激活丙酮酸激酶R的制作方法

激活丙酮酸激酶r
1.相关申请的交叉引用
2.本专利申请要求保护下列共同未决专利申请中的每一件的利益和优先权：2019年9月19日提交的美国专利申请第16/576,720号；2019年9月19日提交的美国专利申请第16/576,360号；2019年9月19日提交的美国专利申请第62/902,887号；2019年9月26日提交的美国专利申请第62/906,437号；2019年9月19日提交的国际申请第pct/us2019/052024号；2020年5月13日提交的美国专利申请第63/024,432号；2020年5月13日提交的美国专利申请第63/024,441号；2020年5月28日提交的美国专利申请第62/704,785号；和2020年6月11日提交的美国专利申请第62/705,106号；其中的每一件通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开涉及治疗性化合物、组合物和包括施用激活丙酮酸激酶r(pkr)的化合物的方法，包括通过施用激活丙酮酸激酶r(pk-r)的治疗性组合物来治疗血红蛋白病病状的方法。


背景技术：

4.血红蛋白是红细胞(rbc)中结合氧的四聚蛋白。氧与血红蛋白分子的四个血红素结合。每个血红素都含有卟啉和亚铁，亚铁通过铁-氧键可逆地结合氧。四个连续氧分子中的每一个与血红素的结合需要的能量比先前结合的氧分子少。血红蛋白有两个α亚基和两个β亚基对称排列形成二聚体，二聚体在氧释放期间旋转以打开中心水腔。在第三个氧和第四个氧的结合之间发生变构转变，包括α-β二聚体的移动。在血液中，血红蛋白在两种变构结构之间处于平衡：脱氧(紧张状态或“t”状态)和氧合(松弛或“r”松弛)状态。
5.用于影响血红蛋白变构平衡(例如，通过增加氧对血红蛋白的亲和力)的药物组合物可用于治疗各种疾病或病状。例如，增加血红蛋白对氧气的亲和力可以提供多种医学益处，诸如治疗镰状细胞贫血或其他血红蛋白病。例如，增加hgbs的氧亲和力(即减少脱氧)的治疗方法可能会减少聚合物的形成、细胞膜的变化以及与某些血红蛋白病病状(诸如scd)相关的临床后果。
6.血红蛋白病是各种各样影响血红蛋白的罕见遗传病症，血红蛋白是rbc中负责运输血液中的氧的含铁蛋白。正常血红蛋白是由两个β-珠蛋白和两个α-珠蛋白蛋白亚基组成的四聚体。β-珠蛋白或α-珠蛋白基因中的突变可引起这些亚基的产生或结构的异常，所述异常可导致rbc的毒性或携氧能力降低。这些突变引起的病症统称为血红蛋白病。
7.scd是最常见的血红蛋白病类型。scd是一种常见的单基因病症。scd是一种由血红蛋白s(hbs)即
□‑
珠蛋白基因的突变形式与另一个hbs拷贝，或不同的缺陷性
□‑
珠蛋白基因变体的遗传引起的隐性疾病。由于其慢性性质，在终身管理、住院和相关病态的直接成本以及患者和护理人员终身收入损失和生产力降低的间接成本两个方面，scd的经济负担高。scd的当前治疗性治疗不充分。急性疼痛性voc事件是常见的，如scd患者中自我报告的，发生在大约55％的天数中。管理疼痛性voc的支持性护理需要使用阿片类药物，阿片类药物在
管理疼痛方面有效，但很容易上瘾。对大多数患者来说，治疗牵涉长期使用羟基脲或hu(一种口服化疗)，它刺激胎儿血红蛋白或hbf的产生，并减少镰状血红蛋白或hbs聚合和随之的rbc镰状化。虽然诱导hbf在治疗上有效，但是hu可阻抑骨髓功能并引起出生缺陷。尽管鉴于scd的后果，认为hu具有可接受的治疗指标，但hu由于安全性问题和副作用，未得到充分利用。沃克罗塔(voxelotor)和立赞利珠单抗(crizanlizumab)最近的批准将改进治疗范式，但仍处于采用的早期阶段，并且两种药物都没有提供解决基础贫血和减少临床后遗症诸如voc的完整解决方案。图1说明了scd的某些治疗策略和已批准的治疗模式。
8.β地中海贫血是一种罕见的遗传疾病，估计患病率在美国和欧洲大约有20,000名患者而全球大约有300,000名患者。在β地中海贫血中，β珠蛋白基因中的突变引起产生缺陷性β珠蛋白亚基或不存在β珠蛋白，这导致rbc携氧总量减少以及α血红蛋白亚基过量，α血红蛋白亚基聚集并引起rbc毒性和破坏，或溶血。这些患者的脾脏常常因慢性溶血率高而肿大。慢性溶血导致胆红素水平升高，胆红素可在胆囊中形成结石，可引起梗阻。为了抵偿这些患者的贫血，骨髓，即典型的rbc产生组织，扩张，并且可以发生在骨髓外，器官诸如肝脏中的rbc产生。这种骨髓扩张可导致骨骼畸形。
9.鉴于当前scd和β地中海贫血的护理标准，医学上明确需要具有适当安全性和功效性特性的无创的、疾病缓解疗法。虽然治疗scd的新型治疗方法越来越多，但对这些患者的治疗选择仍然有限并且仍然需要提高疗效和耐受性的药物来管理患有这种疾病的患者。由于scd的进展性特性，缓解疾病但不影响小儿生长和发育的早期干预是需要的。新兴的scd治疗目标是疾病的机制(hbs聚合)或rbc变形的下游后果(例如血管闭塞)或潜在的疾病原因(血红蛋白突变)；然而，这些治疗策略的结果和适用性有限，并且需要对大多数scd患者而言安全、有效且可获得的疾病缓解疗法。尽管有当前可用的治疗选择，但仍有大量需求未得到满足，因为大多数scd患者发病率显著较高，生活质量下降，终身残疾且平均预期寿命比未受影响的成年人低25至30岁。


技术实现要素：

10.化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(“化合物1”)可以每日施用一次(qd))。尽管在施用几小时内在人类受试者血液中观察到的浓度处于低于ac
50
的浓度，但在足以支持每日一次(qd)给药的时间段内观察到化合物1的药理响应。例如，图43示出了在施用单剂量的化合物1后在人类中化合物1的血液浓度的药代动力学(pk)测量(圆圈)和在这些受试者中测量的2，3-dpg的所得浓度的药效学测量(正方形)。观察到最大2，3-dpg减少发生在给药后约16至24小时并持续到施用后约48小时。另外，在每日一次和每日两次施用化合物1后，在人类中观察到的血红蛋白氧亲和力的增加是相当的。化合物1出乎意料地增加了人类中的血红蛋白氧亲和力，每日一次和每日两次施用达到相当的程度。图42是显示每日一次和每日两次给药，对施用化合物1后24小时测量的氧亲和力(作为p50测量)的影响的图表。化合物1的pk特性为双相型，终末半衰期为约12-14小时。总的来说，在hv中观察到的药效学响应惊人地持久，在血浆cmax后很长时间观察到2，3-dpg降低，表观pd半衰期支持qd给药。因此，在一些实施方案中，治疗方法包括向有此需要的患者，诸如诊断患有血红蛋白病诸如镰状细胞病(scd)的患者，每日一次(qd)施用化合物1(即，不是每天两次或bid)
或其药学上可接受的盐。
[0011]
在实施例12的临床试验中，在健康受试者中给药14天后，第1天和第14天观察到的清除率不变，提供了以下临床证据：在所测剂量下，化合物1的pk与非时间相关性并且不是自动诱导或自动抑制的底物。
[0012]
本公开的一个方面涉及治疗患者，诸如诊断为患有血红蛋白病的患者的方法，其包括施用治疗有效量的pkr激活化合物或其药学上可接受的盐。如本文所用，“pkr激活化合物”是使用实施例2中描述的发光测定法测得ac
50
值小于小于1微摩尔的化合物，或其药学上可接受的盐和/或其他固体形式。
[0013]
化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(“化合物1”)是一种选择性、口服生物可利用的pkr激活化合物，它减少2，3-dpg，增加atp，并且在疾病模型中具有抗镰状化作用，相对于临床前毒性具有广泛的治疗界限。
[0014][0015]
化合物1是重组野生型(wt)pkr的变构激活剂和突变酶pkr r510q，是北美最普遍的pkr突变之一。pkr以二聚体和四聚体状态两者存在，但作为四聚体的功能最有效。丙酮酸激酶r(pkr)是在rbc中表达的丙酮酸激酶的同种型，并且是糖酵解途径中的限速酶。化合物1稳定pkr的四聚体形式，从而降低其底物磷酸烯醇丙酮酸(p)的米-曼二氏常数(michaelis-menten constant，km)。
[0016]
化合物1可以每天口服施用一次(qd)给有此需要的患者，这在需要终身疗法的患者群体中是一种显著的益处。在随机、安慰剂对照、双盲、单个上升和多个上升剂量研究中评价化合物1，以评估在单次上升剂量(sad)队列和多次上升剂量(mad)队列中的健康志愿者中化合物1的安全性、药代动力学和药效学。在200、400、700和1000mg剂量下评价四个健康sad队列，并且四个健康mad队列在14天内以qd或bid给药(100mg bid、200mg bid、300mg bid和400mg qd)接受200至600mg的总日剂量。
[0017]
在一些实施方案中，化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(“化合物1”)可用于单次每日(qd)施用以增加人类受试者的红细胞(rbc)中的血红蛋白氧亲和力，如通过在所述化合物施用后24小时在所述rbc中测量的降低的p50(在50％血红蛋白饱和度下的po2)所测量的。在一些实施方案中，化合物1可用于连续14天每日(qd)施用以增加人类受试者红细胞(rbc)中的血红蛋白氧亲和力，如通过在向所述人类受试者qd施用所述化合物14天后所述rbc中测量的降低的p50(在50％血红蛋白饱和度下的po2)所测量的。在一些实施方案中，化合物1可用于使所述人类受试者血液中的2，3-dpg浓度在所述化合物施用后24小时降低至少30％。在一些实施方案中，化合物1可用于使所述人类受试者血液中的atp浓度在连续14天向所述受试者每日一次施用所述化合物后增加至少40％。在一些实施
方案中，化合物1可用于在向所述试者施用所述化合物后72小时同时激活pkr，增加atp，减少2，3-dpg和增加所述受试者血液中的氧亲和力(p50)。
[0018]
在一些实施方案中，化合物1可施用于诊断患有镰状细胞病(scd)的人类受试者。在一些实施方案中，人类受试者是至少12岁的小儿scd患者。在一些实施方案中，人类受试者至少18岁。
[0019]
在一些实施方案中，化合物1可用于治疗经诊断为下列血红蛋白基因型之一的人类受试者：hgb ss、hgb sβ+-地中海贫血、hgb sβ0-地中海贫血或hgb sc。
[0020]
在一些实施方案中，化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮用于治疗具有hgb ss或hgb sc血红蛋白基因型的人类受试者的镰状细胞病。
[0021]
在健康志愿者的rbc中，化合物1展示出2，3-dpg减少和atp增加。另外，2，3-dpg减少与用单剂量和多剂量化合物1增加氧亲和力相关。在sad队列中，健康受试者2，3-dpg水平的最大下降一般发生在第一剂量后约24小时，降低持续到给药后约48-72小时。在14天的化合物1给药后，这些pd效应随同atp增加高于基线而得以维持。相对于接受安慰剂的受试者，接受单剂量化合物1的健康志愿者经历给药后24小时测量的p50减少。在mad队列中，第14天受试者的2,3-dpg的最大下降为基线的55％(中位数)，并且2，3-dpg水平在第1天达到最低点并稳定，直到第14天最后剂量后72小时才恢复到基线水平。相对于接受安慰剂的受试者，接受化合物1的mad队列中的健康受试者经历血液2，3-dpg水平下降。值得注意的是，在第14天停止化合物1给药后，这些效应维持一天以上。另外，14天每日两次给药后测定的mad队列中健康受试者的p50(在50％血红蛋白饱和度下的po2)在测试的所有剂量水平下都降低(降低的中位数范围为～3-5mmhg)。另外，测量的mad队列健康受试者的血液atp水平在第14天相对于基线水平升高，并且(值得注意的是)在最后一个剂量约60小时后保持升高并在72小时后恢复到基线。
[0022]
在接受单剂量化合物1的健康志愿者中，剂量归一化cmax和auc随着剂量增加≥700mg而增加，表明在测试的最高剂量下暴露量存在大于剂量比的增加(图31a)。化合物1在暴露量和非时间相关性的pk方面表现出剂量线性增加，其中pk参数(cmax，auc)在14天的qd给药后相似(图31b)并且在所有剂量水平下在给药24小时后(2，3-dpg减少，p＜0.0001)和给药14天后(atp增加，p＜0.0001)观察到化合物1的pd活性。这种pd响应的生物学后果是在化合物1给药24小时内氧亲和力增加(p50减少，p＜0.0001)并且到给药期的第4天在所有化合物1剂量队列中绝对网织红细胞计数减少(p＜0.0001)且血红蛋白水平略有提高(ns)。化合物1施用3天使网织红细胞减少(p＜0.0001)，连同血红蛋白增加(ns)。减少的网织红细胞计数可恢复健康志愿者中增加的rbc寿命。
[0023]
申请人还发现，在用化合物1治疗的受试者中观察到的氧亲和力的增加与2，3-dpg的减少相关。即，在施用化合物1后观察到的2，3-dpg的减少(自变量)与在实施例12的临床试验中在接受化合物1的人中观察到的氧亲和力的增加(因变量)相关。在sad和mad队列中，对于接受不同剂量化合物1的健康受试者观察到2，3dpg与p50水平之间呈正相关关系：在用化合物1治疗的受试者中氧亲和力的增加与2，3-dpg的减少相关。然而，观察到的2，3dpg调节不直接跟踪健康受试者在施用单剂量化合物1(400mg)后的血浆药代动力学(化合物1的血液浓度)，其中药效学最大值(即在～24小时时2，3-dpg浓度的最小值)出现在cmax(即在
～1-2小时时pk曲线的最大值)后近24小时。
[0024]
在随机、安慰剂对照、双盲、单个上升和多个上升剂量研究中评价化合物1，以评估在镰状细胞病(scd)患者中化合物1的安全性、药代动力学和药效学。化合物1在测试的scd患者中耐受良好并且具有有利的生物学效应，有药效学活性转化为增加的氧亲和力，镰状化点向较低氧张力偏移，以及与治疗前基线值相比在低po2值下镰状rbc改善的膜可变形性的证据。基于健康志愿者研究中的安全性和pk/pd特性，最初在scd患者(n＝7)中评价单次700mg单剂量。所有患者均具有hb ss基因型和轻度voc病史，尽管接受了羟基脲疗法但仍具有持久性贫血和持续性溶血。
[0025]
在scd患者中在单个700mg剂量的化合物1后观察到增加的血红蛋白o2亲和力(下降的p50)，并且在scd患者中增加的血红蛋白o2亲和力与2，3-dpg的减少相关。在施用化合物1后24小时观察到最大2，3-dpg和atp响应。单剂量化合物1引起经化合物1治疗的参与者的hb增加0.5g/dl(范围：0.3，0.9)，而经安慰剂治疗的参与者的hb下降0.4g/dl(范围：-0.5，-0.3)(hb下降可能是由于静脉切开放血)。安慰剂患者的hb下降归因于在前24小时内进行静脉切开放血以获得血液用于pk/pd测量。因此，在接受化合物1或安慰剂的参与者中，平均hb差为～0.9g/dl。在化合物1给药后72小时，在经化合物1治疗的参与者中还观察到乳酸脱氢酶(ldh)下降，表明rbc溶血减少。化合物1降低了镰状化点(hbs聚合引起rbc变硬时的o2分压)并且改善了镰状rbc o2依赖性可变形性，正如在氧扫描(oxygenscan)中测量的最小伸长指数(eimin)的增加所证明的。化合物1增加了测试的所有参与者中的o2亲和力(降低p50)。化合物1改善了镰状rbc中的克分子渗透压浓度依赖性膜功能，如用渗透压扫描(osmoscan)测量的o
min
和o
hyper
的提高(即，向正常值右移)所证明的。渗透压扫描评价跨克分子渗透压浓度梯度的rbc膜功能(可变形性)。scd rbc的渗透压扫描与从健康rbc获得的有以下区别：(1)o
min
减小(向左偏移)，反映表面/体积比增加，(2)ei
max
/o
max
比率减小(向左偏移)，反映可变形性降低和离子通道功能差，以及(3)o
hyper
减小(向左偏移)，反映rbc粘度增加和rbc体积下降。这些影响是短暂的，在单剂量化合物1后3至7天恢复到基线。接受单剂量化合物1的scd受试者经历hbs氧亲和力增加，得到与hba相似的氧解离曲线，而且随着eimin的增加，经历镰状化点(pos)左移。
[0026]
在诊断患有scd的患者中，化合物1改善了氧亲和力，降低了镰状化点并改善了可变形性。化合物1还改善了膜功能，通过在剪切应力下对渗透梯度的响应改善得以证明。单剂量化合物1引起当观察到最大pd效应时发生血红蛋白、rbc和网织红细胞计数改善。这些改善表明，在用化合物1治疗后，观察到持续的2，3-dpg减少和atp产生增加。
[0027]
化合物1在临床试验中耐受良好并且尚未显示出抑制芳香酶的证据，芳香酶是一种参与将睾酮转化为雌激素的酶，可容许在大范围的患者(包括小儿和成人群体)中给药，因为它不会导致影响小儿生长和发育的激素改变。另外，化合物1展示缺乏细胞色素p450或cyp抑制或诱导，从而降低由于cyp通过血浆浓度的变化对其他药物的药代动力学的影响引起的药物-药物相互作用的风险。
[0028]
在一些实施方案中，可以配制包含化合物1的药物组合物，用作治疗scd的口服、每日一次、潜在疾病缓解疗法。化合物1可以通过pkr激活影响两个关键途径来调节rbc代谢：2，3二磷酸甘油酸(2，3-dpg)的减少，增加氧亲和力；以及atp的增加，可改善rbc和膜的健康和完整性，从而减少rbc溶血且增加寿命。在一些实施方案中，多模式治疗方法可包括施用
化合物1，以通过增加rbc存活率来提高血红蛋白水平并通过减少rbc镰状化和溶血来降低voc。在一些方法中，在早期施用化合物1以缓解scd，潜在地防止终末器官损伤，减少住院，并改善患者的整体健康和生活质量。在一些实施方案中，治疗方法包括施用治疗有效量的化合物1，以经由多模式途径通过减少2，3-dpg和增加atp调节rbc代谢。
[0029]
一些实施方案提供了包含化合物1的口服、每日一次剂型(例如，片剂或胶囊)，用于通过降低2，3-dpg血浓度，增加血红蛋白水平和/或增加细胞内atp来增加血红蛋白氧亲和力的疗法中，在整个治疗过程中每日重复施用后对性激素没有显著影响(例如，没有芳香酶抑制活性)或诱导其自身代谢。
[0030]
即使是单剂量化合物1也引起有利的生物学效应，包括：(1)在低氧浓度下改善氧亲和力，降低镰状化点和改善可变形性；(2)改善膜功能，通过在剪切应力的存在下对渗透梯度的响应改善得以证明；(3)在观察到最大pd效应时血红蛋白和rbc增加而网织红细胞减少，表明持续的2，3-dpg减少和atp产生增加可改善溶血性贫血和表征scd的voc的频率。另外，化合物1改善scd患者的rbc可变形性，增加氧亲和力和改善克分子渗透压浓度依赖性膜功能。单剂量化合物1在scd患者中具有良好的安全性特性。
附图说明
[0031]
图1是引起血红蛋白病的血红蛋白突变的图解，治疗镰状细胞病的当前治疗策略的总结。
[0032]
图2是一对比较scd rbc和健康rbc中的2，3-dpg和atp水平的图表。
[0033]
图3是显示pkr激活与镰状细胞病(scd)临床后果减少的关系的示意图。
[0034]
图4是化合物1的拟议作用机制图解。
[0035]
图5是引起血红蛋白病的血红蛋白突变的图解。
[0036]
图6是通过绘制血红蛋白饱和度(百分比)与氧分压(mmhg)之间的关系来显示氧合血红蛋白解离曲线和调节因子的图表。
[0037]
图7是显示用化合物1激活重组pkr-r510q的图表，绘制了归一化速率与磷酸烯醇丙酮酸(pep)浓度的关系(实施例3)。
[0038]
图8是显示在实施例3的酶测定法中化合物1对重组pkr-r510q的激活的数据图表。
[0039]
图9是显示用化合物1治疗的人红细胞中的pkr激活的数据图表(实施例4)。
[0040]
图10和图11是显示用化合物1治疗对来自scd患者的rbc中的氧合血红蛋白解离的影响的数据图表(实施例5)。图10以灰度显示每个数据点，而图11以样式化的线条显示相同数据。
[0041]
图12是显示来自scd患者的红细胞在不同氧张力下血红蛋白饱和度的δ曲线的数据图表(实施例5)。测量间隔为1mmhg。
[0042]
图13是显示在低氧条件下化合物1对人scd细胞镰状化的影响的数据图表(实施例5)。
[0043]
图14是显示化合物1对来自健康供体和scd供体的rbc的氧亲和力的影响的图表。
[0044]
图15是显示化合物1对scd rbc镰状化的影响的图表。
[0045]
图16是显示化合物1对hbs rbc中的p
50
的影响的图表。
[0046]
图17显示如通过氧扫描测量的，化合物1对hbs rbc伸长指数的影响的图表。
[0047]
图18a(研究1)和图18b(研究2)各自是显示在用化合物1每日一次(qd)口服治疗7天后观察到的小鼠血液中2，3-dpg水平的变化的图表(实施例8)。
[0048]
图19是显示在用化合物1每日一次(qd)口服治疗7天后观察到的小鼠血液中2，3-dpg水平的变化的图表(实施例8，研究2)。
[0049]
图20a(研究1)和图20b(研究2)是在用化合物1每日一次(qd)口服治疗7天后测量小鼠红细胞中atp浓度的数据图表(实施例8)。
[0050]
图21是显示化合物1对非人灵长类动物中atp水平的影响的图表。
[0051]
图22是显示化合物1对非人灵长类动物中2，3-dpg水平的影响的图表。
[0052]
图23a和图23b各自是显示在scd鼠类模型中用化合物1口服治疗7天后rbc中的氧饱和度的数据图表(实施例11)。
[0053]
图24a和图24b各自是显示在scd鼠类模型中用化合物1口服治疗7天后rbc中的氧饱和度变化的数据图表(实施例11)。
[0054]
图25是显示用化合物1口服治疗7天后scd鼠类模型中的镰状细胞百分比的数据图表(实施例11)。
[0055]
图26是显示用化合物1口服治疗7天后scd鼠类模型中的细胞中的网织红细胞计数的数据图表(实施例11)。
[0056]
图27展示与hgb a rbc相比hgbs rbc的2，3-dpg和氧亲和力的图表。
[0057]
图28是用于评估化合物1的安全性和pk/pd的sad/mad试验的总结。
[0058]
图29是描绘在健康志愿者中单剂量化合物1后化合物1的血浆浓度的图表。
[0059]
图30是在接受单剂量化合物1或安慰剂的健康志愿者中随时间推移测量的血液2，3-dpg水平的图表。
[0060]
图31a是从实施例12中描述的化合物1的单个上升剂量(sad)人类临床研究中获得的数据表，显示了单剂量化合物1的药代动力学(pk)性质。值以cmax、auc
0-24
和半衰期的几何平均值[cv％]；和tmax的中位数[cv％]呈现。
[0061]
图31b是从实施例12中描述的化合物1的多个上升剂量(mad)人类临床研究中获得的数据表，显示了化合物1以qd或bid给药14天内的非时间相关性药代动力学(pk)性质。值以cmax、auc
0-τ
、第14天/第1天cmax比率和第14天/第1天auc
0-τ
比率的几何平均值[cv％]；和tmax的中位数[cv％]呈现。
[0062]
图32是在接受单剂量化合物1或安慰剂的健康志愿者中在给药后24小时测量的血液2，3-dpg水平的图表。
[0063]
图33是在接受单剂量化合物1或安慰剂的健康志愿者中在给药后24小时测量的p50值的图表。
[0064]
图34是在接受单剂量化合物1或安慰剂的健康志愿者中在给药前和给药后24小时测量的p50值的图表。
[0065]
图35和图36是在接受日剂量的化合物1或安慰剂14天的健康志愿者中随时间推移测量的血液2，3-dpg水平的图表。
[0066]
图37是在接受日剂量的化合物1或安慰剂14天的健康志愿者中在第14天测量的血液2，3-dpg水平的图表。
[0067]
图38是在接受日剂量的化合物1或安慰剂14天的健康志愿者中在第14天测量的
p50值的图表。
[0068]
图39是在接受日剂量的化合物1或安慰剂14天的健康志愿者中在给药前和第14天测量的p50值的图表。
[0069]
图40是在接受日剂量的化合物1或安慰剂14天的健康志愿者中在第14天测量的血液atp水平的图表。
[0070]
图41是显示化合物1对健康志愿者rbc中的atp水平的影响的图表。
[0071]
图42是显示在接受化合物1或安慰剂的健康志愿者中在剂量前以及第14天剂量后24小时(sad队列)和剂量后24小时(mad队列)测定的p50值的差的图表。
[0072]
图43是在施用单剂量化合物1(400mg)后在第一(左侧)轴上绘制在健康志愿者(hv)患者中测量的化合物1的血液浓度(ng/ml)和在第二(右侧)轴上绘制在这些hv患者中测量的2，3-dpg浓度(微克/ml)的图表。
[0073]
图44是在sad和mad队列中的健康志愿者中观察到的2，3-dpg水平和p50值的散点图。
[0074]
图45是在用化合物1治疗的受试者观察到的2，3-dpg水平和p50值的散点图。
[0075]
图46是描绘在健康志愿者rbc中每日一次(qd)剂量的化合物1的预测pd响应的模型的图表。
[0076]
图47是scd患者和健康志愿者在单次700mg剂量的化合物1后，随时间推移，化合物1的平均血浆浓度的图表。
[0077]
图48是scd患者在单次700mg剂量的化合物1或安慰剂后，随时间推移，2，3-dpg和atp血液浓度的图表。
[0078]
图49是在健康志愿者和scd患者中在单次700mg剂量的化合物1之前和24小时后的氧亲和力(p50)的图表。
[0079]
图50是在健康志愿者和scd患者中在施用化合物1之前和之后观察到的2，3-dpg水平和p50值的散点图。
[0080]
图51描绘了显示scd患者中在单剂量化合物1或安慰剂后血液实验室参数从基线的变化的四张图表。
[0081]
图52是一对描绘单剂量化合物1或安慰剂对scd患者氧扫描的影响的图表。
[0082]
图53是一对描绘单剂量化合物1或安慰剂对scd患者氧亲和力(po
50
)的影响的图表。
[0083]
图54是一对描绘单剂量化合物1或安慰剂对scd患者渗透压扫描的影响的图表。
[0084]
图55a是scd受试者中在单剂量化合物1之前和之后血红蛋白氧饱和度与po2的关系的图表。
[0085]
图55b是scd受试者中在单剂量化合物1之前和之后伸长指数(ei)与po2的关系的图表。
[0086]
图56是用于调查化合物1在scd患者中的安全性和功效的一项2/3期、随机、双盲、安慰剂对照的全球研究(praise)的总结。
[0087]
图57是显示在实施例17的生物利用度实验中随时间推移在大鼠中测量的以不同组合物施用的化合物1的浓度的图表。
[0088]
图58是显示如实施例17所述，非人灵长类动物以不同组合物施用的化合物1的暴
露量(24小时内随时间推移以ng/ml计的化合物1血浆浓度)的图表。
具体实施方式
[0089]
pkr激活化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(化合物1)：
[0090][0091]
是一种选择性、口服生物可利用的pkr激活化合物，它减少2，3-dpg，增加atp，并且在疾病模型中具有抗镰状化作用，相对于临床前毒性具有广泛的治疗界限。化合物1是pkr的有效激活剂和rbc的多模式代谢调节剂。激活pkr同时降低2，3-dpg浓度，从而增加血红蛋白-氧亲和力并减少镰状化，同时还增加细胞内atp，从而改善rbc健康并减少溶血或rbc死亡。
[0092]
化合物1可鉴定为式i的pkr激活化合物：
[0093][0094]
(包括，例如，化合物1以及化合物1与化合物2的混合物)，使用实施例2中描述的发光测定法，具有小于1μm的ac
50
值。
[0095]
化合物1可能对scd和其他血红蛋白病(包括β地中海贫血)患者表现出重大进展。pkr激活化合物，诸如1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，或其药学上可接受的盐，可用于治疗诊断患有诸如scd的血红蛋白病的患者的药物组合物中。本发明部分基于这样的发现，即pkr的激活可以通过减少脱氧-hgbs和溶血来靶向镰状化。在诊断患有血红蛋白病(诸如镰状细胞病)的患者中，化合物1减少2，3-dpg，增加rbc中的atp并增加血红蛋白的氧亲和力(正如通过在50％血红蛋白饱和度下氧分压或p50左移所测量的)。
[0096]
化合物1经由多模式方法通过减少2，3-dpg和增加atp调节rbc代谢。已经观察到降低2，3-dpg浓度会使血红蛋白-氧亲和力正常化并减少体外rbc镰状化。减少rbc镰状细胞有可能改善患者的血红蛋白水平和减少他们的voc。化合物1还可以通过增加atp来改善rbc膜的健康和完整性，从而产生更具柔性的rbc膜，以改善血流量并潜在地减少voc的发生。通过增加atp来改善rbc膜的健康在β地中海贫血的环境中尤其有用。在体外数小时内以及在健康志愿者和scd患者体内在24小时内观察到活性的快速起效，包括跨氧梯度(氧扫描)和跨克分子渗透压浓度梯度(渗透压扫描)的rbc可变形性改善，分别表明对rbc镰状化和rbc膜
健康的影响。化合物1影响相对快速的起效与当前治疗方案形成对比，申请人认为可能需要更长的时间来证明抗镰状化作用，hb和rbc计数的改善，或减少网织红细胞计数。
[0097]
申请人发现化合物1可每日口服施用一次。利用从健康志愿者和scd患者获得的结果的药代动力学/药效学或pk/pd的剂量-暴露量-响应分析支持每日一次给药，不需要广泛监测或剂量调整，潜在地改善scd患者历史上看到的依从性问题。
[0098]
化合物1激活pkr
[0099]
丙酮酸激酶r(pkr)是在rbc中表达的丙酮酸激酶的同种型并且是糖酵解中的关键酶。pkr通过糖酵解起到作为代谢流量调节剂的主要作用。激活pkr提供减少2，3-dpg和增加atp的潜力，这样将会减少hbs聚合引起的rbc镰状化和细胞膜损伤。如图2所示，与正常健康的rbc相比，scd rbc中的2，3-dpg水平显著更高且atp水平显著更低。通过2，3-dpg的减少和atp的增加，pkr激活剂有潜力积极影响导致scd临床病理的生理变化并对scd疾病产生比其他直接缓解hbs的药剂更广泛和更显著的影响，否则可能不会改善rbc健康和膜完整性。
[0100]
本发明部分基于这样的发现，即pkr的激活可以通过减少脱氧-hgbs和溶血来靶向镰状化。靶向溶血可通过改善rbc膜完整性来实现。本公开的一个方面是认识到激活pkr可以减少2，3-二磷酸甘油酸(2，3-dpg)，从而导致脱氧-hgbs减少(并因此减少镰状化)，以及可以增加atp，从而促进膜健康和减少溶血。本公开的另一个方面是认识到激活pkr可以减少2，3-二磷酸甘油酸(2，3-dpg)，从而抑制hgb脱氧/增加hgbs氧亲和力并导致脱氧-hgbs减少(并因此减少镰状化)，以及可以增加atp，从而促进膜健康和减少溶血。因此，在一个实施方案中，pkr激活(例如，通过向诊断患有scd的患者施用治疗有效量的pkr激活化合物)经由2，3-二磷酸甘油酸(2，3-dpg)水平的降低来减少rbc镰状化，这转而减少镰状hgb(hgbs)聚合成使细胞变形的刚性聚集体。此外，在一些实施方案中，pkr激活可经由增加三磷酸腺苷(atp)的水平而有助于整体rbc膜完整性，预计这会减少引起scd患者急性疼痛危象和贫血的脉管阻塞性事件和溶血事件。
[0101]
pkr激活化合物，诸如化合物1，可用于促进糖酵解途径中的活性。作为催化糖酵解最后一步的限速酶，pkr直接影响rbc的代谢健康和主要功能。pkr激活化合物(例如，化合物1)可用于减少2，3-dpg和增加atp。pkr激活化合物(例如，化合物1)也可用于增加rbc中的hgb氧亲和力。本公开部分基于这样的发现，即pkr激活是scd的一种治疗模式，借此经由减少2，3-dpg和增加atp水平来减少hgbs聚合及rbc镰状化和溶血。
[0102]
本公开的一个方面是基于pkr在控制rbc中的糖酵解速率中的作用，靶向pkr激活以降低2，3-dpg水平。pkr活性的增加往往会使磷酸烯醇丙酮酸上游的有机磷酸前体(包括2，3-dpg)耗竭。在临床前研究和健康志愿者中已经证明，随着pkr激活，2，3-dpg减少(例如，图18a、图18b、图19、图22、图30、图35、图36、图37、图43、图44、图45、图48和图50)。另外，在这些相同的研究(例如，图20a、图20b、图21、图40、图41和图48))3中已经观察到pkr激活会增加atp酶。在糖酵解期间连同atp一起生成的nadh对于将高铁血红蛋白还原为hb至关重要，从而降低氧化应激的潜力。此外，atp在维持脂质不对称和跨rbc膜的离子梯度方面发挥作用。因此，升高atp水平可能具有广泛的有益作用。因此，pkr的激活提供了2，3-dpg效应(即减少hgbs聚合引起的细胞膜损伤)的潜力，所述效应受atp对膜完整性的支持而增进。正是经由这些变化，pkr激活剂才能够积极影响导致scd临床病理的生理变化(图3)。另一方面，本公开涉及一种改善hgb ss或hgb sb
0-地中海贫血的scd患者(例如，≥12岁)中的贫血
和与贫血相关的并发症的方法。
[0103]
如图4所示，rbc代谢利用糖酵解以便生成atp。2，3-dpg是糖酵解途径的中间体并且在某些生理条件下在rbc中积聚。2，3-dpg在血红蛋白结合氧的能力中起重要作用。2，3-dpg选择性地与脱氧血红蛋白结合，使氧更难结合血红蛋白且更有可能释放到邻近组织。2，3-dpg是反馈回路的一部分，其可以帮助防止在最有可能发生的条件下的组织缺氧。在低组织氧浓度的条件下，诸如高原、气道阻塞或充血性心力衰竭，rbc激活糖酵解途径的分支即lubering-rappoport分流以生成更多的2，3-dpg。2，3-dpg的积聚降低了血红蛋白对氧的亲和力，最终将氧释放到最需要氧的组织中。
[0104]
pkr激活具有经由减少2，3-dpg和增加atp来减少血红蛋白镰状化和溶血的潜力。pkr激活使2，3-dpg耗竭且增加atp水平，从而增加细胞的供能。增加细胞atp可增强rbc修复膜损伤和耐受毛细血管变形的能力。结合这两种活性，pkr激活剂具有潜力降低镰状化的可能性和增加rbc通过小血管而不溶血的能力。如图4所示，pkr激动剂(例如，化合物1)的多模式作用可增加scd患者的血红蛋白水平并减少voc。实施例中描述的研究证明了化合物1的作用机制。
[0105]
化合物1增加血红蛋白氧亲和力
[0106]
申请人发现化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(“化合物1”)或其药学上可接受的盐增加血红蛋白的氧亲和力，如通过在50％血红蛋白饱和度下的氧分压(p50)左移所测量的。p50的降低表明血红蛋白对氧的亲和力增加。
[0107]
申请人已经发现了一种增加红细胞(rbc)中血红蛋白a(hgba)的氧亲和力的方法。一种治疗方法，可以包括以有效增加hba的氧亲和力的量向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。一种治疗方法，可以包括以有效增加hgba的氧亲和力的量向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0108]
申请人已经发现了一种增加红细胞(rbc)中血红蛋白a(hgba)的氧亲和力的方法。在人类临床研究中，化合物1表现出剂量线性和非时间相关性的pk，并且在所有剂量水平下在给药24小时后(2，3-dpg减少，p＜0.0001)和14天后(atp增加，p＜0.0001)后观察pd活性。接受化合物1的健康志愿者相对于基线和相对于接受安慰剂的健康志愿者经历p50减少，反映了氧亲和力的增加，而接受安慰剂的受试者则没有。这种pd响应的生物学后果是在化合物1给药24小时内氧亲和力增加(p50减少，p＜0.0001)并且到给药期的第4天在所有化合物1剂量队列中绝对网织红细胞计数减少(p＜0.0001)且血红蛋白水平略有提高(ns)。在单剂量之后和在化合物1给药14天后，健康受试者中血红蛋白a(hgba)对氧亲和力的增加可以通过氧合血红蛋白解离曲线(p50；50％的血红蛋白被o2饱和时的o2分压)看到。在单个上升剂量(sad)和多个上升剂量(mad)队列中都观察到相对于基线，2，3-dpg和p50的平均下降和atp的平均增加。在单剂量化合物1的24小时内，观察到2，3-dpg随着p50相应增加而减少。接受化合物1的健康志愿者(具有正常血红蛋白或hgba)经历p50相对于基线的变化(下降)，而接受安慰剂的受试者则没有。在sad队列中，受试者的p50(在50％血红蛋白饱和度下的po2)
是在给药后24小时测定的。在测试的所有剂量水平下，单剂量化合物1后24小时测量的pp50值都降低(中位数降低范围为～3-5mmhg)。在mad队列中，在第14天测定受试者的p50(在50％血红蛋白饱和度下的po2)。在测试的所有剂量水平下，在每日一次或两次给药14天后测量的p50值都降低(中位数降低范围为～3-5mmhg)。
[0109]
在一些实施方案中，一种治疗方法包括以有效增加来自患者的rbc的氧亲和力的量向患者施用化合物1(例如，如通过在向患者施用化合物1后24小时采集的血样的p50降低所测量的)。在一些实施方案中，一种治疗方法可以包括以有效地使施用化合物1后24小时测量的p50p50(在50％血红蛋白饱和度下的po2)相对于基线降低超过0.2mmhg(平均绝对变化)的量向患者施用化合物1，包括使患者的有效p50在施用化合物1后24小时相对于基线降低1、2、3、4、5或更多mmhg(包括降低约2.9、3.4、4.9和5.1mmhg)。在一些实施方案中，一种治疗方法包括施用化合物1，接着在施用化合物1后24小时测量患者中p50相对于基线的下降(例如，来自血液样品)，反映氧亲和力的增加。在一些实施方案中，由于缺乏细胞色素p450诱导和延长的药效学作用半衰期，该化合物以qd方案服用。
[0110]
一种治疗诊断患有血红蛋白病的患者的方法，可以包括以有效增加患者中hbs的氧亲和力或提供患者中镰状化点(pos)随着eimin增加而左移或其组合的量施用化合物1(或其药学上可接受的盐)。例如，血红蛋白病可以是镰状细胞病。在另一个实施方案中，一种治疗诊断患有血红蛋白病的患者的方法可以包括以有效增加rbc中细胞内atp水平或改善膜功能(例如在镰状细胞病或β地中海贫血中)的量施用化合物1(或其药学上可接受的盐)。
[0111]
一种治疗方法，可以包括以有效增加hbs的氧亲和力的量向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。一种增加有需要的患者体内镰状血红蛋白(hbs)的氧亲和力的方法，可以包括向所述患者施用足够量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，施用单剂量(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其盐可以增加患者中所述hbs的氧亲和力。
[0112]
一种增加有需要的患者体内镰状血红蛋白(hbs)的氧亲和力的方法，可以包括向所述患者施用足够量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐以增加scd患者血液的氧亲和力。在一些实施方案中，施用单剂量(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其盐可以增加患者中所述hbs的氧亲和力。
[0113]
在一些实施方案中，增加红细胞(rbc)中血红蛋白的氧亲和力的方法可以包括在有效减少rbc中2，3-dpg的量的条件下和时间内使rbc与一定量的化合物1接触。
[0114]
在一些实施方案中，治疗方法包括以有效增加rbc中的血红蛋白氧亲和力的量向诊断患有溶血性贫血的患者(包括诊断患有镰状细胞病的患者)施用包含化合物1的药物组合物。
[0115]
化合物1增加atp和降低血液中的2，3-dpg浓度
[0116]
本公开的另一个方面是认识到激活pkr可以减少2，3-二磷酸甘油酸(2，3-dpg)，从而抑制hgb脱氧/增加hgbs氧亲和力并导致脱氧-hgbs减少(并因此减少镰状化)，以及可以增加atp，从而促进膜健康和减少溶血。因此，在一个实施方案中，pkr激活(例如，通过向诊断患有scd的患者施用治疗有效量的化合物1或其药学上可接受的盐)经由2，3-二磷酸甘油酸(2，3-dpg)水平的降低来减少rbc镰状化，这转而减少镰状hgb(hgbs)聚合成使细胞变形的刚性聚集体。此外，在一些实施方案中，pkr激活可经由增加三磷酸腺苷(atp)的水平而有助于整体rbc膜完整性，预计这会减少引起scd患者急性疼痛危象和贫血的脉管阻塞性事件和溶血事件。
[0117]
在一些实施方案中，化合物1以药效学有效的剂量施用。在一些实施方案中，化合物1以引起患者中rbc 2，3-dpg减少(例如，在施用化合物1后6小时在患者血液中测量的)的剂量施用。2，3-dpg的减少可以通过用于定量血液中的2，3-dpg的合格lc-ms/ms方法或使用市售试剂盒来测量。在一些实施方案中，一种治疗方法可以包括以有效地使2，3-dpg水平在施用一剂化合物1之后相对于患者基线降低以下一个或多个量的量向患者施用化合物1：
[0118]
·
6小时后降低至少10％(例如，6小时后降低超过7.8％，6小时后降低至少18％，或6小时后降低约18-29％)，
[0119]
·
8小时后降低至少10％(例如，8小时后降低超过7.6％，8小时后降低至少17％，或8小时后降低约17-29％)，
[0120]
·
12小时后降低至少10％(例如，12小时后降低超过4.0％，12小时后降低至少25％，或8小时后降低约25-44％)，
[0121]
·
16小时后降低至少10％(例如，16小时后降低超过6.0％，16小时后降低至少33％，或16小时后降低约33-50％)，
[0122]
·
24小时后降低至少10％(例如，24小时后降低超过2.0％，24小时后降低至少31％，或24小时后降低约31-49％)，
[0123]
·
36小时后降低至少10％(例如，36小时后降低超过6.9％，36小时后降低至少33％，或36小时后降低约33-47％)，
[0124]
·
48小时后降低至少10％(例如，48小时后降低超过15％，48小时后降低至少29％，或48小时后降低约29-48％)，以及
[0125]
·
72小时后降低至少10％(例如，72小时后降低超过6.9％，72小时后降低至少18％，或72小时后降低约18-33％)。
[0126]
在一些实施方案中，化合物1以引起患者中rbc atp增加(例如，在施用化合物1后6小时在患者血液中测量的)的剂量施用。在一些实施方案中，一种治疗方法包括以有效地使患者atp水平相对于基线升高的量向患者施用化合物1一天或连续多天(例如，1-14天或更多天)，其中患者中atp水平保持升高，在最后一剂化合物1之后60小时，atp水平相对于基线保持升高。atp是在rbc中测量的。例如，在一些实施方案中，一种治疗方法包括连续14天以使患者atp水平相对于患者基线增加以下一个或多个量的量每日向患者施用化合物1：
[0127]
·
在第14天施用化合物1后不到6小时内增加超过0％(例如，6小时内增加至少41％，或6小时内增加约41-55％)，
[0128]
·
在第14天施用化合物1后6小时后增加超过2.8％(例如，6小时后增加至少44％，
或6小时后增加约44-48％)，
[0129]
·
在第14天施用化合物1后8小时后增加超过0％(例如，12小时后增加至少47％，或8小时后增加约47-58％)，
[0130]
·
在第14天施用化合物1后12小时后增加超过2.3％(例如，12小时后增加至少45％，或12小时后增加约45-56％)，
[0131]
·
在第14天施用化合物1后16小时后增加超过0％(例如，16小时后增加至少44％，或16小时后增加约44-57％)，
[0132]
·
在第14天施用化合物1后24小时后增加超过2.9％(例如，24小时后增加至少55％，或24小时后增加约55-64％)，
[0133]
·
48小时后增加超过4.7％(例如，48小时后增加至少52％，或48小时后增加约52-59％)以及
[0134]
·
在第14天施用化合物1后72小时后增加超过2.2％(例如，72小时后增加至少49％，或72小时后增加约49-54％)。
[0135]
在一些实施方案中，一种治疗方法可以包括连续多天(例如，14天或更多天)以有效地使2，3-dpg水平在第1天施用第一剂后24小时测试时相对于基线降低至少约25％并且在第14天施用第一剂后24小时测试时相对于基线降低至少约40％的量和剂量间隔向患者施用化合物1。例如，在一些实施方案中，一种治疗方法包括连续14天以使2，3-dpg水平相对于患者基线降低以下一个或多个量的量向患者每日施用化合物1：
[0136]
·
在第14天施用化合物1后不到6小时内增加超过7.6％(例如，6小时内增加至少42％，或6小时内增加约42-59％)，
[0137]
·
在第14天施用化合物1后6小时后增加超过10.9％(例如，6小时后增加至少44％，或6小时后增加约44-53％)，
[0138]
·
在第14天施用化合物1后8小时后增加超过1.6％(例如，12小时后增加至少44％，或8小时后增加约44-54％)，
[0139]
·
在第14天施用化合物1后12小时后增加超过1.6％(例如，12小时后增加至少42％，或12小时后增加约42-55％)，
[0140]
·
在第14天施用化合物1后16小时后增加超过5.3％(例如，16小时后增加至少42％，或16小时后增加约42-52％)，
[0141]
·
在第14天施用化合物1后24小时后增加超过10.7％(例如，24小时后增加至少44％，或24小时后增加约44-52％)，
[0142]
·
48小时后增加超过1％(例如，48小时后增加至少34％，或48小时后增加约34-44％)以及
[0143]
·
在第14天施用化合物1后72小时后增加超过7％(例如，72小时后增加至少20％，或72小时后增加约20-32％)。
[0144]
化合物1减少scd患者rbc的镰状化
[0145]
化合物1可改善rbc膜完整性。本公开的一个方面是认识到激活pkr可以减少2，3-二磷酸甘油酸(2，3-dpg)，从而导致脱氧-hgbs减少(并因此减少镰状化)，以及可以增加atp，从而促进膜健康和减少溶血。
[0146]
在一些实施方案中，本公开涉及一种改善诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的
rbc膜功能的方法，其包括向患者施用足够量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，改善rbc膜功能包括改善rbc膜对渗透梯度的响应，如omin和ohyper向正常值偏移所证明的。
[0147]
一种抑制诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的hbs镰状化的方法，可以包括向所述患者施用足够量的组合物，所述组合物包含(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，可以包括向所述患者施用治疗有效的单剂量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐，使得患者在24小时后经历镰状化点(pos)随着eimin增加而左移。一种治疗方法，可以包括以在患者中有效地引起镰状化点(pos)随着eimin增加而左移的量向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0148]
一种抑制诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的hbs镰状化的方法，可以包括向所述患者施用足够量的组合物，所述组合物包含(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0149]
一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，可以包括向所述患者施用治疗有效的单剂量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐，使得患者在24小时后经历镰状化点(pos)随着eimin增加而左移。
[0150]
在一些实施方案中，本公开涉及一种降低诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的rbc周转的方法，其包括向患者施用足够量的pkr激活化合物，例如(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0151]
用化合物1治疗小儿患者
[0152]
在一些实施方案中，治疗镰状细胞病或其他血红蛋白病的方法包括向成人和12岁及以上的小儿患者每天一次(qd)施用化合物1。在一些实施方案中，治疗镰状细胞病或其他血红蛋白病的方法包括向成人和小于12岁的小儿患者每天一次(qd)施用化合物1。在一些实施方案中，治疗镰状细胞病或其他血红蛋白病的方法包括向2-12岁的小儿患者每天一次(qd)施用化合物1。在一些实施方案中，治疗镰状细胞病或其他血红蛋白病的方法包括向成人和高达2岁的小儿患者每天一次(qd)施用化合物1。
[0153]
化合物1具有成为年轻患者的基础治疗。患者可以从早期治疗中受益，以潜在地减轻疾病的影响。例如，如实施例12中进一步描述的，化合物1尚未显示出芳香酶抑制、cyp诱导或cyp抑制的证据。
[0154]
化合物1耐受良好并且尚未显示出抑制芳香酶的证据，芳香酶是一种参与将睾酮转化为雌激素的酶，可容许在大范围的患者(包括小儿和成人群体)中给药(例如，治疗诊断患有scd或其他病状的12岁及以上患者，或治疗诊断患有scd的小于12岁的小儿患者)，因为
它不会导致影响小儿生长和发育的激素改变。芳香酶是一种由cyp19a1基因编码的酶。它位于产生雌激素的细胞的内质网中并且在许多组织中催化雄激素向雌激素转化的限速步骤。芳香酶是一种含细胞色素p-450血红素蛋白的酶复合物，它催化雌激素产生的限速步骤，即雄烯二酮和睾酮经由三个羟基化步骤转化为雌酮和雌二醇。芳香酶活性存在于许多组织中，诸如卵巢、脂肪组织、肌肉、肝脏、乳腺组织和恶性乳腺肿瘤中。循环雌激素的主要来源是绝经前妇女的卵巢和绝经后妇女的脂肪组织。芳香酶催化雄激素转化为雌酮(e1)，雌酮在颗粒细胞中被酶17β-hsd1型进一步转化为强效雌激素雌二醇(e2)。
[0155]
芳香酶是类固醇生成途径中催化包括睾酮在内的雄激素转化为雌二醇的关键酶。抑制芳香酶增加睾酮而减少雌二醇，两者都是儿童时期人类性发育的重要激素。镰状细胞病是早在6月龄时就表现出来的一种遗传病症。pkr激活剂，包括化合物1，是正在开发用于治疗镰状细胞病的有前景的试验疗法。用临床pkr激活剂ag-348(米非帕特(mitapivat))观察到芳香酶抑制(yang等人2018；grace等人2019)。不存在芳香酶抑制是旨在治疗儿童和青少年(包括患有镰状细胞病的那些)的期望特性。影响儿童和青少年中这些性激素的产生可对儿童/青少年的性成熟/发育和生长具有不利影响。基于临床前研究并且经健康志愿者连续14天接受化合物1所确认的，化合物1对雌二醇和睾酮水平没有影响。
[0156]
化合物1每日一次(qd)给药
[0157]
化合物1在以与血浆浓度没有直接相关的400mg单一日剂量给药的健康志愿者中展示出药理响应。靶接合生物标志物2，3-dpg血液水平的最大下降发生在给药后～16至24小时，即血浆cmax后很长时间，并持续到给药后～48小时(例如，图43)。此外，在给药14天后，对血红蛋白氧亲和力的下游影响与每日一次剂量400mg或每日两次剂量200mg相似(例如，图42)。
[0158]
在接受单剂量化合物1的健康志愿者中，剂量归一化cmax和auc随着剂量增加≥700mg而增加，表明在测试的最高剂量下暴露量存在大于剂量比的增加(图31a)。在接受多剂量化合物1的健康志愿者中，在测试的所有剂量水平下观察到剂量线性暴露量并且与第1天相比，第14天pk参数(cmax和auc)保持不变，表明化合物1展示出非时间相关性的药代动力学(图31b)。在多剂量(每12或24小时，连续14天)后，在测试的所有剂量水平下观察到剂量线性暴露量并且与第1天相比，第14天pk参数(cmax和auc)保持相似，表明非时间相关性的pk。化合物1驱动观察到的非时间相关性的pk的潜在特性包括缺乏观察到的化合物1在体外展示的cyp抑制或诱导，从而降低抑制或诱导其自身清除的风险以及降低药物-药物相互作用的风险。
[0159]
构成随时间推移观察到恒定暴露量的基础的是，缺乏化合物1在体外展示的cyp抑制或诱导，从而降低了抑制或诱导其自身代谢的风险，以及降低由于cyp通过血浆浓度的变化对其他药物的药代动力学的影响而引起的药物-药物相互作用的风险。scd患者通常服用许多并存药物来解决他们的疾病。身体自然会通过cyp分解许多这些药物。当这些酶的表达受另一种药物抑制或诱导时，它可以影响并存药物的功效。限制药物-药物相互作用的潜力是有效治疗该患者群体紧要的。在临床前已经观察到化合物1对cyp酶的抑制或诱导没有显著影响。根据本发明的一些化合物，包括生理上可接受的盐，表现出有利的，即低细胞色素p450(cyp)诱导潜力。cyp诱导可以影响药物分子在多次给药后的药代动力学，这可以引起共同施用药物的药物-药物相互作用(例如，通过增加共同施用的cyp3a4底物的代谢清除)，
或者由于自身诱导导致药物暴露量损失。cyp诱导可导致诱导药物的暴露量减少(如自身诱导)或由诱导酶代谢的共同施用药物的暴露量减少。cyp诱导还可导致药物代谢的增加，引起药理(活性代谢物)和毒理学(毒性代谢物)结果的改变。表征发现或开发候选药物的诱导潜力已经成为整个制药行业的重要筛选。用pxr反式激活测定法评估cyp3a4的诱导潜力。减少对cyp同工酶的抑制可转化为降低不良药物-药物相互作用的风险，不良药物-药物相互作用是一种药物对共同施用药物的正常代谢或药代动力学行为的干扰。
[0160]
化合物1尚未在体外展示出任何心律失常风险、诱变性或对受体、酶、离子通道和激酶组的非特异性结合活性的临床前证据，表明潜在的积极耐受性特性。
[0161]
用化合物1治疗血红蛋白病
[0162]
血红蛋白病是各种各样的罕见遗传病症，其中有异常血红蛋白的产生、血红蛋白量的失调或血红蛋白亚基之一的完全不存在。化合物1的作用机制支持其在许多相邻适应症中的使用。化合物1是pkr的有效激活剂，设计为通过影响关键糖酵解途径来改善rbc的代谢、功能和存活。由pkr激活引起的atp增加可改善rbc膜的健康和完整性。申请人认为，这种方法将通过增加rbc存活来改善血红蛋白相关疾病，减少β地中海贫血相关的溶血并减轻患者的主要症状。
[0163]
本公开的一个方面涉及治疗患者的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的丙酮酸激酶r(pkr)激活剂。优选地，诊断患有血红蛋白病的患者用作为pkr激活化合物的化合物治疗。pkr激活剂可以是鉴定为pkr激活化合物的化合物或使用实施例2中描述的发光测定法鉴定为具有小于1μm的ac
50
值的pkr激活组合物的组合物，或药学上可接受的盐和/或其他固体形式。本公开的一个方面涉及治疗患者，诸如诊断为患有血红蛋白病的患者的方法，其包括施用治疗有效量的化合物1或其药学上可接受的盐。治疗各种血红蛋白病病状的方法可以包括向有需要的患者施用治疗有效量的pkr激活化合物。本文提供了向诊断患有血红蛋白病的患者施用pkr激活化合物的各种附加方法。
[0164]
如本文所用，术语“血红蛋白病”意指个体的任何血红蛋白的结构、功能或表达上的任何缺陷，并且包括由任何突变引起的血红蛋白的一级、二级、三级或四级结构的缺陷，所述突变诸如β-珠蛋白基因编码区中的缺失突变或取代突变，或此类基因中引起与正常或标准条件相比产生的血红蛋白量减少的启动子或增强子的突变或缺失。术语“血红蛋白病”进一步包括由诸如疾病、化疗、毒素、毒物等外部因素引起的血红蛋白量或有效性的任何下降(无论是正常的还是异常的)，本文考虑到的β-血红蛋白病包括但不限于镰状细胞病(scd，也称为镰状细胞贫血或sca)、镰状细胞性状、血红蛋白c病、血红蛋白c性状、血红蛋白s/c病、血红蛋白d病、血红蛋白e病、地中海贫血、氧亲和力增加的血红蛋白、氧亲和力下降的血红蛋白、不稳定的血红蛋白病和高铁血红蛋白症。
[0165]
在一些实施方案中，血红蛋白病是可以通过施用治疗有效量的化合物1而引起的pkr激活进行治疗性治疗的病状。pkr活性的增强也可增加nadh水平并因此增加使高铁血红蛋白还原为血红蛋白的能力。高铁血红蛋白还原酶利用nadh，nadh和atp一样，是在糖酵解期间生成的。
[0166]
在一些实施方案中，疾病或病症选自pkd、scd、镰状细胞性贫血、地中海贫血(例如，β-地中海贫血或α-地中海贫血)、遗传性非球形溶血性贫血、溶血性贫血(例如，由磷酸甘油酸激酶缺乏症(pkd)引起的慢性溶血性贫血)、遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆
形红细胞增多症、无β脂蛋白血症(或巴森-科恩茨威格综合征)、阵发性夜间血红蛋白尿、获得性溶血性贫血(例如，先天性贫血(例如，酶病))或慢性病贫血。
[0167]
在一些实施方案中，所述方法包括施用治疗有效量的化合物1，用于治疗诊断患有选自下组的病状的患者：遗传性非球形溶血性贫血、溶血性贫血(例如，由磷酸甘油酸激酶缺乏症引起的慢性溶血性贫血)、遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症(或巴森-科恩茨威格综合征(bassen-kornzweig syndrome))、阵发性夜间血红蛋白尿、获得性溶血性贫血(例如，先天性贫血(例如，酶病))和慢性病贫血。在一些实施方案中，所述疾病或病症是遗传性非球形溶血性贫血。在一些实施方案中，所述疾病或病症是scd(例如，镰状细胞贫血)或地中海贫血(例如，β-地中海贫血)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是溶血性贫血(例如，在诊断患有pkd的患者中)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是β地中海贫血。在一些实施方案中，所述疾病或病症是scd。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自scd、镰状细胞性贫血、地中海贫血(例如，β-地中海贫血)、遗传性非球形溶血性贫血、溶血性贫血(例如，由磷酸甘油酸激酶缺乏症引起的慢性溶血性贫血)、遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症(或巴森-科恩茨威格综合征)、阵发性夜间血红蛋白尿、获得性溶血性贫血(例如，先天性贫血(例如，酶病))和慢性病贫血。
[0168]
在另一个实施方案中，本公开涉及式(i)的化合物或包含本公开的化合物和药学上可接受的载剂的药物组合物，用于治疗scd、镰状细胞性贫血、地中海贫血(例如，β-地中海贫血)、遗传性非球形溶血性贫血、溶血性贫血(例如，由磷酸甘油酸激酶缺乏症引起的慢性溶血性贫血)、遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症(或巴森-科恩茨威格综合征)、阵发性夜间血红蛋白尿、获得性溶血性贫血(例如，先天性贫血(例如，酶病))或慢性病贫血。
[0169]
一种治疗诊断患有血红蛋白病的患者的方法，可以包括以有效增加患者中hbs的氧亲和力或提供患者中镰状化点(pos)随着可变形性(eimin)增加而左移或其组合的量施用pkr激活化合物。例如，血红蛋白病可以是镰状细胞病或β地中海贫血。在一些实施方案中，用化合物1或其药学上可接受的盐治疗诊断患有血红蛋白病的患者。在一些实施方案中，患者经诊断患有镰状细胞病或β地中海贫血。
[0170]
患者血红蛋白基因型
[0171]
化合物1可以施用给具有各种基因型的受试者。在一些实施方案中，化合物1可以施用给具有正常血红蛋白(例如，hba、hba1、hba2、hbe、hbf、hbs、hbc、hbh和hbm以及hbf＜总血红蛋白的2％)的受试者的红细胞。在一些实施方案中，治疗方法包括向诊断患有血红蛋白病的患者施用药物组合物的步骤，所述血红蛋白病包含除hba以外的血红蛋白基因型。在一些实施方案中，患者经诊断患有先前通过血红蛋白电泳或基因分型确认的病状。在一些实施方案中，患者可以诊断为具有指示以下血红蛋白基因型之一的基因型：hgb ss、hgb sβ+-地中海贫血、hgb sβ0-地中海贫血或hgb sc，这通常被确定为美国大多数州可用的通用新生儿筛查的一部分。在一些实施方案中，本公开涉及一种改善患有hgb ss或hgb sb0-地中海贫血的scd患者(例如，≥12岁，和/或《12岁)中的贫血和与贫血相关的并发症的方法。在一些实施方案中，化合物1施用给诊断为具有包含hbs的scd基因型的患者。在一些实施方案中，治疗方法可以包括将化合物1施用给诊断患有hbss疾病或镰状细胞性贫血(即，s珠蛋
白纯合子)、hbs/b-0地中海贫血(hbs和b-0地中海贫血双杂合子)、hbs/b+地中海贫血、hbsc疾病(即，hbs和hbc双杂合子)、hbs/胎儿hb遗传持久性(s/hphp)、hbs/hbe综合征或罕见hbs组合(例如，hbd洛杉矶、g-费城或hbo阿拉伯)的患者。
[0172]
用化合物1治疗镰状细胞病(scd)
[0173]
在一些实施方案中，治疗方法包括将化合物1施用给诊断患有scd的患者的步骤，其中该患者的特征还在于以下一个或多个：(1)先前确认的血红蛋白基因型选自hb ss和hb sc；(2)年龄在12至65岁；(3)患者在接受化合物1前的过去12个月内脉管阻塞性危象(voc)≤6次；(4)在首次接受化合物1的30天内没有prbc输血；和任选地，(5)伴随使用羟基脲。
[0174]
参考图5中的示意图，scd是由β亚基的异常引起的，特别是当基因突变产生β亚基的变体形式(称为bs)时。scd是一种常染色体隐性遗传病，其特征在于β-珠蛋白基因的点突变，该点突变引起容易导致脱氧血红蛋白聚合的单个氨基酸取代。这种聚合引起rbc变形成柔韧较差的镰刀状。镰刀状rbc还表现出表面脂质改变形式的膜损伤并且易于粘附于外周组织小血管中的血管内皮和白细胞，可阻断血液流向器官并导致急性和疼痛性voc事件。由于这种阻碍，有一些rbc破坏或溶血。rbc的这种破坏导致血管内释放血红蛋白，而血红蛋白本身可以生成高度破坏性的氧化化学物质。血红蛋白和其他细胞质分子从rbc释放也触发信号传导级联，导致血小板激活、内皮黏附增加、脉管系统炎症和进一步阻塞血管。voc的急性并发症由于组织的氧输送缺乏而导致组织损伤，引起剧烈疼痛和症状，诸如急性胸部综合征。缺氧的组织遭受缺血和再灌注损伤，可导致损伤和长期器官衰竭。
[0175]
镰状细胞病(scd)是一种慢性溶血性贫血，由血红蛋白(hgb)突变形式镰状hgb(hgbs)的遗传引起。它是最常见的遗传性溶血性贫血，在美国(us)影响了70,000至80,000名患者。scd的特征在于当hgbs处于脱氧状态(脱氧-hgbs)时，hgbs在红细胞(rbc)中聚合，引起镰刀状变形。镰状细胞聚集在毛细血管中，加剧脉管阻塞性事件，通常表现为急性和疼痛危象，导致组织缺血、梗塞和长期组织损伤。scd患者中的rbc由于镰状化和机械变形的重复循环而倾向于变脆，从而诱导包括膜功能障碍在内的损伤。hbs引起的活性氧导致氧化损伤。总的来说，这些损损伤的来源导致溶血和慢性贫血。最后，受损的rbc具有异常表面，异常表面粘附于血管内皮并损伤血管内皮，引发作为大血管中风和潜在的肺动脉高压的基础的增殖/炎症响应。这些共同促成了与这种疾病相关的显著发病率和增加的死亡率。
[0176]
所描述的scd临床症状主要是由于hgbs分子聚集引起的rbc膜形状和功能的扰乱。与正常hgb不同，hgbs在处于脱氧状态时聚合并且最终导致无法通过小血管的变形、刚性细胞，从而阻断正常血液流过微脉管系统。膜弹性的丧失也增加了脾脏的溶血和清除，减少了rbc寿命。此外，细胞atp减少和氧化损伤促成比正常rbc更硬且更不结实的镰状rbc膜。受损的膜粘附于脉管系统的倾向更大，导致溶血，增加镰状rbc的聚集，增加与脉管阻塞性危象相关的凝血和炎症。
[0177]
镰状化的潜在原因是刚性脱氧-hgbs聚集体的形成，所述聚集体改变细胞形状并因此影响细胞生理和膜弹性。这些聚集体是高度结构化的脱氧hgbs聚合物；氧合形式不聚合。聚合受构象从氧结合的松弛(r)状态向暴露β-珠蛋白链位置6处的突变疏水缬氨酸残基的未结合的紧张(t)状态的微细偏移而促进。hgbs的β-链内的这些缬氨酸残基能够以特定的重复方式相互作用，促进聚合。
[0178]
脱氧-hgbs的浓度取决于几种因素，但主要因素是氧分压(po2)。氧可逆地与hgb分
子的血红素部分结合。当氧合血液经由毛细血管流向正积极损耗氧的外围组织和器官时，po2下降且hgb释放氧。氧与hgb的结合是协作的，并且与po2的关系符合s形曲线(图6)。这种关系可受温度、ph、二氧化碳和糖酵解中间体2，3-dpg影响。2，3-dpg结合在hgb四聚体的中心腔内，导致变构变化，病降低hgb对氧的亲和力。2，3-dpg通常响应与贫血而增加，并且因此在scd患者中更高。增加hgbs的氧亲和力(即减少脱氧)的治疗方法将会减少聚合物形成的速率、细胞膜的变化以及与某些血红蛋白病病状(诸如scd)相关的临床后果。这些变化将在细胞水平上观察到，但也会反映在临床测量，诸如hb、rbc和网织红细胞计数中，以及溶血量度，诸如血浆或血清中的ldh水平中。
[0179]
scd是最常见的血红蛋白病类型，是各种各样影响血红蛋白的罕见遗传病症，血红蛋白是rbc中负责运输血液中的氧的含铁蛋白。在scd中，血红蛋白的结构异常在向组织卸氧后产生具有镰刀状变形的rbc。这些镰状rbc可以聚集在组织血管中并且阻断向器官血液流动和氧输送，从而可导致急性和疼痛性voc事件，所述事件引起组织缺血、梗塞和长期组织损伤。另外，镰状rbc由于镰状化而倾向于变脆且半衰期为10至20天，而正常rbc的半衰期为90天至大约120天。这种脆性导致溶血，或镰状rbc破坏，以及慢性贫血，或rbc和总血红蛋白水平降低。另外，受损的rbc释放对血管内皮有害的因子并且可诱导作为大血管中风和肺动脉高压的基础的炎症响应。平均而言，成人scd患者每年住院三次且具有显著发病率和增加的死亡率。
[0180]
voc事件通常始于儿童早期并且可导致心脏和肺部并发症、肾功能障碍、阴茎异常勃起、脾脏肿大和衰竭、中风、视网膜病变以及精神和身体残疾。慢性疼痛是常见的，如scd患者中自我报告的，发生在大约55％的天数中。急性胸部综合征在所有scd患者的大约一半中发生并且是scd患者住院和死亡的主要原因。11％的scd患者到20岁时发生中风且24％的患者到45岁时发生中风。大约10％的scd患者患有肺动脉高压。一些scd患者经历终末期肾衰竭，终末期肾衰竭需要透析并预示着26％的一年死亡率。成人scd患者平均每年住院1.5次，且三分之一的scd患者在初始住院30天内再次入院。
[0181]
scd临床表现为潜在的严重病理病状，伴随着大量的身体、情绪和经济负担。例如，急性脉管阻塞性疼痛危象可使人虚弱并且需要快速医疗响应。慢性溶血性贫血导致疲劳并且经常需要输血和支持性护理。随着时间推移，通过微脉管系统的氧运输受损加剧了器官和组织损伤。虽然有许多可用于治疗症状的选择，但整体疾病管理将受益于靶向上游过程的疗法以防止脉管阻塞和溶血。
[0182]
如本文所提供的，某些治疗scd的方法优选包括施用治疗有效量的pkr激活化合物(例如，化合物1)，所述化合物例如通过增加hgbs对氧的亲和力来减少hgbs聚合。治疗scd的方法还优选包括施用治疗有效量的化合物(例如，化合物1)，所述化合物例如通过增加hgbs对氧的亲和力来减少hgbs聚合。降低人rbc中的2，3-dpg和/或增加atp水平的方法包括施用pkr激活化合物，诸如化合物1。降低人rbc中的2，3-dpg和/或增加atp水平的方法还包括施用pkr激活化合物，诸如化合物1。总的来说，这些作用与提供减少hgbs镰状化和改善rbc膜健康的疗法一致，提供了一种用于治疗scd的独特的疾病缓解机制。
[0183]
pkr激活剂化合物，诸如化合物1，可以口服施用，每日一次，用于治疗scd。scd是世界上最常见的单基因病症之一，是一种影响血红蛋白的慢性溶血性贫血，血红蛋白是红细胞或rbc中向全身细胞输送氧的含铁蛋白。scd常以低血红蛋白水平、疼痛性脉管阻塞性危
象或voc、进行性多器官损伤和早期死亡为特征。化合物1是丙酮酸激酶r或pkr的有效激活剂，设计为改善rbc代谢、功能和存活，并且潜在地引起血红蛋白水平增加和voc减少。与其他新兴的scd疗法不同，化合物1通过pkr激活影响两个关键途径来调节rbc代谢：2，3二磷酸甘油酸或2，3-dpg的减少，增加氧亲和力；以及三磷酸腺苷或atp的增加，可改善rbc和膜的健康和完整性。这种多模式方法可通过增加rbc存活来提高血红蛋白水平并通过减少rbc镰状化来降低voc。化合物1具有潜力通过在早期缓解疾病并潜在地防止终末器官损伤，减少住院，并改善患者的总体健康和生活质量而成为scd患者的基本护理标准。
[0184]
在一些实施方案中，本公开涉及一种增加诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的hb浓度的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐，每天一次(qd)。在一些实施方案中，本公开涉及一种增加诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的hb浓度的方法，其包括向患者施用足够量的pkr激活化合物，例如(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0185]
在一些实施方案中，本公开涉及一种降低诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的镰状化点(pos)的方法，其包括向患者施用足够量的pkr激活化合物，例如(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0186]
在一些实施方案中，本公开涉及一种增加诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的eimin的方法，其包括向患者施用足够量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0187]
在一些实施方案中，本公开涉及一种改善诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的rbc可变形性的方法，其包括向患者施用足够量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0188]
在一些实施方案中，本公开涉及一种降低诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的rbc周转的方法，其包括向患者施用足够量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0189]
在一些实施方案中，本公开涉及一种增加诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的rbc计数的方法，其包括向患者施用足够量的pkr激活化合物，例如(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本公开涉及一种增加诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的rbc计数的方法，其包括向患者施用足够量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0190]
在一些实施方案中，本公开涉及一种减少诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的
网织红细胞计数的方法，其包括向患者施用足够量的pkr激活化合物，例如(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0191]
在一些实施方案中，本公开涉及一种降低诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的乳酸脱氢酶(ldh)浓度的方法，其包括向患者施用足够量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0192]
在一项多中心、安慰剂对照的i期试验中在12岁及以上的健康志愿者和scd患者中对化合物1进行评价。试验的健康志愿者部分已经完成，数据已于2019年美国血液学会会议上呈现，证明了化合物1在健康志愿者中的耐受性和机制证明。在健康志愿者的rbc中，化合物1展示出2，3-dpg减少和atp增加，这提供了健康rbc中pkr激活的确证证据。另外，用单剂量和多剂量化合物1时2，3-dpg的减少与氧亲和力增加相关。scd患者的单剂量队列和第一多个上升剂量或mad队列正在进行。在scd患者的单剂量队列中，已经观察到有利的耐受性特性和有利的生物学效应，有药效学活性转化为增加的氧亲和力和镰状化点向较低氧张力偏移，以及镰状rbc改善的膜可变形性的证据。此外，计划在scd患者中进行第二mad队列和三个月的开放标签扩展。基于这项试验的结果，计划在scd患者中进行全球关键ii/iii期试验。计划了未来试验中化合物1在小儿scd群体和其他scd患者群体中的临床开发。
[0193]
治疗scd的方法还包括施用治疗有效量的生物活性化合物(例如，小分子、核酸或抗体或其他疗法)，所述生物活性化合物例如通过增加hgbs对氧的亲和力来减少hgbs聚合。在一些实施方案中，一种治疗scd的方法包括向有需要的患者施用生物活性化合物，所述生物活性化合物在用该化合物口服治疗7天后，在本文实施例11中提供的镰状细胞病的鼠类模型中降低镰状细胞的百分比。在一些实施方案中，生物活性化合物是在实施例11中提供的镰状细胞病的鼠类模型中表现出以下一种或多种特征的任何化合物(包括小分子、核酸、蛋白质或抗体)：(a)增加对hgb的氧亲和力；(b)降低p50；(c)降低在低氧压下镰状化的rbc的百分比；(d)增加细胞镰状化的时间；和/或(e)使hgb增加至少大约1g/dl。
[0194]
在一些实施方案中，化合物1在向患者施用的一种或多种附加scd治疗之前、之后或与之组合施用给诊断患有scd的患者。scd治疗包括治愈疗法、疾病缓解剂、作为慢性预防的对症疗法或急性危象的支持性护理。
[0195]
与其他疗法相比，本文提供的治疗scd的方法可以提供更强的保护，防止脉管阻塞性危象和溶血性贫血。因此，使用pkr激活化合物，诸如化合物1，单独地或与通过替代机制起作用的药物(诸如羟基脲(hu))组合，提供了一种新型的改进治疗方法。在一些实施方案中，化合物1施用给先前已经接受过羟基脲(hu)的scd患者或正在进行hu治疗的scd患者，包括在用化合物1治疗时继续接受hu的患者。以包括bristol myers squibb company的droxia在内的商品名销售的以及一般形式的hu被批准用于治疗与scd相关的贫血，以减少voc的频率和输血的需要。羟基脲(hu)诱导阻断hgbs聚合的hgbf，从而具有降低scd脉管阻塞性危象和病理后遗症的活性。虽然hu广泛用作scd的主干疗法，但它仍然只部分有效，并且伴有毒性，诸如骨髓抑制和致畸性。接受hu的患者仍然会经历溶血、贫血和脉管阻塞性危象，表明需要更有效的疗法，无论是作为替代还是与hu组合。除了hu，治疗性干预主要是支持性护理，旨在管理scd的症状。例如，输血通过增加正常rbc的数目和阻抑镰状rbc的合成
来帮助治疗贫血和其他scd并发症。然而，重复输注会导致铁超载和对螯合疗法的需要以避免随之发生的组织损伤。除了这些方法，使用镇痛药物来管理疼痛。许多患者对hu疗法没有响应，并且即使在有响应的患者中，hu也可随时间推移而失去功效。尽管鉴于scd的后果，认为hu具有可接受的治疗指标，但hu由于安全性问题和副作用，未得到充分利用。hu和阿片类药物分别是慢性和急性护理的标准非治愈性治疗。
[0196]
在一些实施方案中，治疗诊断患有scd的患者的方法可以包括将化合物1与抗代谢物诸如hu组合施用给患者的步骤，所述抗代谢物适用于减少疼痛危象的频率和减少患有镰状细胞贫血的患者中复发中度至重度疼痛危象的输血需要。在一些实施方案中，抗代谢物hu每日一次以15mg/kg的初始剂量施用，并且每两周监测患者的血细胞计数。如果血细胞计数在可接受的范围内，则hu的剂量可以每12周增加5mg/kg/天，直至达到最大耐受剂量或35mg/kg/天。如果血细胞计数在可接受范围与有毒之间，则不增加剂量。如果认为血细胞计数有毒，可以停止hu直至血液恢复。然后，使剂量从血液毒性相关剂量减少2.5mg/kg/天后，可以重新开始治疗。hu可以在羟基脲胶囊中施用给患者，可作为含有200mg、300mg和400mg羟基脲的胶囊口服使用。和hu一起的非活性成分可包括柠檬酸、明胶、乳糖、硬脂酸镁、磷酸钠、二氧化钛和胶囊着色剂。可促成其有益作用的droxia的已知药理作用包括增加红细胞(rbc)中的血红蛋白f水平，减少中性粒细胞，增加rbc含水量，增加镰状细胞的可变形性以及改变rbc与内皮的粘附。
[0197]
在一些实施方案中，化合物1施用给诊断患有scd的，也正在接受l-谷氨酰胺以治疗scd的并发症的患者，和/或施用给诊断患有scd的，先前已经接受过l-谷氨酰胺以治疗scd的并发症的患者。由emmaus life sciences，inc.销售的endari，是一种口服l-谷氨酰胺粉末形式，经批准用于减少与该病症相关的严重并发症。l-谷氨酰胺是一种适用于减少成人和5岁及以上小儿患者中的镰状细胞病的急性并发症的氨基酸。l-谷氨酰胺可以基于体重以5克至15克的量口服施用，每日两次。每个剂量的l-谷氨酰胺在摄入之前应混合在8oz.(240ml)的冷饮或室温饮料或4oz.至6oz.的食物中。l-谷氨酰胺化学名称为(s)-2-氨基谷氨酸、l-谷氨酸5-酰胺或(s)-2，scd的病理生理中牵涉氧化应激现象。镰状红细胞(rbc)比正常rbc更容易受到氧化损伤，这可促成与scd相关的慢性溶血和脉管阻塞性事件。吡啶核苷酸nad+及其还原形式nadh在rbc中起调节和防止氧化损伤的作用。l-谷氨酰胺可通过增加还原型谷胱甘肽5-二氨基-5-氧代戊酸的可用性而提高镰状rbc中的nad氧化还原电位。单剂量口服施用0.1g/kg的l-谷氨酰胺后，l-谷氨酰胺平均峰值浓度为1028μm(或150mcg/ml)，出现在施用后大约30分钟。经静脉(iv)推注剂量后，估计分布体积为大约200ml/kg。
[0198]
在一些实施方案中，化合物1施用给接受支持性护理以管理voc的患者。疼痛性voc管理的支持性护理需要使用阿片类药物或其他止痛药。
[0199]
在一些实施方案中，化合物1施用给诊断患有scd的患者，该患者已经接受(或同时正在接受)选自沃克罗塔和立赞利珠单抗的一种或多种疗法。2019年11月，fda批准沃克罗塔和立赞利珠单抗用于治疗scd。
[0200]
在一些实施方案中，一种治疗方法包括将化合物1施用给诊断患有scd的，先前已经接受过抑制hbs分子聚合的疗法的患者。例如，化合物1可以施用给已经用沃克罗塔治疗的scd患者。在一些实施方案中，化合物1与沃克罗塔组合施用给scd患者。fda准予加速批准
沃克罗塔用于治疗成人和12岁及以上儿童的scd。沃克罗塔是一种每日服用一次的口服疗法并且是第一种被批准的直接抑制hbs聚合的治疗。沃克罗塔是一种口服小分子疗法，它展示出总血红蛋白水平的改善，但未能显著降低voc。沃克罗塔设计为通过与hbs分子结合并稳定其与氧的结合来减少hbs聚合。因此，沃克罗塔的机制对增加hbs氧合以减少hbs聚合有特异性。虽然它实现了hb含量的适度增加和溶血减少，但这种作用机制本身可能不足以有效对抗与这种疾病相关的显著贫血和血管损伤。沃克罗塔是一种血红蛋白s聚合抑制剂，适用于治疗成人和12岁及以上小儿患者的镰状细胞病。该适应症是基于血红蛋白(hb)的增加在加速批准下批准的。对该适应症的继续批准可视确认性试验中临床益处的验证和描述而定。沃克罗塔的化学名称为：2-羟基-6-((2-(1-异丙基-1h-吡唑-5-基)吡啶-3-基)甲氧基)苯甲醛。沃克罗塔是一种血红蛋白s聚合抑制剂。沃克罗塔是一种血红蛋白s(hbs)聚合抑制剂，其以1∶1化学计量比与hbs结合并表现出对红细胞(rbc)的优先分配。通过增加hb对氧的亲和力，沃克罗塔展示出对hbs聚合的剂量依赖性抑制。非临床研究表明，沃克罗塔可以抑制rbc镰状化，改善rbc可变形性并降低全血粘度。沃克罗塔被吸收到血浆中，然后主要分布到rbc中，这是因为它与hb优先结合。沃克罗塔的主要消除途径是代谢，随后代谢产物排泄到尿液和粪便中。用单剂量或多剂量时在全血、血浆和rbc中，pk呈线性且沃克罗塔暴露量成比例增加。相对于禁食状态下的auc和cmax，高脂肪、高热量膳食使全血中的沃克罗塔auc增加42％和cmax增加和45％。类似地，血浆中auc增加42％且cmax增加95％。体内外研究表明，沃克罗塔通过i期(氧化和还原)、ii期(葡萄糖醛酸化)以及i期和ii期代谢的组合进行广泛代谢。沃克罗塔的氧化主要由cyp3a4介导，cyp2c19、cyp2b6和cyp2c9贡献较小。在12至《17岁小儿患者和成人中沃克罗塔的药代动学参数相似。在hbsc基因型患者(n＝11)中与hbss基因型患者(n＝220)相比，沃克罗塔稳态全血auc和cmax分别高50％和45％；并且在hbsc基因型患者中与hbss基因型患者相比，沃克罗塔稳态血浆auc和cmax分别高23％和15％。
[0201]
另一种治疗方法以单克隆抗体立赞利珠单抗为例，这是一种p-选择素阻断单克隆抗体，它减少voc但不影响hbs聚合。fda批准立赞利珠单抗，以降低患有scd的成人和16岁及以上的小儿患者中的voc频率。立赞利珠单抗静脉施用并与p-选择素结合，p-选择素是一种细胞粘附蛋白，在可以导致脉管阻塞的多细胞相互作用中发挥核心作用。立赞利珠单抗已经在减少voc数目方面显示出益处，但不能治疗scd的根本原因且只通过静脉施用进行施用。
[0202]
输血也用于治疗scd并且可以通过增加功能性rbc来暂时提高血红蛋白水平。存在与这种治疗方法相关的许多局限性，包括有限的患者接触和严重的并发症，诸如铁超载。
[0203]
造血干细胞移植或hsct也是scd患者的一种选择，但这种疗法受到牵涉化疗消融的有毒预处理方案、供体可用性和对移植后免疫抑制的需要的限制。同种异体hsct是一种侵入性、潜在有毒、高风险的手术，受限于匹配供体的可用性和显著的手术相关并发症。鉴于很难找到合适的匹配供体和与治疗相关的风险，包括大约5％的死亡率，这种治疗选择不常用。hsct更常提供给有可用同胞匹配供体的小儿患者。hsct通常只推荐用于最严重的病例并且主要只提供给有同胞匹配供体的儿童。然而，hsct的使用可受到有毒预处理方案、供体可用性和对移植后免疫抑制的需要的严重限制。
[0204]
基因疗法是另一种也正在研究的具有有前景的初步结果的scd疗法。正在开发的
基因疗法和基因编辑方法为治愈提供了希望，但是侵入性的、高风险手术，需要有毒预处理方案来消融骨髓并为表达正常β-珠蛋白或高水平hbf的工程化细胞腾出空间。此外，这些方法的长期治疗持久性未知。这些因素，加上预期相对较高的治疗成本，可限制基因疗法的使用。许多不同的治疗方法正在开发用于scd患者。例如，一种称为lentiglobin的疗法正处于临床试验测试用于治疗scd。lentiglobin是一种一次性的scd基因疗法治疗，其旨在通过将功能性人β-珠蛋白基因插入患者自身的离体造血干细胞中，然后将经修饰的干细胞移植到患者血液中来治疗scd。另一种正在开发的治疗scd患者的疗法rvt-1801(一种基因疗法)正在人类临床试验中进行评价。另一种正在开发的治疗scd患者的疗法是bivv-003，这是一种使用hbf修饰细胞以产生功能性rbc的基因编辑细胞疗法。
[0205]
命名为imr-687的化合物，即磷酸二酯酶-9的小分子抑制剂，设计为增加用于治疗scd的hbf的产量。另一种正在开发的治疗scd患者的化合物是epi01，这是一种在临床试验中设计为增加hbf产量的小分子。
[0206]
用化合物1治疗β-地中海贫血
[0207]
在实施例12的临床试验期间，施用化合物1增加了患者中的atp。增加atp(从而改善膜功能)可以使诊断患有地中海贫血血红蛋白病的患者受益。在一些实施方案中，可以施用化合物1用于治疗β地中海贫血，β地中海贫血是一种血红蛋白病，由于血红蛋白的生产减少或缺乏引起，从而产生携氧能力比正常rbc低的rbc。与scd不同，β地中海贫血是由于血红蛋白β亚基的生产减少或缺乏引起，从而产生携氧能力比正常rbc低的rbc。进一步地，β血红蛋白亚基水平的降低引起α血红蛋白亚基的过量，从而形成可以增加膜损伤并导致溶血的聚集体。在一些实施方案中，可以施用化合物1以增强β地中海贫血影响的rbc中的能量水平并且使患者能够耐受增加的膜损伤和减少溶血。溶血的减少可引起总血红蛋白的增加，总血红蛋白的增加可改善症状。
[0208]
β地中海贫血患者的红细胞(rbc)具有增加的α-珠蛋白聚集体、游离血红素和游离铁，这些全部都导致有毒活性氧水平的增加，活性氧会损伤rbc膜。因此，β地中海贫血患者的rbc中atp损耗更多，并且认为这种atp储存的耗竭是这些患者中rbc寿命缩短和溶血增加的关键。通过增加β地中海贫血患者rbc中的atp水平，化合物1可减少溶血并增加全身血红蛋白水平。
[0209]
在一些实施方案中，化合物1可以增强β地中海贫血影响的rbc中的能量水平并且使患者能够耐受增加的膜损伤和减少溶血。溶血的减少可引起总血红蛋白的增加，总血红蛋白的增加可改善症状。
[0210]
治疗β地中海贫血的方法还包括施用治疗有效量的生物活性化合物(例如，小分子、核酸或抗体或其他疗法)，所述生物活性化合物例如通过增加hgbs对氧的亲和力来减少hgbs聚合。在一些实施方案中，一种治疗β地中海贫血的方法包括向有需要的患者施用生物活性化合物，所述生物活性化合物在用该化合物口服治疗7天后，在本文实施例11中提供的镰状细胞病的鼠类模型中降低镰状细胞的百分比。在一些实施方案中，生物活性化合物是在实施例11中提供的镰状细胞病的鼠类模型中表现出以下一种或多种特征的任何化合物(包括小分子、核酸、蛋白质或抗体)：(a)增加低氧条件下对hgb的氧亲和力；(b)降低低氧条件下的p50；(c)降低在低氧压下镰状化的rbc的百分比；(d)增加细胞镰状化的时间；和/或(e)使hgb增加至少大约1g/dl。
[0211]
在一些实施方案中，治疗方法包括将化合物1施用给诊断具有选自sp0-地中海贫血或sβ+-地中海贫血的先前确认的血红蛋白基因型的患者的步骤并且其中该患者进一步特征在于以下一项或多项：(1)12至65岁，(2)患者在接受化合物1前的过去12个月内脉管阻塞性危象(voc)≤6次；(3)在首次接受化合物1的30天内没有prbc输血；和(4)伴随使用羟基脲。
[0212]
β地中海贫血患者通常分为两组之一；(i)输注依赖患者，和(ii)非输注依赖患者。输注依赖患者可能需要频繁输血，频繁输血可导致组织中铁超载，铁超载可损伤器官，诸如肝脏、心脏和内分泌器官。因此，使用铁耗竭剂最大限度地减少铁超载的后果。hsct可以治愈β地中海贫血患者，但手术相关的毒性和供体可用性将这限制为一种治疗选择。
[0213]
直到2019年11月，美国还没有针对β地中海贫血的批准药物疗法。许多β地中海贫血患者的护理标准是频繁输血来管理贫血。针对β地中海贫血的一种潜在治愈疗法是hsct，它伴有严重风险并且限于有合适供体的患者。
[0214]
2019年11月，罗特西普(luspatercept-aamt)经fda批准用于治疗输注依赖(即，需要定期输注rbc)的β地中海贫血成年患者的贫血。罗特西普是一种经修饰的受体蛋白，其促进rbc成熟和增加rbc总产量，但不能解决β地中海贫血中牵涉的其他细胞类型。罗特西普不适用于在需要立即矫正贫血的患者中用作rbc输注的替代品。罗特西普皮下给药并且在门诊每三周施用一次。虽然研究表明罗特西普可以减少这些患者可能需要的输注次数并减少铁负载，但这些患者仍然依赖输注，并且这些患者的需要仍然显著未满足。
[0215]
增加用于移植的自体造血干细胞中的β-珠蛋白或hbf表达的基因疗法也正在开发，但受到对骨髓预处理的需要和预期高成本的限制。一种正在开发的基因疗法是施用编码β
a-t87q-珠蛋白基因的自体cd34
+
细胞，是一种开发用于治疗患有输注依赖性β地中海贫血且具有某些基因型的患者的基因疗法。
[0216]
其他正在开发用于患有输注依赖性β地中海贫血的患者的治疗方法包括rivo-cel，一种改良的供体t细胞疗法，与hsct结合使用；imr-687，一种磷酸二酯酶-9的小分子抑制剂；epi01，一种设计为增加hbf产量的小分子；otl-300，一种用于治疗输注依赖性β地中海贫血的自体离体基因疗法；st-400，一种设计为使用hbf产生功能性rbc的基因组编辑细胞疗法；ctx001，一种上调患有输注依赖性β地中海贫血的患者中的hbf表达的基因编辑方法；和激活γ珠蛋白表达以诱导hbf产生用于治疗β地中海贫血的基因控制剂。
[0217]
制备化合物1和药物组合物的方法
[0218]
pkr激活化合物，诸如1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，或其药学上可接受的盐，可用于治疗患者的药物组合物中。pkr激活化合物，诸如化合物1，或其药学上可接受的盐，可用于治疗患者的药物组合物中。包含化合物1或其药学上可接受的盐的组合物可通过本文提供的某些方法获得。包含化合物1或其药学上可接受的盐的组合物可通过本文提供的某些方法，诸如实施例1提供的方法获得。
[0219]
药物组合物可包含化合物1和药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，药物组合物包含化合物1和化合物2。在一些实施方案中，所提供的药物组合物含有化合物1和化合物2：
[0220][0221]
或其药学上可接受的盐。
[0222]
代表性的“药学上可接受的盐”包括，例如水溶性和水不溶性盐，诸如乙酸盐，氨芪磺酸盐(amsonate)(4，4-氨基二苯乙烯-2，2-二磺酸盐)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、钙盐、依地酸钙、樟脑磺酸盐(camsylate)、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐(clavulariate)、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐(edisylate)、丙酸酯十二烷基硫酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、反丁烯二酸盐(fiunarate)、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐(glycollylarsanilate)、六氟磷酸盐、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫氰酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、镁盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘液酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、n-甲基葡糖胺铵盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(1，1-亚甲基-双-2-羟基-3-萘甲酸盐，恩波酸盐(einbonate))、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、多聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、苏拉明酸盐(suramate)、丹宁酸盐、酒石酸盐、氯茶碱盐(teoclate)、甲苯磺酸盐、三乙碘化物和戊酸盐。
[0223]
在一些实施方案中，本文报道的药物组合物可以以单位剂型(例如，胶囊、片剂等)提供。
[0224]
包含含有式(i)化合物的pkr激活组合物的药物组合物可配制为口服施用(例如，配制为胶囊或片剂)。例如，化合物1可以与合适的药典赋形剂组合形成含有目标剂量的化合物1的口服单位剂型，诸如胶囊或片剂。该药物产品可通过以下方法制备：首先生产化合物1作为活性药物成分(api)，接着用合适的聚合物喷雾干燥以得到喷雾干燥的中间体(sdd)。sdd然后通过与颗粒内赋形剂一起碾压/碾磨和与额外颗粒赋形剂掺混进一步加工。药物产品可以在片剂中以所需的化合物1剂量强度(例如，由表1中的药物组合物形成的25mg或100mg片剂)中含有表1中的化合物1api和赋形剂组分。掺混的材料可以压缩形成片剂，然后薄膜包衣。
[0225]
在一些实施方案中，api是包含化合物1和聚合物的无定形固体分散体。在一些实施方案中，聚合物选自羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(hpmcas)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(hpmcp)、羟丙基纤维素(hpc)、乙基纤维素、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)及其组合。在一些实施方案中，聚合物是羟丙基甲基纤维素(hpmc)或羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(hpmcas)。在一些实施方案中，无定形固体分散体中化合物1与聚合物的重量比为约1∶3。表1提供了包含通过实施例1的方法获得的sdd和其他组分的片剂的实例。在一些实例中，片剂的重量可小于约800mg。在一些实例中，片剂含有无定形化合物1api材料，其量在化合物1的片剂中占约10-40重量％，另外
还含有其他成分，诸如填料、干粘合剂、助流剂和润滑剂。在一个实例中，片剂含有100mg的化合物1，片剂重量小于约800mg。在另一个实例中，片剂含有200mg的化合物1，片剂重量小于约800mg。
[0226]
表1.用于口服施用的化合物1的示例性药物组合物
[0227][0228]
在一些实施方案中，所提供的含有式i化合物的组合物包括(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮和(r)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。在一些实施方案中，所提供的含有式i化合物的组合物是作为pkr激活组合物的一部分的化合物1和化合物2的混合物。在一些实施方案中，式i化合物是外消旋的。在一些实施方案中，式i化合物由约50％的化合物1和约50％的化合物2组成。在一些实施方案中，式i化合物不是外消旋的。在一些实施方案中，式i化合物并非由约50％的化合物1和约50％的化合物2组成。在一些实施方案中，式i化合物包含约99-95％、约95-90％、约90-80％、约80-70％或约70-60％的化合物1。在一些实施方案中，式i化合物包含约99％、98％、95％、90％、80％、70％或60％的化合物1。
[0229]
在一些实施方案中，pkr激活组合物包含化合物1和化合物2的混合物。在一些实施方案中，pkr激活组合物包含化合物1和化合物2的混合物，其中所述pkr激活组合物包含治疗有效量的化合物1。
[0230]
式i化合物，包括化合物1，可以通过一系列四个反应步骤从市售原材料得到，如实施例1所概述。将市售7-溴-2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶先用正丁基锂和二丁基镁的混合物处理，接着用硫酰氯处理得到磺酰氯3。将3用1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-羧酸叔丁酯在三乙胺(tea)的存在下处理得到boc保护的单磺酰胺4。化合物4然后在三氟乙酸(tfa)的存在下脱保护以产生5，单磺酰胺的游离碱。生成化合物1(实施例1，步骤5)或化合物1和化合物2(实施例1，步骤4)的最后一步是5和托品酸在1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1h-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶3-氧化六氟磷酸(hatu)的存在下的酰胺偶联。
[0231]
在一些实施方案中，本文报道的药物组合物可以以口服剂型提供。在一些实施方案中，药物组合物以任何口服可接受的剂型口服施用。在一些实施方案中，pkr激活化合物的口服剂型是胶囊。在一些实施方案中，pkr激活化合物的口服剂型是片剂。在一些实施方
案中，口服剂型包括一种或多种填料、崩解剂、润滑剂、助流剂、抗粘附剂和/或抗静电剂。在一些实施方案中，经由干法掺混制备口服剂型。在一些实施方案中，口服剂型是片剂并经由干法制粒制备。
[0232]
其他实施方案
[0233]
治疗方法(例如，通过激活pkr)可包括向有需要的受试者施用治疗有效量的(i)本文公开的化合物或其药学上可接受的盐或(ii)包含本文公开的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载剂的药物组合物。pkr激活化合物可以口服施用，用于治疗在治疗上受益于施用激活pkr的化合物的疾病或病状，包括血红蛋白病，诸如scd或β地中海贫血。在一些实施方案中，化合物1可以口服施用，用于治疗在治疗上受益于施用激活pkr的化合物的疾病或病状，诸如scd或β地中海贫血。化合物1是pkr的有效激活剂并且可改善rbc的代谢、功能和存活。化合物1也可用于提高血红蛋白水平和降低voc的比率。
[0234]
在一些实施方案中，治疗与pkr调节相关的疾病的方法包括施用治疗有效量的本文公开的化合物。在一些实施方案中，治疗丙酮酸激酶缺乏症(pkd)的方法包括施用治疗有效量的本文公开的化合物。在一些实施方案中，治疗pkd相关溶血性贫血的方法包括施用治疗有效量的本文公开的化合物。
[0235]
治疗方法可以包括向有需要的受试者施用治疗有效量的(i)pkr激活化合物(例如，本文公开的化合物)，或其药学上可接受的盐；或(ii)pkr激活组合物(例如，包含本文公开的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载剂的药物组合物)。该药物组合物可以任何口服可接受的剂型口服施用。
[0236]
本公开的一个方面涉及治疗患者，诸如诊断患有血红蛋白病的患者的方法，包括施用治疗有效量的化合物1或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，患者经诊断患有血红蛋白病，诸如镰状细胞病或β地中海贫血。
[0237]
在一些实施方案中，化合物1可以每日一次口服施用，用于治疗血红蛋白病，诸如β地中海贫血或scd。在一些实施方案中，化合物1可以每日一次口服施用，用于治疗scd。在一些实施方案中，化合物1可以每日一次口服施用，用于治疗β地中海贫血。化合物1是pkr的有效激活剂并且可改善rbc的代谢、功能和存活。化合物1也可用于提高血红蛋白水平和降低voc的比率。治疗诊断患有scd的患者的方法可以包括向有需要的患者施用靶向减少脱氧-hgbs的治疗化合物，该治疗化合物可以或者不可以直接改善rbc膜完整性。已经证实化合物1会减少2，3-dpg和增加atp，并且在疾病模型中已经证明了细胞镰状化减少。因此，在一些实施方案中，治疗方法不仅可以解决镰状化，而且可以解决溶血和贫血。
[0238]
在一些实施方案中，化合物1可以每日一次口服施用，用于治疗β地中海贫血。化合物1是pkr的有效激活剂并且可改善rbc的代谢、功能和存活。化合物1也可用于提高两种血红蛋白水平。治疗诊断患有β地中海贫血的患者的方法可以包括向有需要的患者施用靶向减少脱氧-hgbs的治疗化合物，该治疗化合物可以或者不可以直接改善rbc膜完整性。已经证实化合物1会减少2，3-dpg和增加atp，并且在疾病模型中已经证明了细胞镰状化减少。因此，在一些实施方案中，治疗方法不仅可以解决镰状化，而且可以解决溶血和贫血。
[0239]
治疗诊断患有镰状细胞病的患者的方法和用于此类方法的pkr激活化合物，可以包括以足以降低患者红细胞中的2，3-dpg水平的量向患者施用pkr激活化合物(例如，包含一种或多种式i化合物，诸如化合物1或化合物1和化合物2的混合物的组合物)。治疗诊断患
有β地中海贫血的患者的方法和用于此类方法的pkr激活化合物，可以包括以足以降低患者红细胞中的2，3-dpg水平的量向患者施用pkr激活化合物(例如，包含一种或多种式i化合物，诸如化合物1或化合物1和化合物2的混合物的组合物)。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在24小时后降低至少30％或更多(例如，使患者红细胞中的2，3-dpg水平在24小时后降低至少40％)。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在24小时后降低30-50％。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在24小时后降低40-50％。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在12小时后降低至少25％。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在12小时后降低25-45％。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在6小时后降低至少15％。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在6小时后降低15-30％。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在治疗第14天降低至少40％。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在治疗第14天降低40-60％。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在治疗第14天降低至少50％。在一些实施方案中，该量足以使2，3-dpg水平在治疗第14天降低50-60％。
[0240]
治疗诊断患有镰状细胞病的患者的方法和用于此类方法的pkr激活化合物，还可以包括以足以增加患者的atp血液水平的日量向患者施用pkr激活化合物(例如，包含一种或多种式i化合物，诸如化合物1或化合物1和化合物2的混合物的组合物)。治疗诊断患有β地中海贫血的患者的方法和用于此类方法的pkr激活化合物，还可以包括以足以增加患者的atp血液水平的日量向患者施用pkr激活化合物(例如，包含一种或多种式i化合物，诸如化合物1或化合物1和化合物2的混合物的组合物)。在一些实施方案中，该量足以使atp血液水平在治疗第14天增加至少40％或更多(例如，在治疗第14天增加至少50％)。在一些实施方案中，该量足以使atp血液水平在治疗第14天增加40-65％。在一些实施方案中，该量足以使atp血液水平在治疗第14天增加至少50％或更多(例如，在治疗第14天增加至少50％)。在一些实施方案中，该量足以使atp血液水平在治疗第14天增加50-65％。
[0241]
可以将治疗有效量的化合物1以药物组合物的形式施用给有需要的患者。例如，治疗有效量的pkr激活化合物的施用可包括以单剂量或分剂量每天总共施用约25mg-1,500mg的化合物1。在一些实施方案中，化合物1以25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg，和/或如果耐受则更高的每日一次(qd)总剂量(例如，250mg、300mg、500mg、600mg、1000mg和/或1500mg)施用给诊断患有scd的患者。在一些实施方案中，向有需要的患者(例如，诊断患有scd的患者)每日一次(qd)施用80至130mg人类剂量的化合物1。在一些实施方案中，以每天400mg的量(例如，400mg qd或200mg bid)施用pkr激活化合物。在一些实施方案中，以每天400mg的量(例如，400mg qd或200mg bid)施用化合物1或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，以每天400mg的量(例如，400mg qd或200mg bid)施用化合物1或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，以每天700mg的量(例如，700mg qd或350mg bid)施用pkr激活化合物。在一些实施方案中，以每天700mg的量(例如，700mg qd或350mg bid)施用化合物1或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，以每天700mg的量(例如，700mg qd或350mg bid)施用化合物1或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，以每天100mg、200mg、400mg、600mg、700mg、1100mg或1500mg的量，以单剂量或分剂量施用pkr激活化合物。在一些实施方案中，以每天100mg、200mg、400mg、600mg、700mg、1100mg或1500mg的量，以单剂量或分剂量施用化合物1或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，以每天100mg、200mg、400mg、600mg、
700mg、1100mg或1500mg的量，以单剂量或分剂量施用化合物1或其药学上可接受的盐。).在一些实施方案中，每天(qd)以200mg的量施用化合物1或其药学上可接受的盐。
[0242]
在一些实施方案中，每天向人类施用100mg至1500mg日剂量的pkr激活化合物。在一些实施方案中，向人类施用100mg至1500mg日剂量的化合物1。在一些实施方案中，向人类施用100mg至1500mg日剂量的化合物1。具体而言，可向人类施用100mg-600mg日总剂量的pkr激活化合物(包括，例如，以单剂量或分剂量，每天剂量为100mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg)。具体而言，可向人类施用100mg-600mg日总剂量的化合物1(包括，例如，以单剂量或分剂量，每天剂量为100mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg)。具体而言，可向人类施用100mg-600mg日总剂量的化合物1(包括，例如，以单剂量或分剂量，每天剂量为100mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg)。在一些实施方案中，向人类施用400mg日剂量(例如，400mg qd或200mg bid)的pkr激活化合物。在一些实施方案中，向人类施用400mg日剂量(例如，400mg qd或200mg bid)的化合物1或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，向人类施用400mg日剂量(例如，400mg qd或200mg bid)的化合物1。
[0243]
在一些实施方案中，每天向患者施用100mg-600mg总日剂量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。在一些实施方案中，该方法可包括以选自100mg bid、200mg bid、300mg bid和400mg qd的总剂量和剂量间隔向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。在一些实施方案中，向诊断患有scd的患者施用总共300mg qd的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。在一些实施方案中，每天向诊断患有β地中海贫血的患者施用总共300mg qd的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法可以包括向有需要的患者重复施用总共300mg qd的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0244]
在一些实例中，包含化合物1的药物组合物可用于治疗诊断患有镰状细胞病的患者的方法中，该方法包括每天一次(qd)向患者施用400mg的化合物1或其药学上可接受的盐
[0245][0246]
在一些实例中，包含化合物1的药物组合物可用于治疗诊断患有镰状细胞病的患者的方法中，该方法包括每天一次(qd)向患者施用300mg的化合物1或其药学上可接受的盐
[0247][0248]
在一些实例中，包含化合物1的药物组合物可用于治疗诊断患有镰状细胞病的患者的方法中，该方法包括每天一次(qd)向患者施用200mg的化合物1或其药学上可接受的盐
[0249][0250]
在一些实施方案中，本公开提供了式i的pkr激活化合物：
[0251][0252]
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，pkr激活化合物是(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0253]
式i化合物优选为化合物1：
[0254][0255]
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，式i化合物是(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2((s)-1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。在一些实例中，化合物1是稳定的晶体物质。在一些实例中，化合物1是无定形物质。
[0256]
包含化合物1的药物组合物可以在整个医学上适当的治疗过程中施用给患者，该治疗过程可以是连续多周的一系列连续天数。在一些实施方案中，在连续多天内向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0257]
一些实施方案提供了包含化合物1的口服、每日一次剂型(例如，片剂或胶囊)，用于通过降低2，3-dpg血浓度，增加血红蛋白水平和/或增加细胞内atp来增加血红蛋白氧亲和力的疗法中，在整个治疗过程中每日重复施用后没有影响性激素的显著影响(例如，没有芳香酶抑制活性)或诱导其自身代谢。
[0258]
一些实施方案提供了包含化合物1的口服、每日一次剂型(例如，片剂或胶囊)，用于增加血红蛋白氧亲和力的疗法中，在整个治疗过程中每日重复施用后没有影响性激素的显著影响(例如，没有芳香酶抑制活性)或诱导其自身代谢。
[0259]
一些实施方案提供了包含化合物1的口服、每日一次剂型(例如，片剂或胶囊)，用于降低2，3-dpg血浓度的疗法中，在整个治疗过程中每日重复施用后没有影响性激素没有显著影响(例如，没有芳香酶抑制活性)或诱导其自身代谢。
[0260]
一些实施方案提供了包含化合物1的口服、每日一次剂型(例如，片剂或胶囊)，用于增加血红蛋白水平的疗法中，在整个治疗过程中每日重复施用后没有影响性激素的显著影响(例如，没有芳香酶抑制活性)或诱导其自身代谢。
[0261]
一些实施方案提供了包含化合物1的口服、每日一次剂型(例如，片剂或胶囊)，用于增加细胞内atp的疗法中，在整个治疗过程中每日重复施用后没有影响性激素的显著影响(例如，没有芳香酶抑制活性)或诱导其自身代谢。
[0262]
一些实施方案提供了包含化合物1的口服、每日一次剂型(例如，片剂或胶囊)，用于在整个治疗过程中每日重复施用后没有影响性激素的显著影响(例如，没有芳香酶抑制活性)或诱导其自身代谢的疗法中。
[0263]
在其他实施方案中，本公开涉及以下编号的实施方案中的每一个：
[0264]
1.一种组合物，其包含式i的pkr激活化合物或其药学上可接受的盐：
[0265][0266]
2.如实施方案1所述的组合物，其中式i化合物是化合物1，或其药学上可接受的盐：
[0267][0268]
3.如实施方案2所述的组合物，其中所述组合物包含化合物1和化合物2的混合物，或其药学上可接受的盐：
[0269][0270]
4.如实施方案1所述的组合物，其包含所述化合物：(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0271]
5.如实施方案1-4中任一项所述的组合物，其配制为口服单位剂型。
[0272]
6.一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0273]
7.如实施方案6所述的方法，其中所述方法包括口服施用所述药物组合物，所述药物组合物包含(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮作为所述药物组合物中唯一的pkr激活化合物。
[0274]
8.一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含化合物1：
[0275][0276]
或其药学上可接受的盐。
[0277]
9.一种包含通过下述方法可获得的式i化合物的组合物，所述方法包括在描述为步骤4的反应中将化合物5转化为式i化合物的步骤：
[0278][0279]
10.如实施方案9所述的组合物，其中所述方法还包括首先从化合物4通过包括步骤3的方法获得所述化合物5：
[0280][0281]
11.如实施方案10所述的组合物，其中所述方法还包括首先从化合物3通过包括步骤2的方法获得所述化合物4：
[0282][0283]
12.如实施方案11所述的组合物，其中所述方法还包括首先从包括步骤1的方法获得所述化合物3：
[0284][0285]
13.一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的使用实施例2中描述的发光测定法测得ac
50
值小于1μm的pkr激活化合物。
[0286]
14.如实施方案13所述的方法，其中所述pkr激活化合物是化合物1。
[0287]
15.如实施方案13-14中任一项所述的方法，其中所述pkr激活化合物口服施用给有需要的患者。
[0288]
16.化合物1：
[0289][0290]
或其药学上可接受的盐用于治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的用途。
[0291]
17.使用实施例2中描述的发光测定法测得ac
50
值小于1μm的pkr激活化合物在治疗诊断患有镰状细胞病的患者中的用途。
[0292]
18.如实施方案6-8或13-15中任一项所述的方法，其包括每天一次施用化合物1。
[0293]
19.如实施方案6-8或13-15中任一项所述的方法，其包括每天施用总共25mg-1,
500mg的化合物1。
[0294]
20.如实施方案18-19中任一项所述的方法，其包括每天施用总共25mg-130mg的化合物1。
[0295]
21.一种治疗诊断患有scd的患者的方法，其包括向患者施用治疗有效量的pkr激活化合物，其中在实施例11提供的镰状细胞病的鼠类模型中，pkr激活化合物表现出以下一种或多种特征：(a)增加低氧条件下对hgb的氧亲和力；(b)降低低氧条件下的p50；(c)降低在低氧压下镰状化的rbc的百分比；(d)增加细胞镰状化的时间；和/或(e)使hgb增加至少大约1g/dl。
[0296]
22.如实施方案21所述的方法，其中所述pkr激活化合物是抗体。
[0297]
23.如实施方案21所述的方法，其中所述pkr激活化合物是蛋白质。
[0298]
24.如实施方案21所述的方法，其中所述pkr激活化合物是核酸。
[0299]
25.如实施方案21所述的方法，其中所述pkr激活化合物是dna核酸。
[0300]
26.如实施方案21所述的方法，其中所述pkr激活化合物是rna核酸。
[0301]
在其他实施方案中，本公开涉及以下编号的实施方案中的每一个：
[0302]
1.一种用于治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法中的pkr激活化合物，所述方法包括以治疗有效量向患者施用pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是式i的化合物：
[0303][0304]
或其药学上可接受的盐，其使用实施例2中描述的发光测定法，具有小于1μm的ac
50
值。
[0305]
2.如实施方案1所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是化合物1：
[0306][0307]
或其药学上可接受的盐。
[0308]
3.如实施方案1所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是化合物1：
[0309][0310]
[0311]
4.如实施方案3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每天25-1500mg的量施用。
[0312]
5.如实施方案3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每日一次以每天250mg、300mg、500mg、600mg、1000mg或1500mg的量施用。
[0313]
6.如实施方案3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每日一次以每天100mg的量施用。
[0314]
7.如实施方案3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每日一次以每天600mg的量施用。
[0315]
8.如实施方案3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每天施用一次。
[0316]
9.如实施方案3所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物向患者口服施用。
[0317]
10.如实施方案3所述的pkr激活化合物，其中化合物1是施用给所述患者的唯一pkr激活化合物。
[0318]
11.一种用于治疗诊断患有镰状细胞病的患者的方法中的pkr激活化合物，所述方法包括以足以使患者红细胞中的2，3-dpg水平在24小时后降低至少30％的量向患者施用pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是式i化合物：
[0319][0320]
或其药学上可接受的盐，其使用实施例2中描述的发光测定法，具有小于1μm的ac
50
值。
[0321]
12.如实施方案11所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是化合物1：
[0322][0323]
或其药学上可接受的盐。
[0324]
13.如实施方案1所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是化合物1：
[0325][0326]
14.如实施方案13所述的pkr激活化合物，其中化合物1是施用给所述患者的唯一
pkr激活化合物。
[0327]
15.如实施方案11-14中任一项所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物向患者口服施用。
[0328]
16.如实施方案11-15中任一项所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每天施用一次。
[0329]
17.如实施方案11-16中任一项所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以足以使患者红细胞中的2，3-dpg水平在24小时后降低至少40％的量施用。
[0330]
18.如实施方案11-17中任一项所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以足以使患者的atp血液水平在治疗第14天增加至少40％的日量施用。
[0331]
19.如实施方案11-15中任一项所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每天100mg、200mg、400mg、600mg、700mg、1100mg或1500mg的量施用。
[0332]
20.如实施方案11-15中任一项所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每天200mg的量施用。
[0333]
21.如实施方案20所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每天一次(qd)以每天200mg的量施用。
[0334]
22.如实施方案20所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每天两次(bid)以每天100mg的量施用。
[0335]
23.如实施方案11-15中任一项所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每天400mg的量施用。
[0336]
24.如实施方案23所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每天一次(qd)以400mg的量施用。
[0337]
25.如实施方案23所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每天两次(bid)以200mg的量施用。
[0338]
26.如实施方案11-15中任一项所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每天600mg的量施用。
[0339]
27.如实施方案26所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每天两次(bid)以300mg的量施用。
[0340]
28.如实施方案11-15中任一项所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物以每天700mg的量施用。
[0341]
29.如实施方案28所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每天一次(qd)以700mg的量施用。
[0342]
30.如实施方案28所述的pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物每天两次(bid)以350mg的量施用。
[0343]
在其他实施方案中，本公开涉及以下编号的实施方案中的每一个：
[0344]
31.一种药物组合物，其包含化合物1和药学上可接受的载剂：
[0345][0346]
用于治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法中，所述方法包括每天向有需要的患者施用总共25mg-1,500mg的化合物1。
[0347]
32.如实施方案31所述的组合物，其中所述方法包括每天一次以单剂量施用化合物1。
[0348]
33.如实施方案31所述的组合物，其中所述方法包括每天以分剂量施用化合物1。
[0349]
34.如实施方案31-33中任一项所述的组合物，其中所述组合物向患者口服施用。
[0350]
35.如实施方案31-34中任一项所述的组合物，其中所述组合物配制成口服单位剂型。
[0351]
36.一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，所述方法包括以药物组合物的形式向有需要的患者口服施用每天总共25mg-1,500mg的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0352]
37.一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法中，所述方法包括以包含化合物1和药学上可接受的载剂的药物组合物的形式每天向有需要的患者口服施用总共25mg-1,500mg的化合物1：
[0353][0354]
38.如实施方案36-37中任一项所述的方法，其中(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮是所述药物组合物中唯一的pkr激活化合物。
[0355]
39.如实施方案36-38中任一项所述的方法，其包括每天一次以单剂量施用化合物1。
[0356]
40.如实施方案36-38中任一项所述的方法，其包括每天以分剂量施用化合物1。
[0357]
41.一种药物组合物，其包含用于治疗诊断患有镰状细胞病的患者的方法中的pkr激活化合物，所述方法包括以足以使患者红细胞中的2，3-dpg水平在24小时后降低至少30％的量向患者施用pkr激活化合物，其中所述pkr激活化合物是式i化合物：
[0358][0359]
或其药学上可接受的盐，其使用实施例2中描述的发光测定法，具有小于1μm的ac50值。
[0360]
42.如实施方案41所述的组合物，其中所述pkr激活化合物是化合物1：
[0361][0362]
或其药学上可接受的盐。
[0363]
43.如实施方案42所述的组合物，其中化合物1是施用给所述患者的唯一pkr激活化合物。
[0364]
44.如实施方案41-43中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物向患者口服施用。
[0365]
45.如实施方案41-44中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物每天施用一次。
[0366]
46.如实施方案41-45中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物以足以使患者红细胞中的2，3-dpg水平在24小时后降低至少40％的量施用。
[0367]
47.如实施方案41-46中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物以足以使患者的atp血液水平在治疗第14天增加至少40％的日量施用。
[0368]
48.如实施方案41-45中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物以每天100mg、200mg、400mg、600mg、700mg、1100mg或1500mg的量施用。
[0369]
49.如实施方案41-44中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物以每天200mg的量施用。
[0370]
50.如实施方案41-44中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物每天一次(qd)以每天200mg的量口服施用。
[0371]
51.如实施方案41-44中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物每天两次(bid)以每天100mg的量施用。
[0372]
52.如实施方案41-44中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物以单剂量或分剂量以每天400mg的量施用。
[0373]
53.如实施方案41所述的组合物，其中所述pkr激活化合物每天一次(qd)以400mg的量口服施用。
[0374]
54.如实施方案41-44中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物每天两次
(bid)以200mg的量施用。
[0375]
55.如实施方案41-44中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物以单剂量或分剂量以每天700mg的量施用。
[0376]
56.如实施方案41-44中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物每天一次(qd)以700mg的量施用。
[0377]
57.如实施方案41-44中任一项所述的组合物，其中所述pkr激活化合物每天两次(bid)以350mg的量施用。
[0378]
在其他实施方案中，本公开涉及以下实施方案中的每一个：
[0379]
一种增加有需要的患者体内镰状血红蛋白(hbs)的氧亲和力的方法，所述方法包括向所述患者施用足够量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，施用单剂量(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其盐增加患者中所述hbs的氧亲和力。
[0380]
一种抑制诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的hbs镰状化的方法，所述方法包括向所述患者施用足够量的组合物，所述组合物包含(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0381]
一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效的单剂量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐，使得患者在24小时后经历镰状化点(pos)随着eimin增加而左移。
[0382]
一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，包括以有效增加hbs的氧亲和力的量向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0383]
一种治疗方法，其包括以有效增加hba的氧亲和力的量向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
[0384]
一种治疗方法，其包括以有效增加hbs的氧亲和力的量向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，患者经诊断患有镰状细胞病或β地中海贫血。
[0385]
一种治疗方法，其包括以在患者中有效地引起镰状化点(pos)随着eimin增加而左移的量向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，患者经诊断患有镰状细胞病或β地中海贫血。
[0386]
一种增加诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中的hb浓度的方法，其包括向患者施用足够量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐。
基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，其中所述患者经诊断患有scd。
[0399]
在上述一些或任何实施方案中，向患者施用总共300mg qd的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，其中所述患者经诊断患有β地中海贫血。
[0400]
一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，其包括向有需要的患者重复施用总共300mg qd的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0401]
一种治疗诊断患有血红蛋白病的患者的方法，所述方法包括以有效增加患者中hbs的氧亲和力或提供患者中镰状化点(pos)随着eimin增加而左移或其组合的量施用pkr激活化合物。
[0402]
在上述一些或任何实施方案中，所述血红蛋白病是镰状细胞病或β地中海贫血。
[0403]
一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，其包括向有需要的患者重复施用400mg qd剂量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0404]
一种治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的患者的方法，其包括向有需要的患者重复施用300mg qd剂量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0405]
在上述一些或任何实施方案中，每天向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，持续至少7天。
[0406]
在上述一些或任何实施方案中，每天向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，持续至少14天。
[0407]
在上述一些或任何实施方案中，每天向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，持续至少28天。
[0408]
在上述一些或任何实施方案中，每天向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，持续至少60天。
[0409]
在上述一些或任何实施方案中，每天向患者施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，持续至少120天。
[0410]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者在入组前12个月内有1至10次脉管阻塞性危象(voc)事件并且在用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮治疗前，基线血红蛋白(hb)≥5.5至≤10.5g/dl。
[0411]
在上述一些或任何实施方案中，在用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或pkr激活化合物治疗时，所述患者在60天内没有接受过红细胞(rbc)输注或在28天内
没有接受过促红细胞生成素，没有肾功能不全，没有不受控制的肝病，未妊娠且未哺乳。
[0412]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮治疗，直到患者具有定义为与用安慰剂治疗的患者相比hb从基线增加＞1g/dl的hb响应率。
[0413]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮治疗，每日一次，连续至少24周。
[0414]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，每日两次，连续至少24周。
[0415]
一种方法，其包括向诊断患有血红蛋白病的患者施用治疗有效量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，所述治疗有效量有效地在有需要的患者中提供一种或多种作用，所述作用选自：增加患者中镰状血红蛋白(hbs)的氧亲和力；和抑制患者的hbs镰状化。
[0416]
一种在诊断患有镰状细胞病的患者中增加镰状血红蛋白(hbs)的氧亲和力或抑制hbs镰状化的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0417]
在上述一些或任何实施方案中，(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮口服施用。
[0418]
在上述一些或任何实施方案中，每日一次施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0419]
在上述一些或任何实施方案中，连续至少24周施用(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0420]
在上述一些或任何实施方案中，每天向所述患者施用每天总共300mg的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0421]
一种治疗方法，其包括向诊断患有血红蛋白病的患者施用治疗有效量的(r)-2-羟基-2-苯基-1-(5-(吡啶-2-基磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)乙-1-酮或其药学上可接受的盐的步骤。
[0422]
在上述一些或任何实施方案中，所述血红蛋白病是镰状细胞病、pkd或β地中海贫血。
[0423]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者具有选自hgb ss、hgb sβ+-地中海贫血、hgb sβ0-地中海贫血和hgb sc的血红蛋白基因型。
[0424]
在上述一些或任何实施方案中，所述血红蛋白基因型为hgb ss。
[0425]
在上述一些或任何实施方案中，所述血红蛋白基因型是通过血红蛋白电泳或基因分型确认的。
[0426]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者在所述施用前90天内没有开始羟基脲(hu)疗法。
[0427]
如权利要求1-55中任一项所述的方法，其中所述患者在所述施用前14天内没有接受过立赞利珠单抗。
[0428]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者在所述施用前7天内没有接受过沃克罗塔。
[0429]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者在所述施用前30天内没有接受过红细胞输注。
[0430]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者的血红蛋白水平为约7.0g/dl至约10.5g/dl。
[0431]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者≥12岁。
[0432]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者＜18岁。
[0433]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者＜12岁。
[0434]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者＜6岁。
[0435]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者＜3岁。
[0436]
在上述一些或任何实施方案中，所述方法包括改善患有hgb ss或hgb sb0-地中海贫血的患者中的贫血或与贫血相关的并发症。
[0437]
在上述一些或任何实施方案中，所述患者正在用作为cyp底物的并存药物治疗。
[0438]
在上述一些或任何实施方案中，所述并存药物是敏感的cyp底物。
[0439]
一种药物组合物，其包含化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐，用于通过以如通过向患者施用药物组合物后24小时测量的p50降低所测量的，有效地使hgba的氧亲和力增加的量向患者施用药物组合物来增加患者中hgba的氧亲和力。
[0440]
一种药物组合物，其包含化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐，用于通过以如通过向患者施用药物组合物后24小时测量的p50降低所测量的，有效地使hgbs的氧亲和力增加的量向患者施用药物组合物来增加诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中hgbs的氧亲和力。
[0441]
一种药物组合物，其包含化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮或其药学上可接受的盐，用于通过以有效地使向患者施用药物组合物后24小时测量的患者血液中的2，3-二磷酸甘油酸(2，3-dpg)减少的量向患者施用药物组合物来增加诊断患有镰状细胞病(scd)的患者中hgbs的氧亲和力。
[0442]
一种药物组合物，其包含化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮
或其药学上可接受的盐，用于治疗诊断患有溶血性贫血的患者，其中所述患者的溶血性贫血先前通过血红蛋白电泳或基因分型确认，表明为下列血红蛋白基因型之一：hgb ss、hgb sβ+-地中海贫血、hgb sβ0-地中海贫血或hgb sc。
[0443]
在一些实施方法中，本公开涉及：
[0444]
1.化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，用于向人类受试者每日单次(qd)施用200mg至1，000mg的(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0445]
2.如实施方案1所述的化合物，其用于使所述人类受试者血液中的2，3-dpg浓度在连续14天向所述受试者每日一次施用所述化合物后24-72小时降低。
[0446]
3.如实施方案1所述的化合物，其用于使所述人类受试者血液中的atp浓度在连续14天向所述受试者每日一次施用所述化合物后24-72小时增加。
[0447]
4.如实施方案1所述的化合物，其用于使所述人类受试者血液中的ldh浓度在连续14天向所述受试者每日一次施用所述化合物后24-72小时降低。
[0448]
5.如实施方案1所述的化合物，其用于使所述人类受试者血液中rbc的氧亲和力(p50)在向所述受试者施用一次所述化合物后24小时增加。
[0449]
6.如实施方案1所述的化合物，其用于激活pkr而不抑制芳香酶。
[0450]
7.如实施方案1所述的化合物，其用于激活pkr而无cyp抑制或诱导。
[0451]
8.如实施方案1所述的化合物，其用于在向所述试者施用所述化合物后72小时同时激活pkr，增加atp，减少2，3-dpg和增加所述受试者血液中的氧亲和力(p50)。
[0452]
9.如实施方案1-8中任一项所述的化合物，其中所述受试者经诊断患有镰状细胞病(scd)。
[0453]
10.如实施方案9所述的化合物，其用于治疗诊断患有镰状细胞病(scd)的小儿患者。
[0454]
11.如实施方案10所述的化合物，其中所述小儿scd患者小于12岁。
[0455]
12.如实施方案10所述的化合物，其中所述小儿scd患者年龄介于12至18岁之间。
[0456]
13.如实施方案10所述的化合物，其中所述小儿scd患者小于2岁。
[0457]
14.一种化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，其用于治疗具有hgb ss或hgb sc血红蛋白基因型的受试者的镰状细胞病。
[0458]
15.一种化合物(s)-1-(5-((2，3-二氢[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-基)磺酰基)-3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮，其用于增加具有选自hba、hba1、hba2、hbe、hbf、hbs、hbc、hbh和hbm的正常血红蛋白基因型且hbf《总血红蛋白的2％的受试者的红细胞的氧亲和力。
[0459]
本公开使得相关领域的技术人员能够根据多个和变化的实施方案来制作和使用本文提供的本发明。本领域技术人员容易想到的本公开的各种改变、修改和改进，包括某些改变、修改、替换和改进，也是本公开的一部分。因此，前面的描述和附图是以示例的方式说明本文提供的发现。
[0460]
实施例
[0461]
作为催化糖酵解最后一步的酶，pkr构成直接影响rbc代谢健康和主要功能的反应的基础。以下实施例证明了化合物1激活pkr如何影响rbc。化合物1对rbc的主要作用是减少2，3-dpg，认为其减少会降低hgb镰状化及其对rbc和氧输送至组织的影响。化合物1还增加atp，atp可提供代谢资源来在scd中支持细胞膜的完整性并防止可变形性的丧失和溶血水平的提高。结合化合物1对rbc的作用，它有可能减少镰状hgb的临床后遗症并为scd患者提供治疗益处。
[0462]
如实施例1所述制备命名为化合物1的pkr激活化合物，并在实施例2的生化测定法中测试pkr激活活性。
[0463]
pkr的生物酶促活性(即，atp和/或丙酮酸的形成)分别如实施例3和实施例4所述，在酶和细胞测定法中用化合物1进行评价。酶测定法结果显示，化合物1是重组wt-pkr和突变型pkr(例如，r510q)的激活剂，而突变型pkr是北美最普遍的pkr突变之一。pkr以二聚体和四聚体状态两者存在，但作为四聚体的功能最有效。化合物1是pkr的变构激活剂并且经证实会稳定pkr的四聚形式，从而降低对pep的km(米-曼二氏常数)。
[0464]
类似地，对人类scd患者的rbc的测定法结果显示，用化合物1治疗引起p50(在50％血红蛋白饱和度下的po2)的偏移并且这种偏移与在化合物1存在下的氧亲和力增加相关(实施例5)。此外，化合物1减少严重缺氧条件下的镰状化。总之，该数据表明，化合物1可以通过来自pkr激活的氧亲和力增加来减少细胞镰状化，从而减少镰状细胞的临床后果。
[0465]
小鼠体内测试(实施例8和实施例11)证明野生型小鼠中的pkr激活，并提供了对scd小鼠模型中rbc和hgb影响的评价。化合物1在高达测试的最高剂量下耐受良好，并且暴露量成剂量比例的方式增加。2，3-dpg水平对于≥120mg/kg剂量的化合物1而言降低＞30％(0至24小时auc(auc
0-24
＞5200小时
·
ng/ml)并且atp水平对于≥60mg/kg的化合物1而言增加＞40％(auc
0-24
＞4000小时
·
ng/ml)。在scd鼠类模型进行的两项研究中，在化合物1口服(食物)施用7天后，在小鼠rbc中离体观察到氧亲和力增加、镰状化减少和hgb增加。总的来说，这些数据支持化合物1治疗scd的暴露相关治疗益处。
[0466]
在实施例2的发光测定法中，化合物1激活丙酮酸激酶r的野生型以及g332s和r510q变体，其ac50小于1微摩尔。在实施例3的酶测定法中，化合物1激活野生型和r510q丙酮酸激酶，其ac50值小于0.1微摩尔。在实施例4的细胞测定法中，化合物1以浓度依赖性方式激活成熟人红细胞中的wt-pkr，其ec50小于0.5微摩尔。
[0467]
化合物1增加了来自健康受试者(hgba)和诊断患有镰状细胞病(hgbs)的患者体内的红细胞(rbc)中hgb的氧亲和力，如通过在50％血红蛋白氧合时的氧水平p50降低所测量的。p50的减少代表氧亲和力的增加。1小时后在rbc中观察到代表氧亲和力增加的p50偏移，并从诊断患有scd的患者获得的血液中维持至少3小时(实施例5)。将化合物1与来自健康志愿者和诊断患有scd的患者的rbc混合，引起通过对两种类型的rbc测量的p50值的降低来测量的氧亲和力增加(实施例6)。
[0468]
化合物1减少在2％氧的严重低氧条件下的细胞镰状化，提供高达约16％的保护百分比，该保护百分比定义为经处理的细胞中的活性水平，归一化至如实施例5中测量的暴露于严重低氧条件后未经处理的细胞中的活性水平。如实施例7所述，当通过在化合物1的存在下rbc可变形性改善和伸长指数(ei)降低来测量时，化合物1降低来自诊断患有scd的患者的rbc中的镰状化点(pos)。另外，在表达人hgbs的鼠类scd小鼠模型中化合物1增加缺氧
条件下对hgb的氧亲和力，降低p50，降低在低氧压下镰状化的rbc的百分比，并且增加镰状化的时间(实施例11)。
[0469]
实施例1：式i化合物的合成
[0470]
通过本文描述的方法获得pkr激活化合物1。化合物1的分子量为457.50da。
[0471]
步骤1.2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰氯(3)
[0472]
向用惰性氮气气氛吹扫和保持的100ml圆底烧瓶中放入n-buli在己烷中的溶液(2.5m，2ml，5.0mmol，0.54当量)和n-bu2mg在庚烷中的溶液(1.0m，4.8ml，4.8mmol，0.53当量)。将所得溶液在室温(20℃)下搅拌10分钟。在这之后滴加7-溴-2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶(2g，9.26mmol，1.00当量)在四氢呋喃(16ml)中的溶液，在-10℃下搅拌10分钟。将所得混合物在-10℃下搅拌1小时。在-10℃下将反应混合物缓慢地添加到硫酰氯溶液(16ml)中。将所得混合物在-10℃下搅拌0.5小时。然后通过在0℃下小心地添加30ml饱和氯化铵溶液，猝灭反应。将所得混合物用3x50ml二氯甲烷萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将残余物经硅胶柱色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1∶3)洗脱。这提供了1.3g(60％)呈白色固体的2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰氯。lcms m/z：c7h6clno4s计算值：235.64；实测值：236[m+h]
+
。
[0473]
步骤2.5-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡定7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-羧酸叔丁酯(4)
[0474]
向100-ml圆底烧瓶中放入2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰氯(1.3g，5.52mmol，1.00当量)、1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-羧酸叔丁酯(1.16g，5.52mmol)、二氯甲烷(40ml)和三乙胺(1.39g，13.74mmol，2.49当量)。将溶液在20℃下搅拌2小时，然后用40ml水稀释。将所得混合物用3x30ml二氯甲烷萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过用硅胶柱色谱法纯化，用二氯甲烷/甲醇(10∶1)洗脱。这提供了1.2g(53％)呈黄色固体的5-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-羧酸叔丁酯。lcmsm/z：c
18h23
n3o6s计算值：409.46；实测值：410[m+h]
+
。
[0475]
步骤3.2-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯(5)
[0476]
向100-ml圆底烧瓶中放入5-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b吡啶-7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-羧酸叔丁酯(1.2g，2.93mmol，1.00当量)、二氯甲烷(30ml)和三氟乙酸(6ml)。将溶液在20℃下搅拌1小时。将所得混合物真空浓缩。将残余物溶于10ml甲醇中并用碳酸氢钠(2mol/l)调节ph至8。将所得溶液用3x10ml二氯甲烷萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过用硅胶柱色谱法纯化，用二氯甲烷/甲醇(10∶1)洗脱。这提供了650mg(72％)呈黄色固体的2-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯。lcms m/z：c
13h15
n3o4s计算值：309.34；实测值：310[m+h]
+
。
[0477]
步骤4.(s)-1-(5-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶一7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(1)和(r)-1-(5-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(2)
[0478]
向100ml圆底烧瓶中放入2-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯(150mg，0.48mmol，1.00当量)、3-羟基-2-苯基丙酸(97mg，0.58mmol，1.20当量)、二氯甲烷(10ml)、hatu(369mg，0.97mmol，2.00当量)和diea(188mg，1.46mmol，3.00当量)。将所得溶液在20℃下搅拌过夜。将反应混合物用20ml水稀释，然后用3x20ml二氯甲烷萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过用二氯甲烷/甲醇(20∶1)洗脱的制备级tlc纯化，并通过制备级hplc(柱：xbridge c18obd prep柱，5μm，19mm x 250mm；流动相a：水(10mmol/l nh4hco3)，流动相b：mecn；梯度：8分钟内15％b至45％b，流速：20ml/min；uv检测器：254nm)进一步纯化。通过制备级手性hplc(柱，daicelif，2.0cm x 25em，5μm；流动相a：dcm，流动相b：meoh(15分钟内保持60％meoh)；流速：16ml/min；检测器，uv 254&220nm)分离两种对映异构体。这产生峰1(2，rt：8.47分钟)9.0mg(4％)呈黄色固体的(r)-1-(5-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮；和峰2(1，rt：11.83分钟)10.6mg(5％)呈黄色固体的(s)-1-(5-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮。
[0479]
(1)：1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.13(d，j＝2.0hz，1h)，7.61(d，j＝2.0hz，1h)，7.31-7.20(m，5h)，4.75(t，j＝5.2hz，1h)，4.50-4.47(m，2h)，4.40-4.36(m，1h)，4.32-4.29(m，2h)，4.11-3.87(m，8h)，3.80-3.77(m，1h)，3.44-3.41(m，1h)。lc-ms(esi)m/z：c
22h23
n3o6s计算值：457.13；实测值：458.0[m+h]
+
。
[0480]
(2)：1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.13(d，j＝2.0hz，1h)，7.60(d，j＝2.0hz，1h)，7.31-7.18(m，5h)，4.75(t，j＝5.2hz，1h)，4.52-4.45(m，2h)，4.40-4.36(m，1h)，4.34-4.26(m，2h)，4.11-3.87(m，8h)，3.80-3.78(m，1h)，3.44-3.43(m，1h)。lc-ms(esi)m/z：c
22h23
n3o6s计算值：457.13；实测值：458.0[m+h]
+
。
[0481]
步骤5.(s)-1-(5-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(1)
[0482]
可替代地，化合物1可以使用这里描述为步骤5的程序合成。将7-((3，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1h)-基)磺酰基)-2，3-二氢-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶(130.9mg，0.423mmol)在dmf(2.5ml)中的溶液在冰浴上冷却，然后用(s)-3-羟基-2-苯基丙酸(84.8mg，0.510mmol)、hatu(195.5mg，0.514mmol)和diea(0.30ml，1.718mmol)处理并在环境温度下搅拌过夜。将溶液用etoac(20ml)稀释，依次用水(20ml)和盐水(2x20ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤，用硅胶处理并减压蒸发。将材料通过biotage mplc(10g硅胶柱，0至5％meoh于dcm中)进行色谱以提供白色、微粘的固体。使样品重新吸附到硅胶上并进行色谱(10g硅胶柱，0至100％etoac于己烷中)，以提供呈白色固体的(2s)-1-(5-[2h，3h-[1，4]二噁英并[2，3-b]吡啶-7-磺酰基]-1h，2h，3h，4h，5h，6h-吡咯并[3，4-c]吡咯-2-基)-3-羟基-2-苯基丙-1-酮(106.5mg，0.233mmol，55％收率)。
[0483]
步骤6.制备化合物1的喷雾干燥分散体
[0484]
制备化合物1的喷雾干燥分散体(sdd)。sdd由1∶3比率的化合物1和聚合物(羟丙基甲基纤维素as-mg)组成。将化合物1和聚合物溶解在有机溶剂(二氯甲烷和甲醇)中并喷雾干燥以获得无定形的原料药。
[0485]
根据表a，在80：20 dcm：甲醇中以7.8％的固体含量(1∶3化合物1：hpmc as-mg)配制喷雾溶液。使用0.966的api校正因子制备喷雾溶液。通过将dcm和甲醇添加到36l不锈钢混合容器来制备喷雾溶液。将hpmc as-mg添加到溶剂体系中，同时用自上而下的混合器以中等涡旋混合。然后将化合物1添加到溶液中。该溶液具有黄色/棕色透明外观。
[0486]
表a
[0487]
组分制剂％重量，g化合物12.00％595.0hpmc as-mg5.81％1724.3dcm73.75％21896.0甲醇18.44％5474.0总计100.0％29689.3
[0488]
校正因子：0.9660
[0489]
根据表b设置移动式小型喷雾干燥装置并在喷雾前预热大约一小时。洗涤溶液(80∶20 dcm：甲醇)在活性溶液之前喷雾，以使喷嘴平衡。化合物1活性溶液按表b中的设置喷雾。将喷雾干燥的分散体在shel真空炉中在50℃和-25 in hg真空中，在15 scfh的氮气吹扫下干燥过夜(～20小时)。通过gc分析确认所得喷雾干燥的分散体是干燥的。这次运行生成大约2.1kg喷雾干燥的分散体。
[0490]
表b
[0491][0492][0493]
实施例2：用于鉴定pkr激活活性的生化测定法
[0494]
pkr激活化合物可以用实施例2的生化发光测定法鉴定。使用下面的发光测定法评价一系列化学化合物的pkr激活活性，包括命名为化合物1和化合物2的化合物或其混合物。
[0495]
对于测试的每种化合物，激活pkr的能力使用以下发光测定法来测定。pkr磷酸化腺苷-5
′‑
二磷酸(adp)的作用通过激酶glo plus测定法(promega)在fbp(d-果糖-1，6-二磷
酸；boc sciences，cas：81028-91-3)存在或不存的情况下测定，如下。除另有说明外，否则所有试剂均从sigma-aldrich购得。所有试剂在含有50mm tris-hcl、100mm kcl、5mm mgcl2和0.01％triton x100、0.03％bsa，和1mm dtt的缓冲液中制备。酶和pep(磷酸烯醇丙酮酸)以2x添加到含有测试化合物或dmso媒介物的连续稀释液的测定准备板的所有孔中。pkr(wt)、pkr(r510q)和pkr(g332s)的最终酶浓度分别为0.8nm、0.8nm和10nm。最终pep浓度为100μm。酶/pep混合物在室温下与化合物一起温育30分钟，然后添加2x adp和kinasegloplus开始测定。adp最终浓度为100μm。kinasegloplus的最终浓度为12.5％。对于含有fbp的测定法，该试剂在反应开始后以30μm添加。使反应在室温下进行45分钟，直到bmg pherastar fs多标签读取仪记录到发光。该化合物在0.83％dmso中以42.5μm至2.2nm范围的浓度测试，一式三份。通过activitybase xe运行器的标准四参数拟合算法(最大值、最小值、斜率和ac
50
)获得ac
50
测量。化合物的ac
50
值是沿着四参数逻辑曲线拟合的活性介于最小活性和最大活性之间一半时的浓度(μm)。
[0496]
如下面表2和表3所示，ac
50
值定义如下：≤0.1μm(+++)；＞0.1μm和≤1.0μm(++)；＞1.0μm和≤40μm(+)；＞40μm(0)。
[0497][0498]
表2.发光测定数据
[0499][0500]
表3.附加发光测定数据
[0501][0502][0503]
本文所述的化合物和组合物是野生型pkr和与野生型相比具有较低的活性的某些pkr突变体的激活剂。pkr中的此类突变可以影响酶活性(催化效率)、调节性质和/或酶的热稳定性。pkr突变的一个实例是g332s。pkr突变的另一个实例是r510q。
[0504]
实施例3：pkr激活化合物的酶测定法
[0505]
测量化合物1在基于酶的测定法中激活pkr的能力。如图7所示，在某些生理条件下，观察到由vmax(最大酶活性速率的生化量度)测量的pkr活性高达1.8倍的显著增加。具体而言，针对等于或低于km的磷酸烯醇丙酮酸或pep浓度来评价不同浓度的化合物1对pkr的激活。
[0506]
针对wt-pkr和pkr-r510q，评价2μm化合物1对最大速度(v
max
)和pep km(米-曼二氏常数，即v＝1/2v
max
时的pep浓度)的影响。试验在存在和不存在果糖-1，6-二磷酸(fbp)(一种已知的pkr变构激活剂)的情况下进行。在室温下进行长达60分钟的评估，并计算v
max
和pep km。化合物1对v
max
的影响范围从没有影响到适度增加(参见图7的代表性曲线)。～对于wt-pkr和pkr-r510q而言在存在或不存在fbp的情况下，化合物1持续性降低pep km，通常降低2倍(表4)，证明在pep的生理浓度下，化合物1可提高pkr比率。
[0507]
表4.化合物1对pkr酶动力学参数的影响
[0508][0509]
a相对于同一行的其他值，表4中的所有值都归一化为1.00。
[0510]
针对等于或低于km的pep浓度，评价不同浓度的化合物1对wt-pkr和pkr-r510q的激活。化合物1增加atp形成速率，ac
50
值的范围为＜0.05至＜0.10μm并且范围为＜2.0至＜3.0最大倍数激活(即，＜200％至＜300％)(表5)。来自pkr-r510q的代表性数据显示，该作用是浓度依赖性的(图8)。
[0511]
表5.化合物1对pkr野生型和突变型的激活
[0512]
pk酶最大倍数激活ac
50
(μm)wt-pkr＜2.0＜0.05pkr r510q＜3.0＜0.10
[0513]
实施例4：pkr激活化合物的细胞测定法
[0514]
在从research blood component购得的纯化rbc中评价化合物1对离体人成熟红细胞中wt-pkr的激活。在含葡萄糖的培养基中用化合物1处理3小时的细胞经洗涤、裂解并使用biovision丙酮酸激酶测定法(k709-100)进行测定。该测定法重复多次，以解释供体间可变性和相对狭窄的动态范围。平均最大激活作用增加(最大值-最小值)＜100％且平均50％有效浓度(ec
50
)＜125nm(表6)。wt-pkr以浓度依赖性方式激活(图9)。
[0515]
表6.用化合物1处理的人红细胞中的野生型pkr激活
[0516]
重复实验最大值-最小值(％)ec
50
(nm)1＜125＜2502＜150＜1503《100《504《50《50平均值《100《125
[0517]
使用ficoll梯度从全血中新鲜分离小鼠rbc并用与人类rbc测定法中使用的那些相似的方法进行测定。最大激活增加和ec
50
值与人类rbc中的作用相当(表7)。
[0518]
表7.化合物1对小鼠红细胞中pkr激活的影响
[0519]
重复实验最大值-最小值(％)ec
50
(nm)1《50《1252《100《125平均值《100《125
[0520]
实施例5：pkr激活化合物的离体药理学
[0521]
使用来自scd患者的红细胞评价化合物1对低氧条件下hgb对氧的亲和力(即，氧亲和力)和镰状化的影响。将细胞与hepes缓冲盐水(hbs)(未处理)、hbs+二甲基亚砜(dmso)(媒介物)或10μm化合物1一起在37℃下温育1、2和3小时。为了评估氧解离，在脱氧期间收集hgb氧平衡曲线。
[0522]
在用化合物1处理的细胞中，血红蛋白饱和度向左偏移，而在未经处理或0.5％dmso处理的细胞中则没有(图10和图11)。氧亲和力增加对应于p50在1小时后从29至25mmhg的显著(但有限)的偏移，该偏移保持到至少3小时，即评价的最后一个时间点(表8)。值得注意的是，在温育的前2小时内，氧亲和力不受dmso影响。
[0523]
表8.化合物1对血红蛋白饱和度的影响a
[0524]
[0525]
a相对于其他值，表8中的所有值都归一化为1.00。b未处理的细胞是在培养基中以40％红细胞比容洗涤而未温育的rbc。
[0526]
在每个po2下与26.7mmhg的正常po2相比，用化合物1处理的细胞中hgb饱和度的平均偏移在25mmhg左右最为明显(图12)。因此，氧亲和力的偏移发生在与镰状化相关的氧张力下。在2小时时，hgb饱和度比dmso处理的细胞高大约10％。在较低po2(在1％至2％的氧下为大约10mmhg)下，即使在1小时时用化合物1处理的细胞与用dmso处理的那些之间存在明显差异。
[0527]
化合物1(10μm)减少在2％氧的严重低氧条件下(po2＜20mmhg)的细胞镰状化，持续长达20分钟(表9)。保护百分比(即，经处理细胞中的活性水平，归一化为暴露于严重低氧条件后未处理细胞中的活性水平)在低氧条件下15分钟时达到最大16％(图13)并在测量的最后一个时间点保持在15％。
[0528]
表9.化合物1对低氧条件下人scd细胞镰状化的影响
[0529][0530]
实施例6：在体外研究中将化合物1与来自健康供体和scd供体的rbc混合时血红蛋白氧亲和力(p50)的增加
[0531]
如图14所示，将化合物1与来自健康供体和scd供体的rbc混合，分别增加hba和hbs rbc中的rbc氧亲和力，如曲线的向左移所反映的，可通过50％血红蛋白氧合时的氧水平或p50来表征。与化合物1体外温育增加hba rbc中的氧亲和力，与健康志愿者研究中的临床结果一致，并增加hbs rbc中的氧亲和力，表明镰状rbc中的pkr酶也对pkr激活剂有响应，并且所得的2，3-dpg减少使hbs-o2亲和力增加。黑色和绿色曲线代表健康供体，而蓝色和红色虚线曲线代表scd供体。p50的降低表明血红蛋白对氧的亲和力增加。如图14所示，化合物1使scd氧亲和力正常化，引起经化合物1处理的scd供体的红色虚线曲线与未处理的健康供体的黑色曲线重叠。
[0532]
实施例7：scd rbc中镰状化点的降低
[0533]
在镰状rbc中，化合物1增加pkr激活的生物学后果在图15中展示。我们观察到化合物1对scd rbc镰状化的影响，通过镰状rbc在降低(然后增加)氧水平下的可变形性或伸长指数(ei)和定义为观察到ei下降时的po2浓度的镰状化点(pos)来测量。如图15所示，分别在存在和不存在化合物1的情况下测量po2浓度的实线和虚线曲线的比较证明，化合物1处理改善了在较低氧张力下的rbc可变形性，表明化合物1处理的镰状rbc可以保持较高水平的可变形性，因为在较低氧水平下rbc横穿微脉管系统。
[0534]
图16和图17提供了进一步的数据，证明在hbs rbc中在体外脱氧条件下化合物1改
善可变形性。如图16所示，在体外用化合物1处理的hbs rbc具有比用dmso处理的hbs rbc更低的p50。如图17所示，用化合物1(20μm)处理的hbs rbc具有比用dmso处理的hbs rbc更大的伸长指数，如通过氧扫描(氧梯度激光衍射法)测量的。
[0535]
实施例8：化合物1在野生型小鼠中的药代动力学/药效学研究
[0536]
在balb/c小鼠中进行两项药代动力学(pk)/药效学(pd)研究，所述小鼠以0(媒介物)、3.75、7.5、15、30、60mg/kg(研究1)；0(媒介物)、7.5、15、30、60、120或240mg/kg(研究2)的剂量，每日一次通过口服灌胃施用化合物1(配制在10％克列莫佛(cremophor)el/10％pg/80％di水中)，持续7天(qd
×
7)。第7天，给药后24小时收集全血并快速冷冻。稍后将样品解冻并通过lc/ms分析2，3-dpg和atp水平。在两项研究中，化合物1耐受良好。未观察到不良临床体征并且体重变化与媒介物组相比无差异。
[0537]
2，3-dpg水平随化合物1处理而降低(图18a和图18b(研究1和2)以及图19(研究2))。一般而言，减少率在≥15mg/kg化合物1时＞20％，且对于120和240mg/kg化合物1而言＞30％。总的来说，最高剂量的结果提供了2，3-dpg随着pkr激活而减少的体内证据。
[0538]
在这些研究中对atp水平的评价显示，用化合物1处理提高atp水平。在研究1中，与媒介物相比，用30和60mg/kg的化合物1时atp分别提高21％和79％，并且在研究2中，用高达120mg/kg的化合物1时atp水平随着暴露而提高加，与媒介物相比最大增量为～110％(图20a和图20b)。在最高剂量240mg/kg的化合物1下，atp水平提高45％。atp水平与化合物1暴露量以在两个研究中相似方式相关。
[0539]
实施例9：化合物1在非人灵长类动物中以剂量依赖性方式增加atp浓度并减少2，3-dpg
[0540]
测量来自以100、300和550mg/kg接受日剂量的化合物1持续28天的非人灵长类动物的血细胞中的atp水平。观察到atp水平的剂量依赖性提高，如图21所示，与处理前相比，在550mg/kg最高剂量下达到90％。
[0541]
实施例10：化合物1在非人灵长类动物中以剂量依赖性方式降低2，3-dpg浓度
[0542]
测量来自以100、350和550mg/kg接受日剂量的化合物1持续28天的非人灵长类动物的血细胞中的2，3-dpg水平。观察到2，3-dpg水平的剂量依赖性降低，如图22所示，与预处理水平相比降低高达40％。
[0543]
实施例11：在berkeley ss小鼠模型中测试pkr激活化合物
[0544]
berkeley ss小鼠模型中的靶向基因缺失和人类转基因产生几乎只表达人类hgbs(p
á
szty c.transgenic and gene knock-out mouse models of sickle cell anemia and the thalassemias.curr opin hematol.1997年3月；4(2)：88-93)并模拟人类scd的遗传学、血液学和组织病理学特征的小鼠。这些包括不可逆性镰状rbc、贫血和多器官病理。
[0545]
在berkleyss小鼠中评价化合物1对hgb对氧的亲和力、镰状细胞百分比和/或hgb的影响。在小鼠持续7天于小鼠食物中随意接受0或1000ppm化合物1的情况下进行两项研究。第7天抽血并且在低氧条件下进行分析。通过advia测量红细胞参数。
[0546]
在两项研究之间的发现相对一致。低氧条件下对hgb的氧亲和力增加且p50降低(图23a、图23b、图24a和图24b)。观察到对镰状化的积极影响，使得随着化合物1处理在低氧压下镰状化的rbc百分比减少(图25)并且镰状化的时间增加。此外，hgb增加≈1g/dl。总的来说，这些变化支持化合物1将会减少细胞镰状化并积极影响镰状rbc下游临床并发症的假说。化合物1还降低了经处理的小鼠中的网织红细胞水平(图26)，表明红细胞裂解减少。
[0547]
实施例12：评估化合物1在健康志愿者和镰状细胞病患者中的安全性、药代动力学和药效学的sad/mad研究
[0548]
在随机、安慰剂对照、双盲、单个上升和多个上升剂量研究中评价化合物1，以评估在健康志愿者和镰状细胞病患者中化合物1的安全性、药代动力学和药效学。本文公开了化合物1用于治疗人类镰状细胞病的用途。
[0549]
镰状细胞病(scd)的特点是血红蛋白s(hbs)在脱氧后聚合，导致红细胞(rbc)镰状化，并且随后发生氧化/膜损伤、溶血、炎症、细胞粘附和脉管阻塞。加剧scd的发病，hbs rbc具有1)增加的2，3-dpg伴随着降低的氧亲和力(增加的p50)(参见图27)；和2)减少的rbc atp。事实上，镰状rbc含有比健康rbc更多的2，3-dpg，导致血红蛋白o2亲和力降低(即，p50增加)和o2的早期释放(导致hbs脱氧、聚合和镰状化)。镰状rbc也没有足够的能量(即，atp比正常rbc少)来进行膜的维持和修复，从而促成溶血和缩短的rbc寿命。化合物1是红细胞丙酮酸激酶(pkr)的一种新型小分子变构激活剂并且起到rbc代谢调节剂的功能，从而引起rbc中的2，3-dpg减少和atp水平升高。化合物1是丙酮酸激酶r(pkr)的口服激活剂，它在红细胞中的减少2，3-dpg且增加atp。如图4所示，(1)2，3-dpg的减少可引起hbs的o2亲和力增加，从而减少hbs聚合和rbc镰状化；并且(2)atp产生的增加可改善镰状rbc修复和膜健康，从而减少溶血。因此，化合物1的多模式作用可在scd患者体内改善血红蛋白水平并降低脉管阻塞率。在临床前安全性研究中，化合物1对类固醇生成没有影响，展示出药物-与-药物相互作用的低风险，并且在施用的最大剂量下在体内耐受良好。一项在健康受试者(hs)和患有scd的受试者中评价化合物1的首次人类1期研究已经开始。本研究的目的是评价化合物1在hs和患有scd的受试者中的安全性和pk/pd。
[0550]
如图28所示，评估化合物1的安全性和pk/pd的试验是在健康成人志愿者中进行的随机、安慰剂对照、双盲、单剂量和mad试验，以及在患有scd的青少年或成人患者中进行的单剂量和mad试验。该试验还包括为期12周的给药队列，在该队列中多达20名scd患者将各自接受多达84个连续日剂量的化合物1。
[0551]
化合物1是丙酮酸激酶红细胞同工酶(pkr)的口服小分子激动剂，正在开发用于治疗溶血性贫血。这项人类临床试验研究将在健康志愿者和镰状细胞病患者中在1期研究背景下，表征单个上升剂量和多个上升剂量的化合物1的安全性、耐受性和药代动力学/药效学(pk/pd)。在健康志愿者中，还会评价食物对化合物1吸收的影响。
[0552]
研究的目的包括以下：
[0553]
1.评价单个上升剂量和多个上升剂量的化合物1在健康志愿者和镰状细胞病(scd)患者中的安全性和耐受性。
[0554]
2.表征化合物1的药代动力学(pk)。
[0555]
3.评价在单个和多个剂量的化合物1后健康志愿者和scd患者红细胞(rbc)中2，3-二磷酸甘油酸(dpg)和三磷酸腺苷(atp)的水平。
[0556]
4.评价健康志愿者中化合物1血浆浓度与对qt间隔的潜在影响之间的关系。
[0557]
5.评价单个上升剂量的化合物1对健康志愿者心电图(ecg)参数(心率、pr和qrs间隔及t波形态)的影响。
[0558]
6.探讨食物对健康志愿者中化合物1的pk的影响。
[0559]
7.探讨化合物1暴露量和响应变量(视情况而定，诸如安全性、药效学(pd)、血液学
参数)的关联。
[0560]
8.探讨化合物1在单个和多个剂量后对rbc功能的影响。
[0561]
9.探讨化合物1在scd患者中多个剂量后对rbc代谢、炎症和凝结的影响。
[0562]
10.探讨化合物1对rbc血红蛋白-o2亲和力和膜力学的影响。
[0563]
这是化合物1的首次人类试验(fih)1期研究，该研究将表征首先在健康成人志愿者中，然后在患有镰状细胞病的青少年或成人中在单个剂量后和在重复给药后化合物1的安全性、pk和pd。表10中汇总了在研究中待采用的研究臂和指定的干预措施。最初，将在健康受试者中探讨单个上升剂量(sad)递增队列中化合物1的剂量范围。一旦至少两个sad队列的安全性和pk可用于告知研究的2周mad部分的剂量，则将开始将健康受试者招募至2周的多个上升剂量(mad)递增队列。然后，mad队列将与单剂量队列并行运行。计划单剂量队列以了解对化合物1的pk的食物效应(fe)。在健康受试者中的sad和fe研究完成后，然后将在镰状细胞病(scd)受试者中评价发现在健康受试者中是安全的单剂量化合物1的安全性、pk和pd。在健康志愿者中的mad研究完成后，然后将开始scd受试者体内的多剂量研究。化合物1将以口服递送的25mg和100mg片剂的形式施用。
[0564]
在这项研究中，sad/mad队列随机(3：1)接受化合物1或安慰剂(p)。首先在4个健康sad队列和4个健康mad(14天给药期)队列中评价化合物1。基于安全性和来自hs的pk/pd特性，然后在1个scd sad队列和2个scd mad队列中评价化合物1。具体地，基于在健康志愿者研究中的安全性和药代动力学/药效学(pk/pd)特性，在scd患者(pt)中，首先在单剂量(sd或sad)队列中，然后在多剂量(md或mad)队列中(14天和12周)评价化合物1。安全性评估包括ae、生命体征、ecg和实验室参数。在第1天(sad/mad)和第14天(mad)及最后一个剂量后多大72小时和研究结束随访时进行pk/pd采血。pd参数包括所有队列中的2，3-dpg、atp和p50，仅在scd队列中进行附加pd研究(包括氧扫描)。pd参数包括2，3-dpg、atp、p50、rbc可变形性，以及受控制的脱氧和再氧合(氧扫描)和变化的克分子渗透压浓度(渗透压扫描))。为了保持研究是设盲的，需要时去除患者标识符。
[0565]
表10.
[0566]
[0567]
[0568][0569]
表11.
[0570]
剂量水平/队列剂量片剂强度(#/天)sad1200mg100mg(2/天)sad 2400mg100mg(4/天)sad 3700mg100mg(7/天)sad 41100mg100mg(11/天)sad 51500mg100mg(15/天)
[0571]
表12.
[0572][0573]
结果量度
[0574]
主要结果量度：
[0575]
1.在成人健康志愿者和scd患者中，按ctcae v5.0，单个上升剂量和多个上升剂量的化合物1的不良事件(ae)的发生率、频率和严重程度。
[0576]
[时间框架：长达3周的监测]
[0577]
2.最大观测血浆浓度(cmax)
[0578]
[时间框架：长达3周的测试]
[0579]
3.达到最大观测血浆浓度的时间(tmax)
[0580]
[时间框架：长达3周的测试]
[0581]
4.从零时到24小时时间点的血浆浓度-时间曲线下面积(auc0-24)
[0582]
[时间框架：长达3周的测试]
[0583]
5.从零时到最后可量化时间点的血浆浓度-时间曲线下面积(auc0-最后)
[0584]
[时间框架：长达3周的测试]
[0585]
6.从零时到无限的血浆浓度-时间曲线下面积(auc0-inf)
[0586]
[时间框架：长达3周的测试]
[0587]
7.终末消除半衰期(t1/2)
[0588]
[时间框架：长达3周的测试]
[0589]
8.表观清除率(cl/f)
[0590]
[时间框架：长达3周的测试]
[0591]
9.表观分布体积(vd/f)
[0592]
[时间框架：长达3周的测试]
[0593]
10.终末处理速率常数(lz)
[0594]
[时间框架：长达3周的测试]
[0595]
11.肾脏清除率(cir)
[0596]
[时间框架：长达3周的测试]
[0597]
次要结果量度：
[0598]
12.在单个和多个剂量的化合物1后健康志愿者和scd患者红细胞(rbc)中2，3-二磷酸甘油酸(dpg)和三磷酸腺苷(atp)的水平从基线的变化。
[0599]
[时间框架：长达3周的测试]
[0600]
13.在健康志愿者中在单剂量化合物1后，在估计的cmax下使用fridericia校正公式(qtcf)和90％置信区间校正的从基线qt间隔变化的基于模型的估计值。
[0601]
[时间框架：长达7天]
[0602]
14.在健康志愿者中在单剂量化合物1后从基线心率的变化
[0603]
[时间框架：长达7天]
[0604]
15.在健康志愿者中在单剂量化合物1后从基线pr的变化
[0605]
[时间框架：长达7天]
[0606]
16.在健康志愿者中在单剂量化合物1后从基线qrs的变化
[0607]
[时间框架：长达7天]
[0608]
17.在健康志愿者中在单剂量化合物1后从基线t波形态的变化
[0609]
[时间框架：长达7天]
[0610]
探索性结果量度：
[0611]
18.食物对c
max
、auc
0-24
/auc
最后
的影响
[0612]
19.如通过暴露量-向应分析评估的，auc
最后
/auc
0-24
、c
max
、最小血浆浓度(c
min
)、峰谷比、剂量线性关系、累积率对安全性、pd和目标血液学参数的影响
[0613]
20.在化合物1的单剂量和长期给药之后rbc中2，3-dpg减少对氧合血红蛋白解离曲线(p50；50％的血红蛋白被o2饱和时的o2分压)的影响
[0614]
21.通过渗透梯度激光衍射法和氧梯度激光衍射法测定长期化合物1给药对正常和scd rbc可变形性的影响
[0615]
22.长期化合物1给药对scd患者中scd rbc对氧化应激的响应的影响(包括谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶水平的评价)
[0616]
23.长期化合物1给药对scd患者中可测量的炎症标志物(c反应蛋白、铁蛋白、白细
胞介素[il]-1β、il-6、il-8和肿瘤坏死因子-α)的影响
[0617]
24.长期化合物1给药对scd患者中可测量的高凝标志物(d-二聚体、凝血酶原1.2和凝血酶-抗凝血酶[tat]复合物)的影响
[0618]
资格
[0619]
·
最低年龄：18岁(健康志愿者)；12岁(scd受试者)
[0620]
·
最高年龄：60或65岁
[0621]
·
性别：全部
[0622]
·
基于性别的：否
[0623]
·
接受健康志愿者：是
[0624]
纳入标准：
[0625]
·
健康志愿者：受试者必须介于18至60岁之间；scd：受试者必须介于12岁至50岁或65岁之间
[0626]
·
受试者必须能够理解并签署书面知情同意书，书面知情同意书必须在任何研究相关的程序完成之前获得。
[0627]
·
健康志愿者：基于病史、体格检查、生命体征、实验室特性和12导联ecg的结果，受试者必须总体健康状况良好；scd：先前诊断为镰状细胞病(血红蛋白电泳或基因型)。
[0628]
·
受试者的体重指数(bmi)必须在18kg/m2至33kg/m2(含端值)的范围内且最低体重为50kg(健康志愿受试者)或40kg(scd受试者)
[0629]
·
对于scd患者，先前通过血红蛋白电泳或基因分型确认的镰状细胞病，指示以下血红蛋白基因型之一：hgb ss、hgb sβ
+-地中海贫血、hgb sβ
0-地中海贫血或hgb sc
[0630]
·
所有有生育潜力的男性和女性必须同意在研究参与期间和最后一次研究药物施用后90天使用医学上接受的避孕方案。
[0631]
·
受试者必须愿意遵守所有研究要求和限制。
[0632]
排除标准(健康志愿者)：
[0633]
·
临床上显著的医学病状或其他可能显著干扰研究药物的吸收、分布、代谢或排泄，或使受试者作为该研究的参与者而处于不可接受的风险中的病状的证据
[0634]
·
临床上显著的心脏病病史，包括病状扰乱
[0635]
·
异常的血液、肾和肝功能研究
[0636]
·
吸毒或酗酒史
[0637]
排除标准(scd受试者)：
[0638]
·
在过去12个月内有超过6次脉管阻塞性危象(voc)，需要去医院、急诊室或诊所随访
[0639]
·
在过去6个月内有至少一次急性胸部综合征发作
[0640]
·
接受了以下任何批准用于scd的疗法：
[0641]
·
羟基脲(hu)：如果在研究处理第1天之前《90天开始hu，则排除
[0642]
·
立赞利珠单抗：如果在研究处理第1天前14天内接受过输注，则排除
[0643]
·
沃克罗塔：如果在研究处理第1天开始前7天内接受过一个剂量，则排除
[0644]
·
在开始研究药物30天内接受过红细胞输注
[0645]
·
血红蛋白＜7.0g/dl或＞10.5g/dl
[0646]
·
不能服用和吸收口服药物
[0647]
结果(健康受试者)
[0648]
在1期试验中，至少90名健康志愿者已经接受了化合物1(n＝70)或安慰剂(n＝20)。八名scd患者已经接受了设盲试验药物或安慰剂，作为单剂量试验队列的一部分(n＝7)或作为第一个14天剂量mad 1)队列的一部分(n＝1)。迄今，化合物1已经展示出有前景的耐受性特性和非时间依赖性的pk特性。
[0649]
已经在hs sad/mad/食物效应队列(n＝90)和scd sad队列(n＝6)中对化合物1进行了评价。在hs研究中，化合物1耐受良好并且表现出有利的安全性特性，在接受单剂量(4％)或14天(28％)化合物1的hs和1/6接受化合物1/p(设盲)的scd受试者中，1级头痛作为最常见的ae报告。在hs和scd患者中化合物1的pk特性相似。化合物1被迅速吸收，中位tmax为给药后1小时，t1/2为～10-13小时，且auc0-24为～7000h.ng/ml。在健康受试者中未观察到对睾酮或雌二醇水平的影响。
[0650]
在hs研究中，化合物1表现出线性和非时间依赖性的pk，并且在所有剂量水平下在给药24小时后(2，3-dpg减少，p＜0.0001)和14天后(atp增加，p＜0.0001)后观察化合物1的pd活性。这种pd响应的生物学后果是在化合物1给药24小时内氧亲和力增加(p50减少，p＜0.0001)并且到给药期的第4天在所有化合物1剂量队列中绝对网织红细胞计数减少(p＜0.0001)且血红蛋白水平略有提高(ns)。
[0651]
在200、400、700和1000mg剂量下评价四个健康sad队列，并且四个健康mad队列在14天内以qd或bid给药(100mg bid、200mg bid、300mg bid和400mg qd)接受200至600mg的总日剂量。在食物效应(fe)队列中，10名健康受试者在有食物和无食物的情况下接受200mg化合物1qd。
[0652]
表13中提供了sad和mad队列中健康志愿者的人口统计资料和基线特征。
[0653]
表13.人口统计资料和基线特征
[0654][0655]
[0656]
在健康志愿者的sad和mad队列中，没有报告导致退出的严重不良事件(sae)或ae。表14中提供了在健康志愿者队列中记录的治疗紧急不良事件。在表14报告的teae中，sad队列中与化合物1相关的2级或更低级的teae包括头痛(n＝1)和瞬态室性心动过速(n＝1)，各自发生在不同受试者中。mad队列中与化合物1相关的2级或更低级的teae包括头痛(n＝4)、心悸(n＝1)和嗜眠(n＝1)，各自发生在不同受试者中。安慰剂队列中2级或更低级的teae包括一名受试者体内的头痛。一个3级teae与化合物1无关。在1000mg剂量下在一名受试者中注意到短暂的无症状脂肪酶升高。独立地重新评估受试者的备用样品，并且没有检测到脂肪酶升高。
[0657]
表14.健康志愿者：治疗紧急不良事件
[0658][0659]
在pk评估中，化合物1被迅速吸收，中位t
max
为给药后1小时。图29说明了单剂量后健康志愿者中血浆化合物1的药代动力学。从单剂量到700mg，观察到线性药代动力学，t
1/2
为11-15小时。在剂量≥700mg时，单剂量暴露量以大于剂量比例的方式增加。在多剂量递送的bid或qd时，在所有剂量水平(100-300mg bid、400mg qd)都观察到线性pk，且暴露量在第14天之前保持稳定，没有累积效应。给药14天后，未观察到暴露量的显著变化。在进食/禁食条件下化合物1的暴露量相似。
[0660]
在经化合物1治疗的受试者中评价的所有剂量水平下都展示出pd活性(表15)。表15报告了sad和mad队列中在所有剂量和时间点的2，3-dpg、atp和p50的平均最大百分比变化。如表15所示，在sad和mad队列中均观察到相对于基线，2，3-dpg和p50的平均减少和atp的平均增加。在单剂量化合物1的24小时内，观察到2，3-dpg随着p50相应增加而减少。在14天的化合物1给药后，这些pd效应随同atp增加高于基线而得以维持。因此，2，3-dpg浓度的平均最大减少量在sad研究中在接受化合物1的患者中为至少约40％(范围为35.4-56.1％)，并且在mad研究中在接受化合物1的患者中为至少约50％(范围为46.1-63.6％)。
[0661]
表15.关键pd量度从基线的平均最大百分比变化的汇总
[0662][0663]
在sad队列中，在给药后通过用于定量血液中的2，3-dpg的合格lc-ms/ms方法定期测量受试者的血液2，3-dpg水平。在所有剂量水平下在单剂量化合物1后6小时观察到2，3-dpg血液水平下降(早期时间点未收集)。2，3-dpg水平的最大降低通常发生在首个剂量后～24小时，降低持续到给药后～48-72小时。表16报告了在单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂后，在健康志愿者中随时间推移测量的2，3-dpg血液水平相对于基线的中位百分比变化。因此，2，3-dpg浓度相对于基线的中位减少，在施用单剂量24小时后在测试的所有剂量水平下为至少约30％。
[0664]
表16. 2，3-dpg水平的中位百分比变化
[0665][0666]
图30是在接受单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂的健康志愿者中随时间推移测量的血液2，3-dpg水平的图表。如图30所示，相对于接受安慰剂的受试者，接受化合物1的健康志愿者经历血液2，3-dpg水平降低。图31a是从实施例12中描述的化合物1的单个上升剂量(sad)临床研究中的健康受试者获得的数据表。如图31a所示，剂量归一化cmax和auc随着剂量增加≥700mg而增加，表明在测试的最高剂量下暴露量存在大于剂量比的增加。图31b是从实施例12中描述的化合物1的多个上升剂量(mad)人类临床研究中的健康受试者获得的数据表，显示了化合物1以qd或bid给药14天内的非时间相关性药代动
力学(pk)性质。在图31a和图31b的表格中，auc是指浓度-时间曲线下面积；bid指每日两次施用化合物1；c
max
指最大浓度；qd指每日一次施用化合物1；t
max
指达到化合物1最大浓度的时间。图31b中的值作为c
max
、auc
0-τ
、r c
max
和r auc
0-τ
的几何平均值[cv％]呈现；并且t
max
作为中位数[cv％]呈现。
[0667]
图32是在接受单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂的健康志愿者中在剂量后24小时测量的血液2，3-dpg水平的图表。如图32所示，相对于接受安慰剂的受试者，接受化合物1的健康志愿者在剂量后24小时经历血液2，3-dpg水平降低。
[0668]
在sad队列中，在剂量后24小时测定受试者的p50(在50％血红蛋白饱和度下的po2)。在测试的所有剂量水平下，在单剂量化合物1后24小时测量的p50都减少(中位数减少范围为～3-5mmhg)。表17报告了在健康志愿者中在单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂后24小时测量的p50相对应基线的平均绝对变化。
[0669]
表17.p50的平均绝对变化(mmhg)
[0670]
剂量平均绝对变化安慰剂0.20200mg-2.91400mg-3.41700mg-4.851000mg-5.05
[0671]
在单剂量后，接受化合物1的所有hv都表现出与p50减少(hb氧亲和力增加)相关的pd响应。图33是在接受单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂的健康志愿者中在剂量后24小时测量的p50值的图表。如图33所示，相对于接受安慰剂的受试者，接受化合物1的健康志愿者经历p50减少。图34是在接受单剂量化合物1(200mg、400mg、700mg或1000mg)或安慰剂的健康志愿者中在剂量前和剂量后24小时测量的p50值的图表。如图34所示，接受化合物1的健康志愿者经历p50相对于基线的减少，反映了氧亲和力的增加，而接受安慰剂的受试者则没有。
[0672]
在mad队列中，在给药后通过用于定量血液中的2，3-dpg的合格lc-ms/ms方法定期测量受试者的血液2，3-dpg水平。第14天2，3-dpg的最大减少是现对于基线的55％(中位数)。2，3-dpg水平在第1天达到最低点并稳定，并且在第14天最后剂量后72小时尚未恢复到基线水平。表18报告了在接受日剂量的化合物1(100mg bid、200mg bid或300mg bid)或安慰剂14天的健康志愿者中在第1天和第14天第一剂后随时间推移测量的2，3-dpg血液水平相对于基线的中位百分比变化。因此，2，3-dpg浓度相对于基线的中位减少，在第1天施用第一剂后24小时测试的所有剂量水平下为至少约25％，并且在第14天施用第一剂后24小时测试的所有剂量水平下为至少约40％。
[0673]
表18. 2，3-dpg水平的中位百分比变化(第1天和第14天)
[0674][0675]
图35和图36是在接受日剂量的化合物1(100mg bid、200mg bid、300mg bid或400mg qd)或安慰剂14天的健康志愿者中随时间推移测量的血液2，3-dpg水平的图表。如图35所示，相对于接受安慰剂的受试者，接受化合物1的健康志愿者经历血液2，3-dpg水平降低。如图36所示，在健康志愿者的rbc中，化合物1已经展示出2，3-dpg减少，从而为健康rbc中的pkr激活提供了支持。值得注意的是，在第14天停止化合物1给药后，这些效应维持一天以上。pk/pd建模预测，在hv rbc中，在≥150mg bid或≥400mg qd的剂量下，存在最大2，3-dpg响应。图37是在接受日剂量的化合物1(100mg bid、200mg bid、300mg bid或400mg qd)或安慰剂14天的健康志愿者中在第14天测量的血液2，3-dpg水平的图表。如图37所示，相对于接受安慰剂的受试者，接受化合物1的健康志愿者经历血液2，3-dpg水平降低。
[0676]
在mad队列中，在第14天测定受试者的p50(在50％血红蛋白饱和度下的po2)。在测试的所有剂量水平下，在每日两次给药14天后测量的p50值都降低(中位数降低范围为～3-5mmhg)。表19报告了在接受日剂量的化合物1(100mg bid、200mg bid或300mg bid)或安慰剂14天的健康志愿者中在第14天测量的p50相对于基线的平均绝对变化。
[0677]
表19.p50的平均绝对变化(mmhg)(第14天)
[0678]
剂量平均绝对变化安慰剂-0.38100mg bid-3.26200mg bid-4.14300mg bid-5.34
[0679]
在多个剂量后，接受化合物1的所有hv都表现出与p50减少(hb氧亲和力增加)相关的pd响应。图38是在接受日剂量的化合物1(100mg bid、200mg bid、300mg bid或400mg qd)或安慰剂14天的健康志愿者中在第14天测量的p50值的图表。如图38所示，相对于接受安慰剂的受试者，接受化合物1的健康志愿者经历p50减少。图39是在接受日剂量的化合物1(100mg bid、200mg bid、300mg bid或400mg qd)或安慰剂14天的健康志愿者中在给药前和在第14天测量的p50值的图表。如图39所示，接受化合物1的健康志愿者经历p50相对于基线的减少，反映了氧亲和力的增加，而接受安慰剂的受试者则没有。
[0680]
在mad队列中，在第14天通过用于定量血液中的atp的合格lc-ms/ms方法测量受试者的血液atp水平。atp水平在第14天相对于基线升高，并且在最后一个剂量后60小时保持
升高。表20报告了在接受日剂量的化合物1(100mg bid或200mg bid)或安慰剂14天的健康志愿者中在第14天第一剂后随时间推移测量的血液atp水平相对于基线的中位百分比变化。
[0681]
表20.atp水平的中位百分比变化(第14天)
[0682][0683]
图40是在接受日剂量的化合物1(100mg bid、200mg bid、300mg bid或400mg qd)或安慰剂14天的健康志愿者中在第14天测量的血液atp水平的图表。如图40所示，相对于接受安慰剂的受试者，接受化合物1的健康志愿者经历血液atp水平提高。
[0684]
如图41所示，在健康志愿者的rbc中，化合物1已经展示出atp增加，从而为健康rbc中的pkr激活提供了支持。值得注意的是，在第14天停止化合物1给药后，这些效应维持三天以上。pk/pd建模预测，在hv rbc中，在剂量≥50mg bid或≥150mg qd下，存在最大atp响应。
[0685]
图42是显示在接受化合物1或安慰剂的健康志愿者中在剂量前以及第14天剂量后24小时(sad队列)和剂量后24小时(mad队列)测定的p50值的差的图表。如图42所示，接受化合物1的健康志愿者经历p50相对于基线的变化(减少)，而接受安慰剂的受试者则没有。
[0686]
图43是在施用单剂量化合物1(400mg)后在第一(左侧)轴上绘制在健康志愿者(hv)患者中测量的化合物1的血液浓度(ng/ml)和在第二(右侧)轴上绘制在这些hv患者中测量的2，3-dpg浓度(微克/ml)的图表。实心符号表示观察到的化合物1血浆和2，3dpg浓度的几何平均值和标准误差。如图所示，观察到的2，3dpg调节不直接跟踪血浆药代动力学(化合物1的血液浓度)，其中药效学最大值(即在～24小时时2，3-dpg浓度的最小值)出现在药代动力学最大值(即在～1-2小时时pk曲线的最大值)后近24小时。在hv中观察到的药效学响应是持久的，其中在血浆cmax后很长时间内观察到2，3-dpg降低。总的来说，这表明不能孤立地使用药代动力学参数(c
max
/c
min
/auc)来充分地进行鉴定药理活性剂量，但反而支持一种方法，该方法包括整合时间药代动力学/药效学关系，以提供qd给药在镰状细胞病患者中可能是可行的证据平台。
[0687]
图44是在sad和mad队列中的健康志愿者中观察到的2，3-dpg水平和p50值的散点图。实心符号表示在最后一个施用剂量后24小时以化合物1给药的健康志愿者中观察到的p50/2，3-dpg水平。基线数据表示化合物1治疗前和从以安慰剂给药的健康志愿者获得的p50/2，3dpb数据。对于接受不同剂量的患者，观察到2，3dpg与p50水平的正相关关系。如图45所示，用化合物1治疗的受试者中氧亲和力的增加与2，3-dpg的减少相关，展示出健康rbc中机制的初步证据并支持化合物1在scd患者中的进一步临床开发。
[0688]
结果(scd受试者)
[0689]
对健康志愿者rbc中的药效响应的建模表明，化合物1的剂量≥150mg/天引起最大atp响应，并且≥400mg/天使2，3-dpg响应最大化(图46)。鉴定在scd患者中评价的达到最大pd响应剂量范围的潜在暴露量。基于健康志愿者研究中的安全性和pk/pd特性，在scd患者(n＝7)中评价700mg单剂量。选择700mg单剂量的化合物1在scd患者中评价，以使每日给药队列处于较低暴露量。
[0690]
表21和表22中报告了接受700mg单剂量的化合物1或安慰剂的scd患者的基线特征。所有患者均具有hbss基因型和轻度voc病史，尽管接受了羟基脲疗法但仍具有持久性贫血和持续性溶血。
[0691]
表21.招募于单剂量队列中的scd患者的基线特征(n＝7)
[0692]
年龄，岁34.7(15，48)男性2(29％)hb ss基因型7(100％)羟基脲疗法7(100％)12-mo voc比率0(0，2)既往填充rbc输注(》30天)1(14％)血红蛋白电泳％hbs79.6(69.1，88.6)％hbf15.6(7.9，28.6)
[0693]
表22.招募于单剂量队列中的scd患者的基线特征(n＝7)
[0694]
hb，g/dl8.7(7.1，10.3)rbc，10
12
/l2.4(1.8，2.9)arc，109/l196.0(54.9，350.3)总胆红素，mg/dl3.54(2.0，6.2)ldh，u/l393.4(317.0，559.5)2,3-dpg，μg/ghb5291(4602，6137)atp，μg/ghb1845(1552，2158)p50，po2mmhg30.1(26.1，34.0)
[0695]
在sd队列中没有报告导致患者退出的严重不良事件(sae)或teae。在sd队列中，7名患者(2名男性，5名女性，均为hbss)接受700mg化合物1(n＝5)或安慰剂(n＝2)。
[0696]
监测接受700mg单剂量的化合物1或安慰剂的所有scd患者的不良事件7天。表23中报告了接受化合物1(700mg)或安慰剂的scd患者中，治疗紧急不良事件(teae)的发生率。在4名患者中报告了六次teae；所有teae均为1级和瞬时性的。具体地，在7名患者中的4名(57％)中报告了六次teae，包括在接受化合物1的5名患者中的2名(40％)中的3次teae(关节痛、头痛、心悸)，以及在接受安慰剂的2名患者中的2名(100％)中的3次teae(背痛、肌痛、瘙痒)；所有teae均为1级和瞬时性的。在化合物1队列中，关节痛、头痛和心悸各在一名患者中观察到。一个可能相关的teae(心悸)发生在剂量后约8小时。未观察到其他症状，并且心悸在《1分钟内消退。在安慰剂队列中，在一名患者中观察到背痛、肌痛和瘙痒。相比之下，在接受单剂量化合物1(700mg)或安慰剂的健康志愿者中没有观察到teae。700mg单剂量化合
物1被认为是可耐受的，并且开始了第一个多剂量scd队列(图28中的“剂量1”)。
[0697]
表23.化合物1在scd患者中耐受良好
[0698][0699]
在迄今完成md-1的3名scd患者(3名女性，均为hbss)中，14天每日300mg化合物1或安慰剂耐受良好，有1名患者在14天给药期结束时报告恶心/呕吐的瞬时性、无关的2级teae。
[0700]
如图47和表24所示，在接受700mg单剂量化合物1的健康志愿者和scd患者中观察到类似的化合物1血浆药代动力学特性。
[0701]
表24.健康志愿者和scd患者中的血浆pk参数
[0702][0703][0704]
除t
max
(中位数[最小值，最大值])外，值均为几何平均值(几何变异系数)。
[0705]
在接受单剂量化合物1的scd受试者中已经观察到生物活性，证明scd rbc中的pkr酶是功能性的并对变构pkr激活剂有响应。如图48所示，在scd患者中在700-mg单剂量的化合物1后24小时，atp血液浓度增加了30％，而2，3-dpg血液浓度降低26％。
[0706]
在所有经化合物1治疗的患者中观察到随镰状化点(pos)减少而增加的o2亲和力(
↓
p
50
)和改善的hbs rbc可变形性。随着渗透扫描结果向正常值偏移，还展示出改善的hbs rbc膜功能。在单剂量化合物1后24小时也观察到改善的血液学参数，包括与安慰剂相比hb增加加～0.9g/dl。
[0707]
如图49所示，在健康志愿者(还参见图34)和scd患者两者中在700mg单剂量的化合物1后观察到增加的血红蛋白o2亲和力(减少的p50)。
[0708]
如图50所示，在健康志愿者(还参见图40)和scd患者两者中，增加的血红蛋白o2亲和力与2，3-dpg的减少相关。
[0709]
如图51所示，用化合物1治疗的scd患者在化合物1后24小时，当观察到最大2，3-dpg和atp响应时(参见图48)，展示出改善的血液学参数，在72小时后恢复到基线。单剂量化合物1引起经化合物1治疗的参与者的hb增加0.5g/dl(范围：0.3，0.9)，而经安慰剂治疗的参与者的hb下降0.4g/dl(范围：-0.5，-0.3)(hb下降可能是由于静脉切开放血)。在化合物1给药后72小时，在化合物1治疗的参与者中还观察到乳酸脱氢酶(ldh)下降，表明rbc周转减少作为rbc参数瞬时改善的来源。这些结果表明持续的2，3-dpg和atp响应可能是最佳益处所需的。
[0710]
在scd患者中评价单剂量化合物1(700mg)对比安慰剂对氧扫描、氧亲和力(p50)和渗透扫描的影响。在镰状化点(pos或pos)，脱氧hbs的聚合可影响rbc的可变形性且伸长指
数开始减小。eimin是指氧扫描中rbc可变形性的最低水平。eimin越低，rbc可变形性越低。如图52和表25(氧扫描)所示，化合物1降低了脱氧hbs聚合速率且改善了镰状rbc的o2依赖性可变形性，如pos的减少和ei
min
的增加所证明的。在接受化合物1的所有参与者中都观察到这种效应。如图53和表25(氧亲和力曲线)所示，在治疗的所有参与者中化合物1增加了o2亲和力(减少p50)。如图54和表25(渗透压扫描)所示，化合物1改善了镰状rbc中的克分子渗透压浓度依赖性膜功能，如o
min
和o
hyper
的提高(即，向正常值偏移)所证明的。这些效应是瞬时性的，在单剂量化合物1后3至7天恢复到基线。
[0711]
表25.在脱氧和/或剪切应力下在单剂量化合物1(700mg)后镰状rbc的可变形性、氧亲和力和渗透脆性的改善
[0712]
参数给药前给药后(24小时)户值pos(氧扫描)35.4(27.3，38.8)24.0(17.9，31.8).063ei
min
(氧扫描)0.193(0.16，0.21)0.296(0.26，0.38).125ei
max
(氧扫描)0.445(0.41，0.51)0.451(0.42，0.52).250p50(氧亲和力曲线)29.4(26.1，32.3)25.8(23_3，26.8).063ei
max
(渗透扫描)0.483(0.46，0.57)0.478(0.46，0.57).750o
min
(渗透扫描)108(105，121)117(106，124).063o
hvper
(渗透扫描)380(371，399)400(371，412).125
[0713]
值以中位数(范围)呈现。户值基于配对数据的非参数威尔科克森秩和检验(nonparametric wilcoxon rank sum test)。
[0714]
图55a和图55b示出了在化合物1给药后24小时化合物1对scd受试者rbc的影响。如图55a所示，接受单剂量化合物1的scd受试者经历类似于hba的hbs氧亲和力增加。如图55b所示，接受单剂量化合物1的受试者经历镰状化点(pos)随elmin增加而左移。
[0715]
截至2020年7月17日，在md队列中没有报告导致患者退出的严重不良事件(sae)或teae。在迄今完成md-1的3名scd患者(3名女性，均为hbss)中，14天每日300mg化合物1或安慰剂耐受良好，有1名患者在14天给药期结束时报告恶心/呕吐的瞬时性、无关的2级teae。
[0716]
表26中示出了截至2020年7月17日md队列中每名患者相对于预处理的实验室变化。在用化合物1/安慰剂治疗的3名scd md-1患者中的2名中(当前设盲)，治疗14天后(与治疗前水平相比)，hb增加＞1g/dl，网织红细胞％减少且溶血标志物提高。在没有临床ae的情况下，血液学参数在治疗后4至7天恢复到治疗前水平(数据未示出)。对2名hb增加的患者的功能研究显示，相对于治疗前和/或治疗后相比，在进行研究治疗时rbc可变形性(
↓
pos)改善和rbc膜功能改善。
[0717]
表26.每日一次接受300mg化合物1/安慰剂14天的scd患者的实验室变化
[0718][0719][0720]
eot＝治疗结束；pre-tx＝治疗前；pt＝患者；scd＝镰状细胞病；tx＝治疗
[0721]
汇总/结论
[0722]
化合物1具有有利的安全性特性并在hs中在单剂量或多个日剂量后已经展示出pd活性。在健康志愿者研究中，化合物1耐受良好，展示出生理响应(
↓
2，3-dpg和
↑
atp)与生物学效应，包括
↑
o2亲和力、
↓
网织红细胞(p＜.001)和
↑
hb(ns)。
[0723]
化合物1在健康受试者中具有有利的安全性特性。化合物1展示出线性和非时间相关性的pk。健康志愿者rbc中2，3-dpg的减少和atp水平的升高确认化合物1激活pkr。化合物1展示出健康志愿者rbc中hb氧亲和力增加的机制的证据，与来自健康和镰状rbc的体外混合研究的观察结果一致。这些结果支持pkr激活剂化合物1在scd患者中的进一步临床开发。
[0724]
化合物1在接受单剂量或长达14天给药的scd患者中具有有利的安全性特性。scd受试者中的单剂量研究显示了可接受的安全性特性，有证据表明pd活性转化为氧亲和力增加以及pos向较低氧张力偏移和镰状rbc的膜可变形性改善的有利生物学效应。化合物1表现出线性和非时间相关性的pk，导致2，3-dpg减少和atp水平升高。这些结果确认pkr酶在
scd rbc中具有功能性且对pkr激活有响应。单剂量化合物1产生以下的有利的生物学效应：(1)氧亲和力提高，镰状化点减少和可变形性改善；和(2)通过对渗透梯度的响应改善所证明的膜功能改善。具体地，单剂量化合物1导致2，3-dpg减少和atp增加，引起o2亲和力增加，pos降低，rbc可变形性改善和rbc膜功能改善。单剂量化合物1引起当观察到最大pd效应时发生血红蛋白、rbc和网织红细胞改善。这些改善表明，持续的2，3-dpg减少和atp产生增加可改善溶血性贫血和表征scd的voc的频率。
[0725]
另外的研究进一步评价化合物1在scd患者中每日施用后的安全性、pk/pd和临床活性。进行2周的scd/mad队列以评价化合物1对血红蛋白、炎症和rbc代谢组学的影响。进行进一步表征长期pkr激活对scd病理生理学的影响的12周给药队列，以评价2周的mad研究。
[0726]
14天内每日给药300mg化合物1/安慰剂的初始设盲结果，连同改良rbc功能研究一起显示，在3名scd患者中的2名中血液学和溶血参数两者有所改善，表明pkr激活的药效学后果可能在scd中具有临床益处。多剂量进一步评价化合物1在scd患者中每日施用后的安全性、pk/pd和生物活性。
[0727]
针对芳香酶活性对化合物1的评价
[0728]
为了评估对类固醇生成的潜在影响，在体外使用h295r肾上腺皮质癌细胞系(200至0.0002μm下)并在监测细胞活力的测定法中(mtt试剂盒)针对类固醇调节来筛选化合物1。化合物1仅在测试的最高浓度即200μm下显示类固醇调节潜力(高于媒介物的％)，在浓度≤20μm时细胞活力为100％(在200μm时活力为90％)。基于这些结果，考虑到在人类研究中化合物1的预测最大暴露量(1,500mg；c
max
(游离)＝0.004μm；auc
0-inf
(游离)＝0.002μm.小时)，化合物1没有展示出干扰类固醇生成的显著风险。
[0729]
评价对在14天的治疗期接受化合物1或安慰剂的男性和女性健康受试者中的雌二醇和睾酮循环水平的影响。化合物1每日两次(bid)以100mg、200mg和300mg的剂量水平施用，和每日一次(qd)以400mg的剂量水平施用。每个给药队列由9名用化合物1治疗的受试者和3名用安慰剂治疗的受试者组成。在给药前(基线)，然后在第8、14和17天评估睾酮和雌二醇水平。对睾酮和雌二醇水平从基线变化的评价确认，没有统计学上显著的变化，也没有临床上有意义的趋势，与表明不存在化合物1对芳香酶抑制的非临床试验一致。
[0730]
针对cyp介导活性对化合物1的评价
[0731]
当评价其对主要的人cyp介导的药物-药物相互作用的潜力时，高达30μm的化合物1浓度并未可逆性地抑制人类肝脏微粒体中的任何主要细胞色素p450(cyp)同种型(表27)。在原代培养的肝细胞中，cyp3a4、cyp1a2和cyp2b6的信使核糖核酸(mrna)水平在10微摩尔的化合物1浓度下升高较少，并且在化合物1浓度大于最大未结合临床相关系统浓度和未结合肝脏入口浓度时，展示出mrna没有明显增加(增加《2倍)。
[0732]
总的来说，化合物1作为主要通过cyp代谢清除的伴随药物的cyp诱导剂或可逆抑制剂的相互作用风险被归类为低风险。此外，在实施例12的临床试验中，在健康受试者中给药14天后，第1天和第14天观察到的清除率不变，提供了以下临床证据：在所测剂量下，化合物1的pk是非时间相关性的并且不是自动诱导或自动抑制的底物。
[0733]
表27.单底物ddi测定法中化合物1的细胞色素p450酶数据的ic
50
值的汇总
[0734][0735]
表28.在来自三个供体的培养的人肝细胞中试验化合物1和阳性对照对cyp mrna的诱导倍数、ec50和emax值(平均值[n＝3)])
[0736][0737]
实施例13：评估化合物1在健康志愿者和镰状细胞病患者中的安全性、药代动力学和药效学的sad/mad研究
[0738]
在实施例12中描述的sad/mad研究的结果之前，可以在12至65岁的scd患者中的允许注册的全球适应性随机、安慰剂对照、双盲、平行组、多中心试验中对化合物1进行评价。该试验可以利用血红蛋白响应作为主要终点，同时收集围绕voc比率的附加终点来验证临床益处。
[0739]
实施例14：镰状细胞病患者中口服化合物1即丙酮酸激酶激活剂的适应性、随机、安慰剂对照、双盲、多中心研究(praise)
[0740]
镰状细胞病(scd)的特点是血红蛋白s(hbs)在脱氧后聚合，导致红细胞(rbc)镰状化、氧化损伤、膜损伤、溶血、慢性贫血、细胞粘附、脉管阻塞和炎症。通过加剧scd的发病，hbs rbc具有升高(
↑
)的2，3-二磷酸甘油酸(2，3-dpg)水平，引起hb氧亲和力降低(
↓
)(
↑
p
50
)和atp水平降低(
↓
)，这些是rbc内稳态所必需的。
[0741]
化合物1是红细胞丙酮酸激酶(pkr)的强效、选择性和口服生物可利用的变构激活剂，它增加pkr活性，引起rbc中2，3-dpg水平降低(
↓
)和atp水平升高(
↑
)。健康志愿者和scd患者的初步研究数据表明，化合物1耐受良好，对类固醇生成没有影响，并且表现出线性和非时间相关性的药代动力学(pk)和相关的药效学(pd)响应(
↓
2，3-dpg和
↑
atp)。此外，在scd患者中，单剂量化合物1展示出有利的生物学效应，包括hb氧亲和力增加(
↓
p
50
)，镰状化点(pos)减少，rbc可变形性改善，及rbc膜功能改善，表明rbc健康总体改善(实施例12)。
[0742]
因此，设计一项2/3期、随机、双盲、安慰剂对照的全球研究(praise)以调查化合物1在scd患者中的安全性和功效。praise研究可招募多达344名成人和青少年scd患者，包括剂量确定(dd)组中的60至90名患者和功效延续(ec)组中的～274名患者(参见图56)。
[0743]
关键纳入标准：scd(所有基因型)，在过去12个月内有至少2次脉管阻塞性危象(voc)，基线hb≥5.5且≤10g/dl，稳定的羟基脲(hu)疗法持续前90天(如果适用)。
[0744]
关键排除标准：在过去12个月内有超过10次voc，在同意14天内因镰状细胞危象或其他脉管阻塞性事件住院，常规rbc输注，显著的肝或肾功能障碍，不稳定或恶化的心脏病或肺病病史，或2年内明显中风。
[0745]
终点：协同主要终点是(1)第24周的hb响应率(从基线增加＞1g/dl)和(2)基于裁决的voc审查，在设盲治疗期间的voc年化率。次要终点包括溶血测量、第一次voc的时间和promis疲劳量表。安全性终点包括ae的发生率、伴随药物、生命体征、ecg、临床实验室测量和体格检查。
[0746]
设计：研究设计是一项分组序贯、适应性、2/3期研究(参见图56)。患者按年龄、前12个月中voc的数目(2-3与4-10)和前12个月中的既往/伴随hu使用进行分层。2期dd部分评估2个活性剂量和安慰剂，患者1∶1∶1随机化。剂量是在第一中期分析(ia1)时基于前60名dd患者第12周的安全性和hb响应率选择的。对此时的hb响应也进行了无效分析。
[0747]
在剂量选择后，患者1∶1随机分配至3期ec部分，以评估化合物1的功效。一旦来自2期或3期的已经随机分配至选定剂量或安慰剂的110名患者已经完成24周随访或已经退出，就进行第二中期分析(ia2)以评估功效和无效性两者。ia2评估第24周时hb响应率的协同主要终点(p＜0.001)。
[0748]
52周设盲治疗后的最终分析测试voc终点、hb响应率和所有次要终点。关键的次要终点在ia2时测试，并且当存在足够功率时，全部在最终分析中进行测试。
[0749]
治疗：患者随机接受化合物1或安慰剂。在dd期，对两个剂量进行评价，并且在ec期，相比于安慰剂，对来自dd期的化合物1的选定剂量进行评价。服用未选定剂量的dd患者仍继续保持该剂量水平的治疗52周。在完成52周双盲治疗后，患者可以进入52周的开放标签扩展期，以接受选定剂量的化合物1。
[0750]
实施例15：通过lc-ms/ms分析k2edta全血中的atp和2，3dpg
[0751]
采用以下程序用于使用蛋白质沉淀提取程序和通过lc-ms/ms进行的分析，对人全血k2edta中的atp和2，3-dpg进行分析。
[0752]
这种生物分析方法适用于下面描述的参数：
[0753]
测定范围25,000-1,500,000ng/ml提取体积15.0μl物质/基质/抗凝剂水作为人全血k2edta的替代品
提取类型蛋白质沉淀样品储存80℃质谱仪api-5500采集软件analyst/aria系统
[0754]
遵循以下注意事项：
[0755]
1.标准样品和qc样品在冰上制备并储存在塑料容器中。
[0756]
2.研究样品和qc样品在冰上解冻。
[0757]
3.提取在冰上进行。
[0758]
采用以下定义和缩写：
[0759]
crb结转补救空白ft冻融mpa流动相ampb流动相bna不适用nr针头冲洗rt保留时间sip进行中的稳定tbd待测定
[0760]
使用下列化学品、基质和试剂：
[0761][0762]
使用以下程序制备试剂。所列任何适用的重量和体积都是标称的并且只要获得目标组合物，就可以按比例调整：
[0763][0764]
根据下面呈现的表，使用水作为基质制备校准标准品。通过用指定基质体积稀释指定加标体积的原液来制备指定标准品。
[0765][0766]
根据下面呈现的表，使用水作为基质制备质量控制标准品。通过用指定基质体积稀释指定加标体积的原液来制备指定的质量控制标准品。
[0767][0768]
用通过用水稀释浓度为1,000,000ng/ml的atp和2，3-dpg原液的12,500ng/ml最终浓度的atp和2，3-dpg制备内部标准加标溶液。用15.6ml水稀释各0.200ml的atp和2，3-dpg原液，以产生16.0ml的最终体积，atp和2，3-dpg的最终浓度为12,500ng/ml。
[0769]
在经由lc-ms/ms分析之前，使用以下程序进行样品提取。将15.0μl的校准标准品、质量控制、基质空白和样品等分到96孔板中。除基质空白样品外，向板上所有样品中添加50.0μl的内部标准加标溶液；向基质空白样品中添加50.0μl水。随后，将150μl水添加到板上的所有样品中。然后将板加盖并通过高速涡旋搅拌十分钟，然后向板上的所有样品中添加750μl甲醇。将板加盖并涡旋搅拌大约1分钟。然后将板在大约4℃下以大约3500rpm离心五分钟。离心后，使用液体处理机将各50μl样品转移到新的96孔板上并向板上的所有样品添加200μl乙腈。将新制备的板加盖并涡旋搅拌大约1分钟。然后将板在大约4℃下以大约3500rpm离心2分钟。
[0770]
使用以下lc参数和梯度条件分析提取的样品：
[0771]
[0772][0773]
数据从0.08分钟开始收集并在0.70分钟的数据窗口长度内收集。
[0774]
使用以下ms参数用于使用api-5500质谱仪对提取的样品进行分析：
[0775][0776]
实施例16：测量氧亲和力(p50)
[0777]
氧可逆地与hgb分子的血红素部分结合。当氧合血液经由毛细血管流向正积极损耗氧的外围组织和器官时，po2下降且hgb释放氧。氧对血红蛋白的亲和力可以用s形氧平衡曲线测量。在扫描中，y轴绘制血红蛋白氧合百分比且x轴绘制氧分压，单位为毫米汞柱(mm hg)。如果从50％氧饱和点到扫描曲线画一条水平线并且从水平线与曲线的交点到分压x轴画一条垂直线，则确定通常称为p50的值(即，这是当扫描的血红蛋白样品50％氧饱和时的压力，单位为mmhg)。这种关系可受温度、ph、二氧化碳和糖酵解中间体2，3-dpg影响。2，3-dpg结合在hgb四聚体的中心腔内，引起变构变化，并降低hgb对氧的亲和力。在生理条件(即37℃、ph＝7.4和40mm hg的二氧化碳分压)下，正常成人血红蛋白(hba)的p50值为26.5mm hg左右。如果测试的血红蛋白获得低于正常值的p50值，则认为扫描曲线“左移”并且表明存在高亲和力血红蛋白。如果测试的血红蛋白获得高于正常值的p50值，则认为扫描曲线“右移”并且表明存在低亲和力血红蛋白。
[0778]
使用hemox分析仪(tcs scientific corp.)测量患者血液中rbc的氧亲和力，该分析仪是用于记录血氧平衡曲线和相关现象的自动系统。根据标准方法使用hemox分析仪确定全血样品的血红蛋白-氧解离曲线，以血红蛋白50％饱和时的氧分压p50进行数值表征。hemox分析仪的工作原理是基于用于测量血红蛋白光学性质的双波长分光光度法和用于以毫米汞柱为单位测量氧分压的克拉克电极。将全血稀释并放入保持在37℃的特殊塑料比色杯中。为了进行分析，使一束多色光穿过比色杯并在到达光电倍增检测器之前使其成为单色。在血红蛋白的情况下，最大吸收波长是测量波长(560nm)，而参考波长处于等吸光点(570nm)。在血红蛋白脱氧过程中，等吸光点下的吸光度保持不变，但测量波长(560nm)经历吸光度的急剧变化。该变化用电子电路检测并绘制为两个波长之间的对数/比率变化。利用
560nm和570nm下的对数/比率测量以测量血红蛋白脱氧期间的光学吸光度变化。在测量血红蛋白吸光度的同时，使用克拉克电极直接测量样品中的氧浓度。在760mm汞的正常大气条件下，氧浓度(即氧分压)为149mm汞。使用该饱和点在开始绘制曲线之前对计算机进行全面校准。当在连续程序中用惰性气体(氮)取代氧时，血红蛋白就会脱氧。
[0779]
获得用于测试的血样并如下处理。在装有edta(lavender)的管中收集3ml全血的样本样品。需要至少500μl体积的全血。在肝素钠或肝素锂中收集的血液是可接受的，但edta是优选的抗凝剂。从健康正常志愿者抽取的对照样品必须与每个患者样品一起加工。正常对照应与患者样品相同的方式处理(即抽取日期、使用的抗凝剂、样品储存条件)。在实验室接收后将所有样本储存在2-8℃。样本必须用冷包装连夜运输，以保持运输温度为～4℃并连同正常对照一起。样品在保持在2-8℃下48小时的edta抗凝血液中是稳定的。拒绝任何凝结的样品、储存在次优条件下的样品、体积小于200ul的样品和超过48小时的样品。
[0780]
以下参考文献提供了关于获得氧亲和力曲线的方法和如上所述p50的测定的附加指导：
[0781]
1.operation manual for the hemox-analyzer，tcs scientifc，new hope，pa，2007年1月10日修订.
[0782]
2.ellis ss，pepple dj.sildenafil increases the p50and shifts the oxygen-hemoglobin dissociation curve to the right.j sex med.2015；12(12)：2229-32.doi：10.1111/jsm.13038.
[0783]
3.mckoy m，allen k，richards a，pepple d.effect of cilostazol on the p50 of the oxygeh-hemoglobin dissociation curve.int j angio1.2015；24(1)：67-70.doi：10.1055/s-0034-1383433.
[0784]
4.guarnone r，centenara e，barosi g.performance characteristics of hemox-analyzerfor assessment of the hemoglobin dissociation curve.haematologica.1995年9月-10月；80(5)：426-30.
[0785]
5.vanhille dl，nussenzveig rh，glezos c，perkins s，agarwal am.best practicesfor use of the hemox analyzer in the clinical laboratory：qualitycontrol determination and choice of anticoagulant.lab hematol.2012；18(3)：17-9.
[0786]
实施例17：化合物1药物组合物的口服生物利用率
[0787]
通过给药从实施例1的步骤6获得的喷雾干燥分散体(sdd)来评价化合物1在大鼠和小鼠中的全身暴露量，该分散体含有分散在水性媒介物(0.5％羟丙基甲基纤维素的水溶液)中的化合物1和hpmcas-mg(1∶3)。
[0788]
为了比较，还制备并表征了化合物1的结晶形式(指定为a型)。通过xrpd(方法a)、tga、dsc和dvs分析来表征a型。
[0789]
方法a.用panalytical x’pert3粉末xrpd在si零背景支架上进行xrpd分析。对照panalytical 640 si粉末标准品校准2θ位置。下表列出了实验中使用的xrpd方法的细节。
[0790][0791][0792]
通过上述方法a获得的化合物1固体形式a型的xrpd图谱通过下表汇总的xrpd 2-θ峰和晶面间距(d-spacing)表征：
[0793][0794]
化合物1固体形式a型的tga和dsc曲线显示，通过tga测得达到100℃时失重1.9％
并且通过dsc测得85.9℃(峰值温度)和146.0℃(起始温度)下的两次吸热。通过加热到120℃对a型进行dsc分析，并冷却到25℃，然后加热到300℃。在第二加热循环中没有观察到100℃以下的吸热。dsc循环后的xrpd分析显示与a型相比没有形式变化。a型化合物1的dvs结果显示在高达40％rh(环境条件)下的吸水率为3.4％，并且在室温下从40％rh至80％rh下的吸水率为1.0％，表明a型是吸湿性的。如通过xrpd测定的，a型在rt下dvs测试之前和之后未观察到形式变化。基于前述分析数据，据信a型为通道水合物。
[0795]
以500mg/kg向大鼠给药的sdd制剂(“500mpk sdd”)显示出比用标准制剂(由化合物1(a型)在10％丙二醇、10％克列莫佛、80％水中组成的“300mpk悬浮液”)获得的最大暴露量高40倍的auc最后，如下表中的数据所示。另外，对由化合物1(a型)纳米颗粒组成的500mpk纳米悬浮液的暴露量进行评价。用sdd制剂在小鼠中也观察到稳健的暴露量。结果示于图57中。
[0796][0797]
在猴中对化合物1的几种制剂组合物，包括由化合物1和hpmc as-mg(1∶3)组成的sdd进行了评价。所测试的口服剂量制剂的组成列于下表；图58中示出了每种制剂的化合物1暴露量结果。
[0798]
[0799][0800]
评价所述制剂在猴中的药代动力学参数并示于图58。曲线显示，与封装制剂(制剂1、2和3)相比，sdd制剂(制剂4)提供了整体暴露量的显著增强。在相当于100mg的剂量下，在sdd制剂的情况下生物利用率增强为大约50-62％，与其他制剂相比高几倍。