芜菁中性多糖在制备抗肿瘤药物中的应用

本发明涉及芜菁中性多糖应用技术领域，具体涉及芜菁中性多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

芜菁，属十字花科芸蔓属芸蔓种芜菁，常以块根和种子入药，是一种药食同源的植物。李时珍在《本草纲目》中对于其功效有更加详细的描述，“辛、苦、平、无毒，可升可降，能汗能吐能下，能利小便，又能明目解毒，其功甚伟”、唐代《新修本草》将其命名为“芜菁”。芜菁广泛分布在中国新疆、西藏等高海拔地区。新疆人将其称为长寿圣果，素有“新疆人参”之称。常常用于润肺、止咳平喘。主要含有以下化学成分：黄酮类、多糖类、生物碱类等。目前对芜菁块根的分离鉴定表明，芜菁具有抗衰老、抗辐射、止咳平喘、保肝护肝等作用。

原发性支气管肺癌简称肺癌，分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大类，其中非小细胞肺癌约占80-85％。肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，是肿瘤中发病率和死亡率最高的疾病。肺癌的发病率逐年升高已成为非常严峻的社会问题。肺癌的发病率逐年升高已成为非常严峻的社会问题，对于肿瘤的治疗产生的副作用较严重，因此，利用副作用小的天然提取物治疗肿瘤十分重要。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了芜菁中性多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述芜菁中性多糖用于制备小鼠抗肿瘤药物。

进一步地，所述芜菁中性多糖在小鼠体内的抗肿瘤剂量为50-200mg/kg。

进一步地，所述芜菁中性多糖用于制备缓解顺铂毒性的药物。

进一步地，所述芜菁中性多糖用于制备增强免疫力的药物。

进一步地，所述芜菁中性多糖用于制备促进血清中il-2细胞因子增加的药物。

进一步地，所述芜菁中性多糖用于制备促进血清中tnf-α细胞因子增加的药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供了芜菁中性多糖在制备抗肿瘤药物中的应用；

2、本发明中所述的芜菁中性多糖能够提高荷瘤小鼠抑瘤率；

3、本发明中所述的芜菁中性多糖能够缓解顺铂的毒性；

4、本发明中所述的芜菁中性多糖能够促进血清中细胞因子il-2和tnf-α的增加，从而增强机体免疫力；

5、本发明中所述的芜菁中性多糖能够增加脾脏指数和胸腺指数。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中造模小鼠直观图；

图2表示本发明芜菁中性多糖对不同处理组荷瘤小鼠体质量、有效体质量的影响柱图；

其中，图2(a)表示不同处理组荷瘤小鼠给药前质量；

图2(b)表示不同处理组荷瘤小鼠处死时体质量；

图2(c)表示不同处理组荷瘤小鼠体质量变化；

图2(d)表示不同处理组荷瘤小鼠有效体质量变化；

图3表示本发明芜菁中性多糖对荷瘤小鼠免疫器官的影响柱图；

其中，图3(a)表示不同处理组荷瘤小鼠脾脏指数；

图3(b)表示不同处理组荷瘤小鼠胸腺指数；

图4表示本发明芜菁中性多糖对不同处理组对荷瘤小鼠抑瘤率的影响柱图；

上述不同处理组指空白对照组、模型组、阳性对照组(即顺铂组)、中性多糖高剂量组、中性多糖中剂量组和中性多糖低剂量组。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：

实施例1提供了芜菁中性多糖在制备肺癌a549细胞调控的药物中的应用，具体过程如下：

一、材料与仪器

(1)细胞株

从武汉普诺赛生命科技有限公司购入a549肺癌细胞株1支。

(2)动物

balb/c小鼠购自新疆医科大学动物实验中心，6-8周龄，雌雄对半，体重：22-30g，许可证号：scxk(新)2018-0001，饲养环境：温度：22-25℃，相对湿度：40-60％，12h光照12h黑暗，自由饮食饮水、每天定时喂食喂水，5天更换一次垫料，保持鼠笼干净卫生。

(3)药物

顺铂(北京索莱宝科技有限公司)

芜菁药材2019年6月购自阿克苏柯坪县圣泉实业有限公司，经新疆医科大学药学院生药/天药教研室鉴定为新疆特色药材芜菁(brassicarapal.)的地下块根。

芜菁中性多糖：对芜菁进行脱脂、水提、浓缩、干燥、80％醇沉、抽滤、干燥、溶解、透析，得到芜菁多糖brp，通过deae-650m离子交换色谱柱、hw-55f进行分离纯化，得出芜菁中性多糖brnp(具体制备方法见专利cn107011453a)，需要说明的是芜菁的别名为维药恰麻古。

(4)主要试剂

f-12k培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司，pm150910-500)

0.25％胰蛋白酶(gibco公司)

胎牛血清(gibco公司)

t25细胞培养瓶(corning公司)

15、50ml离心管(nest公司)

60mm细胞培养皿(nest公司)

1000μl移液枪(德国eppendorf公司)

75％乙醇消毒液(河北康济药械有限公司)

96孔板(corning公司)

0.9％生理盐水(四川科伦药业股份有限公司)

1ml无菌注射器(陕西龙康鑫医疗器械有限公司)

0.22μm除菌头(millipore公司)

il-2、tnf-αelisa试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。

(4)仪器与设备

heracell150型细胞恒温培养箱(美国thermo公司)

冰箱(haier海尔公司)

生物安全操作台(美国thermo公司)

倒置显微镜(moticae31公司)

离心机(sartoriμs公司)

ndo-601sd型干燥箱(日本eyela公司)

二、具体实验方法

(1)建立肺癌小鼠模型

采用细胞移植法皮下种植途径；将小鼠分为两组，空白组小鼠腹腔注射生理盐水，模型组消毒小鼠右前腋，取0.2ml约1×10⁷瘤细胞接种于皮下，接种肿瘤细胞后，待所有小鼠皮下肿瘤的平均直径达到约5mm时造模成功。

(2)实验小鼠分组和给药

造模成功后，采用随机表法将小鼠分组，可将小鼠分为6组，每组10只小鼠，共计60只。分组情况：空白对照组(不参与建模，注射生理盐水)、模型组(参与建模、注射生理盐水)、顺铂组(腹腔注射6mg·kg^-1)、中性多糖高剂量组(200mg·kg^-1·d)、中性多糖中剂量组(100mg·kg^-1·d)、中性多糖低剂量组(50mg·kg^-1·d)，分别给药10天。上述各给药剂量均根据《中药药理研究方法学》参照临床用药量，查人与小鼠的剂量换算关系，按体表面积折算，小鼠与人之间是10倍，即按临床成人10倍生药量计算。顺铂药液的配制及用量，参阅说明书及上述核算方法，小鼠顺铂的实验剂量为6mg·kg^-1。

(3)一般状态观察

给药前，记录小鼠首次给药体质量，给药后，每隔一天记录每组小鼠体重变化情况，处死小鼠前称量各组小鼠体重。给药10天后解剖所有组别小鼠，取肝脏、脾脏、肺、肾脏和胸腺等脏器，并称重，计算抑瘤率、脏器指数、瘤质量等。然后将所有脏器一分为二，一份用4％的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，进行he染色、用光学显微镜观察颜色深浅、有无血块并拍照记录；另外一份用ep管装好快速冻存用于后续相关指标检测。

(4)检测肺癌小鼠血清中il-2、tnf-α含量

给药10天处死小鼠前12h禁食不禁水，摘其眼球处取血0.8-1.2ml，室温放置1h，离心12000r·min^-1，15min，并取血清(上清液)置于-80℃冰箱储存。后续采用elisa法按照试剂盒提供具体步骤测定il-2、tnf-α的含量。用酶标仪测定吸光度值，通过标准曲线计算小鼠血清中各免疫因子的含量。具体操作如下：

分别设定标准孔、空白孔和样本孔。标准孔加入100μl倍比稀释的标准品。空白孔加入100μl标准品&样本稀释液，其余孔加入100μl待测样本，每组设立3个复孔，给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；甩尽孔内液体，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μl，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时；再甩尽孔内液体，每孔加洗涤液200μl，浸泡1.5分钟，吸去酶标板内的液体，重复此洗板步骤3次，洗板完成后立即进行下步操作，不要让微孔板干燥；每孔加酶结合物工作液100μl，加上覆膜，37℃温育30分钟；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右；每孔加终止液50μl，终止反应；(终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同)用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度。

三、实验结果如下

(1)造模

每天定时观察注入a549细胞部位小鼠的变化，发现7-10天有凹凸状物体形成，待所有小鼠皮下肿瘤的平均直径达到约5mm时造模成功，再开始分组给药。造模小鼠如图1所示。

(2)芜菁中性多糖对荷瘤小鼠体质量和有效体质量的影响

如图2(a)、图2(b)所示，每组小鼠在给药前质量之间无显著性差异(p>0.05)，处死小鼠前进行称重，与模型组相比，阳性对照组小鼠质量减轻；

图2(c)、图2(d)与模型组比较，阳性对照组的体质量、体质量均显著降低(p<0.01)，与阳性对照组相比，芜菁中性多糖各剂量组体质量、有效体质量均有所增加。

(3)芜菁中性多糖对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响

与空白组相比，模型组脾脏指数和胸腺指数均降低(p<0.01)，与模型组相比，阳性对照组和芜菁中性多糖各剂量组脾脏指数和胸腺指数增加，并具有显著性差异(p<0.05)，如图3(a)、3(b)所示。

(4)芜菁中性多糖对荷瘤小鼠抑瘤率的影响

与模型组相比，阳性对照组的抑瘤率具有显著性差异(p<0.01)，芜菁中、高剂量组也具有显著性差异(p<0.01)，芜菁多糖低剂量组虽然对荷瘤小鼠瘤块有效，但抑瘤率较低，如图4所示。

(5)芜菁中性多糖对荷瘤小鼠血清细胞因子il-2、tnf-α的影响

表1芜菁中性多糖对荷瘤小鼠血清细胞因子的影响(x±s，n＝10)

如表1所示，与模型组相比，芜菁多糖各剂量组血清中il-2、tnf-α的含量升高，中、高剂量组的il-2、tnf-α含量差异具有统计学意义(p<0.01)；与空白组相比，模型组血清中il-2、tnf-α的含量降低(p<0.01)。

综上所述，芜菁中性多糖可提高小鼠的体重，较阳性对照组小鼠相比，小鼠饮食饮水较多，说明芜菁中性多糖可改善顺铂带来的毒副作用；同时可提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数；为进一步确认芜菁中性多糖的抑瘤作用和免疫作用，本实验对血清中il-2和tnf-α的含量进行检测，il-2和tnf-α是机体重要的细胞因子，il-2是免疫系统中类细胞生长因子，参细胞免疫，在机体复杂免疫系统中起到中心调节的作用，能刺激免疫细胞活化，促进t细胞的增殖和分化，促进il-2的分泌.提高机体免疫机能，tnf-α通过与受体结合诱导肿瘤细胞凋亡促进t细胞产生炎症因子，增强宿主免疫功能，作用肿瘤血管内皮细胞，导致血管功能亲乱，抑制肿瘤细胞的生长和增殖并促其溶解，对正常的机体和组织无毒性。

不发明中模型组的il-2和tnf-α含量较空白组明显降低，芜菁多糖各剂量组均能提高荷瘤小鼠tnf-α和il-2含量可能与免疫机制有关。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。