一种补锌对小鼠酒精性肝病的治疗与方法

1.通过对各组小鼠肝组织进行病理切片(he染色)及增殖细胞核抗原(pcna)免疫组织化学染色，rt-pcr检测肝细胞核因子-4α(hnf-4α)含量，western blot检测肝组织hnf-4α蛋白表达，对肝组织超氧化物歧化酶(sod)活性及丙二醛(mda)含量进行检测。我们观察到了饮食补锌，增加肝细胞再生，提高sod活力，并且上调了hnf-4α的转录与表达，最终减轻了小鼠酒精性肝病的病理损伤。


背景技术：

2.酒精性肝病主要是由于长期酒精摄入而引起的肝组织及功能的损伤。近年来，酒精引起的肝损伤作用的分子机制已经进行了大量深入的研究，但尚未完全明了。在酗酒的病人体内以及酒精性肝病动物模型中常出现缺锌的情况，现已知许多核受体因子在肝内脂质代谢平衡中发挥着十分重要的作用，绝大多数核受体接近氨基端的区域有一个高度保守的dna结合域，包含两个锌指模序，锌从锌指结构中释放出来时，会导致肝内核受体结合dna的能力丧失。因此锌在酒精性肝病中的重要性不可忽视。肝细胞核因子(hepatic nuclear factor-4α， hnf-4α)是上述肝内核受体超家族的成员之一，至今尚无鉴定的特异配体，作为一个同源二聚体，与必需脂肪酸结合而激活，是肝细胞分化及胆汁和脂质稳态基因的主要调节者。本研究旨在利用酒精性肝病的小鼠模型，针对锌与酒精性肝病以及hnf-4α可能存在的联系，探讨食物补锌对小鼠酒精性肝病的治疗方法。


技术实现要素：

3.肝中锌浓度的结果表明，长期喂养酒精不仅可引起小鼠肝中锌浓度明显减少，而且引起体重增长缓慢，饮食补锌虽没有明显提高基础水平，但可维持正常的体重增长。
4.肝细胞是经生长因子，如表皮生长因子、胰岛素、hgf和细胞因子(tnf和il-6)刺激下再生。本实验pcna结果中用酒精喂养的小鼠肝脏中细胞增殖数明显多于正常对照组小鼠，但肝细胞凋亡与增殖细胞比例较高。这说明，长期摄入酒精的确会诱导肝细胞增殖，但并不足以弥补由酒精引发的肝损伤，而酒精补锌组小鼠的pcna阳性细胞数明显多于酒精中毒组小鼠，证实饮食补锌可以增强小鼠再生肝细胞数，减少了小鼠肝细胞凋亡与增殖的比例，但锌对肝再生的分子作用机制尚需进一步研究。
5.酒精是通过细胞色素p450 2e1(cytochrome p450 2e1)，cyp2e1代谢最后成为乙酸，将产生自由基，导致氧化应激状态，而丙二醛(mda)是脂质过氧化的最终产物，mda含量的增多表明脂质过氧化反应增强。本研究结果显示酒精中毒组mda含量增加显著，sod活力明显下降，说明酒精中毒组小鼠产生过量脂质过氧化物引起肝损伤，sod活性下降；酒精补锌组mda含量减少，sod活性增加，以恢复氧化与抗氧化的平衡。该结果说明补锌可以减少酒精代谢过程中产生的自由基对肝细胞的毒性。
6.前人的研究显示，长期摄取酒精会使肝产生活性氧，锌在多种疾病中都可以平衡氧化-抗氧化状态，而氧化锌指模型与活性氧反应可能会导致锌的释放，从而导致具有锌指
模序的转录因子的功能障碍和退化。肝中多种核受体包括过氧化物增殖物活化受体(ppar-α)视黄醇x受体(rxr)，孕烷x受体(pxr)，肝x受体(iar)都与肝脂质代谢平衡均密切相关，酒精摄入可下调 ppar-α的表达，而ppar-α是pxr的直接转录目标，pxr的激活可引起肝内甘油三酯的堆积，hnf-4α作为核心调节因子，均参与了pxr与lxr调控的基因转录调节，因此推断，酒精补锌组小鼠肝损伤有明显减轻极可能由于锌对hnf-4α及其他核受体的锌指模型起到保护作用。
7.总之，通过本研究，我们观察到了饮食补锌，增加肝细胞再生，提高sod活力，并且上调了hnf-4α的转录与表达，最终减轻了酒精性肝病的病理损伤。
具体实施方式
8.1.方法
9.1.1实验动物分组处理
10.实验使用12周大的雄性c57bl/6小鼠40只，随机分为4组(n＝10)：正常对照组、酒精中毒组、正常补锌组及酒精补锌组。采用2
×
2阶乘设计，乙醇
×
锌。饮食中乙醇的含量(％，w/v)逐渐增加，超过6个月的喂养期间，开始为3.1％，每个月增加0.3％，最终达到4.6％。因此，乙醇的热量贡献从开始占总热量的22％，经过6个月的喂养最终达到32％。在水中加入硫酸锌，使锌的含量达到75mg/l，喂养6个月。每周记录体重，在实验结束时，小鼠用三溴乙醇麻醉处死，取血浆和肝组织标本进行病理学观察、sod与mda活性检测及western blot 检测。
11.1.2肝损伤病理观察及锌浓度测定
12.将10％的福尔马林溶液固定的肝组织标本用石蜡包埋，制成6μm厚的切片，用苏木精和伊红染色；用olympus cx31电子显微镜观察，sony彩色数码摄像头(exwave had digital) 摄像，图片经pas9000病理图像分析系统处理。称取湿重肝脏1mg，置于10ml无污染试管内，加入高纯硝酸2ml，高氯酸0.5ml，在电加热板上加热消化，温度50～200℃，消化至管内剩余液无色透明，用高纯水稀释至5ml，上机检测。小鼠肝锌浓度由附属医院临床检验中心 ggx2 ii型原子吸收分光光度计(共振吸收谱线波长213.8nm，狭缝宽度0.7nm)检测。
13.1.3肝再生的评估
14.用增殖细胞核抗原(pcna)免疫组织化学染色来评估肝再生情况。为了给pcna免疫组织化学染色，切片用高温高压修复抗原。多克隆兔抗pcna被用作一抗(武汉博士德)，4℃过夜。 pbs清洗后，切片用山羊抗兔抗体(北京索莱宝)培养30min。为定量检测pcna阳性细胞，只有明显核染色的细胞才被计数，细胞核有明显棕色或棕黄色颗粒者为pcna阳性，细胞核染成蓝色者为pcna阴性。
15.1.4 mda与sod的含量测定
16.取肝脏用0.2mol/l磷酸盐缓冲液制成5％肝匀浆，检测肝组织中sod与mda含量。按南京建成生物工程研究所提供的测试盒说明书进行。
17.1.5 hnf-4αmrna含量测定
18.用trizol一步组法提取肝织的总rna，使用rt-pcr扩增hnf-4α目的片段，rna反转录为 cdna做模板。pcr反应引物由美国invitrogen公司代理合成。肝脏hnf-4α的引物序列
(上游：5
’‑
gatgcttctcggagggtctg-3’下游：5
’‑
tggcttcttgcttggtgat-3’)，扩增长度：580bp；内参β-actin的引物序列(上游：5
’‑
ctgtccctgtatgcctctg-3’下游：5
’‑
atgtcacgcacgatttcc
ꢀ‑3’
)，扩增长度：191bp，逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)法。反应条件：94℃预变性3min，94℃无变性30s，57℃退火30s，72℃；延伸35s，循环28次，最后72℃延伸7min。根据每条引物的分子量计算所合成引物的含量(mol)，加depc水溶解成100μmol/l的储存液。分别取pcr扩增产物6μl与4μlβ-actin扩增产物混合，于1.5％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm。uvi 凝胶图像扫描仪分析，将每个样本的产物扩增条带光密度与相应的内参照dna扩增条带光密度的比值(e/c)作为特异性扩增片断的半定量检测值。
19.1.6 hnf-4αwestern blot测定
20.取肝脏剪碎按100mg组织加495μl ripa裂解液和5μl pmsf(酶抑制剂)，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，14000
×
g离心5min，取上清置于ep管中。将含有60μg的蛋白组分加到12％sds-聚丙烯酰胺凝胶中。在电泳后，转移蛋白到聚偏乙烯氟化物膜，转膜完成后用pbs清洗，加入western封闭液(blocking buffer)，室温摇动1h，加入一抗hnf兔抗稀释比1∶500，室温下摇动孵育1h，4℃过夜；内参tubulin兔抗稀释比例为1∶1000，室温下摇动孵育1h，4℃过夜。用tbst室温摇动洗脱5min，重复洗脱3次，加入hrp标记抗兔二抗稀释比例为1∶5000(与hnf一抗及tubulin反应)，室温下摇动孵育1h，用tbst室温摇动洗脱7min，重复洗脱4次。滴加beyoecl plus工作液，确保使工作液均匀覆盖，放置1～ 2min；弃beyoecl plus工作液，将膜放在两片保鲜膜中间，进行荧光成像仪检测。利用bio-rad 凝胶成像分析系统图形分析软件对western blot蛋白条带定量分析积分光密度值。目的蛋白表达水平以目的蛋白条带光密度值同tubulin条带光密度值之比表示小鼠hnf-4α蛋白的相对含量。
21.1.7统计方法
22.数据用均数
±
标准差表示，采用spss 17.0统计软件进行处理，计量资料符合正态分布，多个样本均数间的比较采用one-way anova分析，两两比较选用lsd法。
23.2结果
24.2.1体重变化
25.研究发现，酒精中毒组小鼠体重增长较其它各组增长缓慢；正常补锌组、酒精补锌组的小鼠体重增长与正常对照组无显著性差异(p＞0.05，附图1)。
26.2.2肝内锌浓度变化
27.酒精中毒组肝内锌浓度明显低于正常对照组、正常补锌组与酒精补锌组，差异具有统计学意义(表1)。
28.2.3 mda含量与sod活性改变
29.mda与sod含量改变如表1所示。酒精中毒组小鼠mda含量明显高于正常对照组、酒精补锌组以及正常补锌组，差异具有统计学意义(p＜0.05)，而在酒精补锌组小鼠mda含量低于正常对照组、正常补锌组，但差异不具有统计学意义(p＞0.05)。
30.酒精中毒组小鼠sod活力明显低于正常对照组、正常补锌组及酒精补锌组，差异具有统计学意义(p＜0.05)，而酒精补锌组sod活力略高于正常对照组、正常补锌组，但差异不具有统计学意义(p＞0.05)。
31.tab.1 activity of sod，the content of mda and hepatic zinc concentrations in each group of mice(n＝6)
[0032][0033]
*p＜0.05 vs ethanol group
[0034]
2.4肝病理改变
[0035]
在光镜下显示，酒精喂养可以诱发肝组织损伤，包括大滴性脂肪变性，肝细胞坏死，白细胞浸润(图2c)。正常对照组小鼠肝组织可见细胞放射状排列未见脂滴，正常补锌组小鼠肝组织与正常对照组无明显差异，未见明显病理改变，酒精中毒组小鼠肝组织肉眼观察颜色偏白，触摸有油腻感，镜下可见明显脂滴密布；酒精补锌组小鼠肝组织可见脂滴明显减少，细胞并无坏死(附图2)。
[0036]
2.5 pcna评估肝再生能力
[0037]
我们对各组小鼠肝组织病理切片使用免疫组织化学方法测定出pcna的表达情况。正常对照组小鼠肝组织镜下pcna阳性细胞数罕见，正常补锌组肝组织镜下阳性细胞略可见一二，酒精中毒组小鼠肝组织可见阳性细胞散在分布，酒精补锌组小鼠肝组织镜下阳性细胞数显著增加，染色明显(附图3)。
[0038]
2.6锌对hnf-4α的mrna含量变化的影响
[0039]
结果显示，酒精中毒组小鼠肝细胞hnf-4αmrna表达量明显低于正常对照组、正常补锌组及酒精补锌组，差异具有统计学意义(p＜0.05)，而酒精补锌组hnf-4αmrna表达量略高于正常对照组、略低于正常补锌组，但差异均不具有统计学意义(p＞0.05，附图4)。
[0040]
2.7锌对hnf-4α的表达变化的影响
[0041]
结果显示，酒精中毒组小鼠hnf-4α表达水平(0.71
±
0.16)明显低于正常对照组(1.16
±ꢀ
0.09)，差异有统计学意义(p＜0.05，附图5)，而酒精补锌组与正常补锌组的hnf-4α蛋白水平都有所上升，灰度值比分别为1.51
±
0.15与1.04
±
0.17，与正常对照组的差异无统计学意义 (p＞0.05)。
[0042]
附图说明：图1是各组小鼠体重变化对比图；
[0043]
图2是各组小鼠肝脏切片he染色对比图；
[0044]
(其中a组为正常对照组小鼠肝组织he染色切片；b组为正常补锌组小鼠肝组织he染色切片；c组为酒精中毒组小鼠肝组织he染色切片；d组为酒精补锌组小鼠肝组织he染色切片(he x 400))
[0045]
图3是各组小鼠肝组织病理切片(使用免疫组织化学方法测定出pcna的表达情况)。 (其中a组为正常对照组小鼠肝组织he染色切片；b组为正常补锌组小鼠肝组织he染色切片；c组为酒精中毒组小鼠肝组织he染色切片；d组为酒精补锌组小鼠肝组织he染色切片；(pcna：增殖细胞核抗原x 100))
[0046]
图4是各组小鼠肝细胞hnf-4αmrna表达量对比图；
[0047]
(其中a图为各组小鼠hnf-4αmrna荧光电泳结果图；其中1组为酒精补锌组；2组为正常补锌组；3组为正常对照组；4组为酒精中毒组；m为内参照dna扩增条带光密度；b图为各
小组的产物扩增条带光密度与相应的内参照dna扩增条带光密度的比值(e/c)；)
[0048]
图5是各组小鼠hnf-4α蛋白表达水平的对比图。