专利名称：水解酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法
水解酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法
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权利要求
1.分离的、合成的或重组的核酸，其包括(a)，编码至少一种多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包括与下列具有至少约 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,95%、96%、97%、98%、99%、或更大、或完全的(100%)序列同一性的序列(i)SEQID N0:1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :13,SEQ ID NO :15,SEQ ID NO :17,SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :22 或 SEQ ID NO :23，或(ii)SEQID NO :1的核酸，其具有编码一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个、二十四个或更多个或所有的如表3、表4、表9、表10、表 11、表16或表23中所示的氨基酸变化(或其等同变化)的一个或多个核苷酸变化(或其等同变化)，其中所述(i)或(ii)的核酸编码至少一种具有水解酶活性的多肽，或者编码能产生水解酶特异性抗体的多肽或肽(充当表位或免疫原的多肽或肽)，(b)，(a)的核酸(多核苷酸)，其中所述序列同一性如下测定(A)通过用序列比较算法进行分析或通过视觉检查，或(B)在至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、 850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550 或更多个残基的区域内，或在cDNA、转录物(mRNA)或基因的全长区域内，(c)，(a)或(b)的核酸(多肽)，其中所述序列比较算法是BLAST第2.2. 2版算法，其中过滤设置被设置为blastall-p blastp-d "nr pataa"-F F，并且所有其它选项被设置为默认值，(d)，核酸(多核苷酸)，其编码至少一种具有水解酶活性的多肽或多肽，其中所述核酸包括在严格条件下与(a)、(b)或(c)的核酸的互补序列杂交的序列，其中所述严格条件包括在约65°C的温度下在0. 2X SSC中洗涤约15分钟的洗涤步骤，(e)，核酸(多核苷酸)，其编码至少一种具有水解酶活性例如脂肪酶、饱和酶、棕榈酸酶和/或硬脂酸酶活性的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO :2的序列或其酶促活性片段， 具有至少一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个、二十四个或更多个或所有的如表3、表4、表9、表10、表11、表16或表23中所示的氨基酸变化(或其等同变化)，(f)，核酸(多核苷酸)，其编码至少一种具有水解酶活性的多肽，其中所述多肽包括 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、 SEQ ID NO 14,SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18 或 SEQ ID NO 20 的序列或其酶促活性片段，(g)，(A)，(a)至(f)任一项的并且编码多肽的核酸(多核苷酸)，所述多肽具有至少一个保守性氨基酸置换并且保留其水解酶活性，或(B)，(g) (A)的核酸，其中所述所述至少一个保守性氨基酸置换包括用另一类似特征的氨基酸置换氨基酸；或者，保守性置换包括用另一脂肪族氨基酸替换脂肪族氨基酸；用苏氨酸替换丝氨酸或反之亦然；用另一酸性残基替换酸性残基；用另一含有酰胺基团的残基替换含有酰胺基团的残基；用另一碱性残基交换碱性残基；或用另一芳香族残基替换芳香族残基，(h)，(a)至(g)任一项的、编码多肽的核酸(多核苷酸)，所述多肽具有水解酶活性但缺少信号序列，(i), (a)至(h)任一项的、编码多肽的核酸(多核苷酸)，所述多肽具有水解酶活性，进一步包括异源序列，(j)，(i)的核酸(多核苷酸)，其中所述所述异源序列包括编码下列的序列或由编码下列的序列组成㈧异源信号序列；(B)，(A)的序列，其中所述异源信号序列得自异源酶；或者(C)标记、表位、靶向肽、可切割序列、可检测部分或酶，或(k)，核酸序列(多核苷酸)，其与(a)至(j)任一项的序列充分(完全)互补。
2.权利要求1的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述水解酶活性包括脂肪酶活性， 饱和酶、硬脂酸酶或棕榈酸酶活性，其中任选地，所述饱和酶活性包括选择性地水解至少60 %、61 %、62 %、63 %、64 %、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的饱和脂肪酸酯，其中任选地，水解的酯可以是饱和脂肪酸和甘油、伞形醇或其它醇的酯，其中任选地，所述棕榈酸酶活性包括选择性地水解脂肪酸，以使至少60^^61^^62%. 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的水解的脂肪酸是棕榈酸，或其中任选地，所述硬脂酸酶活性包括选择性地水解脂肪酸，以使至少60^^61^^62%. 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的水解的脂肪酸是硬脂酸。
3.权利要求1的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述水解酶活性包括(a)水解三酰基甘油成二酰基甘油和游离脂肪酸，或者水解三酰基甘油成单酰基甘油和游离脂肪酸，或水解二酰基甘油成单酰基甘油和游离脂肪酸，或水解单酰基甘油成游离脂肪酸和甘油，或包括水解三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)或单酰基甘油(MAG)，(b)从二酰基甘油或单酰基甘油和游离脂肪酸合成三酰基甘油，(c)合成1，3-二棕榈酰-2-油酰甘油(POP) ,1,3- 二硬脂酰-2-油酰甘油(SOS)、1-棕榈酰-2-油酰-3-硬脂酰甘油(POS)或1-油酰-2，3- 二肉豆蔻酰甘油(OMM)、长链多不饱和脂肪酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)，(d)水解酶活性，其是三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)或单酰基甘油(MAG)位置特异性的，其中任选地所述水解酶活性是Sn2-特异性的、Snl-或Sn3_特异性的，(e)水解酶活性，其是脂肪酸特异性的，其中任选地所述脂肪酸是棕榈酸、硬脂酸或其它饱和脂肪酸，(f)通过水解、醇解、酯化、酯交换或相互酯化来修饰油，(g)水解酶活性，其是区域特异性或化学选择性的，其中任选地所述水解酶活性包括合成对映异构体纯的手性产物，或(h)合成伞形基脂肪酸(FA)酯。
4.权利要求1的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述水解酶活性是热稳定的，其中任选地所述多肽在包括约-100°C至约-80°C、约-80°C至约-40°C、约_40°C至约-20°C、 约-20°C至约0°C、约0°C至约5°C、约5°C至约15°C、约15°C至约25°C、约25°C至约37°C、约 37°C至约 45"C、约 45°C至约 55"C、约 55°C至约 70°C、约 70°C至约 75"C、约 75°C至约 85"C、 约85"C至约90"C、约90"C至约95 V、约95 V至约100°C、约100 V至约105°C、约105°C至约 110°C、约 110°C 至约 120°〇温度范围内或者951、961、971、981、991、1001、1011、 102 "C >103 "C>104 "C>105 "C>106 "C>107 "C>108 "C>109 "C>110 °C、111 "C>112 "C>113 "C、 114°C、115°C或更高的温度的条件下保持脂肪酶活性。
5.权利要求1的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述水解酶活性是耐热的，其中任选地所述多肽在暴露于约-10(TC至约-80°c、约-80°c至约-40°c、约_40°C至约-20°C、 约-20°C至约0°C、约0°C至约5°C、约5°C至约15°C、约15°C至约25°C、约25°C至约37°C、约 37°C至约 45"C、约 45°C至约 55"C、约 55°C至约 70°C、约 70°C至约 75"C、约 75°C至约 85"C、 约85°C至约90"C、约90"C至约95°C、约95°C至约100°C、约100V至约105°C、约105°C至约 110°C、约 110°C至约 120°C范围内的温度或者 95"C、96°C、97°C、98°C、99°C、100°C、101°C、 102 "C >103 "C >104 "C >105 "C >106 "C >107 "C >108 "C >109 "C >110 °C、111 "C >112 "C >113 °C> 114°C、115°C或更高的温度后保持水解酶活性。
6.表达盒、载体或克隆运载体，其包括包含如权利要求1中所示序列的核酸，其中任选地所述克隆运载体包括病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体，其中任选地所述病毒载体包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，并且任选地所述克隆运载体包括细菌人工染色体(BAC)、质粒、噬菌体Pl衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。
7.转化的细胞，其包括包含如权利要求1中所示序列的核酸、或者如权利要求6中所示的表达盒、载体或克隆运载体，其中任选地所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、 酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
8.转基因非人动物，其包括如权利要求1中所示的序列，其中任选地所述动物是小鼠。
9.转基因植物，其包括如权利要求1中所示的序列，其中任选地所述植物是玉米植株、 高粱植株、马铃薯植株、番茄植株、小麦植株、油料种子植株、油菜籽植株、大豆植株、水稻植株、大麦植株、草或烟草植株。
10.转基因种子，其包括如权利要求1中所示的序列，其中任选地所种子是水稻、玉米种子、小麦仁、含油种子、油菜籽、大豆种子、棕榈仁、向日葵种子、芝麻种子、水稻、大麦、花生或烟草植物种子。
11.分离的、合成的或重组的多肽，其包括序列，该序列(a)，与下列具有至少约 50%、51 %、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更大、或具有 100% (完全的)序列同一性(i)SEQID NO :2的氨基酸序列，或其酶促活性片段，并且具有至少一个、二个、三个、 四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、 十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个、二十四个或更多个或所有的如表3、表4、表9、表10、表11、表16或表23中所示的氨基酸变化(或其等同变化)，或(ii)SEQID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :12,SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :16,SEQ ID NO :18 或 SEQ ID NO :20 的氨基酸序列，或其酶促活性片段，其中所述⑴或(ii)的多肽和肽具有水解酶活性，或者所述多肽和肽能产生水解酶特异性抗体(充当表位或免疫原的多肽或肽)，(b)，(a)的多肽和肽，其中所述序列同一性如下测定(A)通过用序列比较算法进行分析或通过视觉检查，或(B))在至少约 20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、150、200、 250,300或更多个氨基酸残基的区域内，或者在所述多肽或肽或酶的全长内，和/或在其酶促活性子序列(片段)内，(c)，(b)的多肽和肽，其中所述序列比较算法是BLAST第2.2. 2版算法，其中过滤设置被设置为blastall-p blastp-d "nr pataa"-F F，并且所有其它选项被设置为默认值；(d)，由权利要求1的核酸编码的氨基酸序列，其中所述多肽具有(i)水解酶活性，或 ( )具有免疫原活性，因为它能产生与具有(a)的序列和/或其酶促活性子序列(片段) 的多肽特异性结合的抗体；(e),(a)至(d)任一项的氨基酸序列，并且包括至少一个保守性氨基酸残基置换，并且所述多肽或肽保留水解酶活性；(f)，(e)的氨基酸序列，其中所述保守性置换包括用另一脂肪族氨基酸替换脂肪族氨基酸；用苏氨酸置换丝氨酸或反之亦然；用另一酸性残基替换酸性残基；用另一含有酰胺基团的残基替换含有酰胺基团的残基；用另一碱性残基交换碱性残基；或用另一芳香族残基替换芳香族残基，或其组合，(g),(f)的氨基酸序列，其中所述脂肪族残基包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成等同物；所述酸性残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成等同物；所述含有酰胺基团的残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成等同物；所述碱性残基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸或其合成等同物；或者，所述芳香族残基包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或其合成等同物；(h)，(a)至(f)任一项的多肽，其具有水解酶活性但缺少信号序列，(i)，(a)至(h)任一项的多肽，其具有水解酶活性，进一步包括异源序列，(j)，⑴的多肽，其中所述所述异源序列包括下列序列或由下列序列组成㈧异源信号序列；⑶，(A)的序列，其中所述异源信号序列得自异源酶；和/或(C)标记、表位、靶向肽、可切割序列、可检测部分或酶，或(m)，包括由权利要求1的核酸编码的氨基酸序列。
12.权利要求11的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述水解酶活性包括脂肪酶活性，饱和酶、硬脂酸酶或棕榈酸酶活性，其中任选地，所述饱和酶活性包括选择性地水解至少60 %、61 %、62 %、63 %、64 %、.95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的饱和脂肪酸酯，其中任选地，所述水解的酯可以是饱和脂肪酸和甘油、伞形醇或其它醇的酯，其中任选地，所述棕榈酸酶活性包括选择性地水解脂肪酸，以使至少60%、61 %、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%所述水解的脂肪酸是棕榈酸，或其中任选地，所述硬脂酸酶活性包括选择性地水解脂肪酸，以使至少60^^61^^62%. 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% orl00%所述水解的脂肪酸是硬脂酸。
13.权利要求11的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述水解酶活性包括(a)水解三酰基甘油成二酰基甘油和游离脂肪酸，或者水解三酰基甘油成单酰基甘油和游离脂肪酸，或水解二酰基甘油成单酰基甘油和游离脂肪酸，或水解单酰基甘油成游离脂肪酸和甘油，或包括水解三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)或单酰基甘油(MAG)，(b)从二酰基甘油或单酰基甘油和游离脂肪酸合成三酰基甘油，(c)合成1，3-二棕榈酰-2-油酰甘油(POP) ,1,3- 二硬脂酰-2-油酰甘油(SOS)、1-棕榈酰-2-油酰-3-硬脂酰甘油(POS)或1-油酰-2，3- 二肉豆蔻酰甘油(OMM)、长链多不饱和脂肪酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)，(d)水解酶活性，其是三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)或单酰基甘油(MAG)位置特异性的，其中任选地所述水解酶活性是Sn2-特异性的、Snl-或Sn3_特异性的，(e)水解酶活性，其是脂肪酸特异性的，其中任选地所述脂肪酸是棕榈酸、硬脂酸或其它饱和脂肪酸，(f)通过水解、醇解、酯化、酯交换或相互酯化来修饰油，(g)水解酶活性，其是区域特异性或化学选择性的，其中任选地所述水解酶活性包括合成对映异构体纯的手性产物，或(h)合成伞形基脂肪酸(FA)酯。
14.权利要求11的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述水解酶活性是热稳定的，其中任选地所述多肽在包括约-100°C至约-80°C、约-80°C至约-40°C、约_40°C至约-20°C、 约-20°C至约0°C、约0°C至约5°C、约5°C至约15°C、约15°C至约25°C、约25°C至约37°C、约 37°C至约 45"C、约 45°C至约 55"C、约 55°C至约 .70°C、约 70°C至约 75"C、约 75°C至约 85"C、 约85"C至约90"C、约90"C至约95 V、约95 V至约100°C、约100 V至约105°C、约105°C至约 110°C、约 110°C至约 120°C温度范围内或者 95°C、96°C、97°C、98°C、99°C、10(TC、10rC、 102 "C >103 "C >104 "C >105 "C >106 "C >107 "C >108 "C >109 "C >110 °C、111 "C >112 "C >113 °C> 114°C、115°C或更高的温度的条件下保持脂肪酶活性。
15.权利要求11的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述水解酶活性是耐热的，其中任选地所述多肽在暴露于约-100°C至约-80°C、约-80°C至约-40°C、约_40°C至约-20°C、 约-20°C至约0°C、约0°C至约5°C、约5°C至约15°C、约15°C至约25°C、约25°C至约37°C、约 37°C至约 45"C、约 45°C至约 55"C、约 55°C至约 70°C、约 70°C至约 75"C、约 75°C至约 85"C、约85°C至约90 V、约90 V至约95°C、约95°C至约100°C、约100 V至约105°C、约105°C至约 110°C、约 110°C至约 120°C 范围内的温度或者 95"C、96°C、97°C、98°C、99°C、100°C、101°C、 102 "C >103 "C >104 "C >105 "C >106 "C >107 "C >108 "C >109 "C >110 °C、111 "C >112 "C >113 °C> 114°C、115°C或更高的温度后保持水解酶活性。
16.权利要求11的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述水解酶活性包括每毫克蛋白约100至约1000单位范围内、每毫克蛋白约500至约750单位范围内、每毫克蛋白约500 至约1200单位范围内、或每毫克蛋白约750至约1000单位范围内的约37°C下的比活性。
17.权利要求11的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述多肽包含至少一个糖基化位点，其中任选地所述糖基化是N-连接的糖基化，并且任选地所述多肽在巴斯德毕赤酵母 (P. pastoris)或粟酒裂殖酵母(S. pombe)中表达后被糖基化。
18.权利要求11的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述多肽在包括PH3. 0、约？!1 3. 5、约 pH 4. 0、约 pH 4. 5、约 pH 5. 0、约 pH 5. 5、约 pH 6. 0、约 pH 6. 5、约 pH 7. 0、约 pH 7. 5、约 pH 8. Oj^JpH 8. 5、约 pH 9. Oj^JpH 9. 5、约 pH 10. Oj^JpH 10. 5、约 pH 11. OjApH 11. 5、约pH 12. 0或更大pH的条件下保留水解酶活性。
19.蛋白制剂，其包括如权利要求11中所示的多肽，其中所述蛋白质制剂包括液体、固体或凝胶。
20.异源二聚体，其包括如权利要求11中所示的多肽和第二结构域，其中任选地所述第二结构域是多肽，并且所述异源二聚体是融合蛋白，或者所述第二结构域是表位或标记。
21.同源二聚体，其包括如权利要求11中所示的多肽。
22.固定化多肽，其中所述多肽包括如权利要求11中所示的序列或其子序列，其中任选地所述多肽被固定化在细胞、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠子、凝胶、板、阵列或毛细管上。
23.阵列，其包括(i)如权利要求11中所示的固定化多肽。
24.分离的、合成的或重组的抗体，其与如权利要求11中所示的多肽特异性地结合，其中任选地所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
25.杂交瘤，其包括与如权利要求11中所示的多肽特异性地结合的抗体。
26.食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、饮食助剂或食品组合物，其包括如权利要求 11中所示的多肽或其子序列，其中任选地所述多肽被糖基化。
27.食用酶递送基质，其包括如权利要求11中所示的多肽，其中任选地所述递送基质包括丸粒，并且任选地所述多肽被糖基化，或者所述多肽具有耐热的或热稳定的水解酶活性。
28.产生重组多肽的方法，其包括如下步骤(a)提供与启动子可操作地连接的核酸， 其中所述核酸包括如权利要求1中所示的序列；和(b)在允许所述多肽表达的条件下表达步骤(a)的核酸，从而产生重组多肽，其中任选地所述方法进一步包括用步骤(a)的核酸转化宿主细胞，随后表达步骤(a) 的核酸，从而在转化细胞中产生重组多肽。
29.鉴定具有水解酶活性的多肽的方法，其包括下列步骤(a)提供如权利要求11中所示的多肽；(b)提供水解酶底物；和(C)将所述多肽与步骤(b)的底物接触并检测底物量的减少或反应产物量的增加，其中底物量的减少或反应产物量的增加检测出具有水解酶活性的多肽，其中任选地所述底物是脂肪酸、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)或单酰基甘油(MAG)。
30.增加水解酶多肽的耐热性或热稳定性的方法，所述方法包括糖基化水解酶多肽，其中所述多肽包括如权利要求11中所示的多肽的至少30个连续氨基酸，从而增加所述水解酶多肽的耐热性或热稳定性，其中任选地所述水解酶比活性在大于约-100°C至约115°C的范围内的温度下是热稳定的或耐热的。
31.洗涤剂组合物，其包括如权利要求11中所示的多肽，其中所述多肽包括水解酶活性，其中任选地所述水解酶是非表面活性水解酶或表面活性水解酶，或者任选地所述水解酶被配制成非水液体组合物、铸造固体、颗粒形式、微粒形式、压缩片、凝胶形式、粉末、凝胶、水凝胶、脂质体、气溶胶、糊或浆形式。
32.洗涤物体的方法，其包括下列步骤(a)提供包括具有水解酶活性的多肽的组合物，其中所述多肽包括如权利要求11中所示的多肽；(b)提供物体；和(c)在所述组合物可洗涤所述物体的条件下，将步骤(a)的多肽与步骤(b)的物体接触。
33.立体选择性地水解2-取代酸的酯的外消旋混合物的方法，其包括下列步骤(a)提供如权利要求11中所示的水解酶，其中所述水解酶是立体选择性的；(b)提供组合物，其包括2-取代酸的酯的外消旋混合物；和(c)在步骤(b)的所述多肽能选择性地水解所述酯的条件下，使步骤(a)的多肽与步骤 (b)的组合物接触，其中任选地所述水解酶被固定化，并且任选地所述2-取代酸包括2-芳氧基取代的酸、R-2- (4-羟基苯氧基)丙酸或2-芳基丙酸，其中任选地所述2-取代酸包括酮洛芬。
34.组合物，其包括如权利要求11中所示的水解酶、权利要求35的变体水解酶、或由权利要求37的方法所产生的酶，其中任选地所述组合物是食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、饮食助剂或食品组合物，并且其中任选地所述食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、饮食助剂或食品组合物进一步包括包含脂肪或者脂肪和无或极少水解酶的营养基料，或者任选地所述水解酶通过胆汁盐激活，或者任选地所述食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、饮食助剂或食品组合物进一步包括牛奶基婴儿配方，或者任选地所述水解酶能水解长链脂肪酸。
35.产生核酸变体的方法，所述核酸变体编码具有水解酶活性的多肽，所述方法包括下列步骤(a)提供如权利要求1中所示的模板核酸；和(b)修饰、缺失或添加所述模板序列中的一个或多个核苷酸，或其组合，产生所述模板核酸的变体，其中任选地所述方法进一步包括表达所述变体核酸以产生变体水解酶多肽，并且任选地所述修饰、添加或缺失通过包括易错PCR、改组、寡核苷酸定向突变、装配 PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体突变、位点特异性诱变、 基因位点饱和诱变^1(GSSMsm)、合成连接重装配(SLR或GeneReassembly)和其组合在内的方法引入，或者所述修饰、添加或缺失通过包括重组、回归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA 诱变、含有尿嘧啶模板的诱变、缺口双重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成和其组合在内的方法引入。
36.权利要求35的方法，其中所述方法被迭代重复直至(a),(i)产生水解酶，其具有与由所述模板核酸编码的多肽相比改变的或不同的活性或改变的或不同的稳定性其中任选地所述变体水解酶多肽是耐热的，并在暴露于高温后保持一些活性，或者任选地所述变体水解酶多肽相比由所述模板核酸编码的水解酶具有增加的糖基化，或者任选地所述变体水解酶多肽在高温下具有水解酶活性，其中所述由所述模板核酸编码的水解酶在高温下不具有活性，( )产生水解酶编码序列，其具有与所述模板核酸相比改变的密码子使用， 其中任选地所述方法被迭代重复直至产生水解酶基因，所述水解酶基因具有比所述模板核酸更高或更低的信息表达水平或稳定性，或(iii)产生水解酶，其具有改变的底物特异性或底物优先性，其中任选地所述变体水解酶的底物特异性或底物优先性包括从油中优先或增加的棕榈酸水解，或者所述变体水解酶的底物特异性或底物优先性包括从油中优先或增加的硬脂酸水解，或者所述变体水解酶的底物特异性或底物优先性包括从油中优先或增加的棕榈酸和硬脂酸水解，或(b),(a)的水解酶，其中所述变体具有至少一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、 二十个、二十一个、二十二个、二十三个、二十四个或更多个或所有的如表3或表4中所示的氨基酸残基变化(或其等同变化)。
37.制备具有改变的底物特异性或底物优先性的酶的方法，其包括(a)提供如权利要求11中所示的亲本水解酶；和(b)对所述亲本水解酶产生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多个氨基酸残基修饰，其中任选地所述氨基酸残基修饰对应于如表3或表4中所示的对SEQ ID N0:2的氨基酸序列突变(或其等同突变)，从而产生具有改变的底物特异性或底物优先性的酶，其中任选地所述改变的底物特异性或底物优先性包括优先或增加的棕榈酸水解， 其中任选地所述改变的底物特异性或底物优先性包括优先或增加的硬脂酸水解， 其中任选地所述改变的底物特异性或底物优先性包括优先的脂肪酸水解，其中任选地所述脂肪酸是饱和脂肪酸，其中任选地所述脂肪酸是亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸或硬脂酸。
38.脂肪酶，其包括如SEQID NO :2中所示的氨基酸序列但还包括(a)至少一个氨基酸残基修饰 A48C ；D49R ；D61A ；D61E ；R72E ；R72K ；V83M ；R85Y ；E95K ； E116A ；E116I ；E116L ；E116N ；E116Q ；E116R ；E116T ；E116V ；S133A ；A144I ；E149H ；A150I ； I151G ；I151A ；P162G ；P162K ；V163R ；D164R ；R172H ；R172L ；A225S,或其等同修饰，或其组合；(b)至少一个密码子修饰(GCG)35 (GCT) ； (GGC) 45 (GGA) ； (GCG) 92 (GCT)、 (GTG)102 (GTT) ； (AGC)108 (AGT) ； (CTG)117 (CTT) ； (CTG)124 (TTG) ； (CGG)126 (AGG)； (GTC) 128 (GTG) ； (AGT) 133 (TCT) ； (TTC) 135 (TTT) ； (GTG) 183 (GTT) ； (ACC) 188 (ACG)，或其等同修饰，或其组合；或(c)，(a)的脂肪酶，其进一步包括至少一个密码子修饰(GCG)35 (GCT) ； (GGC) 45 (GGA)； (GCG) 92(GCT)、(GTG)102 (GTT) ； (AGC)108 (AGT) ； (CTG)117 (CTT) ； (CTG)124 (TTG)； (CGG)126 (AGG) ； (GTC)128 (GTG) ； (AGT)133 (TCT) ； (TTC)135 (TTT) ； (GTG)183 (GTT)； (ACC) 188 (ACG)，或其等同修饰，或其组合。
39.脂肪酶，其包括如SEQID NO :2中所示的氨基酸序列但还包括至少一个氨基酸残基修饰 I20L ；V62S ；G77P ；V83C ；D88H ；Y113G ；E116T ；E116G ；H140K ；K146S ；I167S ；L180E ； E194M ；A211Q ；S212Y ；G215C ；G215V ；G215W ；A218H ；A218S ；V223A ；A225M ；A225Q,或其等同修饰，或其组合。
40.权利要求38或39的脂肪酶，其中所述新脂肪酶的底物特异性或底物优先性包括与 “亲本”SEQ ID NO :2相比优先或增加的脂肪酸水解，其中任选地所述脂肪酸是亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸或硬脂酸。
41.化妆品或面霜，其包括权利要求38或权利要求39的脂肪酶或如权利要求11中所示的多肽。
42.药品、脂质体、药片、胶囊、制剂或药物递送剂，其包括权利要求38或权利要求39的脂肪酶或如权利要求11中所示的酶。
全文摘要
提供的是水解酶，包括脂肪酶、饱和酶、棕榈酸酶和/或硬脂酸酶，编码它们的多核苷酸以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。另外提供的是多肽，例如酶，其具有水解酶活性，例如，脂肪酶、饱和酶、棕榈酸酶和/或硬脂酸酶活性，以及制备低饱和或低反式脂肪油的方法，诸如低饱和或低反式脂肪动物或植物油，例如大豆油或油菜油。
文档编号C07H21/00GK102197043SQ200980142971
公开日2011年9月21日 申请日期2009年8月28日 优先权日2008年8月29日
发明者N·R·巴顿, A·布埃诺, J·昆卡, T·希契曼, K·A·克兰, J·里昂, M·L·米勒, M·A·沃尔, C·L·G·戴顿 申请人:维莱尼姆公司