一种雷公藤提取成分脂质体在制备鼻腔给药防治脂多糖诱导的行为认知障碍药物中的应用

本发明涉及医药领域，特别是一种雷公藤提取成分脂质体在制备鼻腔给药防治脂多糖诱导的行为认知障碍药物中的应用。

背景技术：

大脑由于复杂的内部结构在产生炎症反应时，很难能够自我精准调控，往往因反应紊乱而出现头痛、眩晕、耳疼等症状，药物常可缓解，而长期慢性炎症则可能会引起中枢神经系统疾病，造成学习记忆功能下降、肢体不协调等行为认知障碍，这种症状在很多疾病中常见，如阿尔茨海默病(ad)、帕金森疾病(pd)等。近年来有大量研究表明神经炎症是导致多种脑部疾病认知障碍发生的重要原因，当感染和炎症发生时，脑部皮质和海马区的tnf-α、il-1β等相关炎症指标表达升高水平与炎症感染严重程度一致，因而可以用来判断神经炎症程度，水迷宫检测空间位置感和方向感的学习记忆能力可以反应认知程度。

从雷公藤去皮根部提取的脂溶性成分混合物雷公藤多苷(又名雷公藤总苷)已制成片剂，作为一种天然的非甾体类免疫抑制剂，其生理活性由多种成分(二萜内酯、生物碱、三萜等)协同产生，广泛应用于临床治疗各类炎症相关疾病，如类风湿性关节炎，风湿性关节炎，肾小球肾炎，肾病综合征，红斑狼疮，口眼干燥综合征，各类皮肤病等。雷公藤多苷中二萜类化合物的代表性成分雷公藤甲素是目前认为最具有药效但毒性也是最强的活性成分，已成为国内外追捧的热点研究药物之一。研究表明，雷公藤甲素对炎症过程中血管通透性增加、炎症因子的产生和释放及炎症后期的纤维增生等具有明显的抑制作用。雷公藤红素是一个具有多种生物活性的天然产物，现代研究表明：它有很强的抗氧化作用，有抗癌症新生血管生成作用，有抗类风湿作用。但是目前尚无雷公藤提取成分脂质体经鼻腔给药治疗脂多糖诱导的行为认知障碍药物中的报道。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种雷公藤提取成分脂质体在制备鼻腔给药防治脂多糖诱导的行为认知障碍药物中的应用，可有效解决制备雷公藤提取成分脂质体经鼻腔给药治疗脂多糖诱导的行为认知障碍药物的问题。

为实现上述目的，本发明解决的技术方案是，一种雷公藤提取成分脂质体在制备鼻腔给药防治脂多糖诱导的行为认知障碍药物中的应用。

所述的雷公藤提取成分为雷公藤多苷、雷公藤甲素或雷公藤红素。

所述的雷公藤提取成分脂质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)、称取重量计的：40份大豆卵磷脂、10份胆固醇和1份雷公藤提取成分，用有机溶剂二氯甲烷超声溶解5-10min，在40℃恒温水浴中，20rpm旋转减压蒸发20min，得均匀的类脂薄膜；

(2)、将类脂薄膜真空下干燥4h，再加入25000份重量体积比的磷酸盐缓冲液pbs，常温搅拌4h，置于100w超声5min，然后用手动挤压器依次过200nm、100nm的滤膜，采用50000mwco的超滤管二次超滤后，取上液，即为雷公藤提取成分脂质体；

所述的重量体积比为固体以g计，液体以ml计。

本发明能够显著抑制脑神经炎症反应，缓解脂多糖诱导的行为认知障碍，是防治认知障碍相关疾病药物的创新，社会和经济效益巨大。

附图说明

图1是本发明实验中各组小鼠morris水迷宫空间探索实验游动轨迹图；

其中a为正常组，b为假手术组，c为模型组，d为雷公藤甲素脂质体低剂量组，e为雷公藤甲素脂质体中剂量组，f为雷公藤甲素脂质体高剂量组。

具体实施方式

以下结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明在具体实施中，所述的雷公藤提取成分脂质体是：

(1)、称取重量份40份大豆卵磷脂、10份胆固醇和1份雷公藤多苷，用有机溶剂二氯甲烷超声溶解5-10min，在40℃恒温水浴中，20rpm旋转减压蒸发20min，得均匀的类脂薄膜；

(2)、将类脂薄膜真空下干燥4h，再加25000份重量体积比的磷酸盐缓冲液pbs，常温搅拌4h，置于100w超声5min，然后用手动挤压器依次过200nm、100nm的滤膜，采用50000mwco的超滤管二次超滤后，取上液，即为雷公藤多苷脂质体；

所述的重量体积比为固体以g计，液体以l计。

实施例2

本发明在具体实施中，雷公藤提取成分脂质体是：

(1)、称取重量份40份大豆卵磷脂、10份胆固醇和1份雷公藤甲素，用有机溶剂二氯甲烷超声溶解5-10min，在40℃恒温水浴中，20rpm旋转减压蒸发20min，得均匀的类脂薄膜；

(2)、将类脂薄膜真空下干燥4h，再加入25000份重量体积比(同上)的磷酸盐缓冲液pbs，常温搅拌4h，置于100w超声5min，然后用手动挤压器依次过200nm、100nm的滤膜，采用50000mwco的超滤管二次超滤后，取上液，即为雷公藤甲素脂质体。

实施例3

本发明在具体实施中，雷公藤提取成分脂质体是：

(1)、称取重量份40份大豆卵磷脂、10份胆固醇和1份雷公藤红素，用有机溶剂二氯甲烷超声溶解5-10min，在40℃恒温水浴中，20rpm旋转减压蒸发20min，得均匀的类脂薄膜；

(2)、将类脂薄膜真空下干燥4h，再加入25000份重量体积比(同上)的磷酸盐缓冲液pbs，常温搅拌4h，置于100w超声5min，然后用手动挤压器依次过200nm、100nm的滤膜，采用50000mwco的超滤管二次超滤后，取上液，即为雷公藤红素脂质体。

根据上述方法通过工业化生产制得任意量的雷公藤提取成分脂质体，并经反复实验，均取得了相同和相近似的结果，方法稳定可靠，所得雷公藤提取成分脂质体制备鼻腔给药防治脂多糖诱导的行为认知障碍药物，有效解决经鼻腔给药治疗脂多糖诱导的行为认知障碍药物的用药治疗问题，并经试验得到了充分证明，以实施例1为例，有关试验资料如下：

一、实验材料与动物

脂多糖(lipopolysaccharides，lps)购自sigma公司；二甲基亚砜(dmso)购自上海麦克林生化科技有限公司；胆固醇购自北京百灵威科技有限公司；雷公藤甲素购自于西安昊轩公司。c57bl/6j小鼠，雄性，spf级，18～22g，购置郑州市惠济区华兴实验动物养殖场，生产许可证号：scⅹk(豫)20190002。

二、实验方法(以雷公藤甲素脂质体为例，即实施例1)

1、雷公藤甲素脂质体的制备

分别称取重量份40份大豆卵磷脂、10份胆固醇和1份雷公藤甲素，用有机溶剂二氯甲烷超声溶解5-10min，在40℃恒温水浴中，20r/min旋转减压蒸发20min，形成均匀的类脂薄膜，真空干燥4h；再加入25份重量体积比的磷酸盐缓冲液pbs，常温搅拌4h后，置于100w超声5min，用手动挤压器依次过200nm、100nm的滤膜，采用50000mwco的超滤管二次超滤后上液，即为雷公藤甲素脂质体。

使用透射电子显微镜观察脂质体的形态，粒径分析仪测得脂质体平均粒径；使用高效液相色谱法测得药物含量，计算包封率，公式为：c包％＝c包入的药物量/c总加入的药物量×100％。将制备的雷公藤甲素脂质体放于4℃冰箱中储存，在3d、7d及14d取样观察其是否澄清透明、检测其粒径大小及分布情况。

2、造模：双侧海马ca1区脑立体定位注射lps

经异弗烷麻醉的小鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，参照《themousebrain》选小鼠双侧海马ca1区为注射区，定位于前囟后(y)2.2mm，左右中线(x)放开2mm，垂直牙科钻钻一小空，垂直插入微量注射器，留针5min后，注射lps，注射后留针5min，缓慢起针。结束

后使用可吸收缝合线进行无菌缝合，之后使用红霉素软膏涂抹伤口进行封闭，防止感染，同时使用红外线理疗灯照射3-5h缓解疼痛，保持体温恒定。

3、分组给药

a：正常组(或称正常对照组)，b：假手术组(同体积注射生理盐水)，c：模型组；d：雷公藤甲素脂质体低剂量组(64μg/kg，即根据小鼠体重确定雷公藤甲素脂质体中雷公藤甲素的用量)，e：雷公藤甲素脂质体中剂量组(96μg/kg)，f：雷公藤甲素脂质体高剂量组(128μg/kg)，每组10只，用10μl移液枪吸取10μl药物溶液，将小鼠抓起仰卧位持平，小心在左侧鼻孔稍外侧缓慢滴加，随呼吸吸入后，放下自由活动再给药下一只，全部小鼠左侧给药结束后再进行右侧给药，20μl/次，每天给药两次，即40μl/只/天，连续给药21d。

4、水迷宫的检测：给药第15d进行水迷宫训练，前5d为训练期，从不同的4个象限放入小鼠自由游动1min，记录逃避潜伏时间，第6d撤掉平台，从平台对面放入小鼠，记录在平台区域所占时间和穿越平台次数。

5、小鼠的海马和皮质匀浆后提取mrna表达量的测定

5.1总rnas的提取：①麻醉后处死小鼠，取出完整大脑放置于冰盒上，将左右脑切开，分离海马及皮质标记液氮冻存备用；②取适量皮质或海马于无酶离心管，加入trizol充分研磨匀浆；③再加入200ul氯仿溶液，盖紧样品管盖，用力摇晃15秒，室温下静置10-15min；④12000rpm冷冻离心机中离心10min，小心取出分三层的裂解混合物，其中rna位于上层液中，小心吸出并移至干净的ep管中(注意不要吸到中间的白色絮状物)；⑤加入500ul异丙醇混匀，室温静置10min，4℃12000rpm离心10min，可见胶白色状沉淀附于ep管管底，即为rna；⑥弃去上清，加入1ml75％乙醇，摇晃混匀，洗涤沉淀，4℃5000rpm离心5min，弃上清，干燥rna沉淀。⑦加适量depc水，溶解沉淀，检测rna浓度及纯度。

5.2rna的逆转录，采用碧云天逆转录试剂盒，按说明书进行。

5.3mrna的定量分析，采用appliedbiosystems试剂盒检测：

以目标mrna/gapdhmrna相对表达量作为各组目标mrna的相对含量。

6、统计学分析

数据采用graphpadprism6.0统计学软件处理并分析实验结果，计量资料采用平均数±标准差(mean±sd)表示，p<0.05具有统计学意义。

三、实验结果

1.行为学水迷宫检测，如表1-表2所示；

注：与正常组相比，^*p<0.05，^***p<0.001，^****p<0.0001，与模型组相比，^#p<0.05，^##p<0.01，^###p<0.001，^####p<0.0001。

表1各组小鼠前5天逃避潜伏期表

表2各组小鼠空间探索能力比较

2.各组小鼠皮质及海马中炎症相关目标mrna的相对含量如表3～6所示。

注：与正常对照组相比，^*p<0.05，^***p<0.001，^****p<0.0001，与模型组相比，^#p<0.05，^##p<0.01，^###p<0.001，^####p<0.0001。

表3各组小鼠海马和皮质中tnf-αmrna的相对含量

表4各组小鼠海马和皮质中il-1βmrna的相对含量

表5各组小鼠海马和皮质中il-6mrna的相对含量

表6各组小鼠海马和皮质中cox-2mrna的相对含量

本发明按上述实验方法，对本发明实施例2-3进行了实验，均取得了相同或相近似的结果，这里不再一一列举。

三、结论

脑立体定位注射脂多糖是常用的致行为认知障碍的造模模型，脑皮质和海马中tnf-α、il-1β等炎症相关指标的表达水平可以反应炎症轻重程度，水迷宫检测空间位置感和方向感的学习记忆能力可以反应认知程度。本发明实验结果中，与对照组相比，模型组炎症相关指标的表达水平显著升高，水迷宫前5天逃避潜伏期未见缩短，表明造模成功。与模型组相比，不同剂量雷公藤甲素脂质体组相关炎症指标水平显著降低，且呈现剂量依赖性，说明雷公藤甲素脂质体能够显著抑制脑神经炎症反应，缓解脂多糖诱导的行为认知障碍，对神经细胞有一定保护作用，水迷宫前5天逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数增多，结合脂质体结构优势及鼻腔给药途径，具有拓宽开发脑神经炎症造成行为认知障碍相关疾病药物的应用前景，是防治认知障碍相关疾病药物上的创新，开拓了治疗认知障碍的新途径，社会和经济效益巨大。

1序列表

<110>河南中医药大学

<120>一种雷公藤提取成分脂质体在制备鼻腔给药防治脂多糖诱导的行为认知障碍药物中的应用

<140>2021100961102

<141>2021-01-25

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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