引起光老化)、吸烟、酗酒、污染、与刺激物持续接触、寒冷、风及其组合。光老化是特别令人感兴趣的，因为它涉及许多疾病或也可以导致严重疾病(例如皮肤肿瘤)的皮肤损伤。
[0049]
优选地，与外在皮肤老化相关的或由外在皮肤老化引起的所述体征或症状选自：红斑、太阳色素沉着或太阳斑、角化病(优选过度角化病)、皮肤发红、晒伤、烧伤、光老化、日光性弹性组织变性、皮质性白内障、翼状胬肉、冷疱的再活化、任何性质的皮肤损伤(溃疡、创伤或瘀伤)、优选唇和/或结膜损伤、皮肤黑素瘤、鳞状皮肤癌、基底细胞癌(基底细胞瘤)、鳞状角膜或结膜癌。
[0050]
皮肤老化与皮肤结构的改变有关，这不可避免地导致对炎性疾病和/或感染的易感性增加。
[0051]
在一个实施方式中，包含益生菌(副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，活且有活力的或灭活的或其衍生物)和透明质酸或其盐的本发明的组合物或混合物m用于治疗(治疗性治疗方法)、预防或减轻与皮肤免疫系统降低或炎性疾病和/或皮肤感染相关的或由其引起的至少一种体征或症状。换句话说，该组合物用于增强皮肤的免疫防御。
[0052]
与皮肤的免疫防御减少或皮肤的炎性病症相关的或由其引起的所述至少一种体征或症状选自：皮炎，优选与刺激或表皮脱落相关，痤疮，急性或慢性皮肤病(例如酒渣鼻(rosacea)或酒糟鼻(couperosa))，皮肤感染，皮肤炎症，红斑，溃疡，银屑病，特应性皮炎，耳炎，皲裂，瘘，和痔。
[0053]
皮肤病变或疾病可能与病原体有关或由病原体引起。在这种情况下，病原体可以是细菌、真菌、酵母、病毒及其组合。
[0054]
在一个实施方式中，包含益生菌(副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，有活力的或灭活的或其衍生物)和透明质酸或其盐的本发明的组合物或混合物m用于治疗(治疗性治疗方法)、预防或减轻与皮肤炎症/感染相关或由皮肤炎症/感染引起的至少一种体征或症状，例如与病原体剂相关或由病原体剂引起的至少一种体征或症状。
[0055]
优选地，所述病原体为细菌，优选为以下属的细菌：丙酸杆菌属，优选痤疮丙酸杆菌物种(propionibacterium acnes，或痤疮皮肤杆菌(cutibacterium acnes)，简写为c.acnes)；葡萄球菌属(staphylococcus)，优选表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、华氏葡萄球菌、酿脓葡萄球菌、缓和葡萄球菌；棒状杆菌属；假单胞菌属，优选铜绿假单胞菌；不动杆菌属，优选约氏不动杆菌；链球菌属，优选酿脓链球菌；微球菌属；短杆菌属。
[0056]
由本技术人得到的实验数据表明，包含透明质酸和益生菌(副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，活且有活力的或灭活的或其衍生物)的本发明的组合物或混合物m能够在角质形成细胞水平上并由此在皮肤水平上发挥抗炎和/或免疫调节作用。
[0057]
不希望受任何理论的束缚，所述组合物的用途归因于组合物中所含的益生菌和透明质酸所促进的抗炎能力、免疫调节、表皮细胞更新、表皮分化和皮肤结构增强。
[0058]
特别是，本技术人已经表明，当皮肤暴露于包含透明质酸和益生菌的组合物时，其能够增加表皮的分化过程，特别是角质层变厚。此外，观察到胶原纤维更致密且更紧实。
[0059]
此外，包含益生菌(副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，有活力的或灭活的或其衍生物)和透明质酸或其盐的本发明的组合物能够发挥对皮肤免疫系统的免疫调节(或免疫刺激)作用，这从趋化因子和防御素的编码基因的表达的评估看是明显的。特别是，通过益生菌和包含透明质酸和益生菌的本发明的组合物，均观察到防卫素β2表达的增加。
[0060]
在本发明的实施方式中，益生菌(与透明质酸或其盐一起存在于本发明的组合物中)优选选自：细菌、真菌、酵母及其组合；优选细菌，更优选属于副干酪乳杆菌物种并被鉴定为副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760(活的、灭活的或其衍生物)的细菌菌株。
[0061]
根据本发明的优选方面，所述细菌属于选自以下的至少一个属：乳杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、丙酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属、气球菌属和肠球菌属。
[0062]
更优选地，所述细菌属于乳杆菌属。
[0063]
根据本发明的优选的另一方面，乳杆菌属的细菌属于选自以下的至少一个物种：副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、解淀粉乳杆菌、食淀粉乳杆菌、消化乳杆菌、鸟乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、棒状乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、法氏乳杆菌、发酵乳杆菌、鸡乳杆菌、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、希氏乳杆菌、约氏乳杆菌、马乳样乳杆菌、开菲尔乳杆菌、粘膜乳杆菌、面包乳杆菌、丘状乳杆菌、类植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、桥状乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、沙克乳杆菌、唾液乳杆菌、三叉乳杆菌及其组合。
[0064]
更优选地，乳杆菌属于副干酪乳杆菌物种，优选菌株副干酪乳杆菌cncm i-1572和/或菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm26760。
[0065]
这两种菌株均由sofar s.p.a.分离和保藏；特别是，细菌菌株干酪乳杆菌(注册商标sofar，意大利)由sofar s.p.a.于1995年5月5日保藏于巴黎的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心，保藏号为cncm i-1572。最初该菌株命名为干酪乳杆菌dg干酪亚种(重新分类为副干酪乳杆菌cncm i-1572)。
[0066]
细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01于2017年5月15日由sofars.p.a.以保藏号dsm 26760保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(根据布达佩斯条约转换保藏的申请日；原始保藏日期：2013年1月11日)。
[0067]
副干酪乳杆菌菌株曾经被重新分类为副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)。
[0068]
在本发明的优选实施方式中，所述组合物包含副干酪乳杆菌lpc-s01和透明质酸或其盐。
[0069]
根据本发明的优选的另一方面，所述双歧杆菌属的细菌属于选自下组的物种中的至少一种：动物双歧杆菌、两岐双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、链状双歧杆菌、角双歧杆菌、星状双歧杆菌、牛双歧杆菌、小猪双歧杆菌、棒状双岐杆菌、家兔双歧杆菌、龋齿双歧杆菌、齿双歧杆菌、高卢双歧杆菌、鸡双歧杆菌、印度双歧杆菌、异形双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、大双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、最小双歧杆菌、假链双歧杆菌、假长双歧杆菌、小鸡双歧杆菌、反刍双歧杆菌、世纪双歧杆菌、细长双歧杆菌、嗜酸热双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、鹤见双歧杆菌；更优选选自：
[0070]
克劳氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、异常芽胞杆菌和海洋芽孢杆菌。
[0071]
根据本发明的优选的另一方面，丙酸杆菌属的细菌属于选自以下的物种中的至少一种：谢氏丙酸杆菌、痤疮丙酸杆菌、澳大利亚丙酸杆菌、贪婪丙酸杆菌、环己丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌、颗粒丙酸杆菌、詹氏丙酸杆菌、微需氧丙酸杆菌、丙酸丙酸杆菌和特氏丙酸杆菌。
[0072]
根据本发明的优选的另一方面，链球菌属的细菌属于选自以下的物种中的至少一种：嗜热链球菌、唾液链球菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、牛链球菌、犬链球菌、星群链球菌、汗毛链球菌、停乳链球菌、马肠链球菌、野鼠链球菌、婴儿链球菌、海豚链球菌、中间链球菌、米勒链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、鼠口腔链球菌、副血链球菌、泛口腔链球菌、肺炎链球菌、假肺炎链球菌、酿脓链球菌、鼠链球菌、虎链球菌、血链球菌、远缘链球菌、猪链球菌、乳房链球菌、前庭链球菌、草绿色链球菌和兽疫链球菌。
[0073]
根据本发明的优选的另一方面，乳球菌属的细菌属于选自以下的物种中的至少一种：韩中大乳球菌、台湾桧木乳球菌、弗氏乳球菌、格氏乳球菌、乳酸乳球菌、鱼乳球菌、植物乳球菌、棉子糖乳球菌和台湾乳球菌。
[0074]
根据本发明的优选的另一方面，气球菌属的细菌属于选自以下的物种中的至少一种：脲气球菌、血气球菌、克里斯滕森气球菌、猪气球菌、尿气球菌和尿小气球菌。
[0075]
根据本发明的优选的另一方面，肠球菌属的细菌属于选自以下的物种中的至少一种：鸟肠球菌、耐久肠球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、血过氧化物肠球菌、海氏肠球
菌、恶臭肠球菌、莫拉维亚肠球菌、蒙氏肠球菌、假鸟肠球菌、棉子糖肠球菌和孤立肠球菌。
[0076]
根据本发明的优选的另一方面，酵母属于酵母菌属，更优选属于物种酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和/或布氏酵母(saccharomyces boulardii)。
[0077]
在本发明的混合物或组合物中，益生菌，优选细菌菌株干酪乳杆菌cncm i-1572和/或细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，以活的形式(与透明质酸或其盐一起)使用，即它们用作益生菌。
[0078]
或者，所述益生菌，优选细菌菌株干酪乳杆菌cncm i-1572和/或细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，是死的和/或灭活的和/或间歇灭菌的。
[0079]
例如，本发明的有活力的细菌菌株(益生菌)(例如副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760)可以通过加热或间歇灭菌或γ照射或超声处理来灭活。通过加热或间歇灭菌的所述灭活可以在50℃至120℃、优选65℃至105℃、更优选75℃至95℃、例如约85℃的温度下进行30分钟至120分钟、优选45分钟至85分钟、例如约60分钟的时间；或者，通过间歇灭菌来进行。根据本领域技术人员已知的技术、程序和设备进行加热或间歇灭菌或γ照射或超声处理方法。
[0080]
经过加热或间歇灭菌灭活过程的细菌是死亡的(通过平板计数和/或细胞荧光测定法控制)，而细胞壁保持完整，优选地，相对于经过所述加热或间歇灭菌灭活技术的细菌总数，死亡的细菌的百分比为70％至99.5％，优选80％至95％。
[0081]
在另一实施方式中，益生菌，优选细菌菌株干酪乳杆菌cncm i-1572和/或细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，以裂解物和/或提取物的形式(与透明质酸或其盐一起)使用，即它们用作副益生菌(paraprobiotic)。
[0082]
作为另一种选择，所述益生菌，优选细菌菌株干酪乳杆菌cncm i-1572和/或细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，以选自以下的细菌产物形式(与透明质酸或其盐一起)使用：上清液、代谢物、代谢生物产物、益生素(postbiotics)、细胞壁及其组分、外多糖、核糖体和糖蛋白、葡聚糖和其他多糖、脂多糖和上清液的任何组分。
[0083]
简而言之，在本发明的上下文中，细菌菌株或有活力的细菌菌株或益生菌(例如副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760)的“衍生物”、前述副益生菌(裂解物或提取物)或细菌菌株的任何衍生物和/或组分(上清液、代谢物、代谢生物产物、益生素、细胞壁及其组分、外多糖、核糖体和糖蛋白、葡聚糖和其他多糖、脂多糖或上清液的任何组分)，如果以适当的量施用(通过口服或局部途径)，会赋予人类或动物服用者益处。
[0084]
在本发明的上下文中，除非另有说明，术语“益生菌”是指并包括活的和灭活的细菌菌株(例如副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760)，和所述细菌菌株的衍生物，如上所定义。
[0085]
通常，所述益生菌是efsa的qps列表中列出的任何微生物物种的单一微生物或微生物组合或聚生体。
[0086]
优选地，上述组合物包含上述菌株与上述其他微生物的组合，优选选自：细菌、真菌、酵母及其组合。
[0087]
益生菌，优选细菌菌株干酪乳杆菌cncm i-1572和/或细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，以足以允许在皮肤、肠和/或生物体其他区域暂时定殖的最小量存在于组合物中(与透明质酸或其盐一起)。优选地，相对于本发明组合物的每日摄入量(或单
剂量)，所述最小量在1
×
106cfu至1
×
10
12
cfu的浓度范围内变化，优选108至10
12
单位的微生物，更优选109至10
11
单位的微生物，例如约或高于1
×
109cfu(集落形成单位)。
[0088]
对于每次摄入，本发明的益生菌，优选细菌菌株干酪乳杆菌cncm i-1572和/或细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，优选以108至10
12
单位的微生物、更优选109至10
11
单位的微生物的量施用。
[0089]
根据优选的方面，益生菌(优选细菌)的摄入每天进行至少1-2次。
[0090]
如上所述，本发明的组合物或混合物m包含透明质酸或其盐及其组合。所述透明质酸或其盐(简称ha)与菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760和可选的至少一种另外的第一或第二物质(根据任何所描述的实施方式)一起包含在本发明的组合物中，且平均分子量优选为约10kda(千道尔顿＝1,000.00道尔顿或103道尔顿)至3,000kda，优选约800kda至2,500kda，更优选约1,000kda至2,000kda，例如约1,300kda、1,400kda、1,500kda、1,600kda、1,700kda、1,800kda。在一个实施方式中，透明质酸盐(例如，透明质酸碱金属或碱土金属)选自：透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸钴及其组合。
[0091]
此外，在本发明的上下文中，术语“透明质酸或其盐”或“ha”或简单地“透明质酸”用于表示透明质酸本身，和水解的透明质酸(例如通过发酵获得)，以及如上所述的透明质酸的盐(透明质酸盐)。
[0092]
当本发明的所述透明质酸是通过发酵获得的生物技术水解的透明质酸时，其可以具有约10kda的平均分子量。当本发明的所述透明质酸为透明质酸钠(例如cas号9067-32-7，mw-分子量1,000-1,400kda或mw 1,000-1,700kda)或透明质酸钾时，其可具有约1,000kda至2,000kda范围内的平均分子量。
[0093]
除了副干酪乳杆菌lpc-01 dsm 26760和ha外，本发明的组合物有利地进一步包含药学上可接受的赋形剂和/或另外的物质(例如，如下所述的第一物质或第二物质)和/或载体。
[0094]
除了副干酪乳杆菌lpc-01 dsm 26760和ha以及可选的第二物质(如下定义)外，本发明的组合物优选还包含选自以下的第一物质：血浆、prp、结瘢物质、再上皮化物质、保湿剂、水合剂、润肤剂、吸附剂、止痛剂、静脉剂、抗炎剂、肌肉松弛剂、抗生素、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、杀虫剂、肽和/或蛋白质物质和/或蛋白质(例如胶原)、属于结缔组织的物质(例如糖胺聚糖，优选硫酸软骨素)和/或其组合。
[0095]
在本发明的实施方式中，将组合物配制(例如以固体、半固体或液体形式)成用于局部或皮肤局部施用，优选以乳膏、凝胶、油、乳液(或泡沫)、溶液、分散体(固-液或液-液)、悬浮液、双相混合物、喷雾剂(喷雾液)、纱布、膏药、绷带、洗剂、摩丝、面膜(适用于皮肤的面膜)、软膏或糊剂的形式。
[0096]
在本发明的一个实施方式中，组合物被配制成用于口服施用，优选作为片剂、胶囊、棒、颗粒粉末、口盖(operculum)、口腔可溶颗粒、小袋或丸剂、悬浮液(例如可饮用的管形瓶)或溶液(单相或双相)。
[0097]
作为另一种选择，通过将组合物与水混合来临时制备组合物。
[0098]
作为另一种选择，通过将两种组分，益生菌(副干酪乳杆菌lpc-01 dsm 26760)和透明质酸或其盐，混合在一起来临时制备组合物，例如用于制备施用于皮肤的面膜或口服
用悬浮液(可饮用管形瓶)。特别是，用于临时制备本发明的组合物的装置可以由包含透明质酸或其盐的水溶液的管形瓶和包含粉末、颗粒或片剂的固体形式的细菌菌株(副干酪乳杆菌lpc-01 dsm 26760，有活力的或灭活的或其衍生物)的位于瓶子一端的部分(例如，用于密封所述管形瓶的部分，例如盖)组成；本发明的组合物的临时制备通过将固体形式的细菌菌株从管形瓶末端部分释放(例如通过压力)到包含在管形瓶中的透明质酸或其盐的溶液中来进行。
[0099]
根据优选实施方式，除了副干酪乳杆菌lpc-01 dsm 26760和ha以及可选的所述第一物质外，本发明的组合物包含选自下组的另外的物质(第二物质)：氨基酸、补充剂、维生素、微量元素(例如锌和硒)、常量和微量营养素、酶和/或益菌素(prebiotic)物质(例如低聚果糖(fos)、低聚半乳糖(gos)、低聚木糖(xos)、菊粉)、瓜尔胶或其组合。
[0100]
包含副干酪乳杆菌lpc-01 dsm 26760、ha和可选的第一或第二物质的本发明的组合物进一步包含所述(ii)至少一种制药或食品或化妆品级添加剂和/或赋形剂，其是适合于制药或食品用途的无治疗活性的物质。在本发明的上下文中，制药或食品或化妆品用途可接受的添加剂和/或赋形剂包括本领域技术人员已知的用于制备固体、半固体或液体形式的组合物的所有辅助物质，例如稀释剂、溶剂(包括水、甘油、乙醇)、增溶剂、酸化剂、增稠剂、甜味剂、增味剂、着色剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、ph稳定缓冲剂及其混合物。
[0101]
包含副干酪乳杆菌lpc-01 dsm 26760和透明质酸或其盐及可选的第一或第二物质的本发明的组合物可以是药物组合物(或活的生物治疗产品)、医疗装置组合物、膳食补充剂、食品、新食品、益生菌产品、用于特殊医疗目的的食品组合物(fsmp)或化妆品组合物。
[0102]
本发明的实施方式(frn)概述如下：
[0103]
fr1.包含益生菌和透明质酸或其盐的组合物，其用于治疗、预防或减轻与皮肤老化相关的/由皮肤老化引起的至少一种体征或症状，或用于治疗、预防或减轻与皮肤免疫系统降低相关的/由皮肤免疫系统降低引起的至少一种体征或症状。
[0104]
fr2.根据fr1使用的组合物，其中皮肤老化选自内在皮肤老化和外在皮肤老化。
[0105]
fr3.根据fr2的组合物，其中与内在皮肤老化相关的/由内在皮肤老化引起的所述至少一种体征或症状选自：皱纹、皮肤松弛、皮肤完整性丧失或降低、缺乏皮肤弹性、缺乏肤色、皮肤变薄、皮肤脱屑和皮肤脱水。
[0106]
fr4.根据fr2使用的组合物，其中与外在皮肤老化相关的/由外在皮肤老化引起的至少一种体征或症状选自：红斑、色素沉着、角化病(优选过度角化病)、皮肤发红、烧伤、皮质性白内障、翼状胬肉、冷疱的再活化、任何性质的皮肤损伤(优选唇和/或结膜损伤)、皮肤黑素瘤、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌(基底细胞瘤)、角膜或结膜的鳞状细胞癌。
[0107]
fr5.根据fr1使用的组合物，其中与皮肤免疫系统降低相关的/由皮肤免疫系统降低引起的至少一种体征或症状选自：皮炎(优选与刺激或表皮脱落相关)、痤疮、感染、皮肤炎症、红斑、溃疡、银屑病、特应性皮炎、耳炎、皲裂、瘘和痔。
[0108]
fr6.根据fr1至fr5中任一项使用的组合物，其中所述益生菌优选选自：细菌、真菌、酵母及其组合，优选它们是属于选自以下的至少一个属的细菌：乳杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、丙酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属、气球菌属和肠球菌属。
[0109]
fr7.根据fr6使用的组合物，其中所述乳杆菌属的细菌属于选自以下的至少一个物种：副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、解淀粉乳杆菌、食淀粉乳杆菌、消化乳杆菌、鸟乳杆菌、短
乳杆菌、布氏乳杆菌、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、棒状乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、法氏乳杆菌、发酵乳杆菌、鸡乳杆菌、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、希氏乳杆菌、约氏乳杆菌、马乳样乳杆菌、开菲尔乳杆菌、粘膜乳杆菌、面包乳杆菌、丘状乳杆菌、类植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、桥状乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、沙克乳杆菌、唾液乳杆菌、三叉乳杆菌及其组合。
[0110]
fr8.根据fr6或fr7使用的组合物，其中所述细菌属于副干酪乳杆菌物种，优选菌株副干酪乳杆菌cncm i-1572和/或菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760。
[0111]
fr9.根据前述fr中任一项使用的组合物，其中所述透明质酸盐选自：透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸钴及其组合。
[0112]
fr10.根据前述fr中任一项使用的组合物，其中所述益生菌是活的和/或死的和/或灭活的和/或间歇灭菌的，和/或为裂解物和/或提取物的形式，和/或为选自以下的细菌产物的形式：上清液、代谢物、代谢生物产物、益生素、细胞壁及其组分、外多糖、核糖体和糖蛋白、葡聚糖和其他多糖、脂多糖和上清液的任何组分。
[0113]
fr11.根据前述fr中任一项使用的组合物，其中所述益生菌以108至10
12
单位的微生物、优选109至10
11
单位的微生物的量存在。
[0114]
fr12.根据前述fr中任一项使用的组合物，其为乳膏、凝胶、油、乳剂、喷雾剂、纱布、药膏、绷带、洗剂、摩丝、面膜、软膏、糊剂或用于临时制备的液体制剂的形式。
[0115]
在本发明的上下文中，术语“治疗”或“治疗性治疗”或“治疗方法”用于表示对有需要的受试者的干预，包括施用治疗有效量的本发明的组合物或混合物m，用于消除、降低/减少或预防病理或疾病及其症状或病症。
[0116]
术语“治疗有效量”是指活性化合物和/或细菌菌株在组织、系统、哺乳动物或人类中引起由个体、研究人员、兽医、医师或其他临床医师或保健工作者寻求和定义的生物反应或药物反应的量。
[0117]
在本发明的上下文中，表述“受试者”用于表示人类受试者或动物受试者(例如宠物，例如狗或猫或其他哺乳动物)。优选地，本发明的组合物用于人类受试者的医学治疗方法或用于美容用途。
[0118]
在本发明的上下文中，术语“医疗器械”以符合1997年2月24日的第46号立法法令或根据新医疗器械法规(eu)2017/745(mdr)的含义使用。
[0119]
在本发明的上下文中，术语“新食品”以符合1997年法规ec 258的含义使用。
[0120]
除非另外指明，否则表述包含“x至y范围内”的量的组分的组合物或混合物或其他用于表示所述组分可以以所述范围内的所有量存在于组合物或混合物或提取物或其他中，即使未指定，也包含该范围的端值。
[0121]
实施例
[0122]
实施例a
[0123]
包含菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dms 26760和透明质酸或其盐的本发明的乳膏：
[0124]
为了制备所述乳膏，将以粉末或粉末胶囊(约8
×
109cfu)的形式冷冻干燥的菌株lpc-s01 dsm 26760(有活力的或灭活的)溶解在13ml基于透明质酸的乳膏(简称ha乳膏)中。
[0125]
ha乳膏的组成实例(重量/重量％)：
[0126]-补足100％的水(溶剂)；
[0127]-功能性物质：氰双苯丙烯酸辛酯(uv-b滤光剂)2-8％(4.5％)、用氰双苯丙烯酸辛酯(uv-b滤光剂)稳定化的封装的bmdbm 0.1-5％(2％)、乳木果油(牛油果树＝非洲酪脂树)(cas号194043-92-0)0.1-4％(1％)、胶原蛋白复合物和泛醇0.1-4％(1％)、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(uv-a滤光剂)0.1-4％(1％)、维生素e 0.01-1％(0.3％)、栀子茎0.01-1％(0.1％)、低分子量透明质酸(例如cas号9004-61-9)0.005-1％(0.05％)、中/高透明质酸(例如cas号9067-32-7)0.005-1％(0.02％)；
[0128]-赋形剂和添加剂(2-10％w/w，根据本领域技术人员已知的技术要求)：抗氧化剂(例如醋酸生育酚)、防腐剂(例如苯氧乙醇、山梨酸钾)、表面活性剂-乳化剂(例如鲸蜡硬脂基葡糖苷、鲸蜡醇)、乳液稳定剂(例如卡波姆)、溶剂(例如1,2-己二醇)、研磨剂(例如二氧化硅)、粘合剂(例如pvp)、湿润剂(例如甘油)和/或皮肤调理剂(例如二甲聚硅氧烷、黄原胶、托酚酮)。
[0129]
实施例b
[0130]
包含菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dms 26760和透明质酸或其盐的本发明的面膜：
[0131]
为了制备所述面膜，将以粉末或粉末胶囊(约8
×
109cfu)的形式冷冻干燥的菌株lpc-s01 dsm 26760(有活力的或灭活的，优选有活力的)溶解在透明质酸或其盐的水溶液中，例如具有表a所示的组分的溶液，其中低分子量透明质酸(例如cas号9004-61-9)0.01-2％(0.1％)和中/高分子量透明质酸(例如cas号9067-32-7)0.005-1％(0.05％)以重量/重量％(相对于所述透明质酸水溶液的总重量)存在。
[0132]
表a
[0133]
成分cas号水7732-18-5丙二醇504-63-2透明质酸钠9067-32-7苯氧乙醇122-99-61,2-己二醇6920-22-5辛酰基二醇1117-86-8水解透明质酸9004-61-9氢氧化钠1310-73-2添加剂/赋形剂-[0134]-加热灭活的菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dms 26760：
[0135]
实验部分-(1)
[0136]
episkin t-skin
tm
模型(3d皮肤模型)
[0137]
episkin t-skin
tm
(简称t-skin或“全层皮肤”或3d皮肤)是体外重建的3d皮肤模型，包括真皮和表皮(全层皮肤模型)。
[0138]
episkin t-skin
tm
是一种体外重建的皮肤，其由皮肤等同物构成，其中人成纤维细胞叠置在分化良好的分层表皮上，该表皮源自在惰性聚碳酸酯滤膜上培养的正常人角质形成细胞。
[0139]
在形态学(多层表皮)、生物化学和生理学性质方面，体外重建的人皮肤模型与体
内人组织更接近，并且它们现在是动物、离体外植体和浸没细胞单层的最有希望的替代物，用于评价产品局部应用的功效和安全性(gordon等，2015，zuang v.2016)。
[0140]
这些模型的生物学相关性和预测性来源于具有不同活细胞层的组织的存在，其允许评价以实际临床剂量和暴露条件局部施用的产品。用局部施用的产品(例如化妆品)处理人皮肤导致具有动态途径的基因组响应，并且它代表在转录水平负责级联事件的第一细胞信号。考虑直接基因组响应和细胞结果以及通过可溶性介质的交叉通信和特异性生物标志物的表达，3d人组织是用于研究作用机制和评价产品功效的相关测试系统。
[0141]
i.episkin t-skin
tm
模型上的稳态模型(非炎性)
[0142]
在episkin t-skin
tm
模型上的稳态模型的当前体外研究中，评估了本发明的包含透明质酸(ha)和有活力的或灭活的细菌菌株lpc-s01 dsm 26760的组合物在皮肤稳态益处方面的功效，以探索其用于皮肤护理的潜在应用和功效。
[0143]
本研究的目的是研究本发明的组合物在暴露于高浓度后的皮肤耐受性特征，并评价它们在以下方面的功效：
[0144]
·
通过诱发抗微生物肽来增强皮肤自身防御，
[0145]
·
先天免疫应答刺激角质形成细胞，表皮更新和分化，
[0146]
·
诱导表皮和真皮隔室的主动更新，充当抗老化剂。
[0147]
i.1.有活力的菌株-稳态模型
[0148]
i.1.1.受分析的产品和对照。
[0149]-阴性对照(nc)：0.9％氯化钠溶液。
[0150]-p1：重悬在盐水溶液中的有活力的菌株lpc-s01 dsm 26760；
[0151]-p2：基于透明质酸的水溶液(如在上文报告的实施例b(面膜)中)；
[0152]-p3：重悬在基于透明质酸的水溶液中的有活力的菌株lpc-s01 dsm 26760；
[0153]
为了制备p3，将冷冻干燥的有活力的菌株lpc-s01 dsm 26760的粉末胶囊的内容物(约8
×
109cfu)溶解在13ml基于透明质酸的水溶液中。
[0154]
为了制备p1(仅菌株)，将冷冻干燥的有活力的菌株lpc-s01 dsm 26760的粉末胶囊的内容物(约8
×
109cfu)重悬于13ml盐水溶液中。
[0155]
i.1.2.自我防御和细胞更新能力的增加的方法学评价
[0156]
在体外重建的全3d皮肤模型上评价益生菌菌株lpc-s01(副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，有活力的；p1)、益生菌菌株lpc-s01(有活力的)+透明质酸(p3)和透明质酸(p2)的自我防御和细胞更新能力的增加，所述模型再现真皮和表皮的区室，并由此允许研究真皮的细胞外基质的改变和活皮肤层的分化(“全层皮肤”模型)。
[0157]
所述研究集中于评价菌株lpc-s01 dsm 26760、透明质酸和包含菌株lpc-s01+透明质酸的组合物对免疫应答的激活、表皮细胞分化和真皮细胞更新的影响。将菌株lpc-s01 dsm 26760、透明质酸和包含菌株lpc-s01益生菌+透明质酸的组合物直接施用(30μl)至3d皮肤模型的表面，温育8小时，然后使用盐水溶液冲洗以除去过量产物。在分析之前将组织再培养16小时，以模拟面膜在24小时内的真实暴露。
[0158]
使用盐水溶液作为阴性对照(nc)。
[0159]
相对于阴性对照，分析以下参数(按照本领域技术人员已知的方法)：
[0160]
·
利用masson三色染色的组织学分析；
[0161]
·
皮肤防御(hbd2和ccl27)、先天免疫应答(tlr2)、表皮分化(krt14、lor和ivl)、表皮更新(has-2、cd44、胶原iii、iv和xiii、kgf和egf)的主要生物标志物的基因表达(qrt-pcr)；
[0162]
·
通过定量腺苷酸激酶(简称ak)的释放来分析细胞损伤(toxilight测定)。
[0163]
实验以生物学一式三份进行。
[0164]
i.1.2.1.利用masson三色染色进行组织形态学分析
[0165]
在处理结束时，用盐水溶液洗涤组织并在10％福尔马林中固定。根据制造商的说明，使用masson三色试剂盒(abcam 150686)标记组织切片。对于每个样品，对切片的3个不同部分进行3次显微采集。在光学显微镜(20
×
和40
×
放大倍数)下分析组织学样品并评价组织的形态学改变。
[0166]
i.1.2.2.实时pcr分析
[0167]
在处理结束时，将组织收集在用于进行rna提取和cdna逆转录的裂解缓冲液中。通过加载提取在1％琼脂糖凝胶中的rna来评价rna完整性：检测到18s和28s核糖体条带。gapdh用作内源对照基因以归一化输入量。使用本领域技术人员已知的方法分析所得数据。
[0168]
i.1.3.自我防御和细胞更新能力的激活结果
[0169]
i.1.3.1.利用masson三色染色进行的组织形态学分析的结果。
[0170]
用盐水溶液温育后，阴性对照(图1a)在表皮和真皮中均未显示形态和/或结构变化。胶原纤维的分布是定向的并且包括成纤维细胞。
[0171]
用菌株lpc-s01 dsm 26760(有活力的)进行的处理未诱导表皮和真皮结构的显著改变。相对于阴性对照，胶原纤维及其分布显示出纤维的厚度减小和密度减小(图1b)。
[0172]
用透明质酸进行的处理未诱导表皮和真皮结构的显著改变。与阴性对照相比，胶原纤维显示出密度降低(图2a)。
[0173]
用益生菌菌株lpc-s01 dsm 26760(有活力的)+透明质酸进行的处理能够改变表皮的形态，特别是较薄的角质层的形态，并增加分化过程(图2b)。
[0174]
i.1.3.2.实时pcr结果(qrt-pcr)。
[0175]
表1显示了相对于阴性对照，用lpc-s01 dsm 26760(有活力的)、透明质酸和lpc-s01 dsm 26760(有活力的)+透明质酸处理的组织的用实时pcr获得的值的相对定量(rq)。
[0176]
表1
[0177]
[0178]
用益生菌lpc-s01 dsm 26760进行的处理诱导了人防御素β2(hbd2)和tlr2的增加。这些数据与该益生菌的免疫调节特性一致，并且它们表明该益生菌具有触发皮肤防御和增强皮肤的先天免疫应答的能力。
[0179]
用透明质酸进行的处理不能诱导对所评价的目标基因表达的调节。
[0180]
与用透明质酸进行的处理相比，用透明质酸+lpc-s01 dsm 26760进行的处理引起hbd2表达增加。观察到胶原iii和has-2的值降低(如在单独的益生菌处理中已经观察到的)，同时也观察到kgf的降低。
[0181]
总体而言，所获得的结果表明，当单独施用时，益生菌lpc-s01 dsm 26760通过增强皮肤的先天免疫(基于tlr2和hbd-2)而对皮肤发挥正面作用。
[0182]
单独使用透明质酸不会对皮肤产生正面作用；相反，在具有透明质酸的相同制剂中引入的lpc-s01能够保持其增强皮肤先天防御的主要活性。
[0183]
i.1.3.4腺苷酸激酶释放的结果(toxilight分析)。
[0184]
用研究主题产品处理的组织所释放的腺苷酸激酶水平表明，在温育8和16小时后该产品具有良好的生物相容性。
[0185]
i.1.4.结论
[0186]
所得结果表明，用透明质酸+lpc-s01 dsm 26760(活且有活力的)进行处理是最有希望的，显示出在改善皮肤分化过程、皮肤更新和通过增加胶原网络来总体增强真皮区室结构方面的正面功效。因此，透明质酸和益生菌lpc-s01 dsm 26760(p3)的组合施用显示出在增强真皮结构、干预细胞分化和更新的关键因素方面的协同作用。这种协同作用是不可预测的，因为透明质酸和益生菌lpc-s01 dsm 26760单独施用时对皮肤分化没有显示出显著效果。
[0187]
i.2.灭活细菌菌株-稳态模型
[0188]
i.2.1.受分析的产品和对照。
[0189]-阴性对照(nc)：0.9％氯化钠溶液；
[0190]-p1-i.：灭活菌株lpc-s01 dms 26760，重悬于盐水溶液(109个细胞/组织)，使用浓度2g lpc-s01/ml；
[0191]-p2-i.：基于透明质酸的乳膏(如在上文报告的实施例a(乳膏)中那样)；
[0192]-p3-i.：灭活菌株lpc-s01 dsm 26760，重悬于基于透明质酸的乳膏(类似于p2-i.)(109个细胞/组织)，使用浓度2g细胞/ml。
[0193]
为了制备p3-i.，将冻干的灭活菌株lpc-s01 dsm 26760的粉末胶囊的内容物(约8
×
109cfu)溶解在基于透明质酸的乳膏中。
[0194]
为了制备p1-i.(仅菌株)，将冻干灭活菌株lpc-s01 dsm 26760的粉末胶囊的内容物(约8
×
109cfu)重悬于盐水溶液中。
[0195]
i.2.2.受分析的菌株的灭活。
[0196]
起始原料：冻干形式的菌株lpc-s01 dsm 26760的有活力的细菌细胞，有活力的细胞数为2*10
11
个细胞/g粉末。
[0197]
处理前一天，称量2g粉末并重悬于4ml盐水溶液中以获得10
11
个细菌细胞/ml的盐水溶液的悬浮液。通过在mrs琼脂上计数，使用30μl该悬浮液验证有效细菌负载。
[0198]
在处理当天，通过在85℃下温育细菌悬浮液1小时来将在盐水溶液中制备的细菌
菌株悬浮液热灭活。此后，将细菌分成4个eppendorf试管(各1ml，对应10
11
个细菌细胞)并离心。然后将沉淀重悬于：
[0199]-1ml盐水溶液，获得p1-i.
[0200]-1ml基于透明质酸的乳膏，获得p3-i.
[0201]
i.2.3.方法学。
[0202]
在稳态条件下，将待分析产物和阴性对照(p1-i.、p2-i.、p3-i.、nc：15μl)直接施用于t-皮肤模型组织的表面上24小时和48小时。通过施用15μl p1-i和p3-i.的悬浮液来施用109个细菌/组织。
[0203]
相对于未处理的对照(阴性对照，nc)分析以下参数：
[0204]
·
用h&e(苏木精&伊红)染色的组织形态学分析；
[0205]
·
皮肤防御(人防御素β2(defb4))、先天免疫应答(tlr2、tnfα)、分化和表皮更新(tgms-1、ccnd1、tgf-β1)的主要生物标志物的基因表达(借助于rt-qpcr)。
[0206]
实验以生物学一式三份进行。
[0207]
i.2.4.结果。
[0208]
i.2.4.1. 24小时和48小时的h&e组织形态学分析结果
[0209]
在每个组织学载玻片上制备三个垂直组织切片(由3个重复组成)；对选定切片进行了5次显微采集。对于每个生物学重复，报告了选定垂直切片的最具代表性的采集结果。对5次显微采集计算平均厚度。
[0210]
结果报告如下：
[0211]
24小时时的cn(图6a)：
[0212]-表皮：完全有活力且具有规则的sc(角质层)片层结构；
[0213]-真皮-表皮接合处：观察到结构完整性；
[0214]-纤维和胶原分布：定向的并包含许多成纤维细胞。
[0215]
24小时时的p1-i.(图中未示出)：
[0216]-表皮：在同一重复中观察到差异，可能与非均匀分布有关；许多显示代谢活化和增殖的细胞是可见的；少致密核；sc片层结构看上去没有显著改变；
[0217]
24小时时的p3-i.(图6b)：
[0218]-表皮：在同一重复中观察到差异，可能与非均匀分布有关；许多显示代谢活化和增殖的细胞是可见的；少致密核；sc(角质层)片层结构出现明显的改变；
[0219]-真皮-表皮接合处：观察到结构完整性；
[0220]-纤维和胶原分布：定向致密、紧实且包括许多成纤维细胞。
[0221]
48小时时的nc(图6c)：
[0222]-表皮：完全有活力且具有规则的sc(角质层)片层结构；
[0223]-真皮-表皮接合处：观察到分离和完整性丧失(组织内在脆性)；
[0224]-纤维和胶原分布：定向的并包含许多成纤维细胞。
[0225]
48小时时的p1-i.(图中未示出)：
[0226]-表皮：观察到完全分化的表皮；由于更大的增殖和分化，该组织在结构和厚度方面表现出改变的sc。
[0227]
48小时时的p3-i.(图6d)：
[0228]-表皮：在同一重复中观察到差异，可能与非均匀分布有关；许多显示代谢活化的细胞是可见的并且它们增殖；少致密核；sc(角质层)片层结构由于更多的增殖而出现改变；
[0229]-真皮-表皮接合处：观察结构完整性；
[0230]-纤维和胶原分布：定向的且包含许多成纤维细胞；相对于阴性对照更致密和紧实。
[0231]
上述数据表明组合物p3-i.(灭活菌株+ha)比p1-i组合物(仅灭活菌株)作用时间更短且效力更大，因为在24小时时施用p3-i于组织后，sc(角质层)的层状结构似乎改变，而在施用p1-i后，必须等待48小时才能观察到sc层状结构的改变。
[0232]
i.2.4.2.实时pcr结果
[0233]
i.2.4.2.1. 24小时实时pcr结果
[0234]
图7显示了24小时时的基因表达(qrt-pcr)结果(在24小时时用nc计算的rq＝1；rq《0.5下调，rq》2上调)
[0235]
在24小时时在用受分析的组合物(p1-i.、p2-i.、p3-i.)处理的组织中获得的相对定量(rq)基因表达(qrt-pcr)的结果总结于下图7中。结果表示为相对于阴性对照(24小时时的nc＝1；rq《0.5下调，rq》2上调)。
[0236]
作为一般考虑，受分析的组合物的非完全均匀施用导致三个重复之间的高生物可变性。
[0237]
处理24小时后：
[0238]
·
受分析的灭活益生菌株，单独(p1-i)或包含在含ha的组合物中(p3-i)，诱导了人防御素β2(defb4)的上调。这些数据与i.1.3.1节中观察到的有活力菌株lpc-s01 dms 26760的免疫调节特性一致，并且它们表明其即使在非活力条件下也能够触发皮肤防御的能力。因此，这种免疫调节活性可能与细菌细胞壁中的外部暴露成分相关。
[0239]
·
仅包含ha的组合物(p2-i.)不调节人防御素β2(defb4)：该结果证实了defb4在p3-i.(菌株+ha)中的上调仅与细菌的存在有关。
[0240]
·
与p1-i.(仅菌株)相比，组合物p3-i.(菌株+ha)在24小时时以更高(尽管不显著)的方式诱导人防御素β2(defb4)的上调。对tnfα的显著调节进行定量，表明炎症反应的诱导可能是由于皮肤表面对细菌的免疫识别。因为在用p2-i.(仅ha)处理的组织中没有观察到这种作用，该结果可与组合物p3-i中包含的高剂量菌株lpc-s01 dms 26760有关。
[0241]
i.2.4.2.2. 48小时实时pcr结果
[0242]
证实了受分析的灭活菌株(p1-i.和p3-i.)诱导人防御素β2(defb4)，其数值高于24小时时间点(i.2.4.2.1节)，表明稳定的生物反应和皮肤防御增强，这导致有效的保护机制。
[0243]
i.2.5.结论。
[0244]
在稳态(非炎性)模型中，包含灭活lpc-s01 dms 26760菌株和透明质酸的组合的本发明的组合物p3-i.(灭活菌株+ha)在3d皮肤模型中是良好耐受的，并且与单独的组分和/或阴性对照相比能够刺激身体的防御和细胞分化过程。
[0245]
特别是，与不与透明质酸组合的细菌菌株(p1-i.)相比，本发明的组合物p3-i.(灭活菌株+ha)在更短时间内达到功效水平。
[0246]
ii.episkin t-skin
tm
模型上的炎症模型
[0247]
在再现真皮和表皮区室的完整3d体外重建的皮肤模型(t-skin
tm
模型)上，评估了包含细菌菌株lpc-s01 dms 26760(有活力的或灭活的)和透明质酸的本发明的组合物的减少由uv照射引起的损伤的能力，从而允许研究真皮的细胞外基质的变化和活力层的分化(全层皮肤模型)。
[0248]
所述评估根据以下报告的两种模型来进行：炎症模型a(对未受损组织的预处理)和炎症模型b(对受损组织的预处理和后处理)。
[0249]
ii.a.用于有活力或灭活细菌菌株的炎症模型a
[0250]
ii.a.1.受分析的产品和对照。
[0251]-p1：重悬于盐水溶液中的有活力的lpc-s01 dms 26760，
[0252]-p2：基于透明质酸的溶液(见i.1.1面膜)；
[0253]-p3：重悬于基于透明质酸的溶液中的有活力的lpc-s01 dms 26760，
[0254]-p1-i.：重悬于盐水溶液中的灭活lpc-s01 dms 26760，
[0255]-p2-i.：基于透明质酸的溶液(见i.1.1面膜)；
[0256]-p3-i.：重悬于基于透明质酸的溶液中的灭活lpc-s01dms26760，
[0257]-阳性对照(pc)：用0.9％nacl盐水溶液处理、擦伤并暴露于uv照射的组织。
[0258]-阴性对照(nc)：用0.9％nacl盐水溶液处理的组织，不暴露于uv照射。
[0259]
p1(仅有活力的菌株)和p3(有活力的菌株+ha)通过将冷冻干燥的细菌菌株的胶囊的内容物(cfu 8
×
109)分别重悬于13ml包含透明质酸的盐水溶液中来制备。
[0260]
p1-i.(仅灭活菌株)和p3-i.(灭活菌株+ha)通过将冷冻干燥的细菌菌株胶囊的内容物(cfu 8
×
109)重悬于盐水溶液中并在85℃下温育1小时来制备。此后，离心细菌并将沉淀分别悬浮在13ml基于透明质酸的盐水溶液(或乳膏)中。
[0261]
ii.a.评价uv损伤减少的方法
[0262]
如上所述，在“全层皮肤”模型上评价益生菌菌株lpc-s01 dsm 26760(活且有活力的或灭活的)的uv损伤减少作用。该研究考虑了菌株lpc-s01、透明质酸和包含菌株lpc-s01 dsm 26760+透明质酸的组合物对苏木精-伊红标记的组织的形态和对响应于uv照射的炎性小体(inflammasome)活化的影响。将菌株lpc-s01 dsm 26760、透明质酸和包含益生菌菌株lpc-s01 dsm 26760+透明质酸的组合物直接施用于3d皮肤模型的表面，温育过夜，随后用盐水溶液漂洗以除去过量产物(预处理步骤)。轻微磨损组织，然后暴露于1med(引起红斑的最小剂量)的uv以模拟正常的日光暴露。在暴露于uv射线4和24小时后测试炎症的活化。用盐水溶液处理并暴露于uv射线的组织用作阳性对照。用盐水溶液处理且未暴露于uv的组织用作阴性对照。
[0263]
根据本领域技术人员已知的方法，通过以下方式评估受分析组合物的减少由uv射线引起的损害的功效：
[0264]-nfkb免疫染色方法；
[0265]-用苏木精/曙红(h&e)染色的组织形态学分析；以及
[0266]-il-1β定量法(仅对于有活力的菌株)。
[0267]
ii.a.3.uv损伤减少的结果(炎症模型a)
[0268]
ii.a.3.1.nfkb免疫染色结果
[0269]
图3概括了暴露于uv射线4小时后nfκb易位的定量结果(包含有活力的菌株的受分
析组合物)。
[0270]
照射后4小时，阳性对照(pc)显示出大量nfκb易位，特别是在表皮的基底上层。
[0271]
相对于阳性对照，用lpc-s01 dsm 26760(p1)、用菌株lpc-s01 dsm 26760和透明质酸(p2)、以及用透明质酸(p3)进行的处理显著抑制了nfkb的核易位。
[0272]
因此，用益生菌lpc-s01 dsm 26760、lpc-s01 dsm 26760+透明质酸、和透明质酸进行的处理已经显示出通过抑制受uv射线损伤的细胞的核中的nfkb的易位来预防炎症活化的能力。
[0273]
此外，表2显示了用包含有活力的菌株(p3)或灭活菌株(p3-i)的受分析组合物预处理16小时(长期)时所确定的nfkb核易位的半定量数据，以及在暴露于uv射线4小时后对参数的评估，其对评估长期治疗的效果是有用的。
[0274]
与未照射样品(阴性对照)相比，经照射的样品(阳性对照)中细胞核中的nfkb易位增加，这证实了所述炎性小体模型(1med的uv暴露，引起红斑的最小剂量)的生物相关性和再现性。
[0275]
在用具有灭活菌株的组合物p3-i进行的研究中，nfkb易位的相对增加(百分比差异)(+70.7％，w＝0.01)与在用具有有活力菌株的组合物p3进行的研究中的定量结果(+83.7，w＝0.01)相当。
[0276]
表2
[0277][0278]
此外，在24小时时，与阳性对照相比，p3显示出nfκb的细胞质含量降低(未针对p3-i测量数据)。
[0279]
ii.a.3.2.h&e染色的组织形态学结果。
[0280]
图4和5显示了在用uv射线损伤后4和24小时分别用盐水溶液(阳性对照)(a)、益生菌lpc-s01 dsm 26760(b)、透明质酸(c)及lpc-s01 dsm 26760(有活力的)+透明质酸(d)处理的组织(用h&e染色的组织形态学)。
[0281]
如图所示，在两个图中，用透明质酸处理和用益生菌lpc-s01 dsm 26760处理不能减少由uv射线诱导的损伤。特别是，在表皮的基底层和棘层中可见到uv射线诱导的晒伤体征。此外，真皮-表皮接合处受到uv射线损伤，表皮不完全贴附于真皮，这是皮肤结构改变的迹象(图4a、4b、5a和5b)。
[0282]
用透明质酸+益生菌lpc-s01 dsm 26760进行处理能够在诱导损伤4和24小时后减少uv所诱导的损伤。特别是，与单独施用透明质酸和益生菌lpc-s01 dsm 26760处理相比，真皮和表皮的结构更紧实。此外，真皮-表皮接合处的结构得到更好的保持，有利于表皮与真皮更好的贴附(图4d和5d)。
[0283]
联合施用透明质酸和益生菌lpc-s01 dsm 26760的这种协同作用是不可预测的，因为单独施用透明质酸和单独施用益生菌都不能减少表皮从真皮的“脱离”，因此不能保持皮肤的生理结构。
[0284]
ii.a.3.3.il-1β定量结果
[0285]
在4小时时，相对于阴性对照和阳性对照，对包含有活力的菌株和透明质酸的本发明的组合物p3的il-1β进行定量(表3)。由于信号低于试剂盒检测限(3.91pg/ml限值)，因此无法将结果视为定量数据。这些结果旨在给出一种整体趋势。
[0286]
表3
[0287] ncpcp3ail-1β(pg/ml)2.122.741.84
[0288]
ii.a.4.结论
[0289]
使用基于uva+uvb(1med剂量)所诱导的炎症途径的t-skin
tm
(全层皮肤)实验模型来评估包含细菌菌株lpc-s01 dms 26760(分别为有活力的或灭活的)和透明质酸的本发明组合物p3和p3-i的功效，其在诱导炎性小体应激之前施用(预处理)。
[0290]
本发明的组合物p3(有活力的菌株+ha)和p3-i(灭活菌株+ha)在长期预处理(16小时)时显示出良好的降低nfkb易位的功效。
[0291]
此外，在用h&e染色的组织形态学研究中，本发明的组合物p3(有活力的菌株+ha)显示出保护真皮-表皮接合处的结构抵御uv射线的良好能力。
[0292]
ii.b.灭活菌株的炎症模型b
[0293]
使用基于uva+uvb(1med剂量)所诱导的炎性途径的t-skin
tm
(全层皮肤)实验模型来评估包含灭活细菌菌株lpc-s01 dms 26760和透明质酸的本发明p3-i.的组合物的功效，其在诱导炎性小体应激之前或之后施用于受损组织(针对uv照射的预处理或后处理)。
[0294]
使用高浓度的待分析的灭活细菌菌株(107或109个细胞/组织)来评估待分析的组合物(参见ii.b.1)，其目的是根据下述2个方案在t-skin炎性小体模型上探索它们的潜在应用和功效：
[0295]
b.i.预处理方案：t-skin通过表皮表面上的机械压力而受到磨损，并且用待检查的组合物预处理45分钟或4小时，然后经受uva和uvb照射(1med)。在所述照射后4小时(温育后)，收集组织用于分析。
[0296]
b.ii.后处理方案：t-skin通过表皮表面上的机械压力而受到磨损并经受uva和uvb照射(1med)，然后用待检查组合物处理45分钟或4小时并立即收集用于分析。
[0297]
本研究的目的是研究高剂量的待分析的灭活细菌菌株(单独或与ha混合)在调节核中nfkb的活化和易位中的功效。
[0298]
ii.b.1.待分析的组合物和对照。
[0299]-p3-i.-109：灭活的lpc-s01 dms 26760(109个细胞/组织)，重悬于基于透明质酸的乳膏中(参见i.2.1.)，相当于最终组合物的30％；
[0300]-p3-i.-107：灭活的lpc-s01 dms 26760(107个细胞/组织)，重悬于基于透明质酸的乳膏中(参见i.2.1.)，相当于最终组合物的0.03％；
[0301]-阳性对照(pc)：用0.9％nacl盐水溶液处理、磨损并暴露于uv照射的组织。
[0302]-阴性对照(nc)：用0.9％nacl盐水溶液处理的组织，不暴露于uv照射。
[0303]
p3-i.(灭活菌株+ha)通过将冷冻干燥的细菌菌株胶囊的内容物(cfu 109)重悬于盐水溶液中并在85℃下温育1小时来制备。此后，离心细菌并将沉淀悬浮在13ml基于透明质酸的乳膏中。
[0304]
ii.b.2.研究设计
[0305]
ii.b.2.1.待分析的组合物的制备
[0306]
将具有2*10
11
个细胞/g粉末的冻干形式的待分析的灭活菌株称重并如下重悬于正确的溶剂中：
[0307]-2g重悬于4ml基于ha的乳膏中(参见i.2.1.)，获得p3-109。通过施用15μl悬浮液来施用109个细菌/组织。
[0308]-0.02g重悬于4ml基于的ha乳膏中(参见i.2.1.)，获得p3-107。通过施用15μl悬浮液来施用107个细菌/组织。
[0309]
ii.b.2.2.炎性体t-skin的诱导和治疗
[0310]
ii.b.2.2.1.预处理方案
[0311]
实验设计总结在图8中：在实验当天，通过轻微的机械压力(algerbrush n冲击＝2)损伤组织，并用15μl分析组合物(p3-i.)处理，将其直接且均匀地施用到t-skin
tm
组织上并温育45分钟或4小时。
[0312]
随后，使用具有氙弧灯和irradiance wg320[mw/cm2]红斑过滤器的oriel 1kw太阳模拟器(0.035mw/cm2，根据opto.cal gmbh发布的校准证书号16121)，在pbs中用1med(相当于0.025j/cm2)照射组织。诱导炎性小体后，将组织在稳态条件下后温育4小时，然后在福尔马林中固定并嵌入石蜡(ffpe)中用于nfκb免疫染色。还收集组织用于进一步rt-qpcr分析。收集载体并储存在-20℃。
[0313]
ii.b.2.2.2.后处理方案
[0314]
实验设计总结在图9中：在实验当天，用轻微的机械压力(algerbrush n冲击＝2)损伤组织并在pbs溶液用1med(相当于0.025j/cm2)照射。在诱导炎性小体后，用15μl待分析组合物处理组织并温育45分钟或4小时。处理后立即收集组织并在福尔马林中固定用于nfκb免疫染色。还收集组织用于进一步rt-qpcr分析。
[0315]
ii.b.3.nfkb免疫染色结果
[0316]
下表4显示了相对于每种方案的阳性对照，阴性对照的nfκb易位结果(表示为在3个生物重复中检测到的细胞核总数)。如表4中报告的，相对于阴性对照，经照射的样品中细胞核中的nfκb易位的增加证实了炎性小体模型的诱导。
[0317]
然而，在该t-skin批次中，在照射后观察到更早的nfkb活化，但在每个时间点都观察到易位。特别是，在照射后45分钟观察到最高的nfκb诱导。
[0318]
所采用的方案基于后处理模型中uv照射后的读数和预处理模型中温育后的读数，因为目的是评估产物在从急性炎症过程中恢复方面的功效。
[0319]
表4
[0320]
阴性对照0阳性对照45分钟预处理+uv温育后4小时7阳性对照4小时预处理+4小时uv温育5阳性对照uv照射后45分钟9阳性对照uv照射后4小时4
[0321]
a)45分钟预处理
[0322]
在表5中，呈现了45分钟预处理+4小时的后uv照射温育时的nfκb核易位的半定量
分析(表示为在所有生物重复中检测到的核总数)。
[0323]
表5.
[0324]
阴性对照nc0阳性对照pc7灭活菌株109+ha
*
p3-i.(109)1灭活菌株107+ha
*
p3-i.(107)5
[0325]
*
本发明的组合物
[0326]
b)4小时预处理
[0327]
在表6中，呈现了4小时预处理+4小时的后uv照射温育时的nfκb核易位的半定量分析(表示为在所有生物重复中检测到的核总数)。
[0328]
表6.
[0329]
阴性对照nc0阳性对照pc5灭活菌株109+ha
*
p3-i.(109)1灭活菌株107+ha
*
p3-i.(107)2
[0330]
*
本发明的组合物
[0331]
表5和6的结果分析：
[0332]-当作为预处理施用时，包含灭活菌株lpc-s01 dms 26760和透明质酸的组合物p3-i.能够减少核中的nfkb易位，表明具有保护皮肤抵御uv射线诱导的炎性应激的预防性功效。
[0333]-在45分钟预处理模型中，在109菌株浓度下，组合物p3-i.(灭活菌株+ha)能够高度减少核中的nfkb易位，表明在灭活的lpc-s01 dms 26760菌株和透明质酸之间具有协同作用和/或高度有效的作用。
[0334]-组织对2种不同浓度的灭活lpc-s01 dms 26760的组合物p3-i.(109)和p3-i.(107)的预处理的响应提示了剂量响应机制：在组合物中的菌株浓度增加的情况下检测到较少的nfkb阳性核。
[0335]
c)后处理45分钟
[0336]
在表7中，呈现了uv照射后的45分钟预处理的nfκb核易位的半定量分析(表示为在所有生物重复中检测到的核总数)。
[0337]
表7.
[0338]
阴性对照nc0阳性对照pc9灭活菌株109+ha
*
p3-i.(109)3灭活菌株107+ha
*
p3-i.(107)0
[0339]
*
本发明的组合物
[0340]
d)后处理4小时
[0341]
在表8中，呈现了uv照射后的4小时预处理的nfκb核易位的半定量分析(表示为在所有生物重复中检测到的核总数)。
[0342]
表8.
[0343]
阴性对照nc0阳性对照pc4灭活菌株109+ha
*
p3-i.(109)1灭活菌株107+ha
*
p3-i.(107)9
[0344]
*
本发明的组合物
[0345]-组合物p3(灭活菌株+ha)已经显示出nfκb的基础水平的快速和有效的恢复，特别是在短期(当炎症应答处于其最大水平时)，表明灭活菌株lpc-s01 dms 26760+透明质酸的组合在恢复炎性组织的稳态方面具有改善性协同作用/效果。
[0346]
ii.b.4.结论
[0347]
这些结果证实，包含灭活的lpc-s01 dms 26760+透明质酸组合的组合物p3-i在稳态条件(参见第i.2节)和皮肤炎症条件(例如由uv照射引起)中都是有效的，特别是在炎症的急性期，因为其在短期炎症发展中特别有效。
[0348]
实验部分(2)
[0349]
在存在本发明的组合物(菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760和透明质酸)的情况下评价痤疮丙酸杆菌dsm1897对3d“全层皮肤”模型的粘附性
[0350]
1.研究目的。
[0351]
本研究的目的是评价益生菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760，单独和/或与透明质酸(ha)组合，对抗痤疮丙酸杆菌体外粘附到“全层皮肤”模型的能力。
[0352]
痤疮皮肤杆菌(简写为c.acne，又名痤疮丙酸杆菌或p.acne(douglas et g
ü
nter，1946))是与诸如痤疮等某些皮肤病相关的生长缓慢的革兰氏阳性厌氧细菌；它也可能是睑缘炎和眼内炎的成因。
[0353]
为了评估各种可能的感染情况，基于对coman等于2015年描述的方法的修改，实施了竞争模型和排除模型。
[0354]
2.实验设计。
[0355]
菌株痤疮丙酸杆菌dsm 1897用于模拟3d“全层皮肤”模型中的感染，购自phenion(henkel)，总共30个插入物。
[0356]
测试是在考虑以下列出的不同处理条件下进行的：
[0357]
1)无处理，以评价痤疮丙酸杆菌dsm 1897在排除和竞争两个模型中的有效粘附能力；
[0358]
2)用副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760进行预防性或伴随性处理24小时；
[0359]
3)用0.5％透明质酸进行预防性或伴随性处理24小时(sigma-aldrich 41897)；
[0360]
4)用透明质酸和副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760的均匀混合物进行预防性或伴随性处理24小时；
[0361]
5)用过氧化苯甲酰进行预防性或伴随性处理24小时(benzac 10％，阳性对照)。
[0362]
制备菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760l的悬浮液并将50μl悬浮液放置成与插入物表面接触。
[0363]
制备0.5％透明质酸悬浮液，并将50μl悬浮液放置成与插入物接触。
[0364]
此外，将50μl菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760与0.25mg透明质酸混合以获
得益生菌+透明质酸的组合制剂，其具有相同的透明质酸浓度(0.5％)和相同的用单独物质测试时所用的初始负载。
[0365]
将50μl benzac凝胶10％(过氧化苯甲酰)放置成与插入物接触，作为阳性对照。
[0366]
以上列出的所有5个条件均一式两份进行试验，将10个插入物在37℃和co2存在下培养24小时。
[0367]
2.a.执行排除测试
[0368]
排除测试包括：用益生菌菌株(或透明质酸，或两者的混合物)预处理插入物，随后用病原体进行感染，以及随后验证病原体对插入物的％粘附相对于理想感染条件(预防性益生菌处理的体外模型)的可能下降。
[0369]
2.b.执行竞争测试
[0370]
竞争测试包括：用益生菌菌株(或透明质酸，或两者的混合物)和病原体同时处理插入物，并随后验证病原体对插入物的％粘附相对于理想感染条件(感染过程中的益生菌处理的体外模型)的可能下降。
[0371]
3.结果
[0372]
3.1排除测试
[0373]
图10显示了病原体痤疮丙酸杆菌dms 1897的活力的降低，以log10 cfu表示，而表9显示了在各种测试条件下病原体活力的降低百分比(％)的相同情况。
[0374]
表9
[0375]
测试条件病原体减少％lpc-s0119.1lpc-s01+透明质酸19.5透明质酸0.8benzac17.0
[0376]
从所报告的结果可以看出，用benzac 10％、lpc-s01 dsm 26760和lpc-s01 dsm 26760在0.5％透明质酸存在下的组合进行的处理使痤疮丙酸杆菌dms 1897的活力计数降低了约1.0-1.4log10，对应于病原体活力降低约20％。单独用0.5％透明质酸处理似乎不能以任何程度降低病原体的活力。
[0377]
3.2.竞争测试
[0378]
图11和表10显示了活力计数的图表，表示为插入物上的痤疮丙酸杆菌dms 1897的对数减少logcfu，其为每个测试条件的一式两份获得的平均值，并且是在竞争测试中获得的减少百分比。
[0379]
表10
[0380]
测试条件病原体减少％lpc-s0118.0lpc-s01+透明质酸17.3透明质酸0.0benzac15.3
[0381]
基于所呈现的数据，证实了用benzac 10％、lpc-s01 dsm 26760和lpc-s01 dsm 26760在0.5％透明质酸存在下的组合进行的处理使痤疮丙酸杆菌dms 1897的活力计数降
低了约1.0-1.3log10 cfu。与排除测试一样，单独用0.5％透明质酸处理似乎不能降低病原体的活力。
[0382]
4.结论
[0383]
进行的所有体外测试证明了benzac 10％阳性对照在抑制痤疮丙酸杆菌感染中的功效，病原体群活力的％下降为15％至23％。
[0384]
排除测试和竞争测试已表明用lpc-s01+0.5％透明质酸的组合(本发明的组合物)进行的处理使痤疮丙酸杆菌dsm1897的感染减少了约18-19％。