辣蓼黄酮乙酸乙酯部分在抗猪伪狂犬病毒中的应用及抗猪伪狂犬病毒的药物

1.本发明涉及抗猪伪狂犬病毒技术领域，尤其是涉及辣蓼黄酮乙酸乙酯部分在抗猪伪狂犬病毒中的应用及抗猪伪狂犬病毒的药物。


背景技术：

2.猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus，prv)属于疱疹病毒属的ⅰ型疱疹病毒，可感染多种动物，造成体温升高、瘙痒、神经症状等。猪是prv的唯一自然宿主，隐性感染猪可长期不断向外界排毒，导致prv在猪场长期流行，难以彻底根除。prv可感染不同年龄阶段的猪，造成15日龄仔猪100％死亡，断奶仔猪40％发病，成年育肥猪生长停滞，以及母猪流产、产木乃伊胎和死胎等现象。一些欧美国家已根除猪伪狂犬病，我国自2011年在部分接种过bartha-16弱毒活疫苗的养殖场暴发了猪伪狂犬病，造成了重大经济损失，经检测发现是由变异强毒株引起的，bartha-16疫苗对prv-he n1的攻击仅提供50％免疫保护。已有研究表明，中药提取物具有抑制prv感染的作用，但其成分复杂，且抗病毒活性不强。
3.筛选能有效抵抗病毒感染的中草药成分，研制新型抗病毒中药成为目前研究的热点。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供辣蓼黄酮乙酸乙酯部分在抗猪伪狂犬病毒中的应用和抗猪伪狂犬病毒的药物。
5.本发明提供了辣蓼黄酮乙酸乙酯部分在抗猪伪狂犬病毒中的应用。
6.优选地，辣蓼黄酮乙酸乙酯部分为体外抗猪伪狂犬病毒。
7.优选地，辣蓼黄酮乙酸乙酯部分通过直接灭活猪伪狂犬病毒、抑制猪伪狂犬病毒增殖、阻断猪伪狂犬病毒作用方式中的一种或多种抗猪伪狂犬病毒；
8.优选地，辣蓼黄酮乙酸乙酯部分通过直接灭活猪伪狂犬病毒、抑制猪伪狂犬病毒增殖作用方式中的一种或两种抗猪伪狂犬病毒。
9.本发明提供了一种包含辣蓼黄酮乙酸乙酯部分的抗猪伪狂犬病毒的药物。
10.优选地，所述药物中辣蓼黄酮乙酸乙酯部分的浓度为25～200μmol/l。
11.优选地，所述药物中辣蓼黄酮乙酸乙酯部分的浓度为100～200μmol/l。
12.优选地，所述辣蓼黄酮乙酸乙酯部分是通过以下方法获得：用酶解-超声偶联法提取辣蓼全草中的总黄酮，再用乙酸乙酯进行萃取，分离杂质，结合大孔树脂纯化富集获得辣蓼黄酮乙酸乙酯部分。
13.黄酮类活性成分具有抗病毒作用，研究发现黄芩苷和紫苏黄酮均能抑制流感病毒的活性，毛地黄黄酮能抑制prv感染raw264.7细胞，减轻炎性反应。黄酮类化合物是蓼属植物的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、调节免疫系统功能等作用。我国蓼属植物约有120种，如扁蓄(polygonum aviculare l.)、虎杖(polygonum cuspidatum)、何首
乌(polygonum divaricatum l.)、拳参(polygonum bistorta l.)等，在医药、兽药、食品添加剂等方面均有良好应用，但对于广泛分布于广西、贵州、云南等地区的植物辣蓼的研究较少，尤其是抗病毒方面。
14.prv引起多种哺乳动物皮肤瘙痒、神经症状、繁殖障碍甚至死亡。prv病毒颗粒较大且结构复杂，与机体细胞之间相互作用会建立持续的感染，严重危害畜牧业的发展。病毒的致病作用有体外和体内研究，细胞培养方法是体外研究病毒致病性及作用机制的基础，有报道表明prv接种pk-15、st、vero、cef细胞均引起细胞病变，细胞产生病变的时间大约分别在17小时、24小时、20小时、24小时，且利用pk-15细胞增殖的病毒含量高于其他几种细胞。本发明采用pk-15细胞扩增prv，24小时后可见细胞间隙增大，形态变得不规则，折光度增强，细胞空泡化、圆缩、堆积。细胞病变达80％左右时细胞大片脱落、裂解、破碎，培养液上清液呈淡黄色，收获含prv病毒的细胞液，经reed-muench公式计算tcid
50
为10-6.25
/0.1ml。
15.利用细胞形态观察法联合中性红检测法判断fea对pk-15细胞的最大安全浓度为200μg/ml。本发明研究了fea体外抗prv的效果，实验设计了三种给药方式，根据细胞病变程度和fea对细胞保护率来判断fea对病毒的作用效果。pk-15细胞中先加fea再加病毒的方式下，fea对pk-15细胞的保护率在23％～74％之间，fea浓度100μg/ml以上对pk-15细胞有一定保护作用，低于该浓度时，细胞病变程度及细胞活性与空白对照组相比存在显著差异，说明fea可以阻止prv吸附和进入pk-15细胞，但这种阻断作用是有限的。pk-15细胞中先加病毒后加fea的方式下，fea对pk-15细胞的保护率在60％～94％之间，fea浓度100μg/ml以上对细胞保护率在80％以上，抗病毒效果较好，提示高浓度的fea可以有效抑制prv的增殖。将病毒和fea作用4小时后同时加入pk-15细胞中的方式下，fea对细胞的保护率在42％～91％之间，fea浓度100μg/ml以上对细胞保护率在80％以上，抗病毒效果较好，说明药物能够直接灭活prv，较高浓度的fea效果明显，且呈剂量依赖性(剂量依赖性是指可根据剂量在一定范围内调整提高疗效)。综合三种药物作用方式，fea体外抗prv的效果主要是通过抑制作用和直接杀灭病毒的方式来实现的，fea对prv感染的pk-15细胞有较强保护作用，减轻细胞病变程度，提高细胞活性，恢复正常的细胞单层现象。
16.为了研究辣蓼黄酮乙酸乙酯部分(辣蓼黄酮乙酸乙酯部分简称fea)抗猪伪狂犬病毒的效果，探索fea体外抗病毒的作用方式，为辣蓼资源开发与利用提供理论依据，试验用pk-15细胞扩增prv，计算tcid
50
；采用观察细胞病变联合中性红检测的方法，筛选fea对pk-15细胞的最大安全浓度；通过计算各试验组(空白对照组、prv阳性对照组、fea组)的细胞保护率观察3种作用方式(阻断作用、增殖抑制作用及直接灭活作用)下不同浓度fea体外抗prv的效果。结果表明：prv扩增病毒液的tcid
50
为1
×
10-6.25
/0.1ml；fea的最大安全浓度为200μg/ml；3种作用方式下，药物对细胞的保护率范围分别是23％～74％、60％～94％及42％～91％，并且后两种作用方式下fea浓度为100μg/ml～200μg/ml时对细胞保护率达80％以上，细胞活性与prv阳性对照组相比差异极显著(p《0.01)。说明高浓度的fea可能通过抑制病毒增殖及直接灭活病毒两种方式发挥抗病毒作用，且抗病毒效果对fea呈剂量依赖性。
17.综上所述，本发明具有以下优点：
18.(1)本发明研究发现辣蓼黄酮乙酸乙酯部分具有体外抗猪伪狂犬病毒的效果，辣蓼黄酮乙酸乙酯部分通过阻断猪伪狂犬病毒、抑制猪伪狂犬病毒增殖和直接灭活猪伪狂犬
病毒这三种作用方式来抗猪伪狂犬病毒。
19.(2)本发明研究发现fea对prv有一定抑制作用，主要通过抑制病毒增殖及直接灭活病毒两种方式发挥抗病毒效果，且呈剂量依赖性，对于pk-15细胞，fea浓度100μg/ml～200μg/ml范围内抗病毒效果最好。
20.(3)本发明研究发现fea对prv感染的pk-15细胞有较强保护作用，能够减轻细胞病变程度，提高细胞活性，恢复正常的细胞单层现象。
21.(4)本发明研究了辣蓼黄酮乙酸乙酯部分体外抗猪伪狂犬病毒的效果，为使用资源丰富的辣蓼治疗猪伪狂犬疾病提供依据。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明实施例1倒置显微镜下pk-15细胞感染prv前后的细胞图；
24.图2为本发明实施例1中fea对pk-15细胞的安全浓度图；
25.图3为本发明实施例1中fea体外对prv的阻断作用效果图；
26.图4为本发明实施例2中fea体外对prv的抑制作用效果图；
27.图5为本发明实施例3中fea体外对prv的直接灭活作用效果图。
28.注：图3、图4和图5中与空白对照组相比，*表示差异显著(p《0.05)，**表示差异极显著(p《0.01)；与prv阳性对照组相比，#表示差异显著(p《0.05)，##表示差异极显著(p《0.01)，y轴数据代表中性红法检测pk-15细胞活性在570nm波长下的od值；图2、图3、图4和图5中的control表示空白对照组，图3、图4和图5中的prv表示prv阳性对照组。
具体实施方式
29.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
30.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
31.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例1
33.辣蓼黄酮乙酸乙酯部分通过阻断猪伪狂犬病毒的方式抗猪伪狂犬病毒。
34.一研究中用到的药物和试剂名称及来源：
35.(1)猪伪狂犬病毒(prv-gxlb-2013)，由广西大学基础兽医学实验室提供；
36.(2)pk-15细胞，购自武汉大学细胞库；
37.(3)辣蓼黄酮乙酸乙酯部分，辣蓼全草购自南宁市山草堂；参考实验室的提取方法获得：用酶解-超声偶联法提取辣蓼全草中的总黄酮，再用乙酸乙酯进行萃取，分离杂质，结合大孔树脂纯化富集获得辣蓼黄酮乙酸乙酯部分；
38.(4)dmem细胞培养液、胎牛血清(fbs)，均购自美国gibco公司；
39.(5)中性红染液，购自康为生物科技有限公司；
40.(6)0.25％胰酶消化液，购自北京索莱宝生物科技有限公司。
41.二研究方法
42.1、prv扩增
43.用新鲜配置的含10％胎牛血清的dmem细胞培养液复苏pk-15细胞，待细胞基本铺满细胞瓶底，用0.25％胰酶消化液消化，传代培养，待长成单层细胞后，将冻存的prv迅速溶解后接种到pk-15细胞，并孵育1.5小时，弃去病毒液，用磷酸缓冲盐溶液(pbs缓冲液)洗3遍，加入8ml的含5％胎牛血清的dmem细胞培养液后继续培养，在倒置显微镜下观察到细胞病变达80％左右的时候收获含病毒的细胞液，在-80℃反复冻融3次后，5000r/min离心5分钟，病毒上清液用0.22μm滤器进行过滤除菌，分装到无菌离心管中，保存备用。
44.采用pk-15细胞扩增prv的结果见图1。如图1a所示，正常的pk-15细胞呈梭形或多边形，细胞大小均匀，折光性强，排列整齐，培养上清液透明，呈橙黄色，无悬浮的细胞和碎片。从图1b上可以看到，pk-15细胞感染prv后出现细胞病变，细胞间隙增大，细胞形态变得不规则，呈现空泡化、圆缩、堆积，形成分散的病灶区，进而部分细胞破碎，悬浮于培养液中。
45.2、prvtcid
50
的测定
46.tcid
50
为半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量，指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathic effect,cpe)所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。
47.将1
×
105个/ml的pk-15细胞加至96孔细胞培养板中，100μl/孔，培养过夜。病毒组将病毒液进行稀释，稀释度分别为1
×
10-1
、1
×
10-2
、1
×
10-3
、1
×
10-4
、1
×
10-5
、1
×
10-6
、1
×
10-7
、1
×
10-8
、1
×
10-9
、1
×
10-10
，每个稀释度接种8孔，同时设空白对照组，继续培养5天，每天观察致细胞病变效应(cpe)，按reed-muench公式计算tcid
50
，重复2次，求平均值。
48.如表1所示，根据细胞病变观察，能使50％pk-15细胞出现病变的病毒稀释度在1
×
10-6
～1
×
10-7
之间，根据reed-muench两氏法计算距离比，距离比＝(60－50)/(60－20)＝0.25；所以tcid
50
＝10-6.25
/0.1ml。
49.表1猪伪狂犬病毒tcid
50
测定
[0050][0051]
3、fea对pk-15细胞安全浓度的测定
[0052]
96孔细胞培养板长满单层pk-15细胞后，按fea的浓度为600μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml分6个组，同时设置空白(细胞)对照组，每组4个孔，继续培养24小时；加入50μl/孔中性红染料共作用2小时；弃去染液，用pbs缓冲液洗3次，加入脱色液150μl/孔，用酶标仪测pk-15的细胞活性，细胞活性用od
570
表示。
[0053]
如图2所示(注：与空白对照组相比*表示差异显著p《0.05，**表示差异极显著p《0.01，y轴数据代表中性红法检测pk-15细胞活性在570nm波长下的od值)，不同浓度的fea与pk-15细胞共孵育24小时后降低了细胞活性，当fea浓度大于或等于400μg/ml时，细胞活性与空白对照组相比差异显著或极显著(p《0.05或p《0.01)；fea对pk-15细胞最大安全浓度为200μg/ml。因此选择25μg/ml～200μg/mlfea用于后续试验。
[0054]
4、fea对prv的阻断作用的实验方法
[0055]
先将fea与pk-15细胞作用，再加入prv病毒，通过观察pk-15细胞病变及采用中性红方法检测pk-15细胞的细胞活性来判断fea对prv的作用效果，并根据od值计算fea对pk-15细胞的保护率。
[0056]
fea对pk-15细胞的保护率(％)＝(fea组od值-prv阳性对照组od值)/(空白对照组od值-prv阳性对照组od值)
×
100％。根据fea对pk-15细胞的最大安全浓度，设4组fea浓度，每组浓度分别为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml，同时设置空白对照组和prv阳性对照组，每组4个孔。
[0057]
96孔细胞培养板刚铺满pk-15细胞后，fea组加入浓度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的fea，100μl/孔，培养过夜后倒掉fea溶液，每孔加入100tcid
50
/0.1ml病毒液100μl，孵育1.5小时；弃去病毒液，用pbs缓冲液洗3次，加入新鲜配制的含5％胎牛血清的dmem细胞培养液，同时，空白对照组不加fea和病毒，prv阳性对照组加病毒不加fea。恒温培养箱中培养24小时，倒置显微镜下观察pk-15细胞病变，同时用中性红染料吸收法测定pk-15细胞的细胞活性。试验结果见表2及图3。
[0058]
从表2和图3可以看出，pk-15细胞先与fea作用，再与prv病毒孵育，这种作用方式
下，prv阳性对照组细胞活性降低，与空白对照组相比差异极显著(p《0.01)。不同浓度的fea处理后细胞活性升高，其中100μg/ml fea及200μg/mlfea组的细胞活性与prv阳性对照组相比差异显著或极显著(p《0.05或p《0.01)；fea对pk-15细胞的保护率范围在23％～74％之间。说明fea对prv有一定阻断作用，但效果不明显，fea组pk-15细胞仍出现一定程度的病变，25μg/ml fea组及50μg/ml fea组pk-15细胞的细胞活性极显著低于空白对照组(p《0.01)，但与prv阳性对照组相比差异不显著(p》0.05)，预测fea通过此方式发挥的抗病毒作用是有限的。
[0059]
实施例2
[0060]
fea通过抑制prv增殖的方式抗猪伪狂犬病毒。
[0061]
一、本实施例的中用到的药物和试剂名称及来源与实施例1中的药物和试剂名称及来源一致。
[0062]
二、研究方法中的prv扩增、prvtcid
50
的测定、fea对pk-15细胞安全浓度的测定与实施例1的技术方案一致。
[0063]
fea抑制prv增殖的实验方法
[0064]
先将prv病毒与pk-15细胞进行孵育，再加入fea，通过观察pk-15的细胞病变及采用中性红方法检测pk-15的细胞活性来判断fea对prv的作用效果，并根据od值计算药物对pk-15细胞的保护率。
[0065]
fea对pk-15细胞的保护率(％)＝(fea组od值-prv阳性对照组od值)/(空白对照组od值-prv阳性对照组od值)
×
100％。根据fea对pk-15细胞的最大安全浓度，设4组fea浓度，每组浓度分别为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml，同时设置空白对照组和prv阳性对照组，每组4个孔。
[0066]
96孔细胞培养板铺满pk-15细胞后，接种病毒液，100μl/孔，孵育1.5小时后倒掉，用pbs洗3次，分别加入200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml浓度的fea。空白对照组不加fea和病毒，prv阳性对照组加病毒不加fea。恒温培养箱中培养24小时，倒置显微镜下观察pk-15细胞病变，同时用中性红染料吸收法测定pk-15细胞的细胞活性。试验结果见表2及图4。
[0067]
从表2和图4可以看出，先将prv病毒与pk-15细胞进行孵育，再加入fea，在这种方式下，prv阳性对照组细胞活性降低，与空白对照组相比差异极显著(p《0.01)。不同浓度的fea处理后细胞活性均升高，与prv阳性对照组相比差异极显著(p《0.01)；fea对细胞的保护率范围在60％～94％之间，其中，100μg/ml fea及200μg/ml fea组对细胞保护率分别为81％、94％。说明fea对prv的抑制增殖作用明显，低浓度fea组pk-15细胞出现轻微病变，高浓度fea组pk-15细胞呈单层分布，形态、大小、折光度均与空白对照组相似。预测fea能通过此方式发挥抗病毒作用，且抗病毒效果与fea呈剂量依赖关系。
[0068]
实施例3
[0069]
fea通过直接灭活prv的方式抗猪伪狂犬病毒。
[0070]
一、本实施例的中用到的药物和试剂名称及来源与实施例1中的药物和试剂名称及来源一致。
[0071]
二、研究方法中的prv扩增、prvtcid
50
的测定、fea对pk-15细胞安全浓度的测定与实施例1的技术方案一致。
[0072]
fea直接灭活对prv的实验方法
[0073]
先将prv病毒先与fea作用，再加入pk-15细胞，通过观察pk-15细胞病变及采用中性红方法检测pk-15细胞的细胞活性来判断fea对prv的作用效果，并根据od值计算药物对pk-15细胞的保护率。
[0074]
fea对pk-15细胞的保护率(％)＝(fea组od值-prv阳性对照组od值)/(空白对照组od值-prv阳性对照组od值)
×
100％。根据fea对pk-15细胞的最大安全浓度，设4组fea浓度，每组浓度分别为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml，同时设置空白对照组和prv阳性对照组，每组4个孔。
[0075]
96孔细胞培养板铺满pk-15细胞，将预先作用4小时的fea与病毒混合液加入，100μl/孔，孵育1.5小时，pbs洗3次，加入含5％胎牛血清的dmem细胞培养液继续培养。空白对照组不加fea和病毒，prv阳性对照组加病毒不加fea。恒温培养箱中培养24小时，倒置显微镜下观察pk-15细胞病变，同时用中性红染料吸收法测定pk-15细胞的细胞活性。试验结果见表2及图5。
[0076]
从表2和图5可以看出，fea与病毒预先作用4小时，再加入细胞进行孵育，这种作用方式下，prv阳性对照组细胞活性降低，与空白对照组相比差异极显著(p《0.01)。不同浓度的fea处理后，细胞活性升高，与prv阳性对照组相比差异显著或极显著(p《0.05或p《0.01)；fea对pk-15细胞的保护率范围在42％～91％之间，其中100μg/ml fea及200μg/ml fea组对细胞保护率分别为80％、91％。说明fea对prv的直接灭活作用明显，低浓度fea组pk-15细胞出现一定程度病变，50μg/ml fea组及25μg/ml fea组细胞活性与空白对照组相比差异显著或极显著(p《0.05或p《0.01)，高浓度fea组pk-15细胞呈单层分布，形态、大小、折光度均与空白对照组相似。预测fea能通过此方式发挥抗病毒作用，且抗病毒效果与fea呈剂量依赖关系。
[0077]
采用spss 21.0进行试验数据统计学分析。各试验组的比较采用单因素方差分析，结果以“平均值
±
标准差”表示。p《0.05表示差异显著，p《0.01表示差异极显著，p》0.05表示差异不显著。
[0078]
表2细胞活性od值和fea对pk-15细胞的保护率
[0079][0080]
综上所述，fea对prv有一定的抑制作用，主要通过抑制prv病毒增殖及直接灭活prv病毒两种方式发挥抗prv病毒效果，且呈剂量依赖性，fea浓度100μg/ml～200μg/ml范围
内抗病毒效果最好。本发明为进一步研究fea的作用机制及开发利用辣蓼资源提供参考依据。
[0081]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。