具有改善的稳定性的核酸分子及其用途的制作方法

本发明涉及一种用于诱导rna干扰的双链rna分子的结构特性，更具体地，涉及一种具有改善的稳定性的、用于诱导rnai的核酸分子结构及其用途。

背景技术：

1、rna干扰(rna

2、interference；rnai)是一种内源性机制，其中，由具有与靶基因同源序列的有义链和具有与其互补序列的反义链构成的双链rna(dsrna)以碱基序列特异性方式在转录后调节基因表达。这种机制在包括秀丽隐杆线虫(c.elegans)的从植物、果蝇和哺乳动物的真核生物中普遍存在。已知rna干扰现象发生的过程如下。当dsrna进入细胞时，dsrna与rna诱导沉默复合体(rna-induced silencing complex；risc)结合，然后只有反义(引导)链与mrna碱基序列互补结合，从而靶mrna被risc复合体中存在的核酸内切酶(endonuclease)结构域降解。

3、小干扰rna(small interfering rna；sirna)是一种长度约为19至29个核苷酸的双链rna，其可通过rnai途径特异性降解靶基因的mrna。sirna具有如此高的特异性且易于接近各种靶基因，并且一个sirna分子可降解多达1000个mrna，因此，sirna被认为是一种能够抑制靶基因表达的非常有效手段。由于这些优点，sirna作为基因治疗剂的有效性已通过各种临床试验进行评估，并在2018年8月，alnylam的sirna治疗剂(patisiran)为用于遗传性转甲状腺素介导(hattr)淀粉样变性成年患者的多发性神经病变的治疗剂，其作为首个rna干扰治疗剂获得美国fda批准。然而，尽管sirna具有很高的治疗潜力，但仍存在一些需解决的问题，例如，由于其尺寸小，易被血液中的酶降解，并迅速被肾脏消除而导致稳定性差，并且缺乏有效的靶向递送系统等。

4、为了解决这些问题，各种非病毒载体(carrier)如脂质体、脂质和聚合物已被广泛研究，特别地，阳离子聚合物由于可溶于水且具有高正电荷而容易与sirna结合，因此减少sirna从血液中分布的各种rnase的降解，从而提高sirna的递送效率。然而，阳离子物质由于其潜在的细胞毒性和诱导免疫反应而在临床应用中受到限制。因此，已经开发出替代策略，通过将各种部分诸如脂质、肽、聚合物或蛋白质直接缀合到sirna来将sirna递送到靶细胞。

5、另一方面，肽核酸(peptide nucleic acid；pna)是一种寡核苷酸类似物，其中dna的脱氧核糖骨架被伪肽骨架(pseudo-peptide backbone)取代(nieslsen等人，science，1991，254，1475)，pna中存在的每个亚基或单体都有一个附接至所述骨架的天然或非天然核碱基(nucleobase)。由于这些结构变化，pna具有对互补dna和pna表现出高亲和力、对核酸酶(nuclease)和蛋白酶(protease)具有抗性、以及在生物环境中具有高稳定性的优点。此外，与相应的dna/dna或rna/rna双链体相比，pna/dna或pna/rna双链体表现出更高的热力学稳定性，这由熔解温度(tm)确定。

技术实现思路

1、技术问题

2、作为本发明人为开发可显着改善体内稳定性而不显着影响靶基因抑制效率的方法而努力进行研究的结果，开发了pna与上述核酸分子结合的新型rnai诱导核酸分子结构，并在此基础上完成了本发明。

3、因此，本发明的目的在于提供一种用于诱导rnai的核酸分子，其包括双链rna分子；以及与所述rna分子结合的pna。

4、此外，本发明的另一目的在于提供一种用于诱导rnai的复合物，其包括所述核酸分子；以及胞内载体。

5、另外，本发明的又一目的在于提供一种用于抑制基因表达的组合物，其包括所述复合物。

6、然而，本发明所要解决的技术问题并不局限于上述问题，本领域技术人员将从以下描述中清楚地理解其他未提及的问题。

7、技术方案

8、为达到本发明的上述目的，本发明提供一种用于诱导rnai的核酸分子，包括：双链rna分子，由第一链和第二链构成，所述第一链包括与靶核酸互补的区域，其长度为15至49个核苷酸，所述第二链与所述第一链形成互补键，且其长度为21至62个核苷酸；以及肽核酸(peptide nucleic acid；pna)，与所述第一链结合，且其长度为6至13个核苷酸，

9、其中，所述pna的n末端结合至所述第一链的3'末端，并且

10、所述pna和所述第一链之间的结合区域由鸟嘌呤(guanine；g)或胞嘧啶(cytosine；c)碱基组成。

11、根据本发明一具体实施例，所述结合区域可包括选自由从所述第一链的3'末端起1至2个核苷酸的区域和从所述pna的n末端起1至2个核苷酸的区域构成的组中的一个或多个区域。

12、根据本发明另一具体实施例，所述第二链可在与所述pna结合位点以外的区域与所述第一链形成互补键。

13、根据本发明另一具体实施例，所述rna分子的第二链可具有由1至5个核苷酸构成的3'-突出端(overhang)。

14、根据本发明另一具体实施例，所述rna分子的特征在于核糖核苷酸的糖结构、所述核糖核苷酸的碱基结构或所述核糖核苷酸之间的结合位点中的一个或多个可被化学修饰。(modification)。

15、根据本发明另一具体实施例，所述化学修饰可为核糖核苷酸2'位的oh基团被h、or、r、卤素、sh、sr、nh2、nhr、nr2或cn取代，所述r可为c1-c6烷基、烯基或炔基。

16、根据本发明另一具体实施例，所述化学修饰可为用硼磷酸酯(boranophosphate)或硫代磷酸酯(phosphorothioate))取代骨架的磷酸二酯键。

17、根据本发明另一具体实施例，所述靶核酸可为选自由信使rna(mrna；messengerrna)、微小rna(microrna)、piwi-相互作用rna(pirna；piwi-interacting rna)、非编码rna(ncrna；non-coding rna)、编码dna序列和非编码dna序列组成的组中的任一种。

18、根据本发明另一具体实施例，所述核酸分子可具有改善的体内稳定性。

19、此外，本发明提供一种用于诱导rnai的复合物，其包括所述核酸分子；以及胞内载体。

20、根据本发明一具体实施例，所述胞内载体选自由阳离子聚合物、脂质、细胞穿透肽(cell penetrating peptide)和细胞靶向配体构成的组。

21、根据本发明另一具体实施例，所述细胞穿透肽的n末端可与构成所述核酸分子的pna的c末端相连。

22、另外，本发明提供一种用于抑制基因表达的组合物，其包括所述复合物。

23、此外，本发明提供一种基因表达抑制的方法，包括用所述复合物处理细胞。

24、并且，本发明提供所述复合物用于抑制基因表达的用途。

25、有益效果

26、根据本发明的用于诱导rnai的核酸分子可显着提高双链rna分子在体内的稳定性，同时保持对靶基因的抑制效率，因此，作为靶向各种基因的可扩展平台，该rna核酸分子有望替代现有的sirna分子，在研究领域和临床中有效地应用于各种疾病的诊断或治疗领域。

27、附图简单说明

28、图1a示出在本发明实施例中合成的pna-sirna核酸分子的结构，在该结构中，pna的n末端与sirna反义链的3'末端相连，并与有义链的5'末端部分形成互补键。

29、图1b示出在本发明实施例中合成的pna-sirna核酸分子的结构，在该结构中，pna的c末端与sirna反义链的5'末端相连，并与有义链的3'末端形成互补键。

30、图2a示出在sirna双链(duplex)和7mer pna以各种摩尔浓度比率(1：1至1：5)混合时验证复合物有否形成(complexation)的结果，并分析上述图1a(正向)和图1b(反向)结构的复合物有否形成。

31、图2b示出在sirna双链和10mer pna以各种摩尔浓度比率(1：1至1：5)混合时验证复合物有否形成的结果。

32、图2c示出在sirna双链和5mer pna以各种摩尔浓度比率(1：1至1：5)混合时验证复合物有否形成的结果。

33、图3a示出根据本发明对pna-sirna核酸分子实施通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native page)的血清稳定性分析的结果，并示出对pna-sirna复合物形式(complex form)执行非变性page后定量条带强度的结果。

34、图3b示出根据本发明对pna-sirna核酸分子实施通过非变性page的血清稳定性分析的结果，并示出对从中分离出pna的sirna双链形式(duplex form)执行非变性page后定量条带强度的结果。

35、图3c示出在从中获得上述图3a和3b的结果的分析中进行非变性page后的凝胶图像。

36、图4a示出根据pna在pna-sirna核酸分子中的位置(图1a和1b的结构)以及pna和反义链连接的结合区域的碱基序列的差异分析血清稳定性的结果，并示出对pna-sirna复合物形式执行非变性page后定量条带强度的结果。

37、图4b示出根据pna在pna-sirna核酸分子中的位置(图1a和1b的结构)以及pna和反义链连接的结合区域的碱基序列的差异分析血清稳定性的结果，并示出对从中分离出pna的sirna双链形式执行非变性page后定量条带强度的结果。

38、图4c示出在从中获得上述图4a和4b的结果的分析中进行非变性page后的凝胶图像。

39、图5a示出通过使用分别具有图1a的结构(#12)和图1b的结构(#13)的核酸分子根据pna位置的差异分析血清稳定性的结果，其中，pna与反义链连接的结合区域序列相同，但pna的位置不同，并示出对pna-sirna复合物形式执行非变性page后定量条带强度的结果。

40、图5b示出通过使用分别具有图1a的结构(#12)和图1b的结构(#13)的核酸分子根据pna位置的差异分析血清稳定性的结果，其中，pna与反义链连接的结合区域序列相同，但pna的位置不同，并示出对从中分离出pna的sirna双链形式执行非变性page后定量条带强度的结果。

41、图5c示出在从中获得上述图5a和5b的结果的分析中进行非变性page后的凝胶图像。

42、图6a示出根据具有与对应于所述图1a的结构相同的结构的pna-sirna核酸分子中pna的长度(5、7、10mer)分析血清稳定性的结果，并示出对pna-sirna复合物形式执行非变性page后定量条带强度的结果。

43、图6b示出根据具有与对应于所述图1a的结构相同的结构的pna-sirna核酸分子中pna的长度(5、7、10mer)分析血清稳定性的结果，并示出对从中分离出pna的sirna双链形式执行非变性page后定量条带强度的结果。

44、图6c示出在从中获得上述图6a和6b的结果的分析中进行非变性page后的凝胶图像。

45、图7示出为了分析pna-sirna核酸分子对sirna基因表达抑制效率的影响而进行体外(in vitro)基因表达抑制效率分析的结果。