包含靶向TNFα和OX40L的免疫球蛋白单可变结构域的多肽的制作方法

包含靶向tnf
α
和ox40l的免疫球蛋白单可变结构域的多肽
1技术领域
1.本发明技术涉及靶向tnfα和ox40l的多肽。它还涉及编码所述多肽的核酸分子和包含所述核酸的载体，并且涉及包含所述多肽、核酸或载体的组合物。本发明技术还涉及用于治疗患有自身免疫疾病或炎性疾病的受试者的方法中的这些产品。此外，本发明技术涉及产生这些产品的方法。
2

背景技术：

2.自身免疫疾病或炎性疾病是机体针对其自身组织产生的免疫应答的结果。自身免疫疾病或炎性疾病通常是慢性的，并且甚至可能危及生命。自身免疫疾病或炎性疾病包括炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎和化脓性汗腺炎。炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)是涉及肠道炎症并伴有上皮损伤的慢性炎性疾病。其他慢性自身免疫疾病如银屑病、银屑病关节炎和化脓性汗腺炎的特征是发红、干燥、发痒或鳞状皮肤斑块，关节疼痛性炎症，或者皮肤上出现炎症和红肿肿块。已经发现，患有银屑病的患者更可能患有某些合并症，包括糖尿病和炎性肠病(如克罗恩病或溃疡性结肠炎)以及癌症。
3.肿瘤坏死因子α(tnfα)是一种同三聚体细胞因子，其主要由单核细胞和巨噬细胞产生，但已知也由cd4
+
和cd8
+
外周血t淋巴细胞分泌。tnfα可以作为可溶形式或作为跨膜蛋白存在。tnfα的主要作用是调节免疫细胞。tnfα充当内源性热原，并且其产生的调节异常与多种人类疾病有关，包括类风湿性关节炎(ra)、银屑病(pso)、化脓性汗腺炎(hs)、炎性肠病(ibd)(如克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc))、以及移植物抗宿主病(gvhd)。
4.fda目前批准的用于ra和ibd炎性肠病的治疗包括抗tnfα生物制剂(如[戈利木单抗]、[依那西普]、[英夫利昔单抗]和[阿达木单抗])。然而，当前用于ra的抗tnfα治疗仅在少数患者中显示完全疾病缓解，并且仍存在大部分无反应者。类似地，当前用于炎性肠病的抗tnfα治疗面临大量对当前可用治疗无反应的患者，并且大部分患者在治疗12个月后发生对抗tnfα治疗的反应丧失。对于银屑病和银屑病关节炎，仅少数患者用包括[英夫利昔单抗]和[阿达木单抗]的生物制剂进行治疗。已经显示当前治疗至少在患者亚组中对于一些银屑病的治疗是有效的。
[0005]
因此，对于自身免疫疾病如例如类风湿性关节炎或银屑病关节炎，迄今还没有生物制剂在大多数患者中展现关于疾病缓解的足够功效，并且反应的缺乏或丧失仍然是个问题。
[0006]
ox40l(也称为cd252或tnfsf4)是tnf超家族的成员，并且是ox40受体(也称为cd134或tnfrsf4)的可诱导的共刺激配体。它主要在激活的抗原呈递细胞(apc)上表达，所述抗原呈递细胞包括树突细胞、巨噬细胞和b细胞。另一方面，ox40主要在激活的t细胞和自然杀伤t细胞上表达。ox40l主要表达为膜结合分子，但是也可以以切割的可溶形式被检测
到。ox40l/ox40已经被公认为多种疾病中的免疫共刺激调节剂，所述疾病的特征为协调免疫应答的激活的t细胞。其触发经由ox40的信号传导，从而引起多种活性，包括炎性细胞因子的产生和释放、效应t细胞(例如th1、th2、th17)和细胞毒性t细胞的扩增和积累，以及降低treg细胞的抑制功效。尽管几项研究表明共刺激ox40l/ox40轴参与自身免疫疾病如ra、pso或ibd，但是当前没有fda批准的ox-40l生物制剂用于其治疗。
[0007]
靶向多种疾病因子可以例如通过两种单独的生物制剂(例如与不同的治疗靶标结合的抗体)的共同施用或组合使用来实现。然而，从实用和商业两个角度来看，共同施用或组合使用单独的生物制剂可能具有挑战性。例如，单独产品的两次注射给患者带来了更加不便和更痛苦的治疗方案，这可能对依从性产生负面影响。关于两种单独产品的单次注射，提供允许两种产品在所需浓度下可接受的粘度和合适的稳定性的配制品可能是困难或不可能的。另外，共同施用和共同配制需要产生两种单独的药物，这可能增加总成本。
[0008]
已经提出了能够与两种不同抗原结合的双特异性抗体作为解决与单独生物制剂(如抗体)的共同施用或组合使用相关的此类局限的一种策略。
[0009]
已经提出了多种形式的双特异性抗体构建体。例如，双特异性抗体形式可能涉及两种抗体或其片段的化学缀合(brennan，m，等人，science，1985.229(4708)：第81-83页；glennie，m.j.，等人，j immunol，1987.139(7)：第2367-2375页)。
[0010]
然而，此类双特异性抗体形式的缺点包括：在高浓度下的高粘度使得例如皮下施用具有挑战性，并且在于每个结合单元需要两个可变结构域相互作用以进行特异性高亲和力结合，对多肽稳定性和产生效率具有影响。此类双特异性抗体形式也可能潜在地导致与轻链错配或重链错配有关的化学、制造和控制(cmc)问题。
3

技术实现要素：

[0011]
在一些实施方案中，本发明技术涉及同时特异性靶向tnfα和ox40l的多肽(或isvd构建体)，其导致与单特异性抗tnfα或抗ox40l多肽相比提高的调节炎性反应的效率。
[0012]
在一些实施方案中，本发明技术的多肽被高效产生(例如在微生物宿主中)并且在高浓度下具有低粘度，这对于皮下施用是有利和方便的。此外，在一些实施方案中，本发明技术的多肽对待治疗的受试者中预先存在的抗体(即在第一次用所述抗体构建体治疗之前存在于受试者中的抗体)具有有限的反应性。在优选实施方案中，此类多肽在待治疗的受试者中展现出足够长的半衰期，使得可以方便地将连续的治疗间隔开。
[0013]
本发明技术的多肽包含至少四个免疫球蛋白单可变结构域(isvd)或由其组成，其中至少两个isvd与tnfα特异性地结合，并且至少两个isvd与ox40l特异性地结合。优选地，与tnfα结合的至少两个isvd与人tnfα特异性地结合，并且与ox40l结合的至少两个isvd与人ox40l特异性地结合。
[0014]
所述多肽优选地还包含任选地经由一个或多个肽接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的相应多肽相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供增加的半衰期。例如，结合单元可以是与血清蛋白结合、优选地与人血清蛋白如人血清白蛋白结合的isvd。
[0015]
还提供了一种能够表达本发明技术的多肽的核酸分子、包含所述核酸的核酸或载
体以及包含所述多肽、所述核酸或所述载体的组合物。所述组合物优选地是药物组合物。
[0016]
还提供了一种包含编码根据本发明技术的多肽的核酸或载体的宿主或宿主细胞。
[0017]
还提供了一种产生根据本发明技术的多肽的方法，所述方法至少包括以下步骤：
[0018]
a.任选地在合适的宿主细胞或宿主生物中或在另一合适的表达系统中表达编码根据本发明技术的多肽的核酸序列，任选地接着是：
[0019]
b.分离和/或纯化根据本发明技术的多肽。
[0020]
此外，本发明技术提供了用作药物的所述多肽、包含所述多肽的组合物或包含含有编码所述多肽的核苷酸序列的核酸或载体的组合物。优选地，所述多肽或组合物用于自身免疫疾病或炎性疾病的治疗中，其中所述自身免疫疾病或炎性疾病优选地选自类风湿性关节炎、炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、银屑病、化脓性汗腺炎、移植物抗宿主病。
[0021]
另外，提供了治疗自身免疫疾病或炎性疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用药学活性量的根据本发明技术的多肽或组合物。所述自身免疫疾病或炎性疾病优选地选自类风湿性关节炎、炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)和化脓性汗腺炎。在优选实施方案中，所述方法还包括施用一种或多种另外的治疗剂，如甲氨蝶呤。
[0022]
还提供了本发明技术的多肽或组合物在制备用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病的药物组合物中的用途，其中所述自身免疫疾病或炎性疾病优选地选自类风湿性关节炎、炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、银屑病、化脓性汗腺炎、移植物抗宿主病。
[0023]
具体地，本发明技术提供了以下实施方案：
[0024]
实施方案1：一种多肽、包含所述多肽的组合物、或包含含有编码所述多肽的核苷酸序列的核酸的组合物，所述多肽或组合物用作药物，其中所述多肽包含至少四个免疫球蛋白单可变结构域(isvd)或由其组成，其中所述isvd中的每一个包含任选地经由一个或多个肽接头连接的三个互补决定区(分别是cdr1至cdr3)；并且其中：
[0025]
a.第一isvd和第二-isvd包含
[0026]
i.cdr1，所述cdr1包含seq id no：7的氨基酸序列或与seq id no：7具有2或1个氨基酸差异；
[0027]
ii.cdr2，所述cdr2包含seq id no：10的氨基酸序列或与seq id no：10具有2或1个氨基酸差异；以及
[0028]
iii.cdr3，所述cdr3包含seq id no：13的氨基酸序列或与seq id no：13具有2或1个氨基酸差异；并且
[0029]
b.第三isvd和第四isvd包含
[0030]
iv.cdr1，所述cdr1包含seq id no：8的氨基酸序列或与seq id no：8具有2或1个氨基酸差异；
[0031]
v.cdr2，所述cdr2包含seq id no：11的氨基酸序列或与seq id no：11具有2或1个氨基酸差异；以及
[0032]
vi.cdr3，所述cdr3包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有2或1个氨基酸差异，
[0033]
其中所述isvd的顺序是从n末端开始。
[0034]
实施方案2：根据实施方案1所述的用于所述用途的组合物，所述组合物是药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，
并且任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。
[0035]
实施方案3：根据实施方案1或2所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中：
[0036]
a.所述第一isvd和所述第二isvd包含含有seq id no：7的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：10的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：13的氨基酸序列的cdr3；并且
[0037]
b.所述第三isvd和所述第四isvd包含含有seq id no：8的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：11的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：14的氨基酸序列的cdr3。
[0038]
实施方案4：根据实施方案1至3中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中：
[0039]
a.所述第一isvd的氨基酸序列包含与seq id no：2的超过90％的序列同一性；
[0040]
b.所述第二isvd的氨基酸序列包含与seq id no：3的超过90％的序列同一性；
[0041]
c.所述第三isvd的氨基酸序列包含与seq id no：4的超过90％同一性的序列同一性；并且
[0042]
d.所述第四isvd的氨基酸序列包含与seq id no：6的超过90％同一性的序列同一性。
[0043]
实施方案5：根据实施方案1至4中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中：
[0044]
a.所述第一isvd包含seq id no：2的氨基酸序列；
[0045]
b.所述第二isvd包含seq id no：3的氨基酸序列；
[0046]
c.所述第三isvd包含seq id no：4的氨基酸序列；并且
[0047]
d.所述第四isvd包含seq id no：6的氨基酸序列。
[0048]
实施方案6：根据实施方案1至5中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述多肽还包含任选地经由一个或多个肽接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的相应多肽相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供增加的半衰期。
[0049]
实施方案7：根据实施方案6所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可与血清蛋白结合的结合单元、fc部分和可与血清蛋白结合的小蛋白质或肽。
[0050]
实施方案8：根据实施方案6至7中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自可与血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如igg)结合的结合单元。
[0051]
实施方案9：根据实施方案8所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述结合单元是可与人血清白蛋白结合的isvd。
[0052]
实施方案10：根据实施方案9所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述与人血清白蛋白结合的isvd包含
[0053]
i.cdr1，所述cdr1包含seq id no：9的氨基酸序列或与seq id no：9具有2或1个氨基酸差异；
[0054]
ii.cdr2，所述cdr2包含seq id no：12的氨基酸序列或与seq id no：12具有2或1个氨基酸差异；以及
[0055]
iii.cdr3，所述cdr3包含seq id no：15的氨基酸序列或与seq id no：15具有2或1个氨基酸差异。
[0056]
实施方案11：根据实施方案9至10中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述与人血清白蛋白结合的isvd包含含有seq id no：9的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：12的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：15的氨基酸序列的cdr3。
[0057]
实施方案12：根据实施方案9至11中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述与人血清白蛋白结合的isvd的氨基酸序列包含与seq id no：5的超过90％的序列同一性。
[0058]
实施方案13：根据实施方案9至12中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述与人血清白蛋白结合的isvd包含seq id no：5的氨基酸序列。
[0059]
实施方案14：根据实施方案1至13中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述多肽的氨基酸序列包含与seq id no：1的超过90％的序列同一性。
[0060]
实施方案15：根据实施方案1至14中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述多肽包含seq id no：1的氨基酸序列或由其组成。
[0061]
实施方案16：根据实施方案1至15中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病。
[0062]
实施方案17：根据实施方案16所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述自身免疫疾病或炎性疾病选自类风湿性关节炎、炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、银屑病、化脓性汗腺炎、以及移植物抗宿主病。
[0063]
实施方案18：一种多肽，所述多肽包括包含编码所述多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述多肽包含至少四个免疫球蛋白单可变结构域(isvd)或由其组成，其中所述isvd中的每一个包含任选地经由一个或多个肽接头连接的三个互补决定区(分别是cdr1至cdr3)；并且其中：
[0064]
a.第一isvd和第二-isvd包含
[0065]
i.cdr1，所述cdr1包含seq id no：7的氨基酸序列或与seq id no：7具有2或1个氨基酸差异；
[0066]
ii.cdr2，所述cdr2包含seq id no：10的氨基酸序列或与seq id no：10具有2或1个氨基酸差异；以及
[0067]
iii.cdr3，所述cdr3包含seq id no：13的氨基酸序列或与seq id no：13具有2或1个氨基酸差异；并且
[0068]
b.第三isvd和第四isvd包含
[0069]
iv.cdr1，所述cdr1包含seq id no：8的氨基酸序列或与seq id no：8具有2或1个氨基酸差异；
[0070]
v.cdr2，所述cdr2包含seq id no：11的氨基酸序列或与seq id no：11具有2或1个氨基酸差异；以及
[0071]
vi.cdr3，所述cdr3包含seq id no：14的氨基酸序列或与seq id no：14具有2或1个氨基酸差异，
[0072]
其中所述isvd的顺序是从n末端开始。
[0073]
实施方案19：根据实施方案18所述的多肽，其中：
[0074]
a.所述第一isvd和所述第二isvd包含含有seq id no：7的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：10的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：13的氨基酸序列的cdr3；并且
[0075]
b.所述第三isvd和所述第四isvd包含含有seq id no：8的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：11的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：14的氨基酸序列的cdr3。
[0076]
实施方案20：根据实施方案18或19所述的多肽，其中：
[0077]
a.所述第一isvd的氨基酸序列包含与seq id no：2的超过90％的序列同一性；
[0078]
b.所述第二isvd的氨基酸序列包含与seq id no：3的超过90％的序列同一性；
[0079]
c.所述第三isvd的氨基酸序列包含与seq id no：4的超过90％同一性的序列同一性；并且
[0080]
d.所述第四isvd的氨基酸序列包含与seq id no：6的超过90％同一性的序列同一性。
[0081]
实施方案21：根据实施方案18至20中任一项所述的多肽，其中：
[0082]
a.所述第一isvd包含seq id no：2的氨基酸序列；
[0083]
b.所述第二isvd包含seq id no：3的氨基酸序列；
[0084]
c.所述第三isvd包含seq id no：4的氨基酸序列；并且
[0085]
d.所述第四isvd包含seq id no：6的氨基酸序列。
[0086]
实施方案22：根据实施方案18至21中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含任选地经由一个或多个肽接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的相应多肽相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供增加的半衰期。
[0087]
实施方案23：根据实施方案22所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可与血清蛋白结合的结合单元、fc部分和可与血清蛋白结合的小蛋白质或肽。
[0088]
实施方案24：根据实施方案22至23中任一项所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自可与血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如igg)结合的结合单元。
[0089]
实施方案25：根据实施方案24所述的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述结合单元是可与人血清白蛋白结合的isvd。
[0090]
实施方案26：根据实施方案25所述的多肽，其中所述与人血清白蛋白结合的isvd包含
[0091]
i.cdr1，所述cdr1包含seq id no：9的氨基酸序列或与seq id no：9具有2或1个氨基酸差异；
[0092]
ii.cdr2，所述cdr2包含seq id no：12的氨基酸序列或与seq id no：12具有2或1个氨基酸差异；以及
[0093]
iii.cdr3，所述cdr3包含seq id no：15的氨基酸序列或与seq id no：15具有2或1个氨基酸差异。
[0094]
实施方案27：根据实施方案25至26中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述与人血清白蛋白结合的isvd包含含有seq id no：9的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：12的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：15的氨基酸序列的cdr3。
[0095]
实施方案28：根据实施方案25至27中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述与人血清白蛋白结合的isvd的氨基酸序列包含与seq id no：5的超过90％的序列同一性。
[0096]
实施方案29：根据实施方案25至28中任一项所述的多肽，其中所述与人血清白蛋白结合的isvd包含seq id no：5的氨基酸序列。
[0097]
实施方案30：根据实施方案18至29中任一项所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含与seq id no：1的超过90％的序列同一性。
[0098]
实施方案31：根据实施方案18至30中任一项所述的用于所述用途的多肽或组合物，其中所述多肽包含seq id no：1的氨基酸序列或由其组成。
[0099]
实施方案32：一种核酸，所述核酸包含编码根据实施方案18至31中任一项所述的多肽的核苷酸序列。
[0100]
实施方案33：一种宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞包含根据实施方案32所述的核酸。
[0101]
实施方案34：一种产生根据实施方案18-31中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括以下步骤：
[0102]
a.在合适的宿主细胞或宿主生物中或在另一种合适的表达系统中表达根据实施方案32所述的核酸；任选地接着是：
[0103]
b.分离和/或纯化根据实施方案18至31中任一项所述的多肽。
[0104]
实施方案35：一种组合物，所述组合物包含至少一种根据实施方案18至31中任一项所述的多肽，或根据实施方案32所述的核酸。
[0105]
实施方案36：根据实施方案35所述的组合物，所述组合物是药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。
[0106]
实施方案37：一种治疗自身免疫疾病或炎性疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用药学活性量的根据实施方案18至31中任一项所述的多肽或根据实施方案35至36中任一项所述的组合物。
[0107]
实施方案38：根据实施方案37所述的方法，其中所述自身免疫疾病或炎性疾病选自类风湿性关节炎、炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、银屑病、化脓性汗腺炎、移植物抗宿主病。
[0108]
实施方案39：根据实施方案37至38中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用一种或多种另外的治疗剂。
[0109]
实施方案40：根据实施方案39所述的方法，其中所述另外的治疗剂是甲氨蝶呤。
[0110]
实施方案41：根据实施方案18至31中任一项所述的多肽或根据实施方案35至36中任一项所述的组合物在制备用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病的药物组合物中的用途。
[0111]
实施方案42：根据实施方案41所述的多肽或组合物的用途，其中所述自身免疫疾病或炎性疾病选自类风湿性关节炎、炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、银屑病、化脓性汗腺炎、移植物抗宿主病。
4附图说明
[0112]
图1：显示了重组可溶htnfα和hox40l与经由hsa捕获的isvd构建体f027300252的同时结合的传感图。
[0113]
图2：可溶tnfα和膜结合hox40l与isvd构建体f027300252的同时结合，如通过流式细胞术在表达人ox40l的cho-ki细胞上所示。irr00096是阴性对照v
hh
。
[0114]
图3：在glo response
tm hek293_nfκb-nlucp报告物测定中isvd构建体f0275000252和参考化合物抗htnfα参考mab对可溶人和食蟹猴tnfα的抑制，irr00096是阴性对照v
hh
。
[0115]
图4：isvd构建体f0275000252和参考化合物抗hox40l mab对膜结合ox40l的抑制，如在pbmc活性测定中所确定。
[0116]
图5：5ng/ml的重组人tnfα或100ng/ml的人ox40l或二者的组合对萤光素酶活性[rlu]的诱导，以及从0.5μg/ml至高达5μg/ml的不同浓度的抗tnfα抗体(pb03017；来自sanofi)、抗ox40l抗体(目录号ab00536，来自absolute antibody)或两种抗体的组合对诱导的萤光素酶活性的抑制。
[0117]
图6：重组人tnfα与人ox40l的组合对萤光素酶活性[rlu]的诱导(如图5中所解释)，以及单特异性抗ox40l v
hh alx-0632、或单特异性抗tnf v
hh atn-103、或抗tnf/抗ox40l双特异性isvd构建体f027300252、f027301104、f027301189、f027301197和f027301199对诱导的萤光素酶活性的抑制。显示通过双特异性或单特异性isvd构建体/v
hh
实现的对nfkb萤光素酶活性的最大抑制％。
[0118]
图7：重组人tnfα与人ox40l的组合对萤光素酶活性的诱导(如图5中所解释)，以及抗tnf/抗ox40l双特异性isvd构建体f027300252、f027301104、f027301189、f027301197和f027301199对诱导的萤光素酶活性的抑制。显示来自至少3次独立实验的平均ic50值(pm)
±
sd。
[0119]
图8：在成熟的第1天、第2天和第3天，ox40l在人单核细胞衍生的树突细胞上的表面表达。通过流式细胞术测量ox40l的表达。结果对应于来自针对来自5个同种异体供体的pbmc测试的3个不同人mdc供体的平均值
±
sem。
[0120]
图9：在第5天，mlr测定中的gm-csf表达。在与单独的抗tnfa抗体[10μg/ml]、或单独的抗ox40l抗体[10μg/ml]、或抗tnf[10μg/ml]+抗ox40l[10μg/ml]抗体的组合一起孵育后，在mlr测定的上清液中测量gm-csf的分泌。结果来自针对来自3个同种异体dc供体的dc测试的5个pbmc供体。
**
p《0.0016，
****
p＜0.0001。
[0121]
图10：显示与对照isvd构建体f027301099和f027301186相比，存在于96个人血清样品中的预先存在的抗体与isvd构建体f027300252、f027301104、f027301189和f027301197的结合的箱形图。
[0122]
图11：显示存在于96个人血清样品中的预先存在的抗体与isvd构建体f027300028、f027300252、f027301097和f027301186的结合的箱形图。
[0123]
图12：不同治疗组(n＝8只小鼠/组)中随时间变化的关节炎得分。从6周龄开始，动物每周两次接受腹膜内注射指定化合物。显示平均每周关节炎得分
±
sem。统计学是双因素anova和邦弗朗尼(bonferroni)多重比较检验。ns(不显著)p＞0.05，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01。
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001。
[0124]
图13：随时间变化的关节炎得分的曲线下面积。显示单独值(符号)和平均值
±
sem(条形)。统计学是单因素anova和邦弗朗尼多重比较检验。ns(不显著)p＞0.05，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01。
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001。
[0125]
图14：组织学得分。显示单独值(符号)和平均值
±
sem(条形)。统计学是单因素anova和邦弗朗尼多重比较检验。
[0126]
图15：用于在tnfα人源化小鼠胶原抗体诱导的关节炎(caia)模型中测试抗tnfa-ox40l isvd构建体f027300252(称为nab)的功效的研究设计。将抗htnfα参考mab与isvd构建体同时进行给药，第1剂量在lps后6小时，并且第2剂量在lps后3天即第4天。
[0127]
图16：在caia的小鼠模型中实验随时间变化的关节炎得分发展(n＝8只小鼠/组，媒介物除外：n＝16只/组，来自两次独立实验)。动物根据图10中的方案接受媒介物、参考化合物抗htnfα参考mab、或半衰期延长的抗tnfa-ox40l isvd构建体f027300252的两次腹膜内注射。统计学是双因素anova和邦弗朗尼多重比较检验。
[0128]
图17：在caia的小鼠模型中来自实验的关节炎得分的auc(n＝8只小鼠/组，媒介物除外：n＝16只/组来自两次独立实验)。
[0129]
图18：组合tdar-dth模型的研究方案。按天计的时程顶部上的浅灰色框展示了用于研究的tdar部分的klh施用。深灰色框标记用于研究的dth部分的第二抗原破伤风样毒素(ttx)和氢氧化铝(alu)的肌内注射。时程顶部上的白色框标记在第31天和第56天使用ttx/alu和klh的皮肤激发，深色箭头用于dth模型。显示第34天和第59天尸检时针对组织病理学和免疫组织化学评估的皮肤活组织检查。在ttx/alu和klh激发后，在相应的dth激发时跟踪所述皮肤区域24/48/72小时以评估存活期间的变化，如表15中所述。
[0130]
图19：在第1天和第29天以3、10、30、100(mg/kg/adm)皮下施用至雌性猴之后，f027300252的平均血清浓度(ng/ml)(半对数标度图)。
[0131]
图20：食蟹猴tdar中的抗klh应答，集中于抗klh igg应答。每组使用4只食蟹猴。数据描绘为平均值
±
sd。d3(第3天)和d31(第31天)标记klh刺激的时间点。初级应答跨越bl(-12d)与第30天(30d)之间的时间窗，次级应答跨越第31天(31d)与第59天研究结束时(59d)之间的时间窗。f027300252是以剂量依赖性方式从3mg/kg至100mg/kg经由每周皮下注射来施用。用第29天的第五次注射停止治疗。统计学是双因素anova和邦弗朗尼多重比较检验，并且应用于次级应答。在初级应答期间，所有治疗组与媒介物没有显著不同。
[0132]
图21：在tdar猴研究中，在tdar的次级应答期间在第34天与第59天之间，来自4mg/kg抗htnfα参考mab和8mg/kg抗hox40l参考mab的媒介物(先导研究)以及来自不同剂量水平f027300252(3、10、30和100mg/kg)的以百分比计的抗klh igg auc的平均下降。剂量表示为nmol/kg。
[0133]
图22：在第59天pbmc的klh再刺激后，通过elispot测定确定的ifn-γ斑点形成细胞/百万个细胞。条形表示平均值
±
sd。单独动物描绘为实心圆(媒介物对照)或空心圆(f027300252治疗组)。以mg/kg提供f027300252的相应剂量。在30mg/kg组中，一只动物的测定未符合质量控制标准，使得仅显示四只动物中的三只。统计学是单因素anova和邦弗朗尼多重比较检验。
[0134]
图23：在第59天pbmc的klh再刺激后，通过eltspot测定确定的il-4斑点形成细胞/百万个细胞。条形表示平均值
±
sd。单独动物描绘为实心圆(媒介物对照)或空心圆
(f027300252治疗组)。以mg/kg提供f027300252的相应剂量。在30mg/kg组中，一只动物的测定未符合质量控制标准，使得仅显示四只动物中的三只。统计学是单因素anova和邦弗朗尼多重比较检验。
[0135]
图24：左侧卡通图上用于tdar(浅灰色)和dth(深灰色)的不同免疫的示意图。对于dth，在第31天或第59天分别用ttx/alu和klh激发动物。使用不同皮内注射部位，如中间卡通图所描绘。在第34天以及在第59天研究结束时取直径8mm的活组织检查，并且通过组织病理学和免疫组织化学进行评估(卡通图的右侧部分)。
[0136]
图25：异种gvhd小鼠模型中随时间变化的gvhd得分发展。数据描绘为平均值
±
sem。n＝7，2种不同的hpbmc供体。统计学是单因素anova和邦弗朗尼多重比较检验。
[0137]
图26：异种gvhd小鼠模型中随时间变化的存活。数据描绘为kaplan-meier存活曲线。n＝7，2种不同的hpbmc供体。使用对数秩(mantel-cox)检验来分析存活数据。针对多重比较校正p值。
[0138]
图27：hpbmc在受体nsg小鼠中的植入。数据描绘为平均值
±
sem。n＝7，2种不同的hpbmc供体。使用混合效应分析和邦弗朗尼多重比较检验分析kaplan-植入数据。
[0139]
图28：异种gvhd小鼠模型中随时间变化的gvhd得分发展。数据描绘为平均值
±
sem。从两项独立研究汇总结果。n＝7-12，3种不同的hpbmc供体。统计学是单因素anova和邦弗朗尼多重比较检验。
[0140]
图29：异种gvhd小鼠模型中随时间变化的存活。数据描绘为kaplan-meier存活曲线。从两项独立研究汇总结果。n＝7-12，3种不同的hpbmc供体。使用对数秩(mantel-cox)检验来分析存活数据。针对多重比较校正p值。
[0141]
图30：hpbmc在宿主nsg小鼠中的植入。数据描绘为平均值
±
sem。从两项独立研究汇总结果。n＝7-12，3种不同的hpbmc供体。使用混合效应分析和邦弗朗尼多重比较检验分析植入数据。
[0142]
图31：单特异性抗tnf单克隆抗体ra14956298以及双特异性抗tnfα/抗ox40l isvd构建体f027300252、f027301104、f027301189、f027301197和f027301199对人全血中pha诱导的il-8释放的抑制。所述值对应于平均ic50[nm]
±
sem并且表示来自3个不同供体的结果，每个供体进行一式三份测量。
[0143]
图32：isvd构建体f027300252的示意图，其从n末端至c末端显示经由9gs接头连接的单价构建块/isvd 1e07/1、1c02/1和alb23002。
5具体实施方式
[0144]
本发明技术旨在提供用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病的新型药物。
[0145]
诸位发明人已经出人意料地发现，与单特异性抗tnfα或抗ox40l多肽相比，包含至少四个isvd的多肽可以用于更高效地治疗自身免疫疾病或炎性疾病，其中至少两个isvd与tnfα、优选地人tnfα特异性地结合，并且至少两个isvd与ox40l、优选地人ox40l特异性地结合。在一些实施方案中，本发明技术的多肽被高效产生(例如在微生物宿主中)，并且在高浓度下显示低粘度，这对于皮下施用是有利且方便的。此外，此类多肽对待治疗受试者中预先存在的抗体(即在第一次用所述抗体构建体治疗之前存在于受试者中的抗体)具有有限的反应性。在优选实施方案中，此类多肽在待治疗的受试者中展现出足够长的半衰期，使得可
以方便地将连续的治疗间隔开。
[0146]
所述多肽是至少双特异性的，但也可以是例如三特异性、四特异性或五特异性的。此外，所述多肽是至少四价的，但是也可以是例如五价的或六价的，等等。
[0147]
术语“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”或“五特异性”均落在术语“多特异性”范围内，并且分别是指与两种、三种、四种或五种不同靶分子结合。术语“二价”、“三价”、“四价”、“五价”或“六价”均落在术语“多价”的范围内，并且分别表示两个、三个、四个或五个结合单元(如isvd)的存在。例如，所述多肽可以是三特异性五价的，如包含五个isvd或由其组成的多肽，其中两个isvd与人tnfα结合，两个isvd与人ox40l结合，并且一个isvd与人血清白蛋白结合(如isvd构建体f027300252)。这种多肽可以同时是双互补位的，例如两个isvd结合人tnfα或人ox40l上的两种不同表位的情况。术语“双互补位”是指与相同靶分子的两个不同部分(例如表位)结合。
[0148]
如本文所用，术语“第一isvd”、“第二isvd”、“第三isvd”等仅表示isvd彼此的相对位置，其中编号从本发明技术多肽的n末端开始。因此，“第一isvd”比“第二isvd”更靠近n末端，而“第二isvd”比“第三isvd”更靠近n末端，等等。因此，当从c末端考虑时，isvd排列是相反的。由于编号不是绝对的，并且仅指示所述至少三个isvd的相对位置，因此不排除多肽中可能存在其他结合单元/构建块，如与tnfα或ox40l结合的另外的isvd，或者与另一靶标结合的isvd。此外，不排除可以在其间放置其他结合单元/构建块(如isvd)的可能性。例如，如下文进一步所述(具体参见第5.3节“(体内)半衰期延长”)，所述多肽还可以包含甚至可以定位于例如“第二isvd”与“第三isvd”之间的另一个与人血清白蛋白结合的isvd。
[0149]
鉴于上文，本发明技术提供了包含至少四个isvd或由其组成的多肽，其中至少两个isvd与tnfα特异性地结合，并且至少两个isvd与ox40l特异性地结合，其中所述tnfα和ox40l优选地是人tnfα和人ox40l。
[0150]
所述多肽的组分(优选地isvd)可以通过一个或多个合适的接头(如肽接头)彼此连接。
[0151]
使用接头连接两个或更多个(多)肽是本领域熟知的。表a-5中显示了示例性肽接头。一类常用的肽接头称为“gly-ser”或“gs”接头。这些是基本上由甘氨酸(g)和丝氨酸(s)残基组成的接头，并且通常包含肽基序如ggggs(seq id no：60)基序的一个或多个重复(例如，包含式(gly-gly-gly-gly-ser)n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大)。此类gs接头的一些经常使用的例子是9gs接头(ggggsgggs，seq id no：63)、15gs接头(n＝3)和35gs接头(n＝7)。参见例如chen等人，adv.drug deliv.rev.2013年10月15日；65(10)：1357-1369；和klein等人，protein eng.des.sel.(2014)27(10)：325-330。在本发明技术的多肽中，使用9gs接头将多肽的组分彼此连接是优选的。
[0152]
在优选实施方案中，与tnfα特异性地结合的至少两个isvd中的两个位于多肽的c末端。诸位发明人令人惊讶地发现，这种构型可以增加多肽的生严产量。
[0153]
同样，在优选实施方案中，与ox40l特异性地结合的至少两个isvd中的两个位于多肽的n末端。
[0154]
因此，优选地，所述多肽按照从所述多肽的n-末端开始的顺序包含以下项或由以下项组成：与ox40l特异性地结合的第一isvd、与ox40l特异性地结合的第二isvd、与tnfα特异性地结合的第一isvd、如本文所定义的为多肽提供增加的半衰期的任选结合单元、以及
与tnfα特异性地结合的第二isvd。为所述多肽提供增加的半衰期的结合单元优选地是isvd。
[0155]
甚至更优选地，所述多肽按照从所述多肽的n-末端开始的顺序包含以下项或由以下项组成：与ox40l特异性地结合的isvd、接头、与ox40l特异性地结合的第二isvd、接头、与tnfα特异性地结合的第一isvd、接头、与人血清白蛋白结合的isvd、接头、以及与tnfα特异性地结合的第二isvd，其中每个接头优选地是9gs接头。
[0156]
所述多肽的此类构型可以提供增加的生产产量、良好cmc特征以及关于免疫应答的调节优化的功能性和更强的效力。
[0157]
优选地，本发明技术的多肽展现出与人血清中预先存在的抗体降低的结合。为此，在一个实施方案中，所述多肽在至少一个isvd中，但优选地在每个isvd中包含氨基酸位置11处的缬氨酸(v)以及氨基酸位置89处的亮氨酸(l)(根据kabat编号)。在另一个实施方案中，所述多肽在c末端isvd的c末端包含1至5个(优选天然存在的)氨基酸的延伸，如单个丙氨酸(a)延伸。isvd的c末端通常是vtvss(seq id no：125)。在另一个实施方案中，所述多肽在至少一个isvd中包含位置110(根据kabat编号)处的赖氨酸(k)或谷氨酰胺(q)。在另一个实施方案中，所述isvd在至少一个isvd中包含位置112(根据kabat编号)处的赖氨酸(k)或谷氨酰胺(q)。在这些实施方案中，所述isvd的c末端是vkvss(seq id no：126)、vqvss(seq id no：127)、vtvks(seq id no：131)、vtvqs(seq id no：132)、vkvks(seq id no：133)、vkvqs(seq id no：134)、vqvks(seq id no：135)或vqvqs(seq id no：136)，使得在添加单个丙氨酸后，所述多肽的c末端例如包含序列vtvssa(seq id no：128)、vkvssa(seq id no：129)、vqvssa(seq id no：130)、vtvksa(seq id no：137)、vtvqsa(seq id no：138)、vkvksa(seq id no：139)、vkvqsa(seq id no：140)、vqvksa(seq id no：141)或vqvqsa(seq id no：142)，优选vkvssa(seq id no：129)。在另一个实施方案中，所述多肽在每个isvd中包含氨基酸位置11处的缬氨酸(v)和氨基酸位置89处的亮氨酸(l)(根据kabat编号)，任选地在至少一个isvd中包含位置110(根据kabat编号)处的赖氨酸(k)或谷氨酰胺(q)，并且在c末端isvd的c末端包含1至5个(优选天然存在的)氨基酸的延伸，如单个丙氨酸(a)延伸(使得所述多肽的c末端例如包含序列vtvssa(seq id no：128)、vkvssa(seq id no：129)或vqvssa(seq id no：130)，优选vkvssa(seq id no：129))。参见例如wo 2012/175741和wo 2015/173325，以获取关于这一方面的更多信息。
[0158]
在优选实施方案中，本发明技术的多肽包含含有与seq id no：1的超过90％，如超过95％或超过99％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，其中任选地五个isvd的cdr如下文章节“5.1免疫球蛋白单可变结构域”和“5.3(体内)半衰期延长”中分别陈述的项目a至c(或a
′
至c
′
，如果使用kabat定义)中所定义，其中特别地：
[0159]
·
与ox40l特异性地结合的第一isvd和第二isvd具有含有seq id no：7的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：10的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：13的氨基酸序列的cdr3；
[0160]
·
与tnfα特异性地结合的第三isvd和第四isvd具有含有seq id no：8的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：11的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：14的氨基酸序列的cdr3；并且
[0161]
·
与人血清白蛋白结合的isvd包含含有seq id no：9的氨基酸序列的cdr1、含有
seq id no：12的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：15的氨基酸序列的cdr3，
[0162]
或者可替代地，如果使用kabat定义：
[0163]
·
与ox40l特异性地结合的第一isvd和第二isvd具有包含seq id no：28的氨基酸序列的cdr1、包含seq id no：31的氨基酸序列的cdr2和包含seq id no：13的氨基酸序列的cdr3；
[0164]
·
与tnfα特异性地结合的第三isvd和第四isvd具有包含seq id no：29的氨基酸序列的cdr1、包含seq id no：32的氨基酸序列的cdr2和包含seq id no：14的氨基酸序列的cdr3；并且
[0165]
·
与人血清白蛋白结合的isvd包含含有seq id no：30的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：33的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：15的氨基酸序列的cdr3。
[0166]
优选地，所述多肽包含seq id no：1的氨基酸序列或由其组成。在最优选的实施方案中，所述多肽由seq id no：1的氨基酸序列组成。
[0167]
与由seq id no：1的氨基酸组成的多肽相比，本发明技术的多肽对人tnfα以及对人ox40l优选地具有至少一半的结合亲和力，更优选地至少相同的结合亲和力，其中所述结合亲和力是使用相同的方法如sierra spr-32(spr)测量的。
[0168]
5.1免疫球蛋白单可变结构域
[0169]
术语“免疫球蛋白单可变结构域”(isvd)与“单可变结构域”可互换使用，其定义了这样的免疫球蛋白分子，在所述免疫球蛋白分子中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并且由单个免疫球蛋白结构域形成。这使得免疫球蛋白单可变结构域与“常规”免疫球蛋白(例如单克隆抗体)或其片段(如fab、fab
′
、f(ab
′
)2、scfv、二scfv)区分开，其中两个免疫球蛋白结构域、特别是两个可变结构域相互作用形成抗原结合位点。通常，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(v
l
)相互作用形成抗原结合位点。在这种情况下，vh和v
l
二者的互补决定区(cdr)将促成抗原结合位点，即总共6个cdr将参与抗原结合位点的形成。
[0170]
鉴于以上定义，常规4链抗体(如igg、igm、iga、igd或ige分子；本领域已知的)的抗原结合结构域或者源自这种常规4链抗体的fab片段、f(ab
′
)2片段、fv片段(如二硫化物连接的fv或scfv片段)或双抗体(本领域中全部已知的)将通常不被视为免疫球蛋白单可变结构域，因为在这些情况下，不是一个(单个)免疫球蛋白结构域发生与相应抗原表位的结合，而是一对(缔合的)免疫球蛋白结构域(如轻链和重链可变结构域)即免疫球蛋白结构域的v
h-v
l
对发生与相应抗原表位的结合，其共同地与相应抗原表位结合。
[0171]
相比之下，免疫球蛋白单可变结构域能够在不与另外的免疫球蛋白可变结构域配对的情况下与抗原表位特异性地结合。免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单个vh、单个v
hh
或单个v
l
结构域形成。
[0172]
因此，单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，v
l
序列)或其合适片段；或重链可变结构域序列(例如，vh序列或v
hn
序列)或其合适片段；只要它能够形成单个抗原结合单元即可(即基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，使得单个抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用即可形成功能性抗原结合单元)。
[0173]
免疫球蛋白单可变结构域(isvd)可以例如是重链isvd，如vh、v
hh
，包括驼源化vh或人源化v
hh
。优选地，其是v
hh
，包括驼源化vh或人源化v
hh
。重链isvd可以源自常规四链抗体或
2008/020079)。此外，应注意，可以以任何本身已知的合适方式获得此类人源化v
hh
，并因此并不严格限于已经使用包含天然存在的vhh结构域作为起始材料的多肽获得的多肽。
[0183]“驼源化v
h”包含与天然存在的vh结构域的氨基酸序列对应但是已经被“驼源化”的氨基酸序列，即通过将来自常规4链抗体的天然存在的vh结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基用重链抗体的v
hh
结构域中的一个或多个相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基替代而驼源化。这能以本身已知的方式进行，这对于本领域技术人员来说是清楚的，例如基于本文的进一步描述和现有技术(例如wo 2008/020079)。如本文所定义，此类“驼源化”取代优选地在v
h-v
l
接合处形成和/或存在的氨基酸位置处插入和/或在所谓的骆驼科动物标志残基处插入，如本文所定义(参见例如wo 94/04678和davies和riechmann(1994和1996)，同上)。优选地，用作用于生成或设计驼源化vh的起始材料或起点的vh序列优选地是来自哺乳动物的vh序列，更优选人类的vh序列，如vh3序列。然而应注意，可以以任何本身已知的合适方式获得此类驼源化vh，并因此并不严格限于已经使用包含天然存在的vh结构域作为起始材料的多肽获得的多肽。
[0184]
应注意，一个或多个免疫球蛋白序列可以彼此连接和/或与其他氨基酸序列连接(例如经由二硫桥)，以提供也可以用于本发明技术的肽构建体(例如fab
′
片段、f(ab
′
)2片段、scfv构建体、“双抗体”和其他多特异性构建体)。例如，参考holliger和hudson的综述，nat biotechnol.2005年9月；23(9)：1126-36。通常，在多肽旨在用于施用至受试者(例如用于预防性、治疗性和/或诊断性目的)时，其优选地包含在所述受试者中并非天然存在的免疫球蛋白序列。
[0185]
免疫球蛋白单可变结构域序列的优选结构可以认为是由四个框架区(“fr”)构成，其在本领域和本文中分别称为“框架区1”(“fri”)、“框架区2”(“fr2”)、“框架区3”(“fr3”)和“框架区4”(“fr4”)，所述框架区被三个互补决定区(“cdr”)打断，所述三个互补决定区在本领域和本文中分别称为“互补决定区1”(“cdr1”)、“互补决定区2”(“cdr2”)和“互补决定区3”(“cdr3”)。
[0186]
如wo 08/020079的第58页和第59页的段落q)中进一步描述的，免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸残基可以根据由kabat等人(“sequence ofproteins of immunological interest”，us public health services，nih贝塞斯达，马里兰州，出版号91)给出的用于vh结构域的通用编号来编号，如在riechmann和muyldermans，2000(j.immunol.methods 240(1-2)：185-195；参见例如该出版物的图2)的文章中应用于来自骆驼科动物的v
hh
结构域。应注意，如本领域中对于vh结构域和v
hh
结构域所熟知的，每个cdr中氨基酸残基的总数可以变化，并且可以不对应于由kabat编号指示的氨基酸残基的总数(也就是说，根据kabat编号的一个或多个位置可能不会在实际序列中被占用，或者实际序列可能含有比kabat编号所允许的数量更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据kabat的编号可以对应于或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。vh结构域和v
hh
结构域中的氨基酸残基总数通常在110至120，常常在112与115之间的范围内。然而应注意，较小和较长的序列也可能适合于本文中描述的目的。
[0187]
在本技术中，除非另有说明，否则cdr序列是根据如kontermann和d
ü
bel(编2010，antibody engineering，第2卷，springer verlag heidelberg berlin，martin，第3章，第33-51页)中所述的abm编号确定的。根据此方法，fr1包含位置1-25处的氨基酸残基，cdr1包
含位置26-35处的氨基酸残基，fr2包含位置36-49处的氨基酸，cdr2包含位置50-58处的氨基酸残基，fr3包含位置59-94处的氨基酸残基，cdr3包含位置95-102处的氨基酸残基，并且fr4包含位置103-113处的氨基酸残基。
[0188]
cdr区的确定也可以根据不同方法进行。在根据kabat的cdr确定中，免疫球蛋白单可变结构域的fri包含位置1-30处的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的cdr1包含位置31-35处的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的fr2包含位置36-49处的氨基酸，免疫球蛋白单可变结构域的cdr2包含位置50-65处的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的fr3包含位置66-94处的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的cdr3包含位置95-102处的氨基酸残基，并且免疫球蛋白单可变结构域的fr4包含位置103-113处的氨基酸残基。
[0189]
在这种免疫球蛋白序列中，所述框架序列可以是任何合适的框架序列，并且例如基于标准手册以及本文中提及的另外的披露内容和现有技术，合适的框架序列的例子对于技术人员将是清楚的。
[0190]
所述框架序列优选地是免疫球蛋白框架序列或者源自免疫球蛋白框架序列(例如，通过人源化或驼源化)的框架序列(的合适组合)。例如，所述框架序列可以是源自轻链可变结构域(例如v
l
序列)和/或重链可变结构域(例如vh序列或v
hh
序列)的框架序列。在一个特别优选的方面，所述框架序列是源自v
hh
序列的框架序列(其中所述框架序列可以任选地已部分或完全人源化)或已驼源化的常规vh序列(如本文所定义)。
[0191]
特别地，本发明技术中使用的isvd序列中存在的框架序列可以含有一个或多个标志残基(如本文所定义)以使得isvd序列是如v
hh
，包括人源化v
hh
或驼源化vh。此类框架序列(的合适组合)的一些优选但非限制性的例子将从本文的进一步公开内容中变得清楚。
[0192]
此外，如本文对于免疫球蛋白序列的一般性描述，也可以使用前述任何一种的合适片段(或片段的组合)，如含有适当地侧接一个或多个框架序列和/或经由一个或多个框架序列连接的一个或多个cdr序列的片段(例如，按照与这些cdr和框架序列可能在衍生所述片段的全尺寸免疫球蛋白序列中出现的相同顺序)。
[0193]
然而应注意，本发明技术在isvd序列(或用于表达它的核苷酸序列)的来源方面不受限制，在生成或获得(或已经生成或获得)isvd序列或核苷酸序列的方式方面也不受限制。因此，所述isvd序列可以是天然存在的序列(来自任何合适的物种)或合成或半合成序列。在特定但非限制性的方面，所述isvd序列是天然存在的序列(来自任何合适的物种)或合成或半合成序列，包括但不限于“人源化”(如本文所定义)免疫球蛋白序列(如部分或完全人源化小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特别是部分或完全人源化v
hh
序列)，“驼源化”(如本文所定义)免疫球蛋白序列，以及已经通过技术(如亲和力成熟(例如从合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、cdr移植、镶饰、组合源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的pcr组装、以及技术人员熟知的工程化免疫球蛋白序列的类似技术)获得的免疫球蛋白序列；或前述任何一种的任何合适组合。
[0194]
类似地，核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成或半合成序列，并且可以例如是通过pcr从合适的天然存在的模板(例如，从细胞分离的dna或rna)分离的序列、已经从文库(并且特别是表达文库)分离的核苷酸序列、已经通过将突变引入天然存在的核苷酸序列中而制备(使用本身已知的任何合适技术，如错配pcr)的核苷酸序列、已经使用重叠
引物通过pcr制备的核苷酸序列或已经使用本身已知的dna合成技术制备的核苷酸序列。
[0195]
如上所述，isvd可以是或其合适片段。对于纳米抗体的一般性描述，参见下文的进一步描述以及本文引用的现有技术。然而在这一方面应注意，本说明书和现有技术主要描述了所谓的“vh3类”的纳米抗体(即与vh3类(如dp-47、dp-51或dp-29)的人种系序列具有高度序列同源性的纳米抗体)。然而应注意，本发明技术在其最广泛的意义上通常可以使用任何类型的纳米抗体，并且例如还使用属于所谓的“vh4类”的纳米抗体(即与vh4类(如dp-78)的人种系序列具有高度序列同源性的纳米抗体)，例如像wo2007/118670中所述的。
[0196]
通常，纳米抗体(特别是v
hh
序列，包括(部分)人源化v
hh
序列和驼源化vh序列)的特征可以在于一个或多个框架序列(再次如本文进一步所述)中的一个或多个“标志残基”(如本文所述)的存在。因此，通常可以将纳米抗体定义为具有以下(一般)结构的免疫球蛋白序列：
[0197]
fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4
[0198]
其中fr1至fr4分别是指框架区1至4，并且其中cdr1至cdr3分别是指互补决定区1至3，并且其中标志残基中的一个或多个是如本文进一步所定义的。
[0199]
特别地，纳米抗体可以是具有以下(一般)结构的免疫球蛋白序列：
[0200]
fr1-cdrl-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4
[0201]
其中fr1至fr4分别是指框架区1至4，并且其中cdr1至cdr3分别是指互补决定区1至3，并且其中所述框架序列是如本文进一步所定义的。
[0202]
更特别地，纳米抗体可以是具有以下(一般)结构的免疫球蛋白序列：
[0203]
fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4
[0204]
其中fr1至fr4分别是指框架区1至4，并且其中cdr1至cdr3分别是指互补决定区1至3，并且其中：
[0205]
根据kabat编号，在位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108处的氨基酸残基中的一个或多个选自下表1中提及的标志残基。
[0206]
表1：纳米抗体中的标志残基
[0207][0208]
本发明技术尤其使用可与tnfα或ox40l特异性地结合的isvd。在本发明技术的情境中，与特定靶分子“结合”在本领域中具有与在抗体及其相应抗原的情境中所理解的通常含义。
[0209]
本发明技术的多肽可以包含与tnfα特异性地结合的两个或更多个isvd和与ox40l特异性地结合的两个或更多个isvd。例如，所述多肽可以包含与tnfα特异性地结合的两个isvd和与ox40l特异性地结合的两个isvd。
[0210]
在一些实施方案中，所述至少一个isvd可以在功能上阻断其靶分子。例如，isvd可以阻断tnfα与tnfr(tnf受体)之间的相互作用，或者可以阻断ox40l与ox40(受体)之间的相互作用，并且优选地抑制ox40l诱导的t细胞的il2释放。因此，在优选实施方案中，本发明技
术的多肽包含与tnfα特异性地结合并在功能上阻断其与tnfr的相互作用的至少两个isvd，以及与ox40l特异性地结合并在功能上阻断其与ox40的相互作用的两个isvd。
[0211]
本发明技术中使用的isvd形成本发明技术的多肽的一部分，所述多肽包含至少四个isvd或由其组成，使得所述多肽可以与tnfα和ox40l特异性地结合。
[0212]
因此，在本发明技术的多肽中使用的所述至少四个isvd的靶分子是tnfα和ox40l。例子是哺乳动物tnfα和ox40l。尽管人tnfα(uniprot登录号p01375)和人ox40l(uniprot登录号p23510)是优选的，但是来自其他物种的形式(例如来自小鼠、大鼠、兔、猫、狗、山羊、绵羊、马、猪、非人灵长类动物(如食蟹猴)(在本文中也称为“cyno”)、或骆驼科动物(如美洲驼或羊驼)的tnfα和il-23)也适用于本发明技术。
[0213]
可在本发明技术中使用的与tnfα或ox40l特异性地结合的isvd的具体例子是如以下项目a和b中所述的：
[0214]
a.如下isvd，其与人ox40l特异性地结合并且包含
[0215]
i.cdr1，所述cdr1包含seq id no：7的氨基酸序列或与seq id no：7具有2或1个氨基酸差异；
[0216]
ii.cdr2，所述cdr2包含氨基酸序列seq id no：10或与seq id no：10具有2或1个氨基酸差异；以及
[0217]
iii.cdr3，所述cdr3包含seq id no：13的氨基酸序列或与seq id no：13具有2或1个氨基酸差异，
[0218]
优选地含有seq id no：7的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：10的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：13的氨基酸序列的cdr3。
[0219]
这种与人ox40l特异性地结合的isvd的优选例子具有如表a-2中针对构建体1e07/1所指示的一个或多个(并且优选地所有)框架区(以及如先前项目a中所定义的cdr)，并且最优选地是包含构建体1e07/1的完整氨基酸序列(seq id no：2或3，参见表a-1和a-2)的isvd。
[0220]
同样在优选实施方案中，与人ox40l特异性地结合的isvd的氨基酸序列可以与seq id no：2或3具有超过90％，如超过95％或超过99％的序列同一性，其中任选地所述cdr如先前项目a中所定义。特别地，与ox40l特异性地结合的isvd优选地包含seq id no：2或3的氨基酸序列。
[0221]
在这种与ox40l特异性地结合的isvd在至少一个cdr中具有相对于相应参考cdr序列的2或1个氨基酸差异(上文项目a)时，与seq id no：2或3中所示构建体1e07/1相比，所述isvd对人ox40l优选地具有至少一半的结合亲和力，更优选地至少相同的结合亲和力，其中所述结合亲和力是使用相同的方法(如spr)测量的。
[0222]
b.如下isvd，其与人tnfα特异性地结合并且包含
[0223]
i.cdr1，所述cdr1包含氨基酸序列seq id no：8或与seq id no：8具有2或1个氨基酸差异；
[0224]
ii.cdr2，所述cdr2包含氨基酸序列seq id no：11或与seq id no：11具有2或1个氨基酸差异；以及
[0225]
iii.cdr3，所述cdr3包含氨基酸序列seq id no：14或与seq id no：14具有2或1个氨基酸差异，
[0226]
优选地含有seq id no：8的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：11的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：14的氨基酸序列的cdr3。
[0227]
这种与人tnfα特异性地结合的isvd的优选例子具有如表a-2中针对构建体1c02/1所指示的一个或多个(并且优选地所有)框架区(以及如先前项目b中所定义的cdr)，并且最优选地是包含构建体1c02/1的完整氨基酸序列(seq id no：4或6，参见表a-1和a-2)的isvd。
[0228]
同样在优选实施方案中，与人tnfα特异性地结合的isvd的氨基酸序列可以与seq id no：4或6具有超过90％，如超过95％或超过99％的序列同一性，其中任选地所述cdr如先前项目b中所定义。特别地，与人tnfα特异性地结合的isvd优选地包含seq id no：4或6的氨基酸序列。
[0229]
在这种与人tnfα特异性地结合的isvd在至少一个cdr中具有相对于相应的参考cdr序列的2或1个氨基酸差异(上文项目b)时，与seq id no：4或6中所示构建体1c02/1相比，所述isvd对人tnfα优选地具有至少一半的结合亲和力，更优选地至少相同的结合亲和力，其中所述结合亲和力是使用相同的方法(如spr)测量的。
[0230]
优选地，如上文项目a和b中所定义的每个isvd包含在本发明技术的多肽中。
[0231]
与由seq id no：1的氨基酸组成的多肽相比，包含如上文项目a和b中所定义的每一个isvd的本发明技术的这种多肽对人ox40l和对人tnfα优选地具有至少一半的结合亲和力，更优选地至少相同的结合亲和力，其中所述结合亲和力是使用相同的方法(如spr)测量的。
[0232]
上文项目a和b中提及的seq id no是基于根据abm定义的cdr定义(参见表a-2)。应注意，根据kabat定义的定义相同cdr的seq id no(参见表a-2.1)同样可以用于上文项目a和b。
[0233]
因此，以上使用abm定义描述的可在本发明技术中使用的与tnfα或ox40l特异性地结合的isvd的具体例子也可以如下文项目a’至b’中所示使用kabat定义来描述：
[0234]
a’.如下isvd，其与人ox40l特异性地结合并且包含
[0235]
i.cdr1，所述cdr1包含seq id no：28的氨基酸序列或与seq id no：28具有2或1个氨基酸差异；
[0236]
ii.cdr2，所述cdr2包含氨基酸序列seq id no：31或与seq id no：31具有2或1个氨基酸差异；以及
[0237]
iii.cdr3，所述cdr3包含seq id no：13的氨基酸序列或与seq id no：13具有2或1个氨基酸差异，
[0238]
优选地含有seq id no：28的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：31的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：13的氨基酸序列的cdr3。
[0239]
这种与人ox40l特异性地结合的isvd的优选例子具有如表a-2-1中针对构建体1e07/1所指示的一个或多个(并且优选地所有)框架区(以及如先前项目a
′
中所定义的cdr)，并且最优选地是包含构建体1e07/1的完整氨基酸序列(seq id no：2或3，参见表a-1和a-2-1)的isvd。
[0240]
b’.如下isvd，其与人tnfα特异性地结合并且包含
[0241]
i.cdr1，所述cdr1包含氨基酸序列seq id no：29或与seq id no：29具有2或1个氨
基酸差异；
[0242]
ii.cdr2，所述cdr2包含氨基酸序列seq id no：32或与seq id no：32具有2或1个氨基酸差异；以及
[0243]
iii.cdr3，所述cdr3包含氨基酸序列seq id no：14或与seq id no：14具有2或1个氨基酸差异，
[0244]
优选地含有seq id no：29的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：32的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：14的氨基酸序列的cdr3。
[0245]
这种与人tnfα特异性地结合的isvd的优选例子具有如表a-2-1中针对构建体1c02/1所指示的一个或多个(并且优选地所有)框架区(以及如先前项目b
′
中所定义的cdr)，并且最优选地是包含构建体1c02/1的完整氨基酸序列(seq id no：4或6，参见表a-1和a-2-1)的isvd。
[0246]
第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比可以如下进行计算：([第一氨基酸序列中氨基酸残基与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的数量]/[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数量])
×
100％，其中与第一氨基酸序列相比在第二氨基酸序列中氨基酸残基的每个缺失、插入、取代或添加被视为单个氨基酸残基处(即单个位置处)的差异。
[0247]
通常，为了根据上文概述的计算方法确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比，将具有最大氨基酸残基数量的氨基酸序列作为“第一”氨基酸序列，并且另一个氨基酸序列作为“第二”氨基酸序列。
[0248]
如本文所用，“氨基酸差异”是指单个氨基酸残基相对于参考序列的缺失、插入或取代，并且优选地是取代。
[0249]
氨基酸取代优选地是保守取代。此类保守取代优选是指这样的取代，其中下组(a)-(e)中的一个氨基酸被同一组中的另一个氨基酸残基取代：(a)小脂肪族、非极性或弱极性残基：ala、ser、thr、pro和gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：asp、asn、glu和gln；(c)极性、带正电荷的残基：his、arg和lys；(d)大脂肪族、非极性残基：met、leu、ile、val和cys；和(e)芳香族残基：phe、tyr和trp。
[0250]
特别优选的保守取代如下：ala取代为gly或取代为ser；arg取代为lys；asn取代为gln或取代为his；asp取代为glu；cys取代为ser；gln取代为asn；glu取代为asp；gly取代为ala或取代为pro；his取代为asn或取代为gln；ile取代为leu或取代为val；leu取代为ile或取代为val；lys取代为arg、取代为gln或取代为glu；met取代为leu、取代为tyr或取代为ile；phe取代为met、取代为leu或取代为tyr；ser取代为thr；thr取代为ser；trp取代为tyr；tyr取代为trp；和/或phe取代为val、取代为ile或取代为leu。
[0251]
5.2特异性
[0252]
术语“特异性”、“特异性地结合”或“特异性结合”是指特定结合单元(如isvd)可以以足够高的亲和力(参见下文)结合的来自同一生物的不同靶分子(如抗原)的数量。“特异性”、“特异性地结合”或“特异性结合”在本文中与“选择性”、“选择性地结合”或“选择性结合”可互换使用。结合单元如isvd优选地与其指定靶标特异性地结合。
[0253]
可以基于亲和力确定结合单元的特异性/选择性。亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常通过kd或解离常数给出，包括mol/l(或m)的单位。亲和力也可以表
示为缔合常数ka，其等于1/kd并且单位为(mol/l)-1
(或m-1
)。
[0254]
亲和力是部分与靶分子上的结合位点之间的结合强度的量度：kd值越小，靶分子与靶向部分之间的结合强度越强。
[0255]
通常，本发明技术中使用的结合单元(如isvd)将以10-5
至10-12
mol/l或更低、并且优选10-7
至10-12
mol/l或更低、并且更优选10-8
至10-12
mol/l的解离常数(kd)(即以105至10
12
l/mol或更高、并且优选107至10
12
l/mol或更高、并且更优选108至10
12
l/mol的缔合常数(ka))与其靶标结合。
[0256]
通常认为任何大于104mol/l的kd值(或任何小于104l/mol的ka值)指示非特异性结合。
[0257]
被认为具有特异性的生物学相互作用(如免疫球蛋白序列与抗原的结合)的kd通常在10-5
mol/l(10000nm或10μm)至10-12
mol/l(0.001nm或1pm)或更小的范围内。
[0258]
因此，特异性/选择性结合可能意味着，使用相同的测量方法(例如spr)，结合单元(或包含所述结合单元的多肽)以10-5
至10-12
mol/l或更小的kd值与tnfα和/或ox40l结合，并且以大于10-4
mol/l的kd值与相关细胞因子结合。ox40l相关靶标的例子是人trail、cd30l、cd40l和rankl。tnfα的相关细胞因子的例子是tnf超家族成员fasl、tnfβ、light、tl-1a、rankl。因此，在本发明技术的实施方案中，所述多肽中包含的至少两个isvd以10-5
至10-12
mol/l或更小的kd值与tnfα结合并且以大于10-4
mol/l的kd值与相同物种的fasl、tnfβ、light、tl-1a、rankl结合，并且所述多肽中包含的至少两个isvd以10-5
至10-12
mol/l或更小的kd值与ox40l结合并且以大于10-4
mol/l的kd值与相同物种的人trail、cd30l、cd40l和rankl结合。
[0259]
因此，与由seq id no：1的氨基酸组成的多肽相比，本发明技术的多肽对人tnfα和对人ox40l优选地具有至少一半的结合亲和力，更优选地至少相同的结合亲和力，其中所述结合亲和力是使用相同的方法(如spr)测量的。
[0260]
与来自特定物种的特定靶标的特异性结合并不排除结合单元也可以与来自不同物种的类似靶标特异性地结合。例如，与人tnfα的特异性结合并不排除结合单元(或包含所述结合单元的多肽)也可以与来自食蟹猴的tnfα特异性地结合。同样，例如，与人ox40l的特异性结合并不排除结合单元(或包含所述结合单元的多肽)也可以与来自食蟹猴(“cyno”)的ox40l特异性地结合。
[0261]
结合单元与其指定靶标的特异性结合可以通过本身已知的任何合适方式(包括例如斯卡查德(scatchard)分析和/或竞争性结合测定(如放射免疫测定(ria)、酶免疫测定(eia)和夹心式竞争测定)和本领域本身已知的其不同变体)；以及本文提及的其他技术来确定。
[0262]
解离常数可以是实际或表观解离常数，正如技术人员所清楚的。确定解离常数的方法对技术人员是清楚的，并且例如包括以下提及的技术。在这一方面，还将清楚的是，可能无法测量大于10-4
mol/l或10-3
mol/l(例如为10-2
mol/l)的解离常数。任选地，如技术人员也清楚的，(实际或表观)解离常数可以基于(实际或表观)缔合常数(ka)通过关系[kd＝1/ka]来计算。
[0263]
可以经由本身已知的不同技术(如熟知的表面等离子体共振(spr)生物传感器技术(参见例如，ober等人2001，intern.immunology 13：1551-1559))来测量两个分子之间的
分子相互作用的亲和力。如本文所用，术语“表面等离子体共振”是指光学现象，其允许通过检测生物传感器基质中蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用，其中一个分子被固定在生物传感器芯片上，并且另一个分子在流动条件下通过所固定的分子，从而产生k
on
、k
off
测量值，并因此产生kd(或ka)值。例如，这可以使用熟知的系统(biacore international ab，一家ge healthcare公司，乌普萨拉，瑞典和皮斯卡塔韦，新泽西州)进行。有关进一步描述，参见jonsson等人(1993，ann.biol.clin.51：19-26)、jonsson等人(1991biotechniques 11：620-627)、johnsson等人(1995，j.mol.recognit.8：125-131)和johnnson等人(1991，anal.biochem.198：268-277)。
[0264]
另一种确定生物分子相互作用的亲和力的熟知的生物传感器技术是生物层干涉测量法(bli)(参见例如，abdiche等人2008，anal.biochem.377：209-217)。如本文所用，术语“生物层干涉测量法”或“bli”是指无标签光学技术，其分析从以下两个表面反射的光的干涉图案：内部参考层(参考光束)和生物传感器尖端上的固定化蛋白质层(信号光束)。与生物传感器尖端结合的分子的数量变化导致干涉图案的偏移，报告为波长偏移(nm)，其大小是与生物传感器尖端表面结合的分子的数量的直接量度。由于可以实时测量相互作用，因此可以确定缔合和解离速率以及亲和力。例如，bli可以使用熟知的系统(fortebio，pall life sciences的部门，门洛帕克，美国)进行。
[0265]
可替代地，可以在动力学排斥测定(kinexa)(参见例如drake等人2004，anal.biochem.，328：35-43)中使用平台(sapidyne instruments inc，博伊西，美国)测量亲和力。如本文所用，术语“kinexa”是指用于测量未修饰分子的真实平衡结合亲和力和动力学的基于溶液的方法。使抗体/抗原复合物的平衡溶液通过具有用抗原(或抗体)预涂覆的珠的柱，以使游离抗体(或抗原)与涂覆的分子结合。如此捕获的抗体(或抗原)的检测是使用结合抗体(或抗原)的荧光标记蛋白来完成的。
[0266]
免疫测定系统为自动化生物分析和快速样品周转提供了平台(fraley等人2013，bioanalysis 5：1765-74)。
[0267]
5.3(体内)半衰期延长
[0268]
所述多肽还可以包含任选地经由一个或多个肽接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其中与没有所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的相应多肽相比，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元为所述多肽提供了增加的(体内)半衰期。体内半衰期延长意指例如所述多肽在施用后在哺乳动物如人受试者中具有增加的半衰期。半衰期可以表示为例如t1/2β。
[0269]
基团、残基、部分或结合单元的类型通常不受限制并且可以例如选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可与血清蛋白结合的结合单元、fc部分和可与血清蛋白结合的小蛋白质或肽。
[0270]
更具体地，为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元可以选自可与血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如igg)结合的结合单元，并且优选地是可与人血清白蛋白结合的结合单元。所述结合单元优选地是isvd。
[0271]
例如，wo 04/041865描述了与血清白蛋白结合(并且特别是针对人血清白蛋白)的其可以与其他蛋白质(如与所需靶标结合的一种或多种其他纳米抗体)连
接以增加所述蛋白质的半衰期。
[0272]
国际申请wo 06/122787描述了许多针对(人)血清白蛋白的这些包括称为alb-1(wo 06/122787中的seq id no：52)的及其人源化变体，如alb-8(wo 06/122787中的seq id no：62)。此外，这些可用于延长治疗性蛋白质和多肽以及其他治疗性实体或部分的半衰期。
[0273]
此外，wo 2012/175400描述了alb-1的另外的改善形式，称为alb-23。
[0274]
在优选实施方案中，所述多肽包含选自以下的血清白蛋白结合部分：alb-1、alb-3、alb-4、alb-5、alb-6、alb-7、alb-8、alb-9、alb-10和alb-23，优选alb-8或alb-23或其变体，如wo2012/175400的第7-9页所示；以及wo2012/175741、wo2015/173325、wo2017/080850、wo2017/085172、wo2018/104444、wo2018/134235、wo2018/134234中所述的白蛋白结合剂。表a-4也显示了一些优选的血清白蛋白结合剂中。本发明技术的多肽的特别优选的另外的组分是如项目c中所述的：
[0275]
c.如下isvd，其与人血清白蛋白结合并且包含
[0276]
i.cdr1，所述cdr1包含seq id no：9的氨基酸序列或与seq id no：9具有2或1个氨基酸差异；
[0277]
ii.cdr2，所述cdr2包含seq id no：12的氨基酸序列或与seq id no：12具有2或1个氨基酸差异；以及
[0278]
iii.cdr3，所述cdr3包含seq id no：15的氨基酸序列或与seq id no：15具有2或1个氨基酸差异；
[0279]
优选地含有seq id no：9的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：12的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：15的氨基酸序列的cdr3。
[0280]
这种与人血清白蛋白结合的isvd的优选例子具有如表a-2中针对构建体alb23002所指示的一个或多个(并且优选地所有)框架区(以及如先前项目c中所定义的cdr)，并且最优选地是包含构建体alb23002的完整氨基酸序列(seq id no：5，参见表a-1和a-2)的isvd。
[0281]
也可以使用kabat定义将项目c描述为：
[0282]
c’.如下isvd，其与人血清白蛋白结合并且包含
[0283]
i.cdr1，所述cdr1包含seq id no：30的氨基酸序列或与seq id no：30具有2或1个氨基酸差异；
[0284]
ii.cdr2，所述cdr2包含seq id no：33的氨基酸序列或与seq id no：33具有2或1个氨基酸差异；以及
[0285]
iii.cdr3，所述cdr3包含seq id no：15的氨基酸序列或与seq id no：15具有2或1个氨基酸差异；
[0286]
优选地含有seq id no：30的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：33的氨基酸序列的cdr2和含有seq id no：15的氨基酸序列的cdr3。
[0287]
这种与人血清白蛋白结合的isvd的优选例子具有如表a-2.1中针对构建体alb23002所指示的一个或多个(并且优选地所有)框架区(以及如先前项目c
′
中所定义的cdr)，并且最优选地是包含构建体alb23002的完整氨基酸序列(seq id no：5，参见表a-1和a-2.1)的isvd。
[0288]
同样在优选实施方案中，与人血清白蛋白结合的isvd的氨基酸序列可以与seq id no：5具有超过90％，如超过95％或超过99％的序列同一性，其中任选地所述cdr如先前项目c中所定义。特别地，与人血清白蛋白结合的isvd优选地包含seq id no：5的氨基酸序列。
[0289]
在这种与人血清白蛋白结合的isvd在至少一个cdr中具有相对于相应的参考cdr序列的2或1个氨基酸差异(上文项目c)时，与seq id no：5中所示的构建体alb23002相比，所述isvd对人血清白蛋白具有至少一半的结合亲和力，优选地至少相同的结合亲和力，其中所述结合亲和力是使用相同的方法(如spr)测量的。
[0290]
在这种与人血清白蛋白结合的isvd包含c末端位置时，其展现c末端丙氨酸(a)或甘氨酸(g)延伸，并且优选地选自seq id no：46、47、49、51、52、53、54、55、56和58(参见下表a-4)。在优选实施方案中，与人血清白蛋白结合的isvd包含与c末端位置不同的另一个位置(即不是本发明技术的多肽的c末端isvd)，并且选自seq id no：5、44、45、48和50(参见下表a-4)。
[0291]
5.4核酸分子
[0292]
还提供了编码本发明技术的多肽的核酸分子。
[0293]“核酸分子”(与“核酸”可互换使用)是经由磷酸骨架彼此连接以形成核苷酸序列的核苷酸单体链。核酸可以用于转化/转染宿主细胞或宿主生物，例如以表达和/或产生多肽。用于产生目的的合适宿主或宿主细胞对本领域技术人员将是清楚的，并且可以是例如任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、原核或真核生物。包含编码本发明技术的多肽的核酸的宿主或宿主细胞也被本发明技术涵盖。
[0294]
核酸可以是例如dna、rna或其杂合体，并且还可以包含经(例如化学)修饰的核苷酸，像pna。其可以是单链或双链的，并且优选地呈双链dna的形式。例如，本发明技术的核苷酸序列可以是基因组dna、cdna。
[0295]
本发明技术的核酸可以以本身已知的方式制备或获得，和/或可以从合适的天然来源分离。编码天然存在的(多)肽的核苷酸序列可以例如经受定点诱变，以提供编码具有序列变异的多肽的核酸分子。另外，对于本领域技术人员而言清楚的是，为了制备核酸，还可以将若干种核苷酸序列(如编码靶向部分的至少一种核苷酸序列)和例如编码一种或多种接头的核酸以合适的方式连接在一起。
[0296]
生成核酸的技术对于技术人员将是清楚的，并且可以例如包括但不限于自动化dna合成；定点诱变；将两个或更多个天然存在的和/或合成序列(或其两个或更多个部分)组合，引入可导致截短的表达产物的表达的突变；引入一个或多个限制位点(例如，以使用合适的限制酶产生容易被消化和/或连接的盒和/或区域)，和/或使用一种或多种“错配”引物通过pcr反应引入突变。
[0297]
5.5载体
[0298]
还提供了包含编码本发明技术的多肽的核酸分子的载体。如本文所用的载体是适合于将遗传物质携带至细胞中的媒介物。载体包括裸露的核酸(如质粒或mrna)或嵌入更大结构(如脂质体或病毒载体)中的核酸。
[0299]
载体通常包含任选地与一种或多种调节元件(例如像一种或多种合适的启动子、增强子、终止子等)连接的至少一种核酸。载体优选地是表达载体，即适合于在合适条件下(例如当所述载体被引入(例如人)细胞中时)表达编码的多肽或构建体的载体。对于基于
dna的载体，这通常包括用于转录(例如启动子和聚a信号)和翻译(例如kozak序列)的元件的存在。
[0300]
优选地，在所述载体中，所述至少一种核酸和所述调节元件彼此“可操作地连接”，这通常意指它们彼此处于功能关系。例如，如果启动子能够启动或以其他方式控制/调节编码序列的转录和/或表达，则所述启动子被认为与编码序列“可操作地连接”(其中所述编码序列应理解为在所述启动子的“控制下”)。通常，当两个核苷酸序列可操作地连接时，它们将在相同的方向上并且通常也在相同的阅读框中。它们通常基本上也是连续的，尽管这也可能不是必需的。
[0301]
优选地，所述载体的任何调节元件使得它们能够在预期的宿主细胞或宿主生物中提供其预期的生物学功能。
[0302]
例如，启动子、增强子或终止子在预期的宿主细胞或宿主生物中应是“可操作的”，这意味着例如所述启动子应能够启动或以其他方式控制/调节与其可操作地连接的核苷酸序列(例如编码序列)的转录和/或表达。
[0303]
5.6组合物
[0304]
本发明技术还提供了一种组合物，其包含至少一种本发明技术的多肽、编码本发明技术的多肽的至少一种核酸分子或含有这种核酸分子的至少一种载体。所述组合物可以是药物组合物。所述组合物还可以包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。
[0305]
5.7宿主生物
[0306]
本发明技术还涉及宿主细胞或宿主生物，所述宿主细胞或宿主生物包含本发明技术的多肽、编码本发明技术的多肽的核酸和/或含有编码本发明技术的多肽的核酸分子的载体。
[0307]
合适的宿主细胞或宿主生物对本领域技术人员将是清楚的，并且是例如任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、原核或真核生物。具体例子包括hek293细胞、cho细胞、大肠杆菌(escherichia coli)或巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)。最优选的宿主是巴斯德毕赤酵母。
[0308]
5.8多肽的方法和用途
[0309]
本发明技术还提供了用于产生本发明技术的多肽的方法。所述方法可以包括用编码所述多肽的核酸转化/转染宿主细胞或宿主生物、在所述宿主中表达所述多肽、任选地接着进行一个或多个分离和/或纯化步骤。具体地，所述方法可以包括：
[0310]
a)在合适的宿主细胞或宿主生物中或在另一种合适的表达系统中表达编码所述多肽的核酸序列；任选地接着是：
[0311]
b)分离和/或纯化所述多肽。
[0312]
用于产生目的的合适的宿主细胞或宿主生物对本领域技术人员将是清楚的，并且可以是例如任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、原核或真核生物。具体例子包括hek293细胞、cho细胞、大肠杆菌(escherichia coli)或巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)。最优选的宿主是巴斯德毕赤酵母。
[0313]
本发明技术的多肽、如所述的核酸分子或载体、或者包含本发明技术的多肽、核酸分子或载体的组合物，优选地所述多肽或包含所述多肽的组合物，可用作药物。
[0314]
因此，本发明技术提供了用作药物的本发明技术的多肽、如本文所述的核酸分子或载体或包含本发明技术的多肽、核酸分子或载体的组合物。
[0315]
还提供了用于(预防性或治疗性)治疗自身免疫疾病或炎性疾病的本发明技术的多肽、如所述的核酸分子或载体、或者包含本发明技术的多肽、核酸分子或载体的组合物。
[0316]
还提供了治疗自身免疫疾病或炎性疾病的(预防性和/或治疗性)方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用药学活性量的本发明技术的多肽、如所述的核酸分子或载体、或者包含本发明技术的多肽、核酸分子或载体的组合物。
[0317]
还提供了本发明技术的多肽、如所述的核酸分子或载体、或者包含本发明技术的多肽、核酸分子或载体的组合物在制备优选地用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病的药物组合物中的用途。
[0318]
所述自身免疫疾病或炎性疾病可以例如是类风湿性关节炎；炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)；银屑病、化脓性汗腺炎；以及移植物抗宿主病。
[0319]
如在本发明技术的上下文中所提及的“受试者”可以是任何动物，优选哺乳动物。在哺乳动物中，可以将人和非人哺乳动物区分开。非人动物可以是例如伴侣动物(例如狗、猫)、家畜(例如牛、马、绵羊、山羊或猪动物)或通常用于研究目的和/或用于产生抗体的动物(例如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、山羊、绵羊、马、猪、非人灵长类动物(如食蟹猴)或骆驼科动物(如美洲驼或羊驼))。
[0320]
在预防性和/或治疗性目的的情境下，受试者可以是任何动物，并且更具体地是任何哺乳动物，但优选地是人受试者。
[0321]
可以将物质(包括多肽、核酸分子和载体)或组合物通过任何合适的施用途径施用于受试者，所述合适的施用途径例如通过肠内(如口服或直肠)或肠胃外(如表皮、舌下、颊、鼻、关节内、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经皮、或经粘膜)施用。肠胃外施用，如肌内、皮下或皮内施用是优选的。最优选的是皮下施用。
[0322]
可将有效量的多肽、如本文所述的核酸分子或载体或包含所述多肽、核酸分子或载体的组合物施用于受试者，以提供预期的治疗结果。
[0323]
可以施用一个或多个剂量。如果施用多于一个剂量，则可以以合适的间隔施用剂量，以使所述多肽、组合物、核酸分子或载体的作用最大化。
[0324]
表a-1：在五价多肽f027300252内鉴定的不同单价v
ah
构建块的氨基酸序列(“id”是指如本文所用的seq id no)
[0325]
[0326]
[0327]
[0328][0329]
表a-4：结合血清白蛋白的isvd序列(“id”是指如本文所用的seq id no)
[0330][0331]
表a-5：接头序列(“id”是指如本文所用的seq id no)
[0332][0333]
6实施例
[0334]
6.1实施例1：多特异性isvd构建体生成
[0335]
与tnfα和ox40l结合的含有isvd的多肽f027300252(seq id no：1)的鉴定源自数据驱动的多特异性工程化和格式化活动，其中包括抗tnfαv
hh
构建块(tnf06c11(wo 2017081320)、tnf01c02(wo 2015173325，seq id no：327)和vhh#3(wo 2004041862))、抗ox40l v
hh
构建块(ox40l1e07、ox40l1b11和ox40l15b07，参见wo 2011073180)和抗hsa v
hh
构建块alb23002(参见wo 2017134234，seq id no：10/wo 2018131234)。应用了构建块的不同位置/取向和不同接头长度(9gs、20gs与35gs)，并且证明这些对于不同的参数(效力、交叉反应性、表达等)是至关重要的。在这种情境下，效力是指对tnfα诱导的nfκb激活的抑制和对ox40l诱导的体外t细胞的共刺激的抑制，如实施例7和9中所测定。
[0336]
在巴斯德毕赤酵母中转化包含84种构建体的组(表2)用于小规模生产。通过逐步添加甲醇发生isvd构建体表达的诱导。将具有分泌的isvd构建体的澄清培养基用作起始材料，用于经由蛋白a亲和色谱纯化，随后进行脱盐。所纯化的样品用于功能表征和表达评价。
[0337]
表2：所评价的84种不同多特异性isvd形式的列表。bb＝构建块，alb＝alb23002。
[0338]
[0339][0340]
一些构建体显示出受损的效力，这取决于效价、接头长度和isvd构建块的相对位置。例如：对于6种双特异性isvd构建体，虽然它们包含相同的靶向ox40l和tnfα的构建块，但是观察到ox40l效力的显著差异。发现确切组成(效价、构建块的取向和接头长度的使用)对于效力是至关重要的。如表3中所示的列出的用于ox40l阻断的效力证实了抗ox40l 1e07/1构建块的双效价和n末端位置的重要性。
[0341]
表3：相比于参考化合物抗hox40l mab，在pbmc活性测定中，具有与isvd构建体f027300052相同的构建块的多特异性isvd中和人和食蟹猴ox40l的ic50值。
[0342][0343]
随后，将大组削减成五种多特异性构建体的组，所述组由isvd构建体f027300252、f027301140、f027301189、f027301197和f027301199组成，基于初步产量估计证明这些isvd构建体对两种靶标(人和食蟹猴)均有效并且具有高表达水平的潜力。
[0344]
在巴斯德毕赤酵母中进行了包含5种isvd构建体的组的较大规模的2l和5l生产，以进行表达产量测定，评估生物物理学特性和预先存在的反应性。已证实，需要抗ox40l构建块与抗tnfα构建块的特定组合以获得在巴斯德毕赤酵母中的高表达产量以及足够的溶解度和生物物理学稳定性。如表5中所例示，比较isvd构建体f027300252与f07301199，使用抗tnf构建块已经导致非常不同的cmc特征。在5l发酵后，isvd构建体f027300252不仅达到6g/l的滴度(是isvd构建体f07301199的3倍)，还展现优越的储存特性和粘度。
[0345]
表4：isvd构建体f027300252和f07301199的构建块组成。
[0346][0347]
表5：五价isvd构建体f0273000252和f027301199的表达产量和生物物理学特性。
[0348][0349]
＊在＞150mg/ml的高浓度下。alb＝alb23002，bb＝构建块，svp＝亚可见颗粒
[0350]
此外，表6和实施例12展现出预先存在的抗体反应性是由相应isvd构建体的组成、效价和接头长度驱动的。
[0351]
表6：与对照isvd构建体f027301099和f027301186相比，存在于96个人血清样品中的预先存在的抗体与f027300252、f027301140、f027301189、f027301197和f027301199的结合。
[0352][0353]
bb＝构建块，nt＝未测试
[0354]
最后，基于效力、与预先存在的抗体的降低的结合、优越的表达水平和cmc特征以及与预先存在的抗体的降低的结合，选择isvd构建体f027300252。
[0355]
6.2实施例2：多特异性isvd构建体对tnfα、ox40l和血清白蛋白的结合亲
[0356]
和力
[0357]
f027300252对人、食蟹猴、豚鼠和小鼠tnfα、人和食蟹猴ox40l以及人和食蟹猴血清白蛋白的亲和力表示为平衡解离常数(kd)，是在gyrolab xp工作站(gyros)上借助溶液中亲和力测量来定量的。
[0358]
在kd控制的测量下，将连续稀释的tnfα或ox40l(范围为1μm-0.1pm)或血清白蛋白(范围为10μm-1pm)和固定量的f027300252(在tnfα的情况下为20pm，在ox40l的情况下为30pm，并且在血清白蛋白的情况下为300pm)混合以允许相互作用，并孵育24或48小时(在ox40l和tnfα的情况下)或2小时(在血清白蛋白的情况下)以达到平衡。
[0359]
在受体控制的测量下，将连续稀释的tnfα或ox40l(范围为1μm-0.1pm)和固定量的f027300252(在tnfα的情况下为5nm，并且在ox40l的情况下为5nm)混合以允许相互作用，并
孵育24或48小时以达到平衡。
[0360]
生物素化人tnfα/ox40l/血清白蛋白被捕获在gyrolab bioaffy 1000 cd的微结构中，所述微结构含有珠的柱并用作分子探针以从平衡溶液捕获游离f027300252。允许tnfα/ox40l/血清白蛋白与f027300252的混合物(含有游离tnfα/ox40l/血清白蛋白、游离f027300252和tnfα/ox40l/血清白蛋白-f027300252复合物)流过珠，并捕获与游离isvd构建体浓度成比例的小百分比的游离f027300252。然后注射荧光标记的抗v
hh
抗体abh0086-alexa647，以标记任何捕获的f027300252，并在冲洗掉过量的荧光探针后测定荧光的变化。使用gyrolab分析软件进行稀释系列的拟合，其中分析kd和受体控制的曲线以测定kd值。
[0361]
结果(表7)证实多特异性isvd构建体以高亲和力结合人/食蟹猴ox40l和人/食蟹猴tnfα。
[0362]
表7：f027500252对人和食蟹猴ox40l、tnfa和血清白蛋白的结合亲和力。
[0363][0364]
6.3实施例3：多特异性isvd构建体与膜结合tnfα的结合
[0365]
使用流式细胞术在表达膜tnfα的人hek293h细胞上以及在从pbmc分离并用pma和离子霉素刺激的激活的cd4+细胞上证实f027300252与膜结合tnfα的结合(显示表达tnfα的hek293h细胞的数据)。简言之，将细胞以1
×
104个细胞/孔的密度接种，并与f027300252或参考化合物抗htnfαmab的从100nm开始直至0.5pm的稀释系列在4℃下一起孵育1小时。平行地，将细胞在接种前用pbs中的4％多聚甲醛和0.1％戊二醛固定(以增加膜结合tnfα的检测)，并与isvd构建体或参考化合物的稀释系列在4℃下一起孵育1小时或在室温下一起孵育24小时。将细胞洗涤3次，随后与抗v
hh mab(abh00119)在4℃下一起孵育30min，再次洗涤，并且与山羊抗小鼠或抗人pe标记的抗体在4℃下一起孵育30min。将样品洗涤并重悬于facs缓冲液(含有10％fbs和0.05％叠氮化钠的d-pbs，补充有5nm topro3)中。然后在iquescreener上分析细胞悬浮液。使用graphpad prism计算ec50值。在1小时孵育后，对于活细胞和固定的细胞，f027300252和抗htnfα参考mab的ec50值在相同范围内，但细胞的固定导致膜上存在更高的tnfα水平(表8)。在24小时孵育后，达到结合平衡。f027300252与抗htnfα参考mab的亲和力是可比的。
[0366]
表8：与参考化合物抗htnfαmab相比，在1小时或24小时的孵育时间后，f027300252对膜表达的tnfα的结合亲和力。
[0367][0368]
6.4实施例4：多特异性isvd构建体与膜结合ox40l的结合
[0369]
使用流式细胞术在表达人或食蟹猴ox40l的cho-ki细胞上证实f027300252与膜结合人和食蟹猴ox40l的结合。简言之，将细胞用pbs中的4％多聚甲醛和0.1％戊二醛固定，以1
×
104个细胞/孔的密度接种，并且与isvd构建体f027300252或参考化合物抗hox40l mab的从100nm开始直至0.5pm的稀释系列在室温下一起孵育48小时。将细胞洗涤3次，随后与抗v
hh mab在4℃下一起孵育30min，再次洗涤，并且与山羊抗小鼠pe或fitc标记的抗体在4℃下一起孵育30min。将样品洗涤并重悬于facs缓冲液(含有10％fbs和0.05％叠氮化钠的d-pbs，补充有5nm topro3)中。然后在iquescreener上分析细胞悬浮液。使用graphpad prism计算ec50值。f0273000252显示比参考化合物抗hox40l参考mab更好的与膜结合ox40l的结合，其因数大于10(表9)。
[0370]
表9：与参考化合物抗hox40l参考mab相比，f027300252对膜表达的人和食蟹猴ox40l的结合亲和力。
[0371] 人ox40l食蟹猴ox40l分析物ec50(m)ec50(m)f0273002521.33e-111.18e-11抗hox40l参考mab1.80e-101.42e-10
[0372]
6.5实施例5：多特异性isvd构建体与tnfα和ox40l选择性地结合
[0373]
通过spr(proteon xpr36)评估与tnfα和ox40l相关人靶标的结合的不存在。评估作为ox40l相关靶标的人trail、cd30l、cd40l和rankl。测试作为tnfα相关细胞因子的tnf超家族成员人fasl、tnfβ、light、tl-1a、rankl。
[0374]
为此，使用胺偶联以25μg/ml将tnf相关细胞因子固定在proteon glc传感器芯片上持续200s，且进行edc/nhs的80秒注射用于激活以及1m乙醇胺盐酸盐的150秒注射用于失活(proteon胺偶联试剂盒，目录号176-2410)。将激活、失活和配体注射期间的流速设为30μl/min。通过从每种配体的pi减去约1.5来选择10mm乙酸盐固定缓冲液的ph。
[0375]
之后，将10nm或300nm的f027300252注射2分钟，并允许其以45μl/min的流速解离900s。使用pbs(ph 7.4)+0.005％吐温20作为运行缓冲液。作为阳性对照，注射0.3μmα-hfasl ab、0.3μmα-htnfβab、0.5μmα-hltght ab和0.3μmα-htl-1aab。f027300252和阳性对照与固定化靶标之间的相互作用是通过检测折射率的增加来测量，所述折射率的增加是由于结合后芯片上的质量变化而发生的。
[0376]
在ox40l相关靶标的情况下，将isvd构建体f027500252或阳性对照抗体α-htrail、α-hcd30l、α-hcd40l和α-hrankl v
hh
以10μg/ml固定在传感器芯片上。
[0377]
之后，将1μm人trail、cd30l、cd40l和rankl注射2分钟，并允许其以45μl/min的流速解离900s。
[0378]
所有阳性对照确实与其各自的靶标结合。未检测到isvd构建体f027300252与人trail、cd30l、cd40l、fasl、tnfβ、light、tl-1a和rankl的结合。
[0379]
6.6实施例6：多特异性isvd构建体与hox40l、htnfα和hsa的同时结合
[0380]
使用biacore t200仪器测定isvd构建体f0273000252是否可以与重组可溶htnfα和hox40l同时结合。为此，经由胺偶联将hsa固定在cm5传感器芯片上至6000ru的水平。将100nm的f0273000252以10μi/min在hsa表面上注射2min，以经由alb23002构建块捕获isvd构建体。随后，将100nm的hox40l、htnfα或hil13或者100nm ox40l+100nm tnfα、100nm il13+100nm ox40l或100nm tnfα+100nm il13的混合物以45μl/min的流速注射2min，接着进行随后的600秒解离步骤。通过将hci(100mm)以45μi/min注射2分钟来再生hsa表面。传感图(图1)展现出isvd构建体f027300252可以同时结合hox40l和htnfα，如在hsa上捕获后响应单位的增加所显示：从仅htnfα增加约1770ru，从仅hox40l增加约800ru，并且对于ox40l和tnfα混合物增加约2300 ru。
[0381]
使用流式细胞术，确定isvd构建体f0273000252是否可以与重组可溶htnfα和细胞膜结合hox40l同时结合。为此，将表达人ox40l的cho-ki细胞以5
×
104个细胞/孔的密度接种，并且与100nm isvd构建体f027300252在4℃下一起孵育90分钟。随后，将所述混合物与生物素化tnfα的从500nm开始直至7.6pm的稀释系列在30μm hsa的存在下一起孵育，在4℃下孵育30min。将细胞洗涤3次，随后与pe标记的抗链霉亲和素在4℃下一起孵育30min，再次洗涤。将样品洗涤并重悬于facs缓冲液(含有10％fbs和0.05％叠氮化钠的d-pbs，补充有5nm topro3)中。然后在iquescreener上分析细胞悬浮液。剂量反应曲线(图2)展现出在has的存在下，isvd构建体f027300252可以同时结合膜结合hox40l和可溶htnfα，而阴性对照v
hh irr0096无法结合。
[0382]
6.7实施例7：多特异性isvd构建体在体外对tnfα诱导的nfkb激活的抑制
[0383]
hek293_nfκb-nlucp细胞是表达tnf受体的细胞，其被在nfκb依赖性启动子控制下的编码nano萤光素酶的报告物构建体稳定转染。所述细胞与可溶人和食蟹猴tnfα的孵育导致nfκb介导的nano萤光素酶基因表达。使用添加到细胞上的以1：50比率与裂解缓冲液混合的nano-glo萤光素酶底物来测量nano萤光素酶发光。将样品在振荡器上混合5分钟以获得完全裂解。
[0384]
将glo response
tm hek293_nfκb-nlucp细胞以20000个细胞/孔接种于白色组织培养(tc)处理的具有透明底部的96孔板中的正常生长培养基中。将f0273000252或参考化合物(抗htnfαmab)的稀释系列添加到25pm人或70pm食蟹猴tnfα中，并在30μm hsa的存在下与所述细胞在37℃下一起孵育5小时。
[0385]
f027300252以浓度依赖性方式抑制人和食蟹猴tnfα诱导的nfκb激活，其中ic50为31pm(对于人tnfα)和91pm(对于食蟹猴tnfα)，与参考化合物抗htnfαmab是可比的(表10，图3)。阴性对照vhh irr00096未显示抑制。表10：在glo response
tm hek293_nfκb-nlucp报告物测定中，相比于参考化合物抗htnfαmab，f0275000252介导的人和食蟹猴tnfα的中和的ic50值。
[0386]
[0387]
6.8实施例8：在稳定的nfkb萤光素酶报告细胞系中，多特异性isvd构建体对tnfα的抑制减少萤光素酶表达
[0388]
对于测量单特异性或多特异性抗体或isvd构建体/v
hh
对tnfα的中和，使用nfκb报告物稳定细胞系a549/nfκb-luc(目录号rc002)。核因子κb(nfκb)是转录因子的rel家族的成员，并且在炎性反应、细胞凋亡或肿瘤发生的调节中具有关键作用。此处所用的细胞系衍生自人肺癌细胞a549，所述人肺癌细胞a549具有受6拷贝的nfκb反应元件调节的萤光素酶报告物构建体的染色体整合。使用这种细胞系，可以准确监测沿nfκb途径发生的任何变化。
[0389]
通过以isvd构建体的ec90中和人tnfα(sigma#h8916)和食蟹猴tnfα(sino 90018-cnae-5)，在10个连续稀释的浓度的剂量反应中测定isvd构建体效力。人tnfα以[15ng/ml]使用，并且食蟹猴tnfα以[10ng/ml]使用。
[0390]
将解冻-使用的a549/nfκb-luc细胞悬浮于含有1％fcs的rpmi培养基中，并接种于384孔板中，每孔以10μl接种10k个细胞。将10μl抗tnf/抗ox40l多特异性isvd构建体f027300252或相应阳性和阴性对照抗体和v
hh
稀释于rpmi培养基中并添加至细胞。使用内部产生的抗tnfα抗体(抗tnfαmab2)作为阳性对照，并且使用v
hh irr00119以及抗体ra11093885作为阴性对照。在室温下预孵育15分钟后，将10μl浓度为15ng/ml的tnfα添加至孔中。在37℃以及5％co2和95％湿度下5小时后，通过添加20μl bio-glo萤光素酶检测试剂(promega e7940)终止整个反应。通过pherastar(bmg)测量发光信号。使用speed中的xlfit程序拟合剂量反应曲线并计算ic50值。
[0391]
表11：平均ic50结果。
[0392][0393]
6.9实施例9：多特异性isvd构建体在体外对ox40l诱导的t细胞的共刺激的抑制
[0394]
使用基于细胞的测定研究人和食蟹猴ox40l的功能活性及isvd构建体f027300252对所述活性的抑制，从而研究ox40l诱导的t细胞的共刺激(pbmc活性测定)。所述测定是通过在透明96孔板中在次最佳浓度的pha-l的存在下(以诱导ox40表达)共培养血沉棕黄层衍生的pbmc(密度为1
×
105个细胞/孔)与过表达ox40l的cho-ki细胞(密度为1x104个细胞/孔)来进行。将isvd构建体f027300252或参考化合物抗hox40l mab的稀释系列添加至共培养物，并在30μm hsa的存在下在37℃下于加湿孵育器中孵育22小时。通过使用elisa评价这些细胞的上清液中的il2水平来进行读出。
[0395]
isvd构建体f027300252以浓度依赖性方式抑制人和食蟹猴ox40l诱导的t细胞激活，其ic50为2.58nm(对于人ox40l)和7.22nm(对于食蟹猴ox40l)，与参考化合物抗hox40l mab是可比的(表12，图4)。
[0396]
表12：在pbmc活性测定中，相比于参考化合物抗hox40l mab，f0273000252介导的人和食蟹猴ox40l的中和的ic50值。
[0397][0398][0399]
6.10实施例10：在稳定的nfkb萤光素酶报告细胞系中，多特异性isvd构建体f027300252对tnfα和ox40l的抑制减少萤光素酶表达
[0400]
对于单独地或组合地测量单特异性或多特异性抗体或isvd构建体/v
hh
对tnfα和ox40l的中和，使用nfκb报告物稳定细胞系jurkat nf-κb luc2/ox40。核因子κb(nfκb)是转录因子的rel家族的成员，并且在炎性反应、细胞凋亡或肿瘤发生的调节中具有关键作用。此处所用的细胞系衍生自人外周血t淋巴细胞，所述人外周血t淋巴细胞具有染色体整合且稳定表达人ox40受体和受6拷贝nfκb反应元件调节的密码子优化的萤火虫萤光素酶报告基因luc2构建体。使用这种细胞系，可以准确监测沿nfκb途径发生的任何变化。将解冻-使用的jurkatnf-κb luc2/ox40细胞重悬于含有1％fcs的rpmi培养基中，并接种于96孔板中，每孔以1x105个细胞/ml接种以供培养。
[0401]
在测定开始时，将重组人tnfα和人ox40l以5ng/ml和100ng/ml的终浓度以85μl/孔添加至96孔eppendorf悬浮培养板的孔中，并且添加85μl预稀释的抗tnfα抗体pb03017(来自sanofi)、抗ox40l抗体(目录号ab00536，来自absolute antibody)、igg1同种型阴性对照抗体(目录号403502，来自biolegend)、阴性对照v
hh
irr00119(来自sanofi)、单特异性抗tnfαv
hh
atn-103(来自sanofi)、单特异性抗ox40l v
hh alx-0632(来自sanofi)或抗tnf/抗ox40l多特异性isvd构建体f027300252、f027301104、f027301189、f027301197和f027301199(都来自sanofi)。在37℃下预孵育15分钟后，添加75μl/孔该混合物至50μl的1x105个细胞/孔，并且在37℃以及5％co2和95％湿度下孵育6小时。通过添加125μl bio-glo萤光素酶检测试剂(promega e7940)停止反应，并测量发光信号。在图7中使用speed中的xlfit程序拟合剂量反应曲线并计算ic50值。
[0402]
在0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和5μg/ml的抗体剂量下，确定与单独组的效力相比，抗tnfα和抗ox40l组合的加性效应(图5)。通过以多特异性isvd构建体的ec90中和重组人tnfα(目录号h8916，来自sigma)和重组人ox40l(目录号71185，来自bpsbioscience)以通过每种单独刺激物实现可比的萤光素酶诱导水平(参见图5)，在9个连续稀释浓度的剂量反应中确定与单特异性v
hh
相比，多特异性isvd构建体的ic50(图7，表13)和抑制％(图6，表13)。分别地，人tnfα以5ng/ml最终测定浓度使用，并且人ox40l以100ng/ml最终测定浓度使用。
[0403]
与用任一种单独的刺激物处理相比，与重组人tnfα(htnfα)和重组人ox40l(ox40l)二者一起孵育导致显著更强的萤光素酶活性的诱导(＞3倍)(参见图5)。使用与重组人tnfα和重组人ox40l(htnfα+ox40l)二者一起孵育来表征：在0.5μg/ml至最高5μg/ml范围内的不同浓度下，单独的抗tnfα抗体的抑制、单独的抗ox40l抗体的抑制、或抗tnfα抗体与抗ox40l抗体的组合的抑制的效应(图5)。尽管用单独的抗tnfα或抗ox40l处理确实导致对组合的htnfα+ox40l诱导的萤光素酶活性的一定抑制，但是仅用组合的抗tnfα/抗ox40l
处理就能够将萤光素酶活性极强地抑制到与无刺激物的对照相对应的极低水平(图5)。因此，与用5μg/ml高浓度的单独抗tnfα或抗ox40l处理相比，使用抗tnf/抗ox40l的组合处理即使在例如0.5μg/ml或1μg/ml的极低浓度下也显著更强地抑制萤光素酶活性(图5)。
[0404]
类似地，使用与重组人tnfα和重组人ox40l的组合(htnfα+ox40l)一起孵育来表征，在1pm至最高20nm范围内的不同浓度下，单特异性抗ox40l v
hh
alx-0632、或单特异性抗tnfαv
hh
atn-103、或抗tnfα/抗ox40l双特异性isvd构建体f027300252、f027301104、f027301189、f027301197和f027301199的抑制的效应(图6和图7)。尽管用单独的抗tnfαv
hh
或抗ox40l v
hh
处理确实导致对组合的htnfα+ox40l诱导的萤光素酶活性的一定抑制，至最高大约＜70％最大值的水平，但仅用双特异性抗tnfα/抗ox40l isvd构建体处理就能够完全抑制萤光素酶活性的诱导，至最高100％的水平(图6)。此外，在1pm至最高20nm范围内的不同浓度下，抗tnfα/抗ox40l双特异性isvd构建体f027300252、f027301104、f027301189、f027301197和f027301199的ic50值的计算显示，isvd构建体f027300252和f027301199在此特定实验集合中具有最强效力(图7)。
[0405]
表13：在jurkat ox40/tnf-nfκb报告物测定中，isvd构建体f027300252、f027301104、f027301189、f027301197和f027301199的ic50值和抑制％(还参见图6和图7)。
[0406][0407][0408]
6.11实施例11：在混合淋巴细胞反应(mlr)中，多特异性isvd构建体对ox40l和tnfα的抑制降低gm-csf水平
[0409]
为了测试ox40l阻断对t细胞激活的生理作用，进行混合淋巴细胞反应测定。简言之，使来自健康血液供体的单核细胞衍生的树突细胞(modc)在体外成熟以表达ox40l，然后将这些细胞与来自另一无关健康供体的pbmc混合。在同一孔中混合无关供体诱导同种异体反应(allo-reaction)和t细胞激活。借助混合细胞后5天时上清液中的细胞因子测量来监测该同种异体t细胞应答。在下文中，显示对modc制备和通过细胞因子测量评价t细胞应答的详细解释。
[0410]
从健康血液供体的pbmc制备单核细胞衍生的树突细胞：
[0411]
通过梯度离心从全血或血沉棕黄层分离pbmc。计数细胞并将3x107个细胞铺板于6孔板的每孔中的3ml rpmi 1640培养基中，所述rpmi 1640培养基含有glutamax、10％人血清、10mm hepes和20μg/ml庆大霉素。1-2小时后，通过3轮洗涤来洗涤未粘附细胞，并将所述细胞在500iu/ml的il-4和500iu/ml gm-csf的存在下孵育5天。在该5天孵育的第3天，将培养基用含有il-4和gm-csf的新鲜培养基进行部分更换。在5天孵育期结束时，收集并计数已分化但仍不成熟的dc。然后将所述dc在6孔或24孔板中重铺板以供进一步成熟(5x105个细胞/ml)。在培养基(与上文相同)中孵育所述细胞，所述培养基含有新型细胞因子混合物
(cocktail)[500iu/ml的il-4、500iu/ml的gm-csf、10ng/ml il-1b、1000iu il-6、10ng/ml tnfa、1μg/ml pge2]，已经将所述混合物鉴定为在诱导dc上的ox40l表达的刺激物中最合适的刺激物(图8)。在成熟的第2天、第3天和第4天，收集dc并通过流式细胞术评价成熟标记如cd86、cd83、cd40、hla-dr和ox40l的表达。在成熟3-4天后，所有成熟dc的30％-70％在表面上表达ox40l。在确认ox40l表达后(图8)，将dc在冷冻介质(90％胎牛血清+10％dmso)中冷冻以在之后用于mlr测定中。
[0412]
混合淋巴细胞反应
[0413]
通过梯度离心从全血或血沉棕黄层分离pbmc。将细胞重悬于x-vivo 15培养基(lonza)中并计数。同时，将dc解冻并重悬于x-vivo 15培养基中。将1x105个pbmc和5x103个dc在u形底96孔板的同一孔中混合。为了表征用单独的抗tnfα[10μg/ml]、或单独的抗ox40l[10μg/ml]、或抗tnfα[10μg/ml]+抗ox40l[10μg/ml]的组合处理的作用，将抗体以相应的稀释度添加，并且将pbmc与dc的混合物孵育5天。类似地，为了表征用isvd构建体处理的作用，添加变化浓度的f027300252(400-0.13nm；5倍连续稀释)或对照vhh irr00119，并将pbmc与dc的混合物孵育5天。使用与对照同种型igg(biolegend；克隆qa16a12)一起孵育作为阴性对照。5天后，收集上清液并且通过基于luminex的多重测定来评价上清液中各种细胞因子的量(图9)。对于抗tnf和/或抗ox40l功效的测定，针对来自5名同种异体供体的pbmc测试来自3名不同人供体的dc。对于f027300252抑制gm-csf产生的ic50值的测定，针对衍生自2名同种异体供体的dc测试来自8名供体的pbmc。使用speed中的xlfit程序拟合剂量反应曲线并计算f027300252的ic50值。
[0414]
与用同种型处理相比，用单独的抗tnfα抗体或单独的抗ox40l抗体(均在10μg/ml的饱和浓度下)处理确实导致对gm-csf分泌的显著抑制(图9)。然而，与单独的tnf(
**
p＜0.0016；图9)或ox40l(
****
p＜0.0001；图9)阻断相比，用抗tnfα抗体与抗ox40l抗体的组合处理能够显著更有效地抑制gm-csf分泌，表明组合阻断tnfα和ox40l的优越的效力(图9)。对于f027300252抑制gm-csf产生的ic50值的测定，针对衍生自2名同种异体供体的dc测试来自8名供体的pbmc。使用speed中的xlfit程序拟合剂量反应曲线并计算ic50值。f027300252以浓度依赖性方式抑制gm-csf产生，其中ic50为51,69
±
19,3nm(sem)，并且最大抑制为70,32
±
5,59％。
[0415]
6.12实施例12：与预先存在的抗体结合的多特异性isvd构建体
[0416]
使用proteon xpr36(bio-rad laboratories，inc.)测定存在于来自健康志愿者的96个血清样品中的预先存在的抗体与isvd构建体f027300252的结合。pbs/吐温(磷酸盐缓冲盐水(ph 7.4)，0.005％吐温20)用作运行缓冲液，并且在25℃下进行实验。
[0417]
经由alb构建块与固定在芯片上的hsa的结合，在芯片上捕获isvd构建体。为了固定hsa，用edc/nhs(流速30μi/min)激活proteon glc传感器芯片的配体道，并将hsa以100μl/ml注射在ph4.5的proteon乙酸盐缓冲液中，以实现大约3200ru的固定化水平。固定后，用乙醇胺hci(流速30μi/min)使表面失活。
[0418]
随后，将isvd构建体以45μi/min在hsa表面上注射2分钟，以实现大约800ru的isvd构建体捕获水平。将含有预先存在的抗体的样品以14,000rpm离心2分钟，并将上清液在pbs-tween20(0.005％)中以1∶10稀释，然后以45μi/min注射2分钟，接着进行随后的400秒的解离步骤。在每个循环后(即在新的isvd构建体捕获和血液样品注射步骤之前)，通过将
hci(100mm)以45μi/min注射2分钟来再生hsa表面。在通过减去1)isvd-hsa解离和2)与参考配体道的非特异性结合的两次参比后，获得显示预先存在的抗体结合的传感图。通过将报告点设置为125秒(缔合结束后5秒)来测定预先存在的抗体的结合水平。相对于参考isvd构建体在125秒时的结合水平，计算预先存在的抗体结合的降低百分比。
[0419]
通过在每个构建块中引入突变l11v和v89l和c-末端丙氨酸针对降低预先存在的抗体结合进行优化的五价isvd构建体f027300252显示出与对照未优化的五价isvd构建体f027301186相比显著更少的与预先存在的抗体的结合(表6、表14、图10和图11)。
[0420]
预先存在的抗体结合取决于多特异性构建体的效价和组成。表6和图10展现出五价isvb构建体f027300252显示比四价isvd构建体f027301104和f027301099更低的预先存在的抗体反应性。
[0421]
由与isvd构建体f027300252相同的亲本构建块构成的四种isvd构建体展示不同的预先存在的抗体反应性(表14、图11)。比较isvd构建体f027300028与isvd构建体f027301186显示，在每个构建块中引入突变l11v和v89l和c末端丙氨酸显著降低预先存在的抗体反应性。比较isvd构建体f027300028与isvd构建体f027301097显示，在c末端构建块中引入t110k突变略微进一步降低预先存在的抗体反应性。通过用isvd构建体f027300252中更短的9gs接头替代isvd构建体f027301097中的35gs接头，进一步显著降低预先存在的抗体反应性。因此，在多价构建体中使用短9gs接头对于获得低的预先存在的抗体反应性至关重要。
[0422][0423]
6.13实施例13：在慢性人tnfα转基因tg197多关节炎模型中对多特异性抗tnfα/ox40l isvd构建体f027300252的评价。
[0424]
在tnf驱动的进行性多关节炎的tg197小鼠模型中剖析f027300252多特异性抗tnfα/ox40lisvd构建体(keffer等人，1991，embo j.，10：4025-4031)。在这些小鼠中，将修饰的人tnfα基因作为转基因插入小鼠中。以使转录的mrna更稳定的方式修饰人基因，并且由此导致tnfα的过表达以及在所有四只爪子中具有100％外显率的自发性进行性关节炎。如果不治疗，那么体征和症状在约6周龄时变得明显，并且不断增加，直到从约10周龄起所述体征和症状导致明显的濒死和死亡。通过评分系统对关节炎的严重程度进行了临床评估，如下文所详述：
[0425][0426]1关节炎得分如图12中的y轴上所示。
[0427]
关节炎对使用针对人tnfα的抑制的治疗剂的治疗敏感(shealy等人，2002，arthritis res.4(5)：r7)。
[0428]
出于建立剂量依赖性功效的目的，以治疗性方式通过每周两次腹膜内注射，向具有关节炎的明显体征和症状的6周龄动物施用不同剂量的isvd构建体(n＝8只动物/组)。使用从人骨髓瘤血清纯化的人igg1(bioxcell#be0297)作为阴性对照，并且使用抗htnfα参考mab作为抑制关节炎的阳性对照。分别以1mg/kg体重、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的四种不同的剂量强度施用f027300252 isvd构建体。持续治疗直至11周龄。每周一次确定临床关节炎得分。如图12中所示，isvd构建体治疗导致对临床关节炎得分随时间变化的剂量依赖性抑制。
[0429]
截至第11周，用人igg1阴性对照抗体治疗的动物发展到平均关节炎得分为1.58
±
0.06。抗htnfα参考mab完全抑制关节炎的进展，截至第11周，平均得分为0.61
±
0.06。到第11周，f027300252减少关节炎进展，平均得分为1.30
±
0.09(1mg/kg)、0.89
±
0.10(3mg/kg)、0.67
±
0.08(10mg/kg)和0.28
±
0.04(30mg/kg)。通过曲线下面积(auc，图13)分析对关节炎的整体抑制。在tg197关节炎模型中，所有剂量的f027300252均显著抑制关节炎进展，与抗htnfα参考mab是可比的。
[0430]
在治疗完成后，对后肢踝关节进行处理以供组织学分析，并使用以下评分系统评价切片的关节炎结构体征：
[0431][0432]1关节炎得分如图14中的y轴上所示。
[0433]
组织学评分的结果描绘于图14中。在较高剂量下，f027300252显著抑制结构性关节炎和关节破坏。
[0434]
总之，结果表明isvd构建体f027300252对关节炎体征和症状的剂量依赖性抑制，以及对结构进展的抑制，其程度与抗htnfα参考mab是可比的。
[0435]
6.14实施例14：在人tnfα驱动的急性类风湿性关节炎小鼠模型(caia)中对抗tnf/ox40l isvd构建体的评价。
[0436]
在称为胶原-抗体诱导的关节炎(caia)的急性类风湿性关节炎模型中评价抗tnf-ox40l isvd构建体(f027300252)的体内功效。caia是类风湿性关节炎的临床前模型，并且广泛用于在药物开发中评估抗关节炎药物的作用(nandakumar和holmdahl(2007)，methods mol med.；136：215-23)。它是使用单克隆抗胶原ii抗体和lps的混合物的较短期(7天)诱导的关节炎模型。使用人源化tnfα和tnfr1小鼠进行该实验：c57bl/6ntac-tnfrsf1a
tm4504.1(tnfrsf1a)tac
tnf
tm4503.1(tnf)tac
。在德国动物福利政府机关的许可下，按照sanofi的实验室动物福利委员会批准的研究方案，根据研究所实验动物使用与管理委员会的指南对所有动物进行给药和监测。以操作者不知情的方式评估体内关节炎得分。将最小10周龄的雄性和雌性小鼠均等地随机化至相应治疗组。小鼠在第0天通过腹膜内(ip)注射接受无菌pbs中的8mg单克隆抗胶原抗体的混合物(arthritomab，mdbiosciense，cia-mab-2c)，之后在24小时后接受pbs中的25μg lps(ip)。监测小鼠7天。与每只小鼠200μl中0.1和0.5mg/kg的抗htnfα参考mab(常规抗体)相比，在第1天lps之后6小时，用同种型对照(igg1同种型1.0mg/kg i.p.200μl/小鼠)、多特异性tnfα-ox40l isvd构建体f027300252(0.03、0.1、0.3、1mg/kg(200μl/小鼠))施用治疗。施加的剂量等于对于f027300252在0.45、1.5、4.5和15nmol/kg下以及对于抗htnfα参考mab在0.65和3.3nmol/kg下估计的摩尔暴露。对于抗htnfα参考mab，进行两项研究，并且汇总媒介物动物以供最终分析。在实验第4天，在第一剂量后三天，向所有动物施加第二剂量。所述实验的示意性研究设计描绘于图15中。
[0437]
所述实验的结果显示于图16中。从两项实验汇总媒介物治疗的对照动物，所述实验相比于对照测试不同的抗htnfα参考mab浓度。在第6天实现了6.135的关节炎得分的平均峰增加。阳性对照抗htnfα参考mab显示对关节炎得分的显著作用，并且在所测试的较高浓度(3.3nmol/kg)下完全阻断疾病发展。抗tnfα-ox40l isvd构建体f027300252展现出剂量依赖性作用，其中体内效力与抗htnfα参考mab相比是类似的。仅0.45nmol/kg的最低剂量显示大约50％作用，这与0.65nmol/kg的较低剂量抗htnfα参考mab是可比的，但是所测试的isvd构建体的所有其他剂量都完全阻断疾病发展。对于f027300252以1.5nmol/kg测试的第二低剂量似乎与3.3nmol/kg的抗htnfα参考mab至少相似(如果不是更有效)。
[0438]
isvd构建体f027300252的显著剂量依赖性作用在图17中更明显，其中描绘了图16中关节炎得分数据的auc。f027300252的所有剂量显著降低关节炎得分，且从1.5nmol/kg向上完全抑制疾病。在等摩尔暴露/剂量下，所述作用与抗htnfα参考mab是可比的。
[0439]
总之，这些结果证实，在急性类风湿性关节炎小鼠模型中，关于靶向人tnfα，抗tnf-ox40l isvd构建体与抗htnfα参考mab相比一样好或者可能更优越，这突出显示了其用于治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎的免疫抑制潜力。统计学是单因素anova和邦弗朗尼多重比较检验。
[0440]
6.15实施例15：f027300252在组合的非人灵长类动物t细胞依赖性抗体应答(tdar)和迟发型超敏反应(dth)模型中的机制验证。
[0441]
t细胞依赖性抗体应答(tdar)模型是依赖于多个免疫过程的有效性的免疫功能的量度，所述多个免疫过程包括抗原摄取和呈递、t细胞辅助、b细胞激活和抗体产生。在该项研究中，使用所述模型来测定抗tnf-ox40l isvd构建体f027300252在非人灵长类动物体内的药效学作用。除了药效学之外，该项研究的目标是遵循以下治疗测定f027300252的pk和安全性：5次每周皮下施用至雌性食蟹猴，之后在第29天最后一次给予f027200252后是30天无治疗期。为了评估f027300252对免疫系统功能性的作用，通过tdar测定在存活期间评价体液应答(在钥孔虫戚血蓝蛋白-klh-免疫后)，同时通过体内迟发型超敏反应(dth)测试和elispot离体测定使用与用于tdar相同的抗原klh来评价细胞免疫应答。
[0442]
对于该项研究，使用总计20只专门培育的(purpose-bred)雌性食蟹猴(食蟹猕猴(macaca fascicularis))。由于f027300252与人靶标的高选择性结合，选择非人灵长类动物作为物种。基于f027300252对食蟹猴的高交叉反应性，选择非人灵长类动物。测试项目对其他啮齿类动物或非啮齿类动物物种没有交叉反应性。因此，基于可得数据，选择食蟹猴作为非啮齿类动物物种用于药理学和非临床安全性测试，并且可在与我们一起工作的合同研究组织(cro)(citoxlab，法国)获得先前研究的背景数据。另外，之前已经在与我们一起工作的cro在食蟹猴中验证了tdar和dth测定。
[0443]
在重复剂量食蟹猴研究中以25mg/kg通过皮下(sc)途径以相隔2周的两次施用评估f027300252的初步安全性(研究编号div1953)。在该组合的tdar-dth研究中选择的剂量跨越的范围覆盖潜在药理学剂量(3和10mg/kg)以及用于安全性评估的更高剂量(30和100mg/kg)二者。每周施用剂量配制品持续29天时间段，总计5次施用。第1天对应于使用测试和对照项目的治疗期的第一天。
[0444]
所选剂量的药代动力学描绘于图19中。
[0445]
在第3天和第31天以10mg/动物的剂量以1ml皮下施用klh抗原(图18)。使用海水养殖钥孔虫戚血蓝蛋白(thermofisher scientific，参考号77600)。对于抗klh igg的定量，根据预定的计划时间表将静脉血(1ml)从适当的静脉收集到普通管中。将血液保持在室温下以允许凝血(最长2小时)，之后离心(在+4℃下大约3000g持续10分钟)，并将所得血清分割成3个80μl等份+剩余体积的1等份。将所述管在-20℃下保持冷冻直至分析。使用在法国citoxlab(对于抗klh igg，法国citoxlab/研究编号41106rdp)开发并验证的特定elisa方法测量抗klh igg水平。对于两个时间段(第3天[klh注射前]至第31天[klh注射前]和第31天[klh注射前]至第59天)中的每一个，计算每只动物的曲线下面积(auc)。将auc值以对数(log10(值+1))进行转换，并使用威尔科克森(wilcoxon)检验依据时间段加
以分析。
[0446]
如所预期，igg对klh的初级应答较小。在第二次暴露于klh后，在媒介物对照治疗组中引发强的抗klh igg应答。从所测试最低剂量向上，用f027300252治疗导致对此应答的强抑制(图20)。绘制与来自使用针对tnfα(抗htnfα参考mab)和ox40l(抗hox40l参考mab)的工具单克隆抗体的先导研究的数据相比，f027300252研究的auc(图21)。与抗hox40l参考mab和抗htnfα参考mab单一治疗相比，即使在针对f027300252(在图21中称为“纳米抗体”)测试的最低剂量(3mg/kg)下，也观察到更显著的auc的降低。
[0447]
在尸检时，从猴子收获外周血单核细胞(pbmc)用于在酶联免疫斑点(elispot)测定中使用相同抗原(klh)进行离体再刺激，以测量细胞免疫应答。elispot测定是灵敏的免疫测定，其在单细胞水平上测量分泌细胞因子的细胞的频率。在该测定中，将细胞接种至96孔板的孔中，所述板预涂覆有对所测定的细胞因子(在该情况下是ifn-γ和il-4)具有特异性的捕获抗体。通过分泌细胞附近的孔底表面上的特异性抗体捕获所述细胞在刺激物的存在(或不存在)下分泌的细胞因子。在适当的孵育时间后，去除细胞，并且使用生物素化检测抗体使分泌的细胞因子可视化。在几个洗涤步骤后，添加与链霉亲和素偶联的酶(碱性磷酸酶)。通过使用沉淀底物，随后将固定的细胞因子揭示为免疫斑点(即分泌细胞因子的单独细胞)。对每个pbmc样品，在用klh刺激后分析ifn-γ和il-4分泌细胞的频率。
[0448]
在测试地点使用elispot分析仪对elispot板进行数字扫描(通过仪器获取单独孔的图像)。然后在用于斑点计数评价的专用软件上分析所述图像。评价每个孔中斑点的存在和斑点的数量，并且计算表示为ifn-γ或il-4斑点形成细胞(sfc)的数量的相应结果。将sfc的数量归一化为每百万个pbmc。
[0449]
来自媒介物对照动物的经刺激细胞显示ifn-γ(图22)和il-4(图23)显著增加。在所测试的f027300252的所有剂量中，治疗后，两种细胞因子都显著减少(图22和图23)。
[0450]
总之，这些结果证实，在非人灵长类动物中进行的t细胞依赖性抗体应答机制验证模型中，抗tnf-ox40l isvd构建体强烈抑制抗原呈递细胞、t细胞、b细胞之间的相互作用。
[0451]
非人灵长类动物研究的第二部分集中于皮肤中的体内迟发型超敏反应(dth)读出，以评估存活期间的细胞免疫应答。使用破伤风类毒素(ttx)和氢氧化铝作为抗原。如图18中所述应用dth激发。用不可擦除的手术笔在背部的每一侧上的皮肤上划定大约21cm长x3cm宽(即边长3cm的正方形)的网格(图24)，每个正方形中心的点指示注射部位。将注射部位用葡萄糖酸氯己定溶液(喷雾剂)消毒。
[0452]
在注射当天将抗原(ttx/alu和klh)各自注射在六个正方形的中心。使用配备有无菌一次性29g针的一次性无菌塑料注射器，通过拉伸皮肤并将所述针引入皮肤厚度中(斜面向上)来进行皮内注射。在注射部位出现小囊泡。然后，将针从皮肤快速抽出。
[0453]
在dth的存活期期间，评估并记录以下参数(表15)。
[0454]
表15
[0455][0456]
上文列出的参数都未显示使用f027300252的治疗效果的明显趋势，表明与肉眼可见的皮肤改变相比，在所述模型的dth部分的存活期期间，组织病理学评估和免疫组织化学可能更灵敏地展现差异。
[0457]
对于免疫组织化学，评价以下标记：cd3(t淋巴细胞)、cd4(t辅助细胞)、cd8(细胞毒性t细胞)、cd30(b淋巴细胞)、cd68(巨噬细胞)、ki67(增殖标记)和foxp3(t调节细胞)。常规h&e组织病理学和免疫组织化学(ihc)染色的结果归纳于下文中。
[0458]
对于第一抗原ttx/alu，在第34天，免疫应答受巨噬细胞支配。观察到炎症的严重程度的轻微剂量依赖性降低，且在最高剂量下效果最显著。免疫组织化学揭示，在所测试的最高剂量下，所有标记的得分显著降低，主要是巨噬细胞降低。在第59天尸检时，观察到与第34天相比，总体轻微较低的炎性反应。与第34天类似，ihc揭示对增殖标记ki67的作用最突出。总之，对于f027300252，在所测试的最高剂量下作用最显著。
[0459]
对于所测试的第二抗原klh，第34天的观察显示受嗜酸性粒细胞支配的免疫应答。总之，炎性反应与第34天的ttx/alu相比中度降低。ihc揭示，在所测试的最高剂量下，所有标记的得分显著降低，主要是cd8+、cd20和ki67降低。在第59天，炎性反应与第59天的ttx/alu相比再次中度降低，并且与第34天的klh相比降低最少。它是在所观察的炎症的严重程度方面的最小降低，具有明显剂量反应。与第34天类似，ihc揭示在f027300252的所测试最高剂量下，对主要降低的cd3、cd8+、cd20和foxp3的作用最突出。
[0460]
总之，所述数据提供f027300252在组合的非人灵长类动物t细胞依赖性抗体应答(tdar)和迟发型超敏反应(dth)模型中的机制验证，所述f027300252是靶向tnfα和ox40l的新型多特异性isvd构建体，这通过测量ifn-γ和il4释放的klh诱导的离体elispot测定来确认。
[0461]
6.16实施例16：在异种移植物抗宿主病模型中对抗tnf/ox40lisvd构建体f027300252的评价。
[0462]
在异种移植物抗宿主病(异种gvhd)的模型中评价抗tnfα/ox40l isvd构建体f027300252的体内功效。在该模型中，将人外周血单核细胞(hpbmc)注射至被辐照的免疫受损的nod-scidil2rγ(缺陷型)(nsg)小鼠中(king等人(2009)，clin exp immunol.，157(1)：104-118)。植入的hpbmc以主要组织相容性复合物依赖性方式攻击鼠宿主，从而导致急
性gvhd的症状(brehm等人(2019)，faseb j.，33(3)：3137-3151)。
[0463]
将最小6周龄的雌性nsg小鼠均等地随机化至相应治疗组。在静脉内(iv)注射2x107个hpbmc之前一天，将小鼠用1gγ辐照。一周三次以操作者不知情的方式使用以下评分系统对动物进行单独评分(riesner等人(2016)，bone marrow transplant.，51(3)：410-417)：
[0464]
表16：
[0465][0466]
通过这些参数的总和来确定gvhd得分。在单个得分达到2或累积得分超过6时，处死动物。通过使用流式细胞术在宿主小鼠的外周血中测定所有cd45+细胞中的人cd45+细胞来评估hpbmc在宿主小鼠中的植入程度。在第1天开始，一周三次ip施用双特异性抗tnf/ox40l纳米抗体f027300252(10mg/kg)，并且与同种型治疗的对照动物相比较。在德国动物福利政府机关的许可下，按照sanofi的实验室动物福利委员会批准的研究方案，根据研究所实验动物使用与管理委员会的指南对所有动物进行给药和监测。
[0467]
为了在异种gvhd小鼠模型中验证作为isvd构建体的靶标的tnf和ox40l，在第1天开始，一周三次ip施用150nmol/kg抗人tnf isvd f027500018、150nmol/kg抗人ox40l isvd f027300044或双特异性抗tnf/ox40l isvd f027300252(150nmol/kg)，并且与同种型治疗的对照动物相比较。在hpbmc注射后两周内观察到宿主小鼠中gvhd的第一症状。在同种型治疗的对照动物中，gvhd得分随着研究进展持续增加，直到该组所有小鼠都被发现死亡或在达到上述人道终点时处死为止。tnf阻断仅对疾病发展具有轻度作用，而ox40l阻断能够显著改善疾病进展(图25)。通过用f027300252治疗实现的双重靶向导致与针对单独的ox40l阻断所观察到的类似的疾病发展。因此，f027500018治疗组的存活仅略微延长，而单独的f027300044或抗tnf/ox40l与f027300252的组合治疗导致进一步延长的存活(图26)。另外，使用f02730044或f027300252阻断ox40l倾向于抑制人cd45+细胞在宿主小鼠中的植入(图27)。
[0468]
为了在异种gvhd小鼠模型中评价双特异性抗tnf/ox40l isvd f027300252，收集另外的数据，并且从两项独立研究汇总结果。在hpbmc转移到小鼠中于几天内观察到gvhd发作。50％的仅接受同种型isvd的动物在转移后五周内发现死亡或达到中止标准。即使
f027300252治疗未防止疾病发作，它也能够改善疾病进展(图28)，并因此延长f027300252治疗的小鼠的存活。超过50％的动物在第9周后保持存活(图29)。在一些情况下，用f027300252治疗的小鼠能够从疾病恢复并存活至研究结束。此外，发现应用f027300252可抑制人cd45+细胞在宿主nsg小鼠中的植入(图30)，这与较慢疾病发展和延长的存活相关。
[0469]
总之，这些结果证实了ox40l阻断和f027300252治疗在异种gvhd小鼠模型中的功效。
[0470]
6.17实施例17：抗tnf抗体和双特异性抗tnfa/抗ox40l isvd构建体f027300252、f027301104、f027301189、f027301197和f027301199对人全血中pha诱导的il-8释放的抑制。
[0471]
对于测量抗tnfα单克隆抗体(mab)ra14956298(来自sanofi)以及双特异性抗tnfa/抗ox40l isvd f027300252、f027301104、f027301189、f027301197和f027301199(都来自sanofi)对抑制人全血中pha诱导的il-8释放的作用，将来自健康人供体的血液在作为抗凝剂的肝素钠[17iu/ml]的存在下抽至vacutainer采血管(bd#368480)中。将pha-l(植物血凝素-l；来自merck millipore；订单号#m5030)在无菌水中重构为储备液[1mg/ml]，并且制备含有[50μg/ml]pha-l的工作溶液。在pbs中以500nm制备阴性对照抗体ra11944493(sanofi；igg1同种型对照)、阳性对照抗体ra14956298(来自sanofi)、阴性对照v
hh
irr00119(来自sanofi/ablynx)和双特异性抗tnfa/抗ox40l isvd构建体f027300252、f027301104、f027301189、f027301197和f027301199(都来自sanofi/ablynx)。
[0472]
将抗体和isvd构建体以8pm至25nm之间的终浓度在培养基[rpmi-1640(来自gibco；订单号61870-010)+10％人ab-血清(来自sigma；订单号h3667)+1％penstrep(来自gibco；订单号15140-122)]中的连续稀释液以25μl添加至96孔微量板(v形底，pp；来自eppendorf；订单号0030601300)。将200μl人血液添加至每个孔并在板上加盖的情况下在室温下孵育30min。将pha-l在培养基[rpmi-1640+10％人ab-血清+1％penstrep]中稀释至50μg/ml的浓度，并且将培养基中25μl的该pha-l添加至96孔板的每个孔中的人血液与抗体或isvd构建体的预孵育混合物中。将样品温和地混合，将板用无菌盖(使用thermo scientific板密封器；订单号236366)密封，并且将板在37℃、5％co2、95％rh下孵育6h。孵育后，将血液样品以2000x g离心12min，加速和中断使用中间斜坡(middle ramp)。收获血浆上清液并在-80℃下储存于新的96孔微量板中，以供通过elisa进行进一步分析。根据制造商提供的方案，使用酶联免疫吸附测定(elisa；来自invitrogen；目录号88-8086)确定il-8的水平，用于人il-8的定量检测。在图31中基于来自3名不同血液供体的结果使用speed中的xlfit程序拟合剂量反应曲线并计算ic50值。
[0473]
将人全血与阴性对照抗体ra11944493或阴性对照v
hh irr00119一起孵育没有导致对pha诱导的il-8释放的任何抑制(数据未显示)。相反，将人全血与单特异性抗tnf单克隆抗体(mab)ra14956298一起孵育导致对pha诱导的il-8释放的强抑制，其中ic50为0.96nm(
±
0.08sem)(图31)。将人全血与双特异性抗tnfa/抗ox40l isvd构建体f027300252一起孵育导致甚至更强的对pha诱导的il-8释放的抑制，其中ic50为0.33nm(
±
0.09sem)(图31)。双特异性抗tnfa/抗ox40l isvd构建体f027301104、f027301197和f027301199还导致对pha诱导的il-8释放的强抑制，其中ic50值分别为0.8233(
±
0.4sem)、0.5667(
±
0.27sem)和0.3133(
±
0.08sem)(图31)。双特异性抗tnfa/抗ox40lisvd构建体f027301189具有最低效
力，其中ic50为2.143(
±
1.54sem)(图31)。
[0474]
7工业实用性
[0475]
本文所述的多肽、编码所述多肽的核酸分子、包含所述核酸的载体、和组合物可以用于例如治疗患有自身免疫疾病或炎性疾病的受试者。