包含用于增强抗癌效果的雌激素相关受体γ抑制剂作为有效成分的组合物的用途的制作方法

包含用于增强抗癌效果的雌激素相关受体
γ
抑制剂作为有效成分的组合物的用途
技术领域
1.本发明涉及包含用于增强抗癌效果的雌激素相关受体γ(errγ，estrogen-related receptorγ)抑制剂作为有效成分的组合物的用途，更详细地提供包含使抑制肝癌对索拉非尼(sorafenib)的耐药性及抗癌效果增强的雌激素相关受体γ抑制剂作为有效成分的药学组合物及利用其的索拉非尼耐药性肝癌的治疗方法，进而，提供将雌激素相关受体γ应用为用于诊断索拉非尼耐药性肝癌的生物标志物的索拉非尼耐药性肝癌诊断用试剂盒及利用其的用于诊断索拉非尼耐药性肝癌的信息提供方法。


背景技术：

2.韩国国民的最主要的死亡原因之一是恶性新生物(malignant neoplasm，癌症)引起的，根据统计厅公布的死亡原因统计，2016年肝癌死亡率为每10万人口中21.5名，仅次于肺癌死亡率，癌症死亡率中排第二(肝细胞癌诊疗指南，韩国肝癌学会，2018)。
3.肝癌的根本治疗为肝切除术，是局限于无肝硬化的肝脏的单次肝细胞癌患者中的初级治疗方法(lang h.,liver resection for hepatocellular carcinoma in non-cirrhotic liver without underlying viral hepatitis.br j surg.2005feb；92(2):198-202)，即使有肝硬化，当预料残留肝功能充分时，可优先考虑(capussotti l,muratore a,massucco p,ferrero a,polastri r,bouzari h major liver resections for hepatocellular carcinoma on cirrhosis:early and long-term outcomes..liver transpl.2004feb；10(2suppl 1):s64-8)，但只有初期接受诊断的30-40％可手术治疗。
4.当有局部淋巴结、肺等肝外转移或有肝血管侵犯时，进行作为多重激酶抑制剂(kinase inhibitor)的索拉非尼(sorafenib，)治疗，临床上的生存改善程度远远达不到预期水平，大部分在6个月以内复发，正在努力克服这种问题(llovet jm,ricci s,mazzaferro v,hilgard p,gane e,blanc jf,de oliveira ac,et al.sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma.n engl j med 2008；359:378-390)。
5.另一方面，克服现有抗癌剂或靶治疗剂的局限性，通过与正常细胞不同的癌细胞特有的特异性代谢调节研究，进行针对癌症的代谢特征的癌症代谢研究和新药开发研究(vander heiden mg.targeting cancer metabolism:a therapeutic window opens.nat rev drug discov 2011；10:671-684)。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.(专利文献1)韩国授权专利第10-1704533号


技术实现要素：

9.技术问题
10.对此，本发明人确认雌激素相关受体γ的抑制剂可抑制肝癌对索拉非尼的耐药性，有效抑制肝癌的增殖，完成本发明。
11.因此，本发明的目的在于，提供包含雌激素相关受体γ抑制剂作为有效成分的索拉非尼耐药性肝癌的预防用或治疗增强用药学组合物。
12.本发明的再一目的在于，提供包含雌激素相关受体γ抑制剂作为有效成分的肝癌的索拉非尼耐药性抑制用药学组合物。
13.本发明的另一目的在于，提供包含雌激素相关受体γ抑制剂及索拉非尼作为有效成分的肝癌的预防或治疗用药学组合物。
14.本发明的还一目的在于，提供包括将候选物质处理于索拉非尼耐药性肝癌细胞的步骤以及评价上述细胞中雌激素相关受体γ的活性或表达的步骤的索拉非尼耐药性肝癌治疗增强物质的筛选方法。
15.本发明的又一目的在于，提供包含测定雌激素相关受体γ(errγ，estrogen-related receptorγ)基因的信使核糖核酸(mrna)或由此表达的蛋白质的水平的制剂的索拉非尼耐药性肝癌诊断用试剂盒。
16.本发明的又一目的在于，提供用于诊断索拉非尼耐药性肝癌的信息提供方法，其包括：
17.步骤(a)，在从确认是否对索拉非尼呈现耐药性的肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；
18.步骤(b)，在从并非索拉非尼耐药性肝癌的普通肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；以及
19.步骤(c)，当在上述步骤(a)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平高于在上述步骤(b)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平时，将上述步骤(a)的肝癌患者判断为索拉非尼耐药性肝癌患者。
20.本发明的又一目的在于，提供确定肝癌患者的治疗方法所需的信息的方法，其包括：
21.步骤(a)，在从肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；
22.步骤(b)，在从并非索拉非尼耐药性肝癌的普通肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；以及
23.步骤(c)，当在上述步骤(a)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平高于在上述步骤(b)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平时，将上述步骤(a)的肝癌患者判断为索拉非尼耐药性肝癌患者。
24.本发明的又一目的在于，提供索拉非尼耐药性肝癌的诊断及治疗方法，其包括：
25.步骤(a)，在从肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；
26.步骤(b)，在从并非索拉非尼耐药性肝癌的普通肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；以及
27.步骤(c)，当在上述步骤(a)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平高于在上述步骤(b)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平时，将上述步骤(a)的肝癌患者判断为索拉非尼耐药性肝癌患者，适用除了索拉非尼之外的其他肝癌治疗剂。
28.本发明的又一目的在于，提供包括将雌激素相关受体γ抑制剂给药到索拉非尼耐药性肝癌患者的步骤的索拉非尼耐药性肝癌的预防或治疗增强方法。
29.本发明的又一目的在于，提供包括将雌激素相关受体γ抑制剂给药到索拉非尼耐药性肝癌患者的步骤的肝癌的索拉非尼耐药性抑制方法。
30.本发明的又一目的在于，提供包括将雌激素相关受体γ抑制剂及索拉非尼给药到肝癌患者的步骤的肝癌的预防或治疗方法。
31.但是，本发明要解决的技术问题不局限于以上提及的问题，本发明所属技术领域的普通技术人员可从以下记载内容中明确地理解未提及的其他问题。
32.解决问题的方案
33.为了实现本发明的目的，本发明提供用于索拉非尼(sorafenib)耐药性肝癌的预防用或治疗增强的能够抑制雌激素相关受体γ(errγ，estrogen-related receptorγ)蛋白质的活性或雌激素相关受体γ基因的表达的制剂。
34.与其相关地，本发明提供包含上述雌激素相关受体γ抑制剂作为有效成分的索拉非尼(sorafenib)耐药性肝癌的预防用或治疗增强用药学组合物。
35.并且，本发明提供包括将上述雌激素相关受体γ抑制剂给药到个体的步骤的索拉非尼耐药性肝癌的预防或治疗增强方法。
36.进而，本发明提供上述雌激素相关受体γ抑制剂的索拉非尼耐药性肝癌的预防、改善或治疗增强用途。
37.在本发明的一实例中，抑制上述雌激素相关受体γ蛋白质的活性的制剂可以为对雌激素相关受体γ的反向激动剂(inverse agonist)或拮抗剂(antagonist)或能够与雌激素相关受体γ特异性地相结合的抗体或适体，但不局限于此。
38.在本发明的一实例中，对上述雌激素相关受体γ的反向激动剂可以为由以下化学式1表示的化合物或其药学上能够接受的盐，但只要是呈现与其同等的效果的雌激素相关受体γ反向激动剂，就不局限于上述化合物。
39.化学式1
40.41.在本发明的再一实例中，抑制上述雌激素相关受体γ基因的表达的制剂能够选自由与上述基因的信使核糖核酸特异性地相结合的微小核糖核酸(mirna)、小干扰核糖核酸(sirna)、短发夹核糖核酸(shrna)及反义寡核苷酸组成的组中，但不局限于此。
42.并且，本发明提供预防或治疗肝癌时用于抑制索拉非尼的耐药性的能够抑制雌激素相关受体γ蛋白质的活性或雌激素相关受体γ基因的表达的制剂。
43.与其相关地，本发明提供包含上述雌激素相关受体γ抑制剂作为有效成分的肝癌的索拉非尼耐药性抑制用药学组合物。
44.进而，本发明提供包括将上述雌激素相关受体γ抑制剂给药到个体的步骤的抑制肝癌的索拉非尼耐药性的方法。
45.不仅如此，本发明提供上述雌激素相关受体γ抑制剂对肝癌的索拉非尼的耐药性抑制用途。
46.并且，本发明提供包含用于预防或治疗肝癌的能够抑制雌激素相关受体γ蛋白质的活性或雌激素相关受体γ基因的表达的制剂及索拉非尼的组合物。
47.与其相关地，本发明提供包含上述雌激素相关受体γ抑制剂及索拉非尼作为有效成分的肝癌的预防或治疗用药学组合物。
48.进而，本发明提供包括将包含雌激素相关受体γ抑制剂及索拉非尼作为有效成分的组合物给药到个体的步骤的肝癌的预防或治疗方法。
49.不仅如此，本发明提供包含雌激素相关受体γ抑制剂及索拉非尼作为有效成分的组合物对肝癌的预防、改善或治疗用途。
50.在本发明的一实例中，上述组合物能够增强肝癌对索拉非尼的药物敏感性(susceptibility)或增强索拉非尼对肝癌的抗癌效果，但不局限于此。
51.本发明的另一实例中，上述组合物能够与索拉非尼同时(simultaneous)、单独(separate)或依次(sequential)给药，但不局限于此。
52.并且，本发明提供索拉非尼耐药性肝癌治疗增强物质的筛选方法，其包括：将候选物质处理于索拉非尼耐药性肝癌细胞的步骤；在上述细胞中评价雌激素相关受体γ的活性或表达的步骤。
53.本发明还提供包含测定雌激素相关受体γ(errγ，estrogen-related receptorγ)基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的水平的制剂的索拉非尼耐药性肝癌诊断用试剂盒。
54.在本发明的一实例中，测定上述基因的信使核糖核酸水平的制剂能够包含与上述基因特异性地相结合的引物对、探针或反义核苷酸，但不局限于此。
55.在本发明的还一实例中，测定上述蛋白质的水平的制剂能够包含对上述蛋白质特异性的抗体或适体，但不局限于此。
56.在本发明的又一实例中，上述试剂盒能够为反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)试剂盒、竞争性反转录-聚合酶链式反应试剂盒、实时反转录-聚合酶链式反应试剂盒、脱氧核糖核酸(dna)芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒，但不局限于此。
57.进而，本发明提供用于诊断索拉非尼耐药性肝癌的信息提供方法，其包括：
58.步骤(a)，在从确认是否对索拉非尼呈现耐药性的肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；
r(图2b)中孤儿核受体雌激素相关受体γ增加的图。
74.图3a及图3b为表示将作为雌激素相关受体γ反向激动剂的化学式1的化合物(dn200434)处理于作为索拉非尼耐药性肝癌细胞株的huh7-r(图3a)及sk-hep-r(图3b)，其结果，在各个索拉非尼耐药性肝癌细胞株中活性氧簇(ros，reactive oxygen species)增加的图。
75.图4a及图4b为表示当单独处理索拉非尼时无抗癌效果的耐药性肝癌细胞huh7-r(图4a)及sk-hep-r(图4b)通过化学式1的化合物(dn200434)和索拉非尼的同时处理减少细胞增殖的图。
76.图5a为表示向来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株huh7-r的动物模型(异种移植(xenograft))将化学式1的化合物(dn200434)和索拉非尼并用给药，其结果，相比于对照组(索拉非尼单独给药组)，肿瘤的大小显著减少的照片。
77.图5b为表示向来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株huh7-r的动物模型将化学式1的化合物(dn200434)和索拉非尼并用给药，其结果，相比于对照组(索拉非尼单独给药组)，肿瘤的重量显著减少的图表。
78.图5c为表示向来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株huh7-r的动物模型将化学式1的化合物(dn200434)和索拉非尼并用给药，其结果，相比于对照组(huh7-r-con，索拉非尼单独给药组)，肿瘤的体积显著减少的图。
79.图5d为表示根据利用来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株huh7-r的动物模型的实验结果，无组间体重变化的图。
80.图6a为表示向来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株sk-hep-r的动物模型(xenograft)将化学式1的化合物(dn200434)和索拉非尼并用给药，其结果，相比于对照组(索拉非尼单独给药组)，肿瘤的大小显著减少的照片。
81.图6b为表示向来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株sk-hep-r的动物模型将化学式1的化合物(dn200434)和索拉非尼并用给药，其结果，相比于对照组(索拉非尼单独给药组)，肿瘤的重量显著减少的图表。
82.图6c为表示向来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株sk-hep-r的动物模型将化学式1的化合物(dn200434)和索拉非尼并用给药，其结果，相比于对照组(huh7-r-con，索拉非尼单独给药组)，肿瘤的体积显著减少的图。
83.图6d为表示根据利用来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株sk-hep-r的动物模型的实验结果，无组间体重变化的图。
具体实施方式
84.实施本发明的最佳方式
85.本发明提供用于索拉非尼(sorafenib)耐药性肝癌的预防用或治疗增强的可抑制雌激素相关受体γ(errγ，estrogen-related receptorγ)蛋白质的活性或雌激素相关受体γ基因的表达的制剂。
86.与其相关地，本发明提供包含可抑制雌激素相关受体γ(errγ，estrogen-related receptorγ)蛋白质的活性或雌激素相关受体γ基因的表达的制剂作为有效成分的索拉非尼(sorafenib)耐药性肝癌的预防用或治疗增强用药学组合物。
87.作为本发明的再一实施方式，本发明提供预防或治疗肝癌时用于抑制索拉非尼的耐药性的可抑制雌激素相关受体γ蛋白质的活性或雌激素相关受体γ基因的表达的制剂。
88.与其相关地，本发明提供包含可抑制雌激素相关受体γ蛋白质的活性或雌激素相关受体γ基因的表达的制剂作为有效成分的肝癌的索拉非尼耐药性抑制用药学组合物。
89.作为本发明的另一实施方式，本发明提供包含用于预防或治疗肝癌的可抑制雌激素相关受体γ蛋白质的活性或雌激素相关受体γ基因的表达的制剂及索拉非尼的组合物。
90.与其相关地，本发明提供包含可抑制雌激素相关受体γ蛋白质的活性或雌激素相关受体γ基因的表达的制剂及索拉非尼作为有效成分的肝癌的预防或治疗用药学组合物。
91.本说明书中使用的术语“肝癌”是指在肝脏中首先产生的原发性的恶性肿瘤，病理学(组织性)上，原发性肝癌有肝细胞癌和胆管上皮癌、肝胚细胞瘤、血管肉瘤等多种，其中，肝细胞癌和胆管上皮癌占大部分。
92.在本发明中，上述肝癌可以为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)，但不局限于此。
93.本说明书中使用的术语“治疗增强”是指获得肝癌对索拉非尼的耐药性之后，通过本发明的药学组合物的给药，索拉非尼耐药性肝癌的症状好转或有利变更的所有行为。
94.本说明书中使用的术语“治疗”是指获得肝癌对索拉非尼的耐药性前或后，通过本发明的药学组合物的给药，肝癌引起的症状好转或有利变更的所有行为。
95.在本发明中，本发明的药学组合物可增强对索拉非尼的药物敏感性(susceptibility)，或增强索拉非尼对肝癌的抗癌效果，但不局限于此。
96.在本发明的一实施例中，作为索拉非尼耐药性肝癌细胞株，构建huh7-sr或sk-hep-r细胞株，确认到在获得上述索拉非尼耐药性的肝癌细胞株中孤儿核受体雌激素相关受体γ(errγ，estrogen-related receptorγ)显著增加(参照实施例1)。
97.并且，在本发明的一实施例中，将作为雌激素相关受体γ反向激动剂的由上述化学式1表示的化合物(dn200434)处理于索拉非尼耐药性肝癌细胞，其结果，确认到ros增加，确认到单独处理索拉非尼时无效的耐药性肝癌细胞因由上述化学式1表示的化合物和索拉非尼的并用处理而减少细胞增殖，从而确认到由化学式1表示的化合物通过抑制雌激素相关受体γ的活性增加对索拉非尼的敏感性，以呈现药剂耐药性克服效果(参照实施例2)。
98.不仅如此，在本发明的一实施例中，向索拉非尼耐药性肝癌动物模型将索拉非尼和由上述化学式1表示的化合物并用给药之后，测定所形成的肿块的大小变化，其结果，确认到相比于对照组(索拉非尼单独处理组)，肝癌的大小显著减少(参照实施例3)。
99.在本发明中，抑制上述雌激素相关受体γ蛋白质的活性的制剂可以为对雌激素相关受体γ的反向激动剂(inverse agonist)或拮抗剂(antagonist)或可与雌激素相关受体γ特异性地相结合的抗体或适体，但不局限于此。
100.本说明书中使用的术语“反向激动剂(inverse agonist)”或“拮抗剂(antagonist)”是指可直接或间接减少受体的生物学活性的分子，当与受体的配体一同使用时，包含可减少上述配体的作用的分子，但不局限于此。
101.本说明书中使用的术语“抗体”是指可与蛋白质或肽分子的抗原性部位特异性地相结合的蛋白质分子，这种抗体可根据常规方法将各个基因克隆于表达载体，以得到由上述标记基因编码的蛋白质，从得到的蛋白质根据常规方法制备。
102.本说明书中使用的术语“适体(aptamer)”是指具有对规定的靶分子的结合活性的核酸分子。上述适体可以为核糖核酸(rna)、dna、修饰(modified)核酸或它们的混合物，可呈直链状或环状，据熟知，大致上，构成上述适体的核苷酸的序列越短，化学合成及大量生产更加容易，费用方面的优点优秀，容易实现化学修饰，生物体内稳定性优秀，毒性低。
103.上述反向激动剂及拮抗剂可以为化合物。
104.在本发明中，对上述雌激素相关受体γ的反向激动剂可以为由以下化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐，但不局限于此。
105.化学式1
[0106][0107]
本说明书中使用的术语“药学上可接受的”这一术语是指无过大的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，收益/风险比合理，适合与对象体(例如，人类)的组织相接触地使用，正确的医学判断的范畴以内的化合物或组合物。
[0108]
本发明的化合物可呈药学上可接受的盐的形态，作为盐，可有用的是由药学上可接受的游离酸(free acid)形成的酸加成盐。
[0109]
酸加成盐可从盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸或亚磷酸之类的无机酸类和脂肪族单羧酸酯及二羧酸酯、苯基取代的链烷酸酯、羟基链烷酸酯及链烷二酸酯、芳香族酸类、脂肪族及芳香族磺酸类之类的无毒性有机酸得到。
[0110]
这种药学上无毒的盐类包含硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己烷-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸甲盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、β羟基丁酸盐、乙醇酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐、丙烷磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐或扁桃酸盐。
[0111]
本发明的酸加成盐可通过常规方法，例如，使上述化学式1的化合物溶解于酸水溶液中，使用水混溶性有机溶剂，例如，甲醇、乙醇、丙酮或乙腈使该盐沉淀来制备。并且，可在该混合物中使溶剂或过量的酸蒸发之后，使干燥或析出的盐吸入过滤来制备。
[0112]
并且，可使用碱基制备药学上可接受的金属盐。碱金属或碱土金属盐例如，使上述
化学式1的化合物溶解于过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤非溶解化合物盐，使滤液蒸发、干燥来得到。此时，作为金属盐，制备钠、钾或钙盐，这可在制药上是合适的。与其相对应的银盐使碱金属或碱土金属盐与适当的银盐(如硝酸银)进行反应来得到。
[0113]
本发明的化合物的范围除了药学上可接受的盐之外，全部包含可通过常规方法制备的所有同分异构体、水合物及溶剂化物。
[0114]
在本发明中，抑制上述雌激素相关受体γ基因的表达的制剂可选自由与上述基因的信使核糖核酸特异性地相结合的微小核糖核酸、小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸及反义寡核苷酸组成的组中，但不局限于此。
[0115]
本说明书中使用的术语“微小核糖核酸、小干扰核糖核酸及短发夹核糖核酸”是指为了介导rna干扰或基因沉寂(silencing)而主要与从靶基因转录的信使核糖核酸相结合地抑制上述信使核糖核酸的翻译的核酸分子。上述微小核糖核酸、小干扰核糖核酸及短发夹核糖核酸可在翻译水平上抑制靶基因的表达，因而可用于有效的基因敲除(knockdown)方法或基因治疗方法。
[0116]
本说明书中使用的术语“反义寡核苷酸”是指含有与特定信使核糖核酸的序列互补的核酸序列的dna或rna或它们的衍生物，可呈现与信使核糖核酸内的互补的序列相结合地抑制向信使核糖核酸的蛋白质的翻译的效果。
[0117]
另一方面，本发明的药学组合物除了有效成分之外，还可包含通常用于制备为药学组合物的适当的载体、赋形剂和/或稀释剂。并且，可根据常规方法以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气雾剂等口服型剂型、外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态剂型化而使用。
[0118]
可包含在上述组合物的载体、赋形剂及稀释剂有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等。当将上述组合物制剂化时，可使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来调配。
[0119]
本发明的药学组合物以药学上有效的量给药。在本发明中，“药学上有效的量”是指以可适用于医学治疗的合理的收益/风险比治疗疾病充分的量，有效容量水平可根据包括患者疾病的种类、重症度、药物的活性、对药物的敏感度、给药时间、给药途径及排出比率、治疗期间、同时使用的药物的因素及其他医学领域中熟知的因素确定。
[0120]
在本发明中，本发明的药学组合物可与索拉非尼同时(simultaneous)、单独(separate)或依次(sequential)给药，可单次或多次给药。
[0121]
重要的是，将均考虑上述因素而在无副作用的情况下能够以最小限度的量得到最大效果的量进行给药，这可由本发明所属技术领域的普通技术人员确定。具体地，本发明药学组合物的有效量可根据患者的年龄、性别、状态、体重、体内活性成分的吸收度、非活性率及排泄速度、疾病种类、并用的药物而不同。
[0122]
本发明的药学组合物能够以多种途径给药到个体。例如，可通过口服给药、鼻腔内给药、经支气管给药、动脉注射、静脉注射、皮下注射、肌肉注射或腹腔内注射进行给药。每日给药量可每日分一次至几次进行给药。
dna)探针、双链dna(double stranded dna)探针、rna探针等的形态制作。在本发明中，利用与本发明的雌激素相关受体γ多核苷酸互补的探针实施杂交，可通过杂交程度筛选索拉非尼耐药性肝癌患者。适当的探针的选择及杂交条件能够以该领域中公知的内容为基础变形。
[0138]
本发明的引物或探针可使用亚磷酰胺固体支持体方法或其他广泛公知的方法化学合成。这种核酸序列还可利用该领域中公知的多种手段变形。这种变形的非限制性例有甲基化、加帽化、天然核苷酸向一个以上的同系物的取代及核苷酸之间的变形，例如，向不带电荷的连接体(如磷酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电荷的连接体(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的变形。
[0139]
当考虑生物学上具有等同活性的变异时，测定本发明中利用的雌激素相关受体γ基因的表达水平的制剂的碱基序列被解释为还包括与特异性地结合于雌激素相关受体γ基因的序列呈现实质同一性(substantial identity)的序列。上述术语“实质同一性”为以使特定序列与任意其他序列最大限度地相对应的方式排比(align)，当通过该领域中通常利用的算法分析排比的序列时，是指呈现最少60％的同一性，更具体为70％的同一性，进而具体为80％的同一性，最具体为90％的同一性的序列。
[0140]
在本发明的试剂盒中，术语“抗体”及“适体”与上述药学组合物中描述的内容相同，因而省略其记载。
[0141]
本发明的试剂盒可用于通过确认雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸表达水平或由这些基因编码的蛋白质的表达水平，诊断索拉非尼耐药性肝癌，或预测对索拉非尼的治疗反应性。
[0142]
本发明的试剂盒可用于预测对索拉非尼的治疗反应性，在这一方面，可用作用于预测肝癌患者的预后的用途。
[0143]
在本发明中，术语“预后预测”是指预先估计医学趋向，根据本发明的目的，是指预先估计肝癌患者对索拉非尼的耐药性。
[0144]
根据本发明的一实例，上述试剂盒可以为反转录-聚合酶链式反应试剂盒、竞争性反转录-聚合酶链式反应试剂盒、实时反转录-聚合酶链式反应试剂盒、dna芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒，但不局限于此。
[0145]
根据本发明的一实例，用于测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸表达水平的试剂盒可以为包含用于执行反转录-聚合酶链式反应所需的必要因素的试剂盒。反转录-聚合酶链式反应试剂盒除了对标记基因特异性的各个引物对之外，还可包括试管或其他适当的容器、反应缓冲液、脱氧核苷酸(dntps)、taq-聚合酶及反转录酶、脱氧核糖核酸酶(dnase)、核糖核酸酶(rnase)抑制剂、depc-水(depc-water)、灭菌水等。
[0146]
本发明的试剂盒中可包括用于从体液、细胞或组织提取核酸(例如，总rna)的试剂盒、标记用荧光物质、核酸扩增用酶及培养基、使用说明书等。
[0147]
根据本发明的再一实例，本发明的试剂盒可以为用来检测包括用于执行dna芯片所需的必要因素的雌激素相关受体γ的试剂盒。dna芯片试剂盒可包括以探针附着有基因或相当于其片段的cdna的基板，基板包含定量对照组基因或相当于其片段的cdna。
[0148]
根据本发明的另一实例，在本发明中，用于测定由雌激素相关受体γ编码的蛋白质的表达水平的试剂盒为了抗体的免疫学检测而可包含底物、适当的缓冲溶液、显色酶或
由荧光物质标记的第二抗体及显色底物等。上述中，底物可利用硝酸纤维素膜、由聚乙烯树脂合成的96孔板、由聚苯乙烯树脂合成的96孔板及由玻璃形成的载玻片等，显色酶可使用过氧化物酶(peroxidase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)，荧光物质可使用fitc、ritc等，显色底物液可使用abts(2,2
’‑
联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或opd(邻苯二胺)、tmb(四甲基联苯胺)等。
[0149]
本发明的试剂盒还可包括具有适合分析方法的一个以上的其他结构成分的组合物、溶液或装置。
[0150]
作为本发明的又一实施方式，提供用于诊断索拉非尼耐药性肝癌的信息提供方法。
[0151]
具体地，用于诊断索拉非尼耐药性肝癌的信息提供方法包括：步骤(a)，在从确认是否对索拉非尼呈现耐药性的肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；步骤(b)，在从并非索拉非尼耐药性肝癌的普通肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；以及步骤(c)，当在上述步骤(a)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平高于在上述步骤(b)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平时，将上述步骤(a)的肝癌患者判断为索拉非尼耐药性肝癌患者。
[0152]
在本发明中，术语“生物学试样”包括作为索拉非尼耐药性肝癌标记的雌激素相关受体γ的表达和/或活性水平存在差异的组织(肝组织)、细胞(肝细胞)、全血、血浆、血清、血液、唾液、滑液、尿液、痰液、淋巴液、脑脊液、组织尸检试样(脑、皮肤、淋巴结、脊髓等)、细胞培养上清液或破裂的真核细胞等，除了癌症的原发病灶之外，还包括来源于转移病灶的试样。可在操作这些生物学试样或未操作的状态下确认雌激素相关受体γ的活性或表达水平。
[0153]
在用于诊断本发明的索拉非尼耐药性肝癌的信息提供方法中，上述步骤(a)的生物学试样可利用向本发明所属技术领域的普通技术人员公知的特定方法获取。例如，生物学试样可从脊椎动物，尤其哺乳动物获取，优选地，可从要确认是否对索拉非尼呈现耐药性的肝癌患者获取。此时，上述肝癌患者为人类。组织活检时常用于得到肿瘤组织的代表性的碎片。作为替代方案，肿瘤细胞能够以被公知为包含关注肿瘤细胞或如此的组织或流体的形态间接得到。
[0154]
在本发明中，术语“信使核糖核酸表达水平测定”为在生物学试样中确认雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸存在与否和表达程度的过程，可通过测定信使核糖核酸的量来得知。用于其的分析方法有反转录-聚合酶链式反应、竞争性反转录-聚合酶链式反应(competitive rt-pcr)、实时反转录-聚合酶链式反应(real-time rt-pcr)、rnase保护分析法(rnase protection method)、rna印迹法(northern blotting)或dna芯片(dna chip technology)等，但不局限于此。
[0155]
在本发明中，术语“蛋白质表达水平测定”为在生物学试样中确认从雌激素相关受体γ基因表达的蛋白质的存在与否和表达程度的过程，可利用对从上述基因表达的蛋白质特异性地相结合的抗体确认蛋白质的量。用于其的分析方法有蛋白质印迹法(western blotting)、酶联免疫吸附测定法(elisa，enzyme linked immunosorbentassay)、放射免疫
分析法(ria，radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radial immunodiffusion)、双向免疫扩散法(ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)、免疫组织化学染色法(immunohistochemical staining)、免疫沉淀分析法(immunoprecipitation assay)、补体固定分析法(complement fixation assay)、免疫荧光法(immunofluorescence)、免疫层析法(immunochromatography)、荧光激活细胞分选仪(facs)分析法(fluorescenceactivated cell sorter analysis)或蛋白质芯片方法(protein chip technology)等，但不局限于此。
[0156]
在用于诊断本发明的索拉非尼耐药性肝癌的信息提供方法中，并非索拉非尼耐药性肝癌的普通肝癌患者可以为未呈现索拉非尼耐药性肝癌的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)或肝腺癌(hepatic adenocarcinoma)患者，但不局限于此。
[0157]
在本发明的用于诊断索拉非尼耐药性肝癌的信息提供方法中，可在信使核糖核酸水平或蛋白质水平测定上述雌激素相关受体γ基因的表达水平，在生物学试样中可利用公知的工序执行信使核糖核酸或蛋白质的分离。用于测定信使核糖核酸水平的分析方法及用于测定蛋白质水平的分析方法如上所述。
[0158]
可通过本发明的用于诊断索拉非尼耐药性肝癌的信息提供方法预测肝癌患者对索拉非尼的治疗反应性，基于预测结果按不同患者制定治疗策略，以可有效治疗肝癌。
[0159]
对此，作为本发明的又一实施方式，提供确定肝癌患者的治疗方法所需的信息提供方法，其包括在从肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平。
[0160]
具体地，提供确定肝癌患者的治疗方法所需的信息的方法包括：步骤(a)，在从肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；步骤(b)，在从并非索拉非尼耐药性肝癌的普通肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；以及步骤(c)，当在上述步骤(a)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平高于在上述步骤(b)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平时，将上述步骤(a)的肝癌患者判断为索拉非尼耐药性肝癌患者。
[0161]
当根据提供确定上述肝癌患者的治疗方法所需的信息的方法确认肝癌患者对索拉非尼的耐药性时，可适用除了索拉非尼之外的其他公知的肝癌治疗剂诱导肝癌治疗效果。
[0162]
由此，在追加方面，本发明提供索拉非尼耐药性肝癌的诊断及治疗方法。
[0163]
具体地，本发明的索拉非尼耐药性肝癌的诊断及治疗方法包括：步骤(a)，在从肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；步骤(b)，在从并非索拉非尼耐药性肝癌的普通肝癌患者分离的生物学试样中测定雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平；以及步骤(c)，当在上述步骤(a)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平高于在上述步骤(b)中测定的雌激素相关受体γ基因的信使核糖核酸或由此表达的蛋白质的表达水平时，将上述步骤(a)的肝癌患者判断为索拉非尼耐药性肝癌患者，适用除了索拉非尼之外的其他肝癌治疗剂。
[0164]
本发明的提供确定肝癌患者的治疗方法所需的信息的方法和/或索拉非尼耐药性肝癌的诊断及治疗方法的具体内容与上述的用于诊断索拉非尼耐药性肝癌的信息提供方法相同，因而省略其记载。
[0165]
本说明书及发明要求保护范围中使用的术语或词汇不应限定于通常或词典上的含义而解释，发明人为了以最佳的方法说明其自身发明而应立足于可适当定义术语的概念的原则解释为符合本发明的技术思想的含义和概念。
[0166]
以下，为了有助于理解本发明，提出优选的实施例。但是，以下实施例仅用于更加容易理解本发明，本发明的内容不局限于以下实施例。
[0167]
实施本发明的方式
[0168]
实验例
[0169]
常规实验方法
[0170]
本发明人应用来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株(huh7-sr cell line，sk-hep-r cell line)和肝癌细胞株的动物模型(xenograft)来执行实验。为了确认作为雌激素相关受体γ反向激动剂(inverse agonist)的合成化合物dn200434对肝癌细胞的增殖和ros产生的影响，利用细胞计数(cell count)和dcf-da(2',7'-二氯荧光素二乙酸酯，2',7'-dichlorofluorescin diacetate)测定ros。最后，将索拉非尼耐药性肝癌细胞株注入于白鼠来诱导索拉非尼耐药性肝癌的形成之后，在注入雌激素相关受体γ反向激动剂dn200434和索拉非尼的组及注入对照药物的组中确认到肝癌的大小变化。
[0171]
实施例1
[0172]
索拉非尼耐药性肝癌细胞株的构建和雌激素相关受体γ表达增加的确认
[0173]
使肝癌细胞株[huh7细胞(cell)(韩国细胞株银行kclb no.60104)，sk-hep细胞(htb-52
tm
)]持续暴露在索拉非尼中(逐渐增加至10μm)，以构建索拉非尼耐药性肝癌细胞株(huh7-sr cell line，sk-hep-r cell line)。首先，为了利用facs评价癌细胞死亡，将癌细胞株培养于fitc-结合膜联蛋白(annexin)及碘化丙啶(propidium iodide，pi)15分钟之后，利用流式细胞仪(flow cytometry)测定膜联蛋白和pi结合，利用bd accuri c6流式细胞仪(bd生物科学(biosciences))获得数据，通过accuri c6分析程序(bd生物科学)/flowjo软件(flowjo，llc.)进行分析。利用切割的半胱天冬酶-3抗体(cleaved caspase-3antibody)(细胞信号技术(cell signaling technology))评价癌细胞株死亡，如图1a至图1c所示，确认到作为索拉非尼耐药性肝癌细胞株的huh7-sr细胞株和sk-hep-r细胞株均未因索拉非尼而增加细胞凋亡。
[0174]
并且，为了在huh7-sr细胞株及sk-hep-r细胞株中确认孤儿核受体雌激素相关受体γ的表达形态而执行蛋白质印迹，其结果，如图2a及图2b所示，确认到上述两种索拉非尼耐药性肝癌细胞株中均显著增加雌激素相关受体γ的表达。
[0175]
实施例2
[0176]
孤儿核受体雌激素相关受体γ对索拉非尼耐药性肝癌产生的影响的查明
[0177]
为了查明作为雌激素相关受体γ反向激动剂的由化学式1表示的化合物dn200434对索拉非尼耐药性肝癌细胞的ros的生成产生的影响，使用作为ros探针的h2-dcf-da(2',7'-二氯氢荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorohydrofluorescein diacetate)；英杰(invitrogen)公司，美国)用facs测定。将索拉非尼(10μm)和dn200434化合物(12μm)处理于
药剂耐药性细胞24小时之后，将10μm的h2-dcf-da添加到细胞来培养30分钟，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗之后，使用bd accuri
tm
c6流式细胞仪(bd生物科学，美国)收集数据，使用accuri
tm
c6分析程序(bd生物科学，美国)进行分析。对于细胞数评价，对索拉非尼耐药性肝癌细胞株并用处理索拉非尼(10μm)和dn200434化合物(12μm)用台盼蓝(trypan blue)染色之后，利用细胞计数器(hemocytometer)测定细胞数。
[0178]
其结果，如图3a及图3b所示，在作为索拉非尼耐药性肝癌细胞株的huh7-sr细胞株及sk-hep-r细胞株中均确认到ros因dn200434化合物而增加，如图4a及图4b所示，确认到当单独处理索拉非尼时无效的耐药性肝癌细胞因由上述化学式1表示的dn200434的同时给药而细胞增殖显著减少。通过如上所述的结果确认到dn200434抑制雌激素相关受体γ活性，增加对索拉非尼的敏感性，可克服对药剂的耐药性。
[0179]
实施例3
[0180]
索拉非尼耐药性肝癌动物模型中抗癌效果的确认
[0181]
将索拉非尼耐药性肝癌细胞株huh7-r注入于小鼠，构建索拉非尼耐药性肝癌动物模型(xenograft)，之后将雌激素相关受体γ反向激动剂、dn200434(化学式1)和索拉非尼并用给药，之后，测定所形成的肿块的大小变化。此时，将对索拉非尼耐药性肝癌动物模型仅处理索拉非尼的组利用为比较对照组。
[0182]
其结果，如图5a至图5c所示，在向来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株huh7-r的动物模型将作为雌激素相关受体γ反向激动剂的由上述化学式1表示的dn200434化合物与索拉非尼并用给药的组中，确认到相比于对照组，肝癌的肿瘤大小、重量及体积显著减少。此时，如图5d中所确认，实验组和对照组之间的体重变化未呈现差异。
[0183]
以与上述相同的方法建立来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株sk-hep-r的动物模型，确认到作为雌激素相关受体γ反向激动剂的由上述化学式1表示的dn200434化合物和索拉非尼的并用给药效果。
[0184]
同样，如图6a至图6c所示，在来源于索拉非尼耐药性肝癌细胞株sk-hep-r的动物模型中，也在将dn200434化合物和索拉非尼并用给药的组中，确认到相比于对照组，肝癌的肿瘤大小、重量及体积显著减少，如图6d中所确认，实验组和对照组之间的体重变化未呈现差异。
[0185]
综合上述实施例1至实施例3的结果，确认到在索拉非尼耐药性肝癌中雌激素相关受体γ的表达有意义地增加，在细胞实验中确认到由化学式1表示的雌激素相关受体γ反向激动剂、dn200434增加细胞内ros，以抑制索拉非尼耐药性肝癌细胞的增殖，增加对索拉非尼的敏感性。并且，可确认在利用索拉非尼耐药性肝癌细胞株的动物实验中也相比于对照组，癌症增殖有意义地减少。如上所述的结果证明雌激素相关受体γ对肝癌的药剂耐药性起到重要作用，当利用雌激素相关受体γ反向激动剂、dn200434抑制雌激素相关受体γ的活性时，对治疗药剂耐药性进行性肝癌有效。
[0186]
上述的本发明的说明用于例示，本发明所属技术领域的普通技术人员应当理解可在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下以其他具体的形态容易变形。因而应当理解以上描述的实施例在所有方面是例示性的，而非限定。