PHB抑制剂在胶质瘤治疗中的应用

本发明涉及生物医学领域中，phb抑制剂在胶质瘤治疗中的应用。

背景技术：

源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤，它是最常见的颅内恶性肿瘤，约占颅脑肿瘤的40％-50％，世界卫生组织(who)根据脑胶质瘤恶性程度将其分为ⅰ到iv级，由低到高。脑胶质瘤根据病理可分为星形细胞瘤、髓母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme，gbm)、室管膜瘤、少突胶质细胞瘤等，其中多形性胶质母细胞瘤(gbm)均是iv级胶质瘤，是恶性程度最高的一类肿瘤，gbm患者即使经过最积极的治疗，平均生存周期也仅为12-15个月。

脑胶质瘤呈浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，gbm作为恶性程度最高的胶质瘤，浸润转移更迅速，更易复发，患者预后极差，临床上标准治疗手段为手术结合放化疗。手术不能完全切除病灶，放化疗短时间内可以抑制肿瘤的生长，但gbm对放化疗抵抗且易复发，因此患者5年存活率仍不足5％。gbm组织中的肿瘤干细胞称为胶质瘤干细胞(gliomastem-likecell,gsc),它与正常的神经干细胞(neuralstemcell，nsc)表达同样的干细胞标志物，如cd133、nestin、sox2、olig2等，同时也具备自我更新、无限增殖、肿瘤发生的能力。越来越多证据表明gsc与gbm肿瘤发生、持续生长和复发密切相关。以gsc为研究对象，剖析其在脑胶质瘤中的特点及功能，可以更深入的揭示脑胶质瘤的发生、发展以及复发的原因，为脑胶质瘤的治疗提供新的思路。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何治疗和/或预防脑肿瘤。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了rocaglamide(roca，楝酰胺)在制备治疗和/或预防脑肿瘤产品中的应用。

上述应用中，所述治疗和/或预防脑肿瘤可体现在抑制脑肿瘤生长和/或延长脑肿瘤动物生存期上。

所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物可为人或小鼠。在本发明的一个实施例中，所述小鼠为免疫缺陷小鼠balb/cnude。

上述应用中，所述脑肿瘤可为胶质瘤。所述胶质瘤可为由胶质瘤干细胞(gsc)引发的肿瘤。在本发明的一个实施例中，所述胶质瘤干细胞(gsc)为387gsc、4121gsc、456gsc、3832gsc或、3691gsc。

本发明还提供了rocaglamide在制备具有如下任一用途产品中的应用：

x1、抑制脑肿瘤细胞生长；

x2、抑制脑肿瘤细胞成瘤能力；

x3、降低脑肿瘤细胞活力；

x4、降低脑肿瘤细胞的自我更新能力。

上述应用中，所述脑肿瘤细胞可为胶质瘤细胞。所述胶质瘤细胞可为胶质瘤干细胞，如387gsc、4121gsc、456gsc、3832gsc或、3691gsc。

本发明还提供了rocaglamide在抑制phb-prdx3复合体形成中的应用，或在制备抑制phb-prdx3复合体形成中的应用。

本发明还提供了具有如下任一用途的产品，含有(或其活性成分为rocaglamide：

y1、治疗和/或预防脑肿瘤；

y2、抑制脑肿瘤生长；

y3、延长脑肿瘤动物生存期；

y4、抑制脑肿瘤细胞生长；

y5、抑制脑肿瘤细胞成瘤能力；

y6、降低脑肿瘤细胞活力；

y7、降低脑肿瘤细胞的自我更新能力。

本发明中，phb为phb基因所编码的蛋白质(ncbiid：5245，更新日期2021年1月3日)，phb基因可为prohibitin或phb1基因(genebankaccession：nm_001281496，更新日期2020年11月17日)，prdx3为prdx3基因(genebankaccession：nm_006793；更新日期2020年12月6日)所编码的蛋白质(ncbiid：10935，更新日期2020年12月6日)。

所述脑肿瘤可为哺乳动物脑肿瘤。所述脑肿瘤细胞、所述胶质瘤细胞和所述胶质瘤干细胞均可为哺乳动物细胞。所述哺乳动物可为人或小鼠。在本发明的一个实施例中，所述小鼠为免疫缺陷小鼠balb/cnude。

本发明的实验证明，roca处理能够明显抑制肿瘤生长，并延长荷瘤小鼠的生存周期，且roca处理后导致肿瘤组织氧化损伤明显增加，凋亡细胞比例升高以及肿瘤干细胞比例降低，但其对小鼠的体重，肝肺以及正常脑组织均没有影响。说明roca能够抑制gsc自我更新，抑制gbm移植瘤恶性进程。本发明具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为roca能够竞争性结合phb并抑制gsc生长。

a.4121gsc给予roca(10nm)、mg132(10um)处理12小时，免疫共沉淀检测prdx3与phb相互作用；

b.五株gscs(387、4121、456、3832、3691)和nha、hnp1分别给予不同浓度roca(0、1、2、5、10nm)处理，并检测细胞活力，横坐标为处理时间；

c.五株gscs(387、4121、456、3832、3691)和nha分别给予十个递增浓度的roca(0、1、2、5、10、20、50、100、200、500nm)处理48小时，检测细胞活力并绘制剂量反应曲线，计算每株细胞ic50。

图2为roca能够抑制gbm肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存周期。

a.活体成像实时动态监测gbm移植瘤肿瘤生长情况，并量化统计；

b.kaplan-meier生存曲线分析荷瘤小鼠生存周期，纵坐标neurologicalsignfreesurvival为无病生存期；

c.移植瘤小鼠肿瘤组织切片后，免疫荧光染色分析组织氧化损伤标志物8-ohdg、干细胞标志物sox2、凋亡标志物tunel，并量化统计，bar＝40μm；

d.roca处理后12小时收取鼠脑组织，质谱分析roca含量，右图纵坐标为鼠脑含量；

e.测量小鼠体重变化情况；

f.肝肺组织h&e染色，bar＝100μm；

g.免疫荧光染色发现脑室下区sox2、cleaved-caspase3无明显变化，bar＝40μm；

***表示差异达到显著水平，p值＜0.001；ns表示无显著差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的387gsc、4121gsc、3691gsc均记载在文献(hypoxicinductionofvasorinregulatesnotch1turnovertomaintaingliomastem-likecells，manetal.,2018,cellstemcell22,104–118.january4,2018a2017elsevierinc.https://doi.org/10.1016/j.stem.2017.10.005)(第四页figure2图e和第六页figure3图b)中，公众可从申请人处获得，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。387gsc、4121gsc、456gsc、3832gsc、3691gsc均为不同gbm患者肿瘤组织中分离所得的胶质瘤干细胞，经过一系列的功能验证，它们与正常的神经干细胞(neuralstemcell，nsc)表达同样的干细胞标志物，如cd133、nestin、sox2、olig2等，同时也具备自我更新、无限增殖、肿瘤发生的能力。

下述实施例中的nha(normalhumanastrocyte)(人星形胶质细胞)：北京北纳生物技术有限公司(货号bncc341796)产品。它具有许多突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用，并参与了血脑屏障的形成。由于星形胶质细胞能产生和分泌某些神经递质以及表达某些神经递质受体，可对一些神经活性物质产生反应。另外，星形胶质细胞能对外源性化合物进行生物转化，并可帮助调节神经元周围的离子微环境。

下述实施例中的hnp1记载在文献(fangetal.,deubiquitinaseusp13maintainsglioblastomastemcellsbyantagonizingfbxl14-mediatedmycubiquitination，j.exp.med.2017vol.214no.1245–267，https://doi.org/10.1084/jem.20151673)(第4页figure2图g)中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。hnp1是神经祖细胞，它最显著的特点就是具有自我更新、分化为各种类型细胞的能力，具有增殖跟分化的潜能。

roca(rocaglamide，楝酰胺)：mce公司，货号hy-19356；cas号码：84573-16-0；分子式：c29h31no7。

mg132(蛋白酶抑制剂)：selleck公司，货号s2619。

phb抗体：anti-prohibitinantibody，abcam公司，货号ab28172。

prdx3抗体：anti-prdx3antibody，thermofisherscientific公司，货号lf-ma0045。

二抗：兔二抗affinipuregoatanti-rabbitigg(h+l)，jacksonimmunoresearch公司，货号111-005-003。

pspax2：addgene公司，货号#12260。

pci-vsvg：addgene公司，货号#1733。

pcdh-neo质粒：systembiosciences公司，货号cd514b-1。

pcdh-luciferase-neo质粒：将pcdh-neo质粒的noti和xhoi识别序列间的dna片段替换为luciferase的编码dna得到的重组质粒，luciferase的编码dna如序列表中序列1所示。

实施例1、roca能够与phb竞争性结合并抑制gsc生长

本实施例发明人首先在gsc中对roca与phb竞争性结合进行了验证，同时给予mg132(10μm)和roca(10nm)处理12小时，收集细胞样品利用phb抗体进行免疫共沉淀检测phb(prohibitin)蛋白质(ncbiid：5245，更新日期2021年1月3日)(由phb基因编码，phb基因genebankaccession：nm_001281496，更新日期2021年1月3日)与prdx3(peroxiredoxin3)蛋白质(ncbiid：10935，更新日期2020年12月6日)(由prdx3基因编码，prdx3基因genebankaccession：nm_006793；更新日期2020年12月6日)相互结合情况。

待测细胞为4121gsc，具体步骤如下：

a.将细胞培养板中的4121gsc随机分为对照组和roca处理组，每组5个复孔，每孔2000个细胞，每孔200μlnbm完全培养基(在500ml基础培养基neurobasalmedium(thermofisher公司，货号12348-017)中添加10mlb27-supplement血清替代物(thermofisher公司，货号12580-010),20ng/mlegf(r&d公司，货号cat#236-eg)和20ng/mlbfgf(r&d公司，货号cat#4114-tc)配制而成)，向对照组中添加mg132使其在体系中的浓度为10μm，向roca处理组中添加mg132与roca使mg132与roca在体系中的浓度分别为10μm和10nm，在37摄氏度下处理12-16小时(过夜处理)。处理结束后分别收集细胞样品于ep管中，进行免疫共沉淀。

b.向ep管中加入2-3ml含3mmdtt和cocktail的np-40裂解液(武汉博士德生物科技有限公司，ar0107)，充分裂解混匀后，置于4℃混悬仪上混悬20-30min；

c.将步骤b所得混悬后的裂解产物在4℃超速离心机中12000rpm离心15min，留存上清液，丢弃沉淀；

d.向步骤c所得上清液中加入25μlproteina(gehealthcare公司，货号17-1279-01)beads，然后置于4℃混悬仪上混悬1h进行预沉淀；

e.向步骤d所得预沉淀后的液体在4℃离心机中600rcf离心1min，留存上清液，丢弃proteinabeads；

f.取3％-5％步骤e所得的上清液作为input，以备后续实验用,向剩余上清液中加入5μgphb抗体，置于4℃混悬仪上孵育12-16h(过夜)，得到孵育产物；

g.向步骤f所得孵育产物中再加入25μlproteinabeads，4℃混悬仪上孵育4-6h；

h.步骤g孵育完的液体在4℃离心机中600rcf离心1min后，丢弃上层上清液，留下beads；

i.利用np-40裂解液清洗步骤h的得到的beads，每次混悬仪上混悬10min，共6次；

j.步骤i最后一次洗完后，用微量进样针吸干残留的液体，留存beads；

k.向步骤f留存的input上清液和步骤j留存的beads中分别加入适量5×loading蛋白上样缓冲液，沸水中煮20min；

l.步骤k完成后，吸取液体作为蛋白样品，利用westernblotting检测免疫共沉淀效果；所用一抗为prdx3抗体与phb抗体，二抗为兔二抗affinipuregoatanti-rabbitigg(h+l)。

结果发现：与对照组相比，roca处理组中，与phb相结合的prdx3明显减少(图1中a)，这一结果提示roca可以与prdx3竞争性结合phb从而抑制phb-prdx3复合体的形成。

为了评价roca的生物活性，发明人利用不同浓度的roca分别处理五株gscs以及nha、hnp1，然后在0、2、4、6天对细胞活力进行检测，待测细胞为387gsc、4121gsc、456gsc、3832gsc、3691gsc、nha、hnp1，具体步骤如下：

a.将待测细胞消化成单个，并用台盼蓝染色后计活细胞数；

b.将96孔细胞培养板中的待测细胞随机分为5组，即对照组(0nm组)、1nm组、2nm组、5nm组、10nm组，每孔2000个细胞，向1nm组、2nm组、5nm组、10nm组中分别加入roca使其在这四组中的浓度分别为1、2、5、10nm，对照组不添加roca，每组5个复孔，每孔200μlnbm完全培养基，接种4个同样的96孔板在37摄氏度下进行培养；

c.在培养第0h，48h，96h，144h(即roca处理第0、2、4和6天)分别利用celltiter-luminescentcellviabilityassay(promega公司，货号g7572)检测每孔的细胞活力，每个孔板对应一个时间点；具体的测量方法是：在避光的条件下，将celltiter试剂恢复至室温，每个孔中加入100μlcelltiter-试剂并用微量移液器轻轻吹打混匀，然后从混合后的300μl体系中取200μl转移至另外一个黑色的96孔板(glomax全自动荧光仪可以识别的，promega公司)中，所有孔都转移至黑色96孔板中；将黑色96孔板置于水平摇床上轻轻孵育10min，使其彻底混匀；将黑色96孔板置于glomax全自动荧光仪中读值，然后将四个时间点的值换算成相对细胞活力(relativecellviability，反映细胞生长)。

结果发现roca在极低浓度(5nm)情况下对gscs有明显杀伤作用，抑制gscs生长，而对正常的脑组织细胞如nha、hnp1影响较小(图1中b)。在处理第6天，387gsc在roca浓度分别为0nm、1nm、2nm、5nm和10nm下的相对细胞活力分别为17.91±0.29、17.05±0.11、15.36±0.15、7.31±0.06、0.32±0.01，与roca为0时相比，roca浓度为5nm时的相对细胞活力已显著下降(p＜0.0001)；4121gsc在roca浓度分别为0nm、1nm、2nm、5nm和10nm下的相对细胞活力分别为25.06±0.80、20.76±0.56、16.72±0.08、5.15±0.13、0.18±0.01，与roca为0时相比，roca浓度为5nm时的相对细胞活力已显著下降(p＜0.0001)；456gsc在roca浓度分别为0nm、1nm、2nm、5nm和10nm下的相对细胞活力分别为16.68±0.12、12.34±0.21、4.49±0.01、1.47±0.01、0.12±0.01，与roca为0时相比，roca浓度为5nm时的相对细胞活力已显著下降(p＜0.0001)；3832gsc在roca浓度分别为0nm、1nm、2nm、5nm和10nm下的相对细胞活力分别为16.87±0.41、15.71±0.28、13.11±0.12、7.27±0.25、1.76±0.01，与roca为0时相比，roca浓度为5nm时的相对细胞活力已显著下降(p＜0.0001)；3691gsc在roca浓度分别为0nm、1nm、2nm、5nm和10nm下的相对细胞活力分别为12.51±0.13、8.85±0.10、6.07±0.14、2.17±0.14、0.30±0.01，与roca为0时相比，roca浓度为5nm时的相对细胞活力已显著下降(p＜0.0001)；nha在roca浓度分别为0nm、1nm、2nm、5nm和10nm下的相对细胞活力分别为23.72±0.36、23.79±0.36、22.73±0.26、20.84±0.85、14.99±0.20，与roca为0时相比，roca浓度为5nm时的相对细胞活力略有变化(p＜0.05)；hnp1在roca浓度分别为0nm、1nm、2nm、5nm和10nm下的相对细胞活力分别为7.64±0.06、6.66±0.23、5.44±0.15、3.60±0.11、3.48±0.06，与roca为0时相比，roca浓度为5nm时的相对细胞活力有所下降(p＜0.0001)。

进一步对半数致死剂量(ic50)分析，待测细胞为387gsc、4121gsc、456gsc、3832gsc、3691gsc、nha，检测步骤如下：

a.将待测细胞消化成单个，并用台盼蓝染色后计活细胞数；

b.将96孔细胞培养板中的待测细胞随机分为10组，即0.1nm组、1nm组、2nm组、5nm组、10nm组、20nm组、50nm组、100nm组、200nm组、500nm组，每孔2000个细胞，向0.1nm组、1nm组、2nm组、5nm组、10nm组、20nm组、50nm组、100nm组、200nm组、500nm组中分别加入roca使其在这十组中的浓度分别为0.1、1、2、5、10、20、50、100、200、500nm，每组5个复孔，每孔200μlnbm完全培养基，在37摄氏度下进行培养；

c.在培养第48h(即roca处理第2天)分别利用celltiter-luminescentcellviabilityassay(promega公司，货号g7572)检测每孔的细胞活力，具体的测量方法同评价roca的生物活性的步骤c。

结果发现roca对五株gscs的ic50均低于5nm，而nha的ic50则显著高于gscs(图1中c)，roca对387gsc、4121gsc、456gsc、3832gsc、3691gsc、nha的ic50分别为3.569、2.834、1.579、4.828、2.219和16.54nm。

实施例2、roca能够抑制gbm小鼠肿瘤生长并延长生存周期

免疫缺陷小鼠：balb/cnude(北京维通利华实验动物技术有限公司)，4周龄，15-17克。

1、稳定表达luciferase的4121gsc制备

1)病毒包装

提前24h将1.5×10⁶个hek293细胞接种于10cm培养皿中，利用磷酸钙转染法将慢病毒包装质粒pspax2(5μg)和pci-vsvg(5μg)以及pcdh-luciferase-neo质粒(5ug，表达luciferase)分别转染至hek293细胞中，转染12h后换成nbm完全培养基。细胞培养72h后收集病毒上清，3000rpm离心3min，病毒上清用0.45μm过滤器进行过滤，收集过滤后的病毒(记为含有pcdh-luciferase-neo病毒)置于-80℃保存。

按照上述方法，将pcdh-luciferase-neo质粒替换为对照质粒pcdh-neo，其他步骤均不变，得到阴性对照病毒(即pcdh-neo病毒)。

2)病毒感染gsc并筛选阳性细胞

将1.5×10⁶个gsc(4121gsc)接种于10cm培养皿中，分别加入5ml含有pcdh-luciferase-neo和阴性对照病毒上清，然后用nbm完全培养基补齐至10ml，将细胞置于培养箱中培养48h后，用accutase消化细胞至单个，用含有g4181mg/ml的nbm完全培养基重悬细胞筛选实验组gsc(由含有pcdh-luciferase-neo病毒上清得到)以及阴性对照gsc(由含有阴性对照病毒上清得到)。

3)鉴定gsc中luciferase表达

取等量实验组gsc以及阴性对照gsc于96孔板中，加入适量luciferin底物于孔板中(避光操作)，待其反应5-10分钟后，利用酶标仪对相应的孔进行读值。若实验组gsc读值远远大于阴性对照gsc，则表明实验组gsc稳定表达luciferase，即稳定表达luciferase的gsc制备成功。

2、稳定表达luciferase的4121gsc制备

将稳定表达luciferase的4121gsc利用nbm基础培养基(neurobasalmedium，thermofisher公司，货号12348-017)稀释后原位注射至免疫缺陷小鼠颅内右额叶部位构建gbm移植瘤模型，每只小鼠注射5×10⁴个细胞，在肿瘤生长到一定大小时(注射第16天)，将其随机分为对照组(ctrl)和roca处理组，每组6只。而后对于roca处理组，利用橄榄油稀释roca后进行腹腔注射，每次roca注射量为2.5mg/kg体重,三天一次，共八次，roca处理组每次注射roca时对照组注射等体积的橄榄油。利用活体成像实时监测肿瘤生长情况，并记录荷瘤小鼠的生存期。

结果发现roca处理能够明显抑制肿瘤生长(图2中a)，并延长荷瘤小鼠的生存周期(图2中b)。在细胞注射构建移植瘤模型第36天，对照组和roca处理组的肿瘤活体成像读取的lucifer值(生物发光数，单位：p/s/cm²/sr)分别为11851666.67±3848361.05与1145000±360240.66，两组具有显著差异；对照组和roca处理组的中位生存期分别为33和47天，两组具有显著差异。

进一步对鼠脑组织切片染色，发现roca处理后导致肿瘤组织氧化损伤明显增加，凋亡细胞比例升高以及肿瘤干细胞比例降低(图2中c)，sox2阳性细胞在对照组和roca处理组中的百分比分别为23.34±1.62与7.51±0.92，两组具有显著差异，tunel阳性细胞在对照组和roca处理组中的百分比分别为16.67±0.95与2.62±0.34，两组具有显著差异。所用试剂为deadendfluorometrictunelsystem试剂盒：promega公司，g3250；sox2抗体：santacruz公司货号sc-17230。

第二次给予roca处理后12小时收取鼠脑组织，质谱分析roca含量，发现经腹腔注射给药后roca能够透过血脑屏障(图2中d)，但其对小鼠的体重，肝肺以及正常脑组织均没有影响，免疫荧光染色检测脑室下区中sox2、cleaved-caspase3，脑室下区sox2、cleaved-caspase3无明显变化(图2中e，2中f，2中g)。所用试剂为sox2抗体：santacruz公司货号sc-17230；cleaved-caspase3抗体：cellsignalingtechnology公司货号#9664。

综合以上实验结果，发现：roca能够靶向结合phb从而抑制gsc自我更新，抑制gbm移植瘤恶性进程。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>军事科学院军事医学研究院生物医学分析中心

<120>phb抑制剂在胶质瘤治疗中的应用

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1830

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>1

atggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacggg60

accgccggcgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatc120

gcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttcgagatgagc180

gttcggctggcagaagctatgaagcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtg240

tgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtg300

gctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatc360

agccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcaaaagatcctcaacgtgcaa420

aagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggc480

ttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccggcttcaacgagtacgac540

ttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggc600

agtaccggattgcccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagt660

catgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatcatccccgacaccgctatcctcagcgtg720

gtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggcttt780

cgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactat840

aagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagcttcttcgctaagagcactctc900

atcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgagatcgccagcggcggggcgccgctcagc960

aaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctac1020

ggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggc1080

gcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaag1140

acactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggc1200

tacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagc1260

ggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagc1320

ctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaa1380

caccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctg1440

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tatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggac1560

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