一种香水莲花总黄酮及其提取方法与应用与流程

1.本发明涉及一种香水莲花总黄酮及其提取方法与应用，属于天然产物的提取 技术领域。


背景技术：

2.香水莲花(nymphaea hybrid)为睡莲科(nymphaeaceae)睡莲属(nymphaea) 水生宿根草本植物，其香味浓郁，颜色鲜艳，花朵硕大，是一种很好的观赏性植 物。香水莲花的主要活性成分包括黄酮类、酚酸类、生物碱类、木脂素和多糖类 等多种物质，具备抗氧化、抗菌、抗炎、抗辐射、降血糖、降血压的功效，将其 应用于功能性食品、医药和化妆品等行业具有广泛的应用前景。现有技术在提取 香水莲花总黄酮时，耗时久、提取率低、得到的香水莲花总黄酮的药理作用不明 显，并未发现一种提取效率高，具有更优抗氧化、抗炎效果的提取方法。


技术实现要素：

3.本发明解决的技术问题是：现有技术在提取香水莲花总黄酮时，存在耗时久、 提取率低、得到的香水莲花总黄酮的药理作用不明显等问题。
4.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种香水莲花总黄酮的提取方法，包 括如下步骤：
5.步骤1：将香水莲花粉、纤维素酶和乙醇混合，超声提取，过滤，取上清得 到香水莲花总黄酮粗提取液；其中，所述香水莲花粉与纤维素酶的质量比为 1:0.01～0.05；所述香水莲花粉与乙醇的质量体积比为1g:20～60ml；
6.步骤2：调节所得香水莲花总黄酮粗提取液的浓度至0.35～1.72mg/ml、ph 至2～6，得到上样液，将所述上样液上样于大孔树脂吸附柱上，洗脱，收集洗脱 液得到香水莲花总黄酮。
7.优选地，所述步骤1中的香水莲花粉为过40～60目筛后收集的香水莲花粉； 所述乙醇的浓度为40～60vt％。
8.优选地，所述步骤1中超声提取的功率为140～160w，温度为45～55℃，时 间为25～35min。
9.优选地，所述步骤1中过滤的方式为通过布氏漏斗抽滤。
10.优选地，所述步骤2中调节香水莲花总黄酮粗提取液的浓度所用的溶剂为蒸 馏水；所述调节香水莲花总黄酮粗提取液的ph所用的试剂为稀盐酸。
11.优选地，所述步骤2中大孔树脂吸附柱中填充的大孔树脂的型号为d-101、 ab-8、hp-20或nka-9。
12.优选地，所述步骤2中上样时大孔树脂吸附柱中的大孔树脂与上样液的质量 体积比为1g:14～24ml；所述上样液的流速为0.5～3ml/min。
13.优选地，所述步骤2中洗脱的溶剂为乙醇；所述乙醇的浓度为50～90vt％； 所述乙
醇的用量为上样液体积的0.5～1.5倍；所述洗脱的流速为0.5～3ml/min。
14.本发明还提供了上述的香水莲花总黄酮的提取方法提取得到的香水莲花总 黄酮。
15.本发明还提供了上述的香水莲花总黄酮在制备具有抗氧化和/或抗炎症的化 妆品或食品中的应用。
16.本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
17.1.本发明将超声提取和酶解法提取联用提取香水莲花总黄酮，具有效率高、 提取率高、绿色、安全和可持续的优点；
18.2.本发明的提取方法得到的香水莲花总黄酮的得率高，且提取得到的香水莲 花总黄酮经纯化后生理活性高，能有效清除dpph自由基、abts自由基，还对 透明质酸酶有明显的抑制作用，可添加在抗氧化、抗炎化妆品或食品中，具有良 好的应用前景。
附图说明
19.图1为香水莲花总黄酮对dpph自由基的清除能力；其中，nhe表示未经 纯化的香水莲花总黄酮粗提取液，nhep表示经过纯化的香水莲花总黄酮，vc 表示维生素c对dpph自由基的清除能力；
20.图2为香水莲花总黄酮对abts自由基的清除能力；其中，nhe表示未经 纯化的香水莲花总黄酮粗提取液，nhep表示经过纯化的香水莲花总黄酮，vc 表示维生素c对abts自由基的清除能力；
21.图3为香水莲花总黄酮对透明质酸酶的抑制率；其中，nhe表示未经纯化 的香水莲花总黄酮粗提取液，nhep表示经过纯化的香水莲花总黄酮，dg表示 甘草酸二钾对透明植酸酶的抑制能力。
具体实施方式
22.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
23.本发明提供了一种香水莲花总黄酮的提取方法，包括如下步骤：
24.(1)将香水莲花粉、纤维素酶和乙醇混合，超声提取，过滤，取上清得到 香水莲花总黄酮粗提取液；
25.(2)调节所述香水莲花总黄酮粗提取液的浓度和ph，得到上样液，将所述 上样液上样于大孔树脂吸附柱上，洗脱，收集洗脱液得到香水莲花总黄酮；
26.所述香水莲花粉与纤维素酶的质量比为1:0.01～0.05；
27.所述香水莲花粉与乙醇的质量体积比为1g:20～60ml；
28.所述调节所述香水莲花总黄酮粗提取液的浓度至0.35～1.72mg/ml；
29.所述调节所述香水莲花总黄酮粗提取液的ph至2～6。
30.在本发明中，所述香水莲花粉为过40～60目筛后收集的香水莲花粉；所述过 筛的目数优选为50目。
31.在本发明中，所述香水莲花粉的制备方法为：将香水莲花干燥、粉碎、过筛 得到香水莲花粉。
32.在本发明中，所述干燥优选为放入冻干机中，冷冻干燥，所述粉碎通过50 目筛实
现。
33.在本发明中，所述乙醇的浓度为40～60vt％，优选为50vt％；
34.所述香水莲花粉与乙醇的质量体积比优选为1g:30～50ml，进一步优选为 1g:40ml。
35.在本发明中，所述香水莲花粉与纤维素酶的质量比优选为1:0.02～0.04，进一 步优选为1:0.03。
36.在本发明中，所述超声提取的功率为140～160w，优选为150w；所述超声 提取的温度为45～55℃，优选为50℃；所述超声提取的时间为25～35min，优选 为30min。
37.本发明在所述过滤的方式为通过布氏漏斗抽滤。
38.在本发明中，所述调节香水莲花总黄酮粗提取液的浓度所用的溶剂为蒸馏 水；
39.所述调节香水莲花总黄酮粗提取液的ph所用的试剂为稀盐酸。
40.在本发明中调节上样液中香水莲花总黄酮的浓度和ph是为了增加大孔树脂 对香水莲花总黄酮的吸附量。
41.在本发明中，所述大孔树脂吸附柱中填充的大孔树脂的型号为d-101、ab-8、 hp-20或nka-9。
42.在本发明中，所述上样时大孔树脂吸附柱中的大孔树脂与上样液的质量体积 比为1g:14～24ml，优选为1g:19ml；
43.所述上样液的流速为0.5～3ml/min，优选为1～2.5ml/min，进一步优选为 1.75ml/min。
44.在本发明中，所述洗脱的溶剂为乙醇；
45.所述乙醇的浓度为50～90vt％，优选为60～80vt％，进一步优选为70vt％；
46.所述乙醇的用量为上样液体积的0.5～1.5倍；
47.所述洗脱的流速为0.5～3ml/min。
48.本发明还提供了所述的提取方法提取得到的香水莲花总黄酮。
49.本发明还提供了所述的香水莲花总黄酮在制备具有抗氧化和/或抗炎症的化 妆品或食品中的应用。
50.以下实施例和应用实施例中所述的香水莲花总黄酮的测定方法为：采用三氯 化铝显色法检测总黄酮含量。以75vt％乙醇做空白对照，测定425nm处的吸光 度。
51.标准品为芦丁标准品，根据吸光度(y)和浓度(x)得到的标准回归方程 为：y＝0.0078x-0.0008，r2＝0.9992。
52.总黄酮含量＝总黄酮质量(mg)/香水莲花粉末质量(g)。
53.实施例1
54.香水莲花干燥、粉碎，过50目药典筛，收集筛下组分得到香水莲花粉。
55.准确称取1g的香水莲花粉，0.01g纤维素酶，将香水莲花粉和纤维素酶加入 到40ml40vt％的乙醇中，在超声功率为140w，超声温度为50℃的条件下，超 声提取25min，布氏漏斗抽滤，取上清，得到香水莲花总黄酮粗提取液，测定香 水莲花总黄酮粗提取液中总黄酮的含量。
56.经过检测本实施例得到的香水莲花总黄酮粗提取液中总黄酮的含量为 26.4mg/g。
57.实施例2
58.香水莲花干燥、粉碎，过40目药典筛，收集筛下组分得到香水莲花粉。
59.准确称取1g的香水莲花粉，0.05g纤维素酶，将香水莲花粉和纤维素酶加入 到20ml60vt％的乙醇中，以超声功率为160w，超声温度为45℃的条件下，超 声提取35min，布氏漏斗抽滤，取上清，得到香水莲花总黄酮粗提取液，测定香 水莲花总黄酮粗提取液中总黄酮的含量。
60.经过检测本实施例得到的香水莲花总黄酮粗提取液中总黄酮的含量为 27.06mg/g。
61.实施例3
62.香水莲花干燥、粉碎，过50目药典筛，收集筛下组分得到香水莲花粉。
63.准确称取1g的香水莲花粉，0.03g纤维素酶，将香水莲花粉和纤维素酶加入 到60ml50vt％的乙醇中，以超声功率为150w，超声温度为55℃的条件下，超 声提取30min，布氏漏斗抽滤，取上清，得到香水莲花总黄酮粗提取液，测定香 水莲花总黄酮粗提取液中总黄酮的含量。
64.经过检测本实施例得到的香水莲花总黄酮粗提取液中总黄酮的含量为 26.62mg/g。
65.实施例4
66.称取5g d-101大孔树脂装于玻璃填柱中得到d-101大孔树脂吸附柱，备用。 用蒸馏水调节实施例1得到的香水莲花总黄酮的浓度为1.72mg/ml后，得到中 间液，用稀盐酸调节所述中间液的ph至6.0，得到上样液。取上样液120ml上 样于d-101大孔树脂吸附柱中，调节上样的流速为3ml/min，上样完成后，利 用90vt％的乙醇进行洗脱处理，乙醇的用量为120ml，洗脱的流速为3ml/min。 洗脱结束后收集洗脱液得到香水莲花总黄酮。
67.实施例5
68.称取5g ab-8大孔树脂装于玻璃填柱中得到ab-8大孔树脂吸附柱，备用。
69.用蒸馏水调节实施例2得到的香水莲花总黄酮的浓度为0.35mg/ml后，得 到中间液，用稀盐酸调节所述中间液的ph至2.0，得到上样液。取上样液100ml 上样于ab-8大孔树脂吸附柱中，调节上样的流速为1ml/min，上样完成后，利 用50vt％的乙醇进行洗脱处理，乙醇的用量为50ml，洗脱的流速为1ml/min。 洗脱结束后收集洗脱液得到香水莲花总黄酮。
70.实施例6
71.称取5g nka-9大孔树脂装于玻璃填柱中得到nka-9大孔树脂吸附柱，备 用。
72.用蒸馏水调节实施例3得到的香水莲花总黄酮的浓度为0.8mg/ml后，得到 中间液，用稀盐酸调节所述中间液的ph至4.0，得到上样液。取上样液70ml 上样于nka-9大孔树脂吸附柱中，调节上样的流速为0.5ml/min，上样完成后， 利用60vt％的乙醇进行洗脱处理，乙醇的用量为105ml，洗脱的流速为 0.5ml/min。洗脱结束后收集洗脱液得到香水莲花总黄酮。
73.应用实施例1对dpph自由基清除能力测定
74.将实施例1得到的香水莲花总黄酮粗提取液和实施例4得到的香水莲花总黄 酮分别配制成不同浓度的溶液，即浓度为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、 20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml和60μg/ml的溶液，分别取各浓度溶液2ml，与 2ml浓度为0.1mmol/l的dpph溶液
混合，得到不同浓度的样品溶液，用保鲜 膜封口，在25℃条件下黑暗反应30min后。于517nm下测定吸光度值，记为a。 以2ml无水乙醇和2ml蒸馏水混合作为空白组调零；以2ml样品溶液加上2ml 无水乙醇反应30min后的溶液作为空白对照组，其在517nm处的测得的吸光度 值为ai，空白对照组的作用是为了去除总黄酮样品本身存在的吸光度；以2ml 0.1mmol/ldpph溶液加上2ml无水乙醇作为模型对照组，在517nm处测得的吸 光度值记为a0。以浓度为横坐标，清除率为纵坐标绘制清除效果图，以vc对 dpph的清除为对照。结果如图1所示。
75.所述dpph溶液配置时的溶剂为无水乙醇。
76.清除率计算公式为:
77.dpph的清除率＝[1-(ai-a)/a0]
×
100％；
[0078]
a为2ml样品溶液加入2ml的dpph测得的吸光值；
[0079]
ai为2ml样品溶液加入2ml无水乙醇测得的吸光值；
[0080]
a0为2ml的dpph溶液加入2ml无水乙醇测得的吸光值。
[0081]
图1显示，香水莲花总黄酮粗提取液和香水莲花总黄酮都对dpph自由基有 一定的清除能力，但是纯化后的香水莲花总黄酮对dpph自由基的清除效果优于 未经纯化的香水莲花总黄酮粗提取液。这说明本发明纯化方法对香水莲花总黄酮 的纯化效果更优质。
[0082]
应用实施例2对abts自由基清除能力测定
[0083]
将浓度为7mmol/l的abts溶液与2.45mmol/l的过硫酸钾溶液按照体积比 1:1的比例进行混合，配制abts自由基的阳离子工作液，避光12～14h，从而激 发abts自由基。用pbs稀释abts自由基直至吸光值为0.7
±
0.02制成abts 工作液。
[0084]
将实施例2得到的香水莲花总黄酮粗提取液和实施例5得到的香水莲花总黄 酮分别配制成不同浓度的溶液，即浓度为1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml 和50μg/ml的溶液，分别取各浓度溶液0.09ml，分别加入0.11mlabts工作液， 混合均匀，避光37℃反应10min，于734nm处测定吸光值a；分别取上述各浓 度溶液0.09ml，分别加入0.11ml pbs溶液，避光37℃反应10min后，于734nm 处测得吸光值ai；再分别以0.11mlabts工作液和0.09ml去离子水反应，于 734nm处测得吸光值a0作为参比。以vc对abts的清除效果作为对照，结果 如图2所示。
[0085]
计算公式为:
[0086]
abts清除率＝[1-(ai-a)/a0]
×
100％；
[0087]
a为0.09ml样品溶液加入0.11ml的abts工作液的吸光值；
[0088]
ai为0.09ml样品溶液加入0.11ml pbs的吸光值；
[0089]
a0为0.11ml的abts溶液加入0.09ml去离子水的吸光值。
[0090]
图2显示，香水莲花总黄酮粗提取液和香水莲花总黄酮都对abts自由基有 一定的清除能力，但是纯化后的香水莲花总黄酮对abts自由基的清除效果优于 未经纯化的香水莲花总黄酮粗提取液。
[0091]
应用实施例3对透明质酸酶抑制率的测定
[0092]
(1)取0.1ml0.25mmol/l氯化钙溶液和0.5ml透明质酸酶溶液于37℃保温培 养20min；
[0093]
(2)加入不同浓度实施例3得到的香水莲花总黄酮粗提取液和实施例6得到 的香水莲花总黄酮0.5ml，继续37℃保温培养20min；
[0094]
(3)加入0.5ml透明质酸钠溶液，37℃保温培养30min，25℃放置5min；
[0095]
(4)加入0.1ml 0.4mol/l氢氧化钠溶液和0.5ml乙酰丙酮溶液，置于100℃水 中加热15min后，立即用冰水进行冷却5min；
[0096]
(5)加入埃尔利希试剂1.0ml，并用3.0ml无水乙醇进行稀释，25℃放置20min 显色，分光光度计测定585nm的吸光值，得到样品组吸光值。
[0097]
所述不同浓度为0.16mg/ml、0.32mg/ml、0.62mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml 和5mg/ml的溶液。
[0098]
利用浓度为0.1mol/l ph＝3.5的醋酸缓冲液代替香水莲花总黄酮溶液进行反 应，所得到的吸光值作为空白组，得到空白组的吸光值。
[0099]
利用浓度为0.1mol/l ph＝3.5的醋酸缓冲液代替透明质酸酶进行反应，所得 到的吸光值作为样品对照组的吸光值。
[0100]
利用浓度为0.1mol/l ph＝3.5的醋酸缓冲液的吸光度值作为空白对照组的吸 光值。
[0101]
以甘草酸二钾对透明植酸酶的抑制效果作为对照，结果如图3所示。
[0102]
所述透明质酸酶抑制率(％)＝[(a-b)-(c-d)]/(a-b)
×
100％，
[0103]
a为空白组的吸光值；
[0104]
b为空白对照组的吸光值；
[0105]
c为样品组的吸光值；
[0106]
d为样品对照组的吸光值。
[0107]
图3显示，香水莲花总黄酮粗提取液和香水莲花总黄酮都可抑制透明质酸 酶，但是纯化后的香水莲花总黄酮的抑制效果优于未经纯化的香水莲花总黄酮粗 提取液。
[0108]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的 限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下， 还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。