核酸用载体及核酸的给药方法

1.本发明涉及核酸用载体及核酸的给药方法。


背景技术：

2.近年，关于抑制基因表达的sirna、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)等核酸试剂，正在尝试应用于医疗领域。但是，用于将上述核酸试剂载入细胞内的药物传递系统(dds)正在开发，尚未建立能够保持核酸、再现性良好地将核酸载入细胞内的载体。


技术实现要素：

发明所要解决的技术问题
3.因此，本发明的目的在于，提供用于将sirna等核酸导入细胞的新载体。用于解决问题的技术方案
4.为了达到上述目的，本发明的核酸用载体的特征在于，包含植物果实的囊泡。
5.本发明的传递型核酸试剂的特征在于，包含上述本发明的核酸用载体和核酸，上述核酸用载体与上述核酸形成复合体。
6.本发明的传递型核酸试剂的制造方法的特征在于，包括以下工序：通过使上述本发明的核酸用载体和核酸在溶剂中共存，从而形成上述核酸用载体与上述核酸的复合体。
7.本发明的核酸的给药方法的特征在于，包括以下工序：形成上述本发明的核酸用载体与核酸的复合体的工序；以及，给药上述复合体的工序。发明的效果
8.根据本发明的核酸用载体，例如，能够容易保持核酸，而且将保持的核酸导入细胞内。因此，可以说本发明例如在基因治疗等医疗领域中作为dds非常有用。
附图说明
9.图1为表示实施例1中的来自针叶樱桃(acerola)的囊泡的粒度分布的图表。图2为表示实施例1中的核酸试剂的表达的图表。图3为表示使用实施例1中的囊泡的核酸试剂的载入的照片。图4为表示使用实施例1中的囊泡向细胞siha载入核酸试剂和抑制靶表达的图表。图5为表示使用实施例1中的囊泡向细胞nhdf载入核酸试剂和抑制靶表达的图表。图6为表示在实施例2中通过比较核酸试剂的扩增量来确认囊泡与核酸试剂的复合体形成的结果的图表。图7为表示在实施例2中通过核酸试剂的扩增量来确认热休克和冰冷的有无对复合体形成的影响的结果的图表。图8为表示在实施例2中通过核酸试剂的扩增量来确认温育(incubate)条件对复合体形成的影响的结果的图表。图9为表示在实施例2中通过核酸试剂的扩增量来确认复合体形成与囊泡添加量
的相关关系的结果的图表。图10为表示在实施例3中通过核酸试剂的扩增量来确认囊泡抑制核酸试剂的分解的结果的图表。图11为表示在实施例4中基于复合体形成的核酸试剂向细胞的导入的图表。图12为表示在实施例5中基于复合体形成的核酸试剂向小鼠的导入的概要图。图13为表示在实施例5中关于基于复合体形成的核酸试剂向小鼠的导入，各器官中的上述核酸试剂的扩增量的图表。图14为在实施例5中确认以复合体形式导入到小鼠的核酸试剂的功能的图表。图15为表示在实施例6中通过核酸试剂的扩增量确认囊泡产生的抑制核酸试剂分解的结果的图表。
具体实施方式
10.只要没有特别说明，本说明书中使用的术语能够以该技术领域中通常使用的含义来使用。
11.(1)核酸用载体如上述所示，本发明的核酸用载体的特征在于，其包含植物果实的囊泡。本发明人发现，植物果实的囊泡保持核酸且将上述核酸与上述囊泡的复合体载入到细胞内，并且所保持的核酸在细胞内起作用，从而建立了本发明。本发明以包含上述囊泡为特征，其它构成及条件没有特别限制。
12.成为上述植物果实的来源的植物没有特别限制，可举出金虎尾科(malpighiaceae)植物、芸香科(rutaceae)植物等。
13.上述金虎尾科(malpighiaceae)植物的种类没有特别限制，例如可举出金虎尾属(malpighia)，具体而言，例如可举出针叶樱桃种(malpighia sp.)等，优选凹缘金虎尾(m.emarginata dc.)、亮叶金虎尾(m.glabra)和红叶金虎尾(m.punicifolia)等针叶樱桃。
14.上述芸香科(rutaceae)植物的种类没有特别限制，例如可举出柑橘属(citrus)，具体而言，例如可举出葡萄柚种(citrus
×
paradisi，英文名grapefruit)、柠檬种(c.limon、英文名lemon)等。
15.上述囊泡可由上述植物的果实得到。上述果实例如可以为完熟的，可以为未完熟的，可以为它们的混合物。上述囊泡例如优选为从上述果实的果汁回收的、后述的囊泡级分。
16.上述囊泡例如可通过从上述植物果实提取而制备。上述制备方法没有特别限制，例如可通过以下方法得到：将上述果实破碎而制备其破碎物或破碎物的悬浮液，通过基于超滤法、超速离心法、浓度梯度法、微液体系统的分离法等方法将囊泡分级，从而得到。上述制备方法中，例如可以使用市售的试剂盒，可使用exoeasy maxi kit(商品名，qiagen公司)、exoquick(商品名，system bioscience公司)、总外泌体分离试剂(total exosome isolation reagent)(商品名、invitrogen公司)等。上述囊泡，例如可以将对上述果实进行压榨而得到的果汁供于上述各种分离方法。上述果汁例如可以为完熟果实的果汁，可以为未完熟果实的果汁，可以为完熟或未完熟的冷冻果实的果汁。
17.本发明的核酸用载体，例如可使用包含多种囊泡的囊泡级分。上述囊泡的大小没
有特别限制，其粒径例如可例示30～400nm、80～300nm、150～300nm、100～200nm、80～200nm。上述囊泡例如也称为微囊泡(microvesicles)或纳米囊泡(nanovesicles)。在利用粒度分布来表示上述包含多种囊泡的囊泡级分的情况下，粒径的峰例如为30～400nm、80～300nm、150～300nm、100～200nm、80～200nm。另外，在上述粒度分布中，将全部囊泡设为100％的情况下，上述峰(例如，200
±
20nm)的囊泡的比例的下限例如为30％以上、50％以上、80％以上，其上限例如为100％、80％以下、70％以下。上述囊泡级分例如为：以成为上述粒径和上述粒度分布的方式从上述果实的果汁提取的级分。在使用上述囊泡级分作为本发明的核酸用载体的情况下，例如可使用通过成为上述粒径和上述粒度分布的提取方法从上述植物果实提取的级分，可以为包含来自上述果汁的其它成分的状态。
18.囊泡粒径的测定方法没有特别限制，例如可采用纳米粒子追踪分析等方法，例如可使用市售的装置(设备名nanosight、qnano)等。上述囊泡例如可以为细胞外囊泡、细胞内囊泡中的任一种。上述囊泡，例如可举出外泌体样囊泡(与人源外泌体同等大小)。与人源外泌体同等大小的囊泡，例如是通过与人源外泌体相同的分离方法得到的囊泡。
19.本发明的核酸用载体可与核酸形成复合体。具体而言，上述囊泡可与上述核酸形成复合体。通过使上述核酸与上述核酸用载体形成复合体，从而能够传递上述核酸，因此以下也将上述复合体称为传递型核酸试剂。上述复合体的形态没有特别限制，例如可以为在上述囊泡内部包封有上述核酸的形态，也可以为在上述囊泡的外壁负载有上述核酸的形态。上述囊泡与上述核酸的复合体的形成方法没有特别限制，例如可以仅是使上述囊泡与上述核酸在溶剂中共存，也可利用在细胞内导入核酸的常规手法。在前者的情况下，例如通过使上述囊泡和上述核酸在溶剂中共存并温育，由此能够形成上述囊泡与上述核酸的复合体。温育的温度没有特别限制，例如可以为室温范围(例如，30
±
10℃)，也可以为低于室温的温度范围(例如，超过0℃且低于20℃)，混杂有rnase时，从能够防止核酸在形成复合体前分解的观点出发，优选为低温范围(例如，4
±
5℃)，进一步优选为冰冷条件下(例如，1～6℃)。温育时间没有特别限制，下限为例如5分钟以上、15分钟以上，上限没有特别限制，例如通过30分钟左右的温育能够达到复合体形成的平台期。上述溶剂没有特别限制，例如可使用水、生理盐水、pbs等缓冲液等液体。另外，在后者的情况下，例如可利用电穿孔法、脂质体转染法等。
20.目前为止，作为核酸的dds，例如报告了在载体中通过电穿孔法等导入核酸的方法，从再现性等观点出发，有效的手段尚未阐明。另外，基于那样的理由，例如在将动物源外泌体用于dds的方法中，采取对产外泌体细胞本身进行改变的手法。与此相对，本发明的核酸用载体，如上述所示，仅通过使上述植物果实的囊泡，例如，在上述溶剂中共存上述核酸，也能够形成上述囊泡与上述核酸的复合体，因此能够非常简便地将dds的对象即核酸保持于上述囊泡。此外，根据本发明的核酸用载体，例如通过使上述核酸和上述囊泡形成复合体，也能够通过上述囊泡的内吞作用将上述核酸从细胞外导入细胞内。
21.如上述所示，上述复合体的形成，例如仅使上述核酸和上述囊泡在上述溶剂中共存即可，为了使上述囊泡负载上述核酸，可省略以往的转染方法等。作为上述转染方法，例如可举出添加氯化钙的热休克法等。上述热休克法为：例如在负载核酸的载体(例如，细胞)与核酸共存下，通过改变温度并温育规定时间，再恢复至原来的温度来实施热处理的方法。温度的变化，例如是从相对低的温度(变化前的处理温度)向相对高的温度(变化后的处理
温度)的变化，优选在相对高的温度下温育后恢复到相对低的温度。温度变化的幅度(变化导致的温度差)例如为5～45℃，变化前的处理温度例如为低温，具体为1～10℃，变化后的处理温度例如为高温、具体为40～46℃。
22.另外，本发明的核酸用载体，例如可通过与核酸形成复合体而防止rnase、酸、碱等引起的核酸分解。因此，本发明的核酸用载体也可称为核酸的分解防止剂。
23.上述核酸，例如为用于抑制表达的核酸试剂。上述核酸试剂的抑制表达的机理没有特别限制，例如，可以为抑制基因的表达，也可以为抑制蛋白质的表达，具体可举出抑制来自基因的转录、抑制向蛋白质的翻译、分解转录产物等。上述核酸试剂的种类没有任何限制，例如可举出sirna、反义核酸(antisense)、shrna、mirna、mirna模拟物(mirna mimic)(例如，参照wo2015/099122)等。
24.在上述复合体的形成中，上述囊泡的添加量相对于上述核酸的比例没有特别限制，相对于上述核酸1pmol，例如为囊泡5
×
104～8
×
104粒、2
×
105～5
×
105粒、2
×
106～5
×
106粒。
25.本发明的核酸用载体能够传递上述核酸的部位，没有特别限制，例如可举出肝脏、肠(直肠、肠道、胃等)、脑、脾脏等。
26.本发明的核酸用载体，例如作为医药品、诊断试剂和农药、以及农学、医学、生命科学等的研究工具是有用的。
27.(2)本发明的传递型核酸试剂及其制造方法如上述所示，本发明的传递型核酸试剂的特征在于，包含上述本发明的核酸用载体和上述核酸，上述核酸用载体与上述核酸形成了复合体。具体而言，上述本发明的核酸用载体中的上述囊泡与上述核酸形成复合体。本发明的传递型核酸试剂(上述复合体)可以援引上述(1)的记载。
28.如上述所示，本发明的传递型核酸试剂的制造方法包括以下工序：使上述本发明的核酸用载体和上述核酸在上述溶剂中共存，从而形成上述核酸用载体与上述核酸的复合体的工序。本发明的制造方法可以援引上述(1)的记载。
29.(3)核酸的给药方法如上述所示，本发明的核酸的给药方法的特征在于，其包括以下工序：形成上述本发明的核酸用载体与核酸的复合体的工序；以及，给药上述复合体的工序。本发明的特征在于使用上述本发明的核酸用载体，其它工序和条件等没有任何限制。
30.上述复合体的形成方法没有特别限制，例如，如上述所示，可以仅是使上述囊泡和上述核酸共存，也可以使用电穿孔法等。本发明中，例如从能够简便形成复合体出发，优选为前者。
31.在上述复合体的形成工序中，上述囊泡与上述核酸的比例没有特别限制，例如，相对于囊泡2
×
108个，核酸为50～100pmol。
32.上述给药的方式没有特别限制，例如可以为体内(in vivo)也可以为体外(in vitro)。在上述给药为体外(in vitro)的情况下，给药对象，例如可举出细胞、组织或器官等。上述给药为体内(in vivo)的情况下，其给药方法没有特别限制，例如可举出口服给药、非口服给药。上述非口服给药，例如可举出静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、局部等的给药。
33.上述给药对象，例如可举出人或非人动物，上述非人动物没有特别限制，例如可举出小鼠、大鼠、兔子、狗、骆驼、牛等。
34.以下，通过实施例等对本发明进行详细说明，但本发明不受这些示例限定。实施例
35.(实施例1)对于源自针叶樱桃的囊泡，确认作为核酸用载体的功能。试剂盒、试剂及装置等按照其操作说明书来使用。只要没有特别说明，则后文的实施例的各处理的条件也同样。
36.(1)囊泡的制备利用孔径0.45μm的膜滤器(商品名durapore(商标)pvdf membrane filter、millipore公司)过滤冲绳产完熟针叶樱桃果实的果汁8ml。将得到的滤液8ml供于试剂盒(商品名exoeasy maxi kit、qiagen公司)，通过使用上述试剂盒的buffer xe 400μl的洗脱来分离(解离)囊泡，对上述洗脱级分供于超速离心分离(100000
×
g、49000rpm、70分钟、4℃)，回收囊泡的颗粒。将其悬浮于50μl的pbs，作为囊泡级分。将上述囊泡级分供于纳米粒子分析系统(商品名nanosight、malvern公司)，确认上述囊泡级分包含的囊泡的粒度分布。
37.将粒度分布的结果示于图1的图表中。图1中，纵轴表示粒子浓度(粒/ml)，横轴表示粒径(nm)。如图1所示，上述囊泡级分的囊泡浓度为2.2
×
108粒/ml，粒径的平均(mean)为208nm，众数径(mode)为155nm，sd为108nm。
38.(2)复合体的形成间接确认核酸试剂与囊泡的复合体的形成。
39.核酸试剂使用以mmp2为靶标的mirna模拟物(商品名ambion(商标)mir-340mimic、thermo fisher scientific公司)。将上述mir-340模拟物200pmol和上述囊泡级分1ml混合，添加氯化钙使其为0.1mol/l，将该混合物在冰上静置30分钟后，在42℃静置1分钟，再次在冰上静置5分钟，由此进行热休克法。此后对上述混合物进行超速离心分离，回收沉淀级分。超速离心分离设为囊泡沉淀且mirna模拟物单独不沉淀的条件(100000
×
g、49000rpm、70分钟、4℃、以下相同)。准备在上述沉淀级分中以成为5μg/ml的方式添加rnase的体系和未添加rnase的体系，在37℃处理1小时后，使用mirneasy mini kit(商品名，qiagen)提取rna，通过qrt-pcr测定mir-340模拟物。将该体系作为b。上述qrt-pcr，作为外添对照(spike control)，以达到规定量(0.1μmol/l)的方式添加外添mirna(ath-mir-159)而进行，对上述外添mirna也同样进行测定(以下相同)。
40.未添加上述mir-340模拟物，在上述囊泡级分1ml中以成为0.1mol/l的方式添加氯化钙，将该混合物在冰上静置30分钟后，在42℃静置1分钟，再次在冰上静置5分钟，由此进行热休克法。然后，对上述混合物进行超速离心分离，回收沉淀级分，准备添加rnase的体系和未添加rnase的体系，与上述体系b相同进行处理、测定。将该体系作为a。
41.将上述mir-340模拟物200pmol和上述囊泡级分1ml混合，在冰上静置30分钟后，通过超速离心分离回收沉淀级分，准备在上述沉淀级分中添加rnase的体系和未添加rnase的体系，与上述体系b同样进行处理、测定。该体系未添加氯化钙、未进行热休克处理。将该体系作为c。
42.将上述mir-340模拟物200pmol和pbs1ml混合，在冰上静置30分钟后，准备在该混合物中添加rnase的体系和未添加rnase的体系，与上述体系b同样进行处理、测定。该体系
未添加上述囊泡级分、未添加氯化钙、未进行热休克处理、未进行超速离心分离处理。将该体系作为d。
43.将上述mir-340模拟物200pmol和pbs1ml混合，在冰上静置30分钟，进行超速离心分离而除去液体级分，准备在残留物中添加rnase的体系和未添加rnase的体系，与上述体系b同样进行处理、测定。该体系未添加上述囊泡级分、未添加氯化钙、未进行热休克处理。将该体系作为e。
44.将上述结果示于图2。图2为表示mir-340模拟物的扩增量(检测量)的图表。y轴为mir-340模拟物的扩增量的相对值，具体而言，对于各个体系，将mir-340模拟物的扩增量通过外添对照ath-mir-159的扩增量(检测量)标准化，由将体系d(未添加rnase)的标准化值设为1时的相对值表示。图2中，a～e分别为体系a～e的结果，左侧的条为未进行rnase处理的体系(rnase-)，右侧的棒为rnase处理的体系(rnase+)的结果。
45.如图2所示，体系a未添加mir-340模拟物，因此在rnase-和rnase+中均未确认到扩增。体系e在超速离心分离前的混合物中包含游离的mir-340模拟物，但是未添加上述囊泡级分，因此超速离心分离后的上述残留物中不包含mir-340模拟物，未确认到扩增。体系d未进行超速离心分离，因此rnase-中包含游离的mir-340模拟物，确认到扩增，但是rnase+中rnase导致游离的mir-340模拟物分解，因此未确认到扩增。与此相对地，体系b和体系c通过添加上述囊泡级分，从而使上述囊泡和上述mir-340模拟物共存，因此在rnase-及rnase+中均确认到mir-340模拟物的扩增。即，可以说通过上述囊泡和上述mir-340模拟物形成复合体，从而能够避免rnase导致的分解。另外可知，体系c显示与体系b相同的结果，因此例如不使用热休克法等而仅使上述囊泡和上述mir-340模拟物共存也能够形成复合体。
46.(3)在细胞内载入的确认将利用fitc标记的标记mir-340模拟物50pmol和上述囊泡级分1ml混合，在4℃静置1小时。对该混合物进行超速离心分离，回收沉淀级分，利用50μl的pbs(ph7.2)将其悬浮。利用上述pbs进一步将该悬浮液稀释为1/10而制备稀释液。另一方面，利用dmem+10％胎牛血清fbs培养基培养源自宫颈癌的细胞siha，在该培养液500μl中添加上述稀释液5μl，在37℃的co2培养箱内温育24小时。培养后，利用荧光显微镜观察上述细胞。通过dapi对细胞核进行染色。作为比较例，仅使用上述囊泡级分或仅使用上述标记mir-340模拟物同样进行培养、观察。将它们的结果示于图3。
47.图3为放大的荧光显微镜照片，白线表示一个细胞的外形。a为仅使用囊泡的结果，b为使用囊泡和标记mir-340模拟物的结果，c为仅使用标记mir-340模拟物的结果。图3中，a在细胞的中央确认到表示细胞核的dapi的荧光，但是未添加标记mir-340模拟物，因此在细胞内未确认到fitc的荧光。c添加标记mir-340模拟物，因此确认到fitc的荧光，但是不是利用囊泡的导入，因此其荧光零散。与此相对，b在细胞内确认到囊泡形状的fitc的荧光。由此可知，标记mir-340模拟物以与囊泡形成复合体的状态被载入细胞内。
48.(4)在体外(in vitro)的靶的功能：siha将上述mir-340模拟物50pmol和上述囊泡级分1ml混合，在4℃静置1小时。对该混合物进行超速离心分离，回收沉淀级分，利用50μl的pbs(ph7.2)将其悬浮。利用上述pbs进一步将该悬浮液稀释为1/10而制备稀释液。另一方面，利用dmem+10％fbs培养基培养来自宫颈癌的细胞siha，在其培养液500μl中添加上述稀释液5μl，在37℃的co2培养箱内温育24
小时。利用pbs清洗培养后的上述细胞，从上述细胞提取rna，通过qrt-pcr测定mir-340模拟物。另外，也测定mir-340模拟物的靶即mmp2的mrna的表达。
49.作为比较，未添加上述mir-340模拟物且仅使用上述囊泡级分的体系、使用不具有表达抑制能力的核酸(nega-mir、thermo fisher scientific公司)50pmol代替上述mir-340模拟物的体系、未添加上述囊泡级分而仅使用上述mir-340模拟物的体系也同样进行分析。
50.将它们的结果示于图4。图4为表示mmp2的表达量的相对值的图表，y轴是利用管家基因即β-肌动蛋白的表达量将mmp2的表达量标准化而得的值(相对值)。图4中，acerola mv意味着上述囊泡级分(以下在其它图中也相同)。与上述(3)的结果相同，只有使用上述囊泡和上述mir-340模拟物的复合体的体系，从细胞中检测到上述mir-340模拟物(未图示)。此外，如图4所示，只有使用上述囊泡和上述mir-340模拟物的复合体的体系(acelora mv+mir-340模拟物)确认到上述mir-340模拟物的靶即mmp2的表达抑制。根据这些结果可知，上述mir-340模拟物通过与上述囊泡形成复合体而被载入细胞，发挥对靶的表达抑制的功能。
51.(5)在体外(in vitro)的靶的功能：nhdf将以nf-κb为靶基因的核酸试剂mir-146a模拟物(商品名ambion(商标)mir-146a mimic、thermo fisher scientific公司)50pmol和上述囊泡级分1ml混合，在4℃静置1小时。对该混合物进行超速离心分离，回收包含上述mir-146a模拟物与上述囊泡的复合体的沉淀级分，利用50μl的pbs(ph7.2)将其悬浮。利用上述pbs进一步将该悬浮液稀释为1/10而制备稀释液。另一方面，与上述(4)相同利用dmem+10％fbs培养基培养人正常皮肤成纤维细胞nhdf，在该培养液500μl中添加上述稀释液5μl，在37℃的co2培养箱内温育24小时。利用pbs清洗培养后的上述细胞，从上述细胞提取rna，通过qrt-pcr测定mir-146a模拟物(adens+mir-146a mimic)。另外，也测定mir-340模拟物的靶即nf-κb的mrna的表达。
52.同时，未添加上述mir-146a模拟物且仅使用上述囊泡级分的体系(adens)、使用不具有表达抑制能力的核酸(nega-mir、thermo fisher scientific公司)代替上述mir-146a模拟物的体系(adens+nega-mir)、未添加上述囊泡级分的上述mir-146a模拟物的体系(mir-146a mimic)同样进行测定。
53.将它们的结果示于图5。图5为表示nf-κb的表达量的相对值的图表，y轴是利用管家基因即β-肌动蛋白的表达量将nf-κb的表达量标准化而得的值(相对值)。与上述(4)的siha的结果相同，只有使用上述囊泡和上述mir-146a模拟物的复合体的体系从细胞中检测到上述mir-146a模拟物(未图示)。此外，如图5所示，只有使用上述囊泡与上述mir-146a模拟物的复合体的体系(adens+mir-146a mimic)确认到上述mir-146a模拟物的靶即nf-κb的表达抑制。根据这些结果可知，上述mir-146a模拟物通过与上述囊泡形成复合体而被载入细胞，并且发挥对靶的表达抑制的功能。另外，根据上述(4)及该(5)的结果可确认，通过上述囊泡，无论核酸试剂的种类、细胞的种类，均能够形成与核酸试剂的复合体并在细胞内导入核酸试剂。
54.(实施例2)作为源自针叶樱桃的囊泡，使用上述实施例1的囊泡级分，上述囊泡可确认作为核酸用载体的功能。只要没有特别说明，则设为与上述实施例1相同的条件。
55.(1)将上述囊泡级分1ml和上述核酸试剂(mir-340模拟物)200pmol混合，添加氯化
钙，将该混合物在冰上静置30分钟后，进行热休克法。然后，对上述混合物进行超速离心分离(100000
×
g、49000rpm、70分钟、4℃)，从得到的沉淀级分提取rna，通过qrt-pcr测定mir-340模拟物。与该体系(氯化钙(+)/冰冷(+)/热休克(+))相同，改变条件的以下体系也同样进行测定。氯化钙(+)/冰冷(+)/热休克(+)氯化钙(-)/冰冷(+)/热休克(+)氯化钙(-)/冰冷(+)/热休克(-)
56.将它们的结果示于图6。图6为表示各体系的mir-340模拟物的扩增量(检测量)的图表。y轴为mir-340模拟物的扩增量的相对值，具体而言，各体系与上述实施例1相同，将mir-340模拟物的扩增量标准化，由将氯化钙(+)/冰冷(+)/热休克(+)/的体系的标准化值设为1时的相对值表示。如图6所示，在未添加氯化钙且进行热休克处理的情况下，从超速离心分离后的沉淀级分中回收的rna，观察到mir-340模拟物的扩增，另外在未添加氯化钙且未进行热休克处理的情况下，得到更高的相对值。由此可知，仅通过使mir-340模拟物和囊泡共存就能够进行mir-340模拟物与囊泡的复合体的形成。
57.(2)将上述核酸试剂mir-340模拟物200pmol和上述囊泡级分1ml混合，将该混合物在冰上静置30分钟后(冰冷)进行超速离心分离(uc、100000
×
g、49000rpm、70分钟、4℃)，回收沉淀级分。从上述沉淀级分提取rna，通过qrt-pcr测定mir-340模拟物。应予说明，未添加氯化钙、未进行热休克处理。与该体系(囊泡(+)/mirna模拟物(+)/冰冷(+)/uc(+))相同，改变条件的以下体系也进行测定。囊泡(-)为使用pbs 1ml代替上述囊泡级分的体系，mirna模拟物(-)为未添加上述mir-340模拟物且仅使用上述囊泡级分的体系，uc(-)为不进行超速离心分离且在冰冷后提取rna的体系。囊泡(+)/mirna模拟物(+)/冰冷(+)/uc(+)囊泡(+)/mirna模拟物(+)/冰冷(+)/uc(-)囊泡(+)/mirna模拟物(-)/冰冷(+)/uc(+)囊泡(+)/mirna模拟物(-)/冰冷(+)/uc(-)囊泡(-)/mirna模拟物(+)/冰冷(+)/uc(+)囊泡(-)/mirna模拟物(+)/冰冷(+)/uc(-)
58.将它们的结果示于图7。图7为表示各体系中的mir-340模拟物的扩增量(检测量)的图表。y轴为mir-340模拟物的扩增量的相对值，具体而言，各体系与上述实施例1相同，将mir-340模拟物的扩增量标准化，由将囊泡(-)/mirna 模拟物(+)/冰冷(+)/uc(-)的体系的标准化值设为1时的相对值表示。图7中，adens是指上述实施例1的囊泡级分，即源自针叶樱桃的外泌体样囊泡(acerola derived exosome like nanoperticles)(以下，其它图中也相同)。如图7所示，未添加mirna模拟物的体系(囊泡(+)/mirna模拟物(-))无论有无超速离心分离(uc(+)或(-))均未观察到mir-340模拟物的扩增。未添加囊泡级分的体系(囊泡(-)/mirna模拟物(+)在未进行超速离心处理(uc(-))的情况下，可观察到mir-340模拟物的扩增，但是在超速离心处理(uc(+))的情况下，未观察到mir-340模拟物的扩增。另一方面，添加囊泡级分和mirna模拟物的体系(囊泡(+)/mirna模拟物(+))与未进行超速离心处理(uc(-))相比存在一定的下降，但是即使进行超速离心处理(uc(+))，也能够确认到mir-340模拟物的扩增。在上述超速离心分离的条件下，mirna模拟物单独无法沉淀，因此，通过与上述
囊泡级分共存，从而在通过超速离心分离得到的沉淀级分中观察到mirna模拟物的扩增这一结果意味着mirna模拟物与囊泡形成复合体。
59.(3)对于上述(1)的氯化钙(-)/冰冷(+)/热休克(-)，改变冰冷时的静置时间，同样进行测定。另外，同时，氯化钙(-)/冰冷(-)/热休克(-)进行室温(25℃)下的静置来代替冰冷，改变静置时间，同样进行测定。
60.将它们的结果示于图8。图8为表示各体系中的mir-340模拟物的扩增量(检测量)的图表。y轴为mir-340模拟物的扩增量的相对值，具体而言，各体系与上述实施例1相同，将mir-340模拟物的扩增量标准化，由将冰冷(+)60分钟的体系的标准化值设为1时的相对值表示。如图8所示，上述核酸试剂和上述囊泡级分，无论是在冰上静置还是在室温下静置，均观察到mir-340模拟物的扩增。冰上静置与室温下静置相比，扩增量高出一些，因此可认为：例如通过冰上静置，从而在上述核酸试剂与上述囊泡级分的囊泡形成复合体之前更能保护上述核酸试剂发生分解。
61.(4)上述(1)的氯化钙(-)/冰冷(+)/热休克(-)的体系，将上述(1)的上述囊泡级分的添加量设为相对值1，以成为1/2、1/10、1/50的方式添加，除此以外，同样进行测定。
62.将它们的结果示于图9。图9为表示各体系中的mir-340模拟物的扩增量(检测量)的图表。y轴为mir-340模拟物的扩增量的相对值，具体而言，各体系与上述实施例1相同，将mir-340模拟物的扩增量标准化，由将上述囊泡级分的添加量相对值1的体系的标准化值设为1时的相对值来表示。如图9所示，上述囊泡级分的添加量，浓度依赖地使扩增量增加。
63.(5)本实施例，在上述实施例1的囊泡级分(2.2
×
108粒/ml)50μl中混合50pmol核酸试剂(mir-340模拟物)，使混合液中的mir-340模拟物终浓度为1pmol/μl(1μmol/l)。在冰冷下将上述混合液温育30分钟，通过超速离心分离(100000
×
g、49000rpm、70分钟、4℃)回收沉淀级分作为上述囊泡与上述mir-340模拟物的复合体。从上述沉淀级分提取rna，通过qrt-pcr测定上述mir-340模拟物。另一方面，对照不进行超速离心分离，除此以外，同样进行从温育后的上述混合液提取rna并测定上述mir-340模拟物。然后，测定得到的扩增量与上述实施例1相同进行标准化，以对照的标准化值为100％，求出实施例的扩增量的相对值。其结果，实施例的扩增量的相对值为60％。
64.上述对照包含总mir-340模拟物。另一方面，上述实施例通过超速离心分离除去游离的mir-340模拟物，因此形成上述复合体的mir-340模拟物的扩增量。因此可知，在本实施例的条件下，通过囊泡1.1
×
107粒能够使30pmol的mir-340模拟物形成复合体而使用。
65.(实施例3)确认到源自针叶樱桃的囊泡对核酸试剂的抗性的效果。只要没有特别示出，则设为与上述实施例1或实施例2相同的条件。
66.实施例3与上述实施例2(2)相同，将上述核酸试剂mir-340模拟物和上述囊泡级分混合，在冰上静置30分钟后，不进行上述氯化钙处理和上述热休克处理，对上述混合物进行超速离心分离，回收沉淀级分。在上述沉淀级分中，添加会对核酸造成损伤的各种损伤试剂(rnase、hcl或naoh)，在规定条件下处理后，提取rna，通过qrt-pcr测定mir-340模拟物。实施例的对照在不添加上述各种损伤试剂的情况下提取rna，同样进行测定。
67.上述试剂使用rnase、hcl、naoh。在上述沉淀级分中，以成为5μg/ml的方式添加上述rnase，在37℃处理1小时后提取rna。在上述沉淀级分中，以成为1
×
10-2
mol/l(ph2)的方
式添加上述hcl，在37℃处理1小时后提取rna。在上述沉淀级分中，以成为1
×
10-2
mol/l(ph10)的方式添加上述naoh，在37℃处理1小时后提取rna。
68.另外，比较例在上述核酸试剂mir-340模拟物中不添加上述囊泡级分，添加上述各种试剂(rnase、hcl或naoh)，在规定条件下处理后提取rna，通过qrt-pcr测定mir-340模拟物。以上述实施例中添加于上述沉淀级分中的试剂相同的量，在上述核酸试剂中添加上述各种试剂，处理条件也相同。比较例的对照，不添加上述各种损伤试剂而提取rna，同样进行测定。
69.将它们的结果示于图10。图10的(a)为表示实施例中的mir-340模拟物的扩增量(检测量)的图表，图10的(b)为表示比较例中的mir-340模拟物的扩增量(检测量)的图表。各y轴为mir-340模拟物的扩增量的相对值，分别与上述实施例1相同，将mir-340模拟物的扩增量标准化，由将各个对照的标准化值设为1时的相对值来表示。如图10的(b)所示，在单独使用上述mir-340模拟物的比较例的情况下，在利用任一试剂(rnase、hcl或naoh)处理的情况下，mir-340模拟物的扩增量显著减少。另一方面，如图10的(a)所示，实施例通过使上述mir-340模拟物与上述囊泡级分共存，从而在利用任一试剂处理的情况下，mir-340模拟物的扩增量，均未观察到如上述比较例那样的显著减少，可维持对照的一半以上的扩增量。根据该结果可知，通过添加上述囊泡级分，从而上述囊泡和上述mir-340模拟物形成复合体，由此能够抑制各种损伤试剂导致的上述mir-340模拟物的分解。
70.(实施例4)将以荧光素酶基因为靶的luc sirna(商品名，genedesign公司，anti-luc sirna)50pmol和上述实施例1的囊泡级分1ml混合，在4℃静置1小时。对该混合物进行超速离心分离，回收沉淀级分，利用50μl的pbs(ph7.2)将其悬浮。另一方面，利用孔板的dmem+10％fbs培养基培养luc强制表达细胞(3ll-luc、由jcrb细胞银行获得，导入荧光素酶基因)，在该培养液500μl中添加上述悬浮液5μl，在37℃的co2培养箱内温育24小时。对于培养后的上述细胞测定荧光素酶活性。上述细胞的荧光素酶活性的测定按照以下进行。将100μl的bio-glo reagent(商品名，promega公司)添加于培养后的培养液，在暗处在室温静置15分钟。然后，利用光度计(tecan公司)测定荧光素酶活性。同时，在其它孔板中在与上述相同的条件下培养的细胞，通过celltiter-glo 2.0 assay(商品名，promega公司)测定细胞数。另外，作为对照，luc sirna(-)/囊泡(+)的体系、luc sirna(+)/囊泡(-)的体系也同样进行荧光素酶活性和细胞数的测定。
71.将它们的结果示于图11。图11为表示荧光素酶活性的图表，y轴表示利用细胞数标准化的荧光素酶活性。图中，＊表示p＜0.05。如图11所示，在并用上述囊泡级分和上述sirna的情况下，荧光素酶活性显著减少。
72.(实施例5)确认源自针叶樱桃的囊泡在体内(in vivo)的dds效果。
73.(1)囊泡的给药利用荧光性细胞膜染色色素pkh26处理上述实施例1的囊泡级分(2.2
×
108粒/ml)2ml，对上述级分包含的囊泡进行荧光标记。利用上述经pkh26处理的囊泡级分供于超速离心分离(条件100000
×
g、49000rpm、70分钟、4℃)，回收包含上述荧光标记的囊泡的沉淀级分，将其全部悬浮于200μl的pbs。使用灌胃管对多只野生型小鼠(雌性、8周龄、c57/bl)口服
给药上述荧光标记囊泡的悬浮液的全部。然后，经时(1小时、3小时、6小时)利用体内(in vivo)荧光检测设备(商品名ivis，summit pharmaceuticals international corporation)对小鼠个体进行荧光信号检测。
74.图12表示小鼠各器官中的表示荧光信号的成像的概要图，图12示出在荧光信号的成像图像中显示特别显著的荧光信号的部位。图12中，星号意味着确认到荧光信号，其大小表示荧光信号的相对大小，其数值表示荧光信号在各器官中的分布广度。图12为给药1小时后的结果，网格线表示的区域为显示荧光的区域。如图12所示，各区域(脑、肝脏、胃、肠道、膀胱)中确认到荧光信号，可知从给药开始1小时以内标记囊泡被传递到上述各区域。此外，随着时间推移，荧光信号衰减，但是在给药6小时后，也能够局限地在直肠中确认到荧光信号。
75.(2)利用囊泡的核酸试剂的传递将上述核酸试剂的拟南芥mirna(ath-mir-159)200pmol和上述囊泡级分2ml混合，将该混合物在冰上静置30分钟后(冰冷)，与上述(1)相同，全部口服给药于小鼠。口服给药开始1小时后，从小鼠摘出各器官，提取rna，通过qrt-pcr进行各器官中的ath-mir-159的检测。另外，作为对照，仅给药上述ath-mir-159的小鼠也同样进行检测。
76.将它们的结果示于图13。图13为表示各器官中的ath-mir-159的扩增量(检测量)的相对值的图表，y轴为利用内源性对照小rna(small rna)即rnu6b的扩增量(检测量)将上述ath-mir-159的扩增量标准化的值(相对值)。如图13所示，仅给药上述ath-mir-159的小鼠的全部器官中ath-mir-159均为检测限以下，无法进行检测(undetecet,ud)。另一方面，给药上述复合体的小鼠，在上述(1)中强烈确认到荧光信号的器官(肝脏、小肠等肠道)中，同样确认到上述ath-mir159的表达。另外，还在肾脏和脾脏中确认到上述ath-mir159。
77.(3)传递的核酸试剂的功能显现上述(2)中，可确认上述囊泡能够在体内(in vivo)传递核酸试剂，因此可确认传递的核酸试剂在传递到的部位是否发挥功能。
78.作为上述核酸试剂，使用与上述实施例4相同的luc sirna，除此以外，与上述(2)同样进行，将上述核酸试剂和上述囊泡级分混合，冰冷30分钟后，全部口服给药于小鼠。上述小鼠使用荧光素酶转基因小鼠(luc-tg/c57bl/6j，12周龄)。此外，在给药开始1小时后，与上述(1)相同利用检测设备(商品名ivis)测定小鼠个体、解剖后的各器官中的荧光素酶活性(adens+luc sirna)。对照仅口服给药pbs，同样进行而测定荧光素酶活性(control)。
79.将它们结果示于图14。图14的(a)为表示解剖前小鼠个体整体的亮度(flux)的图表，图14的(b)为表示摘出的器官(脑、肺、肝脏、肾脏、脾脏、肠、包括膀胱在内的卵巢区域)的亮度的合计的图表。各图表中，y轴表示亮度(flux，单位
×
108p/s)。如图14的(a)及(b)所示，给药上述复合体的小鼠与对照相比，表示荧光素酶活性的亮度显著降低。另外，上述(b)为上述(2)中确认到核酸试剂的传递的器官中的亮度的合计。因此，对于给药复合体的结果(adens+luc sirna)，比较上述(a)的小鼠个体亮度和上述(b)的器官的合计亮度，结果确认到相对于各个对照的亮度在上述(b)中显著减少。根据该结果可知，通过形成上述复合体，上述核酸被传递至各器官，抑制荧光素酶的表达。
80.(实施例6)分离源自柠檬果实和葡萄柚果实的囊泡。
81.通过与上述实施例1相同的方法，使用从柠檬完熟果实压榨而得到的果汁以及从葡萄柚完熟果实压榨而得到的果汁制备各自的囊泡级分，确认上述囊泡级分包含的囊泡的粒度分布。源自柠檬的囊泡级分的囊泡浓度为1.84
×
10
11
粒/ml，粒径的平均(mean)为113.7nm，众数径(mode)为79.1nm，sd为66.8nm。源自葡萄柚的囊泡级分的囊泡浓度为7.37
×
10
12
粒/ml，粒径的平均(mean)为95.7nm，众数径(mode)为61.9nm，sd为30.5nm。
82.确认上述源自柠檬的囊泡或上述源自葡萄柚的囊泡对核酸试剂的抗性带来的效果。具体而言，使用上述源自柠檬的囊泡级分以及上述源自葡萄柚的囊泡级分代替源自针叶樱桃的囊泡级分，除此以外，与上述实施例3同样进行，测定上述核酸试剂mir-340模拟物。该实施例的对照与实施例3的对照相同，不添加上述各种损伤试剂，除此以外，同样进行测定。
83.另外，针对使用上述源自柠檬的囊泡或上述源自葡萄柚的囊泡的实施例的比较例，使用上述针对实施例3的比较例(参照图10的(b))。
84.将这些的结果示于图15。图15的(a)为表示使用上述源自柠檬的囊泡级分的实施例中的mir-340模拟物的扩增量(检测量)的图表，图15的(b)为表示使用上述源自葡萄柚的囊泡级分的实施例中的mir-340模拟物的扩增量(检测量)的图表。各y轴为mir-340模拟物的扩增量的相对值，分别与上述实施例1相同，将mir-340模拟物的扩增量标准化，由将各自的对照的标准化值设为1时的相对值表示。
85.如上述的图10的(b)所示，在单独使用上述mir-340模拟物的比较例的情况下，在利用任一试剂(rnase、hcl或naoh)处理的情况下，mir-340模拟物的扩增量均显著减少。另一方面，如图15的(a)所示，在实施例通过使上述mir-340模拟物与上述源自柠檬的囊泡级分共存，从而利用任一试剂处理的情况下，未观察到mir-340模拟物的扩增量如上述比较例那样的显著减少，能够维持对照的一半以上的扩增量。另外，如图15的(b)所示，使用上述源自葡萄柚的囊泡级分的实施例也相同。根据上述结果可知，通过添加上述囊泡级分，从而上述囊泡和上述mir-340模拟物形成复合体，由此能够抑制各种损伤试剂导致的上述mir-340模拟物的分解。
86.以上，参照实施方式对本技术发明进行了说明，但是本技术发明不受上述实施方式限定。本技术发明的构成、详细内容可以在本技术发明的范围内进行本领域技术人员可理解的各种变更。
87.本技术主张以2019年7月5日提出申请的日本技术特愿2019-126172为基础的优先权，将其公开的全部内容引入本说明书。产业上的可利用性
88.根据本发明的核酸用载体，例如容易保持核酸，此外能够将保持的核酸导入细胞内。因此，例如在基因治疗等医疗领域，本发明非常有用。