专利名称：一种利用杂交技术将核酸应用于仿伪的方法
技术领域：
本发明公开一种利用核酸分子杂交技术将核酸应用于防伪的方法，属于生物防伪技术领域。
常用的防伪技术包括激光全息防伪、磁性防伪、条形码防伪、荧光防伪、隐形防伪、核隐形防伪、等离子隐形防伪、紫外光防伪、喷码防伪、温致变防伪、计算机编码防伪等等。
传统的防伪标记大多是物理或化学性质的制品，如光学变色膜、图象扰频、热变油墨、磁条、软件等。
目前国际上开始将生物技术利用于防伪上，形成了多样的生物防伪技术和相应的生物防伪标记。这些防伪技术主要采用抗原抗体反应原理，比一般的防伪技术准确、灵敏。由于抗原抗体是蛋白质，稳定性较差，尤其在高温环境中容易失活，从而降低防伪的灵敏度和可靠性。此外，抗原抗体反应变化少，一旦知道其中一种成分，就容易被仿制。
本发明的一个目的是在生物防伪的技术领域克服已有标记容易被仿制的缺陷，设计出将核酸密码分析技术应用于防伪的方法。
本发明的另一个目的是提供一种新的防伪标记及检测其真伪的方法。
本发明提供了一种新的防伪技术和防伪标记，其核心是生物大分子——核酸。一切生命的基本遗传物质(基因)都是核酸，也就是脱氧核糖核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)核酸是由四种碱基交互排列组成，其排列组合的差异，形成地球上生命类型的多样性。一条含有1000个碱基对(1kb)的DNA链就可能有10603种排列组合方式。现在自然界的生物种类(动植物和微生物)在一百万种以上，因此可以利用作防伪的天然生物基因数不胜数。每个物种基因级的长度一般均大于104至106kb。假若设定用1kb长度的核酸作防伪标记，则可供选择的核酸密码就有105×(104--106)＝1010--1012之多。因此核酸中所包含的的海量信息为防伪技术提供了取之不尽的来源。利用核酸密码序列这样巨大的信息量可以有数以亿万计的密码可用于防伪标记。
核酸的分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。
在进行分子杂交技术时，作为检测工具用的已知DNA或RNA序列片段称为杂交探针。单链DNA或RNA分子探针，只与其同源互补的DNA链杂交。当在某防伪标记内加入某种特定的DNA片段时，在辩伪过程中将DNA从防伪标记上洗脱下来，用该种DNA探针探测检验即可辩出真伪。
本发明是将筛选的一段核酸(可以是DNA，或是RNA)，以一定量(可少到10-8克)固定到固相载体上。固相载体可以是各种各样的材料，如各种天然或人造纤维制成的纸张或薄膜、多孔颗粒或粉末，天然或合成的皮革、塑料或各种有机或无机多聚体和树脂、固体石腊、天然或合成的无机物质如陶瓷、玻璃、水晶、金属、硅藻土等。各种油墨和涂料也可作为防伪核酸的载体。
为了达到保护固相载体上作为防伪标记的核酸的目的，可以在含有核酸的固相载体表面加上保护层，例如可用塑料薄膜，海藻糖等制成保护层。这种核酸防伪标记可固定在商品或物件上或其包装物及附属物上。
当需要检验辨别真伪时，将本发明的防伪标记揭去保护层，用缓冲液溶解固定在固相载体上的核酸。检测人员已知检测商品或物品上核酸防伪标记的种类，就可用特定的核酸分子杂交进行探测。
根据杂交结果与已知核酸探针的比较，即能判定防伪标记的真假。如能显示出杂交信号，则认为防伪标记为真。否则为假。
利用核酸制作防伪标记有如下优点1.不可仿制性首先核酸密码无色，肉眼难以看到，其次，密码来自自然界庞大的基因库，即使知道是基因的密码但不知是哪一种，仿冒者也无法破译和仿造。而对检验人员来说，只要以专用的分析方法测试，真伪则一目了然。
2.可靠性只有按预定的核酸密码设计的探针或PCR引物进行检验，才有可能探测出密码的存在与密码的种类，所以核酸密码具有极高的专一性。
3.多样性可以很容易设计出千万种核酸密码作为防伪标记，每种都有自身相应的探针和引物，互不通用。所以核酸密码可为多种多样的商品和物件分别提供独特的防伪标记体系。
4.稳定性核酸(特别是DNA)稳定，特别是干燥的DNA存放经久，不易分解，适于一些长期保存物件的防伪。
5.广泛的适用性核酸密码只需极微量(10-8-10-10克)存在于商品或物件中即可探测出来，因此适用于种类贵重的商品和物件。如科学仪器和家用电器；高档服装、家具及文体、文娱用品；高级烟酒、食品及营养品；农业和园艺的珍奇或重要种子；重要的证件和文件；经鉴定的珍贵文物和艺术品等等，几乎所有固态的物件上都可适用。
本发明提供一张附图
图1为核酸分子杂交法检验DNA防伪标记真伪，图中，A为空白(无DNA)；B为其他非特异DNA，10微克；C为CAT编码基因，0.02微克。
下面结合附图就利用核酸分子杂交技术将核酸应用于防伪提出一项实施例防伪标记是否可靠专一，取决于精确的辩伪检验方法。本实施例采用核酸分子杂交方法。DNA是两条走向相反而盘绕在一起的核苷酸链，为双螺旋结构。两条核苷酸链之间依赖腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)四种碱基上的氢键维系。因此，DNA-DNA或DNA-RNA链之间的结合即所谓的“分子杂交”，其稳定性完全取决于双链碱基之间的严格的互补性。即A与T互补，G与C互补。单链DNA或RNA分子探针，只与其同源互补的DNA链杂交。当在某防伪标记内加入某种特定的DNA片段时，在辩伪过程中将DNA从防伪标记上洗脱下来，用该种DNA探针探测真伪即可辩出真伪。其具体操作步骤如下1、样品处理从防伪标记洗脱DNA(约0.02微克)，浓缩后点在杂交用的硝基纤维膜或尼龙膜上；2、变性、中和膜上的DNA经0.5mol/L氢氧化钠变性，在用1mol/L缓冲液中和3、固相杂交经变性的DNA膜置于杂交液中，加入核酸探针(同位素探针或非同位素化学发光探针)，在55℃杂交液中4小时或过夜，再经过洗涤去除非特异结合的探针，最后用X光底片暴光；4、鉴定X光底片显影后，如在杂交膜点样的位置上存在显影斑点如图1(C)所示，即证明样品中含有预设的防伪DNA，若如图1(A，B)所示未出现斑点，则证明其为假冒的伪品或赝品。
需要说明的本实施例只是一个通例，不是固定的操作程序。实际操作中，常随DNA模板和引物设计上的不同而有所变化，否则不能达到预期结果。这种严格的操作条件对于防伪又极为有利，因防冒者不知反应条件，无从破译密码。
权利要求
1.一种利用核酸分子杂交技术将核酸应用于防伪的方法，其特征在于将核酸或其片断，固定在固相载体上用来作为防伪标记，利用核酸分子杂交技术检验真伪。
2.如权利要求1所述的防伪标记，其特征在于所述的防伪标记可直接固定在任何固态的物体上。
3.如权利要求1所述的防伪标记，其特征在于所述的防伪标记可以加覆塑料薄膜或海藻糖等保护层。
4.如权利要求1所述的固相载体，其特征在于所述的固相载体可以是天然或人造纤维、纸张、薄膜、皮革、塑料、多孔颗粒、粉末、树脂、固体石腊、陶瓷、玻璃等有机或无机的固态材料。
5.如权利要求1所述的检验防伪标记真伪的方法，其特征在于根据防伪标记上核酸的分子杂交检验结果与已知核酸探针结果的比较，即能判定防伪标记的真假。
全文摘要
本发明公开了一种新的将核酸应用于防伪的方法,将核酸制成防伪标记并利用核酸分子杂交技术检测出真伪。本发明还公开了以此技术制作防伪标记的方法。本发明还公开了这种新的方法的用途。
文档编号G01N33/50GK1360210SQ0012792
公开日2002年7月24日 申请日期2000年12月18日 优先权日2000年12月18日
发明者毛裕民, 谢毅 申请人:上海博德基因开发有限公司