一种含生物发酵制备的黑色素前体物的染发产品的制备方法与应用与流程

本发明涉及黑色素前体物制备的染发产品灭菌技术领域，具体地说，涉及一种含生物发酵制备的黑色素前体物的染产发品的制备方法与应用。

背景技术：

化学染发剂含有苯胺类、氢醌和氨基酚类物质以及氨水和过氧化氢等致癌和致敏的物质，已引起广大消费者的极大关注。为了给大众提供安全无害的染发产品，国内外已经进行了多年的开发工作。比如：从植物中提取植物色素乌发剂(专利cn101164528a)；通过微生物基因工程技术，利用表达霉菌属丝状菌细胞中的儿茶酚氧化酶，对多巴及其衍生物进行氧化，将其转变为黑色素前体的方法(专利cn101914585b)；生物黑色素合成及组合产品(专利cn106854383a和cn105267055a)；从产黑色素的芽孢杆菌发酵液中提取复合酶制备黑色素(专利cn102586328a)；从食用真菌蘑菇中提取的复合酶液制备的天然黑色素及使用方法和多剂型黑色素前体物质染发剂组合产品(专利cn102586328a、cn106109258b和cn106038411a)。

在利用植物等生物体中提取的复合酶经生物发酵并转化为黑色素，再经一系列工艺流程制备成的黑色素染发剂(中国专利cn103202795a，cn101164528a，cn105411980a，cn106109258b和cn106038411a)中，在专利cn102586328a、cn106109258b和cn106038411a所述的由食用菌提取的复合酶液中不仅含有可乌发的黑色素物质，还富含多种营养成分，如蛋白质、氨基酸、维生素和糖类等，这些富养物质具有养发作用，同时也是微生物滋生的营养物质。在生产过程中，随着有效成分和营养成分的浓缩，细菌总数也会成倍增加，如不进行杀菌防腐措施，带菌产品不可能成为合格的上市商品。但由于1.原料的属性：如植物、食用菌以及提取液中的复合酶等具有生物属性，酶在高温高压处理易失活；2.产品的有效成分功效：复合酶经生物发酵并转化为黑色素前体物在高温高压下易集聚为大的黑色素颗粒，即失去染发功效。3.产品的安全性:要达到对人体无毒害，制剂配方中的添加剂需达到对人体无毒害的要求，故利用超高温和高压的灭菌方法和添加化学类防腐剂均不适宜在此类产品制备中采用而产品的安全质量直接影响到产品的上市和货架贮藏期长短及功效的稳定性。因此，工厂化生产生物黑色素产品必然面临着更为不同寻常的杀菌工艺问题。利用植物等生物体中提取的复合酶经生物发酵并转化为黑色素前体物制备黑色素染发产品的生产中以何时、采用何种方式进行杀菌，制成安全上市产品，至今均无文献报道。

作为生产中常用的生物发酵产品的杀菌方法，生产企业会根据各种产品的特性及其安全质量标准，采用不同杀菌方法。如巴氏低温灭菌法、超高温瞬时杀菌法、超高压灭菌和辐照杀菌等。具体地，巴式低温灭菌法，在61.7℃-62.8℃下处理30分钟，也可在71.6℃或略高温度下处理15分钟。该方法能有效杀灭生长型致病菌，但不能彻底杀灭芽孢杆菌。最终产品需要冷藏保存，保质期短，一般2天到15天不等，多用于奶类和酒类的灭菌工艺。超高温瞬时杀灭法(135℃-150℃，时间维持3-4秒)的处理方法，可以完全杀灭生长的微生物和芽孢，但需要相应的高温高压和速降温设备。间歇蒸汽灭菌法需要连续重复3天以上的工序，操作费时、工效低。超高压灭菌和辐照杀菌，需要在具有特殊超高压和辐射灭菌设备的、有专业资质的机构进行处理。

以上所列的杀菌方法，对于经生物发酵技术制备的生物黑色素产品均不合适。或因终产品无灭菌措施造成各种菌类将大量繁殖，有效营养成分被微生物消耗，已无利用价值；或因生物酶的生物属性，高温或高压，使酶失活，无法进行发酵反应；或因不适高温处理不能完全杀死产品内的耐高温的微生物，特别是芽孢杆菌，造成产品有菌，无法长期保存；而超高温和高压下，有效物质黑色素前体物易转化集聚为黑色素，失去产品应有的功效。故目前此类产品，均无法作为上市产品，故有必要提供一种新的解决含生物黑色素前体物的产品的杀菌问题的方法，解决现有生产技术中的缺陷。

技术实现要素：

为解决天然生物色素染色产品的上市防腐保质问题，并达到最大限度保护生物黑色素染色产品中的有效成分和营养成分，保证产品的染色和养护功效。本发明提供一种可用于生物黑色素前体物生产工序中的高温灭菌工艺，为工业化生产生物黑色素产品领域提供一种必不可少的杀菌新工艺。

为了实现本发明该目的，本发明的技术方案如下：

一种含生物发酵制备的黑色素前体物的染发产品的制备方法，其先将生物发酵制备的黑色素前体物的浓缩液在常压下，90℃-95℃灭菌30-40分钟后，间隔14小时-16小时，再次在常压下，90℃-95℃灭菌30-40分钟获得灭菌后的黑色素前体物溶液，之后再与辅料混合制备染发产品。

本发明中，利用生物发酵制备的黑色素前体物的制备方法与中国专利cn106109258b或cn106038411b中的黑色素前体的制备方法相同。

本发明中，利用生物发酵制备的黑色素前体物中包括多巴色素、5，6-二羟基吲哚、5，6-二羟基吲哚-2-羧酸中的一种或多种。优选地，包括5，6-二羟基吲哚。

由于本发明的黑色素前体物溶液是利用食用菌经生物发酵方式制备得到的，故本领域技术人员可以理解，该溶液中还含有蛋白质、氨基酸多糖、脂类等物质。

在染发剂产品制备时，灭菌处理的对象可为生产中间产物如发酵液、浓缩液，或制成的终产品。本发明发现浓缩液相比终产品更能达到完全灭菌的效果，故灭菌对象选取浓缩液。采用本发明灭菌方法既确保了生物复合酶的生物活性，不失发酵转化的功能，且工艺易行，便于采样检测，减少污染机会。

本发明两次灭菌均在常压下进行，既利于生产上的安全操作，又无需增添新的高压灭菌设备，降低了生产成本。浓缩液可在常压加热设备如水浴锅、干燥箱或发酵罐中进行灭菌，降低了高压高温对有效成分的破坏作用。本发明特定加热温度和时间的选择既可保证黑色素前体物质及营养成分最大限度的保留，又可保证微生物的完全杀灭，既提升了产品安全性又延长了保质期。

优选地，本发明可采用水浴加热方式进行灭菌，以既利于浓缩液获得持续稳定的温度，又可利用其与浓缩罐配套使用进行不同产量的灭菌，不需要另配一套蒸汽加热加压设备，节能省时便于安全操作。

优选，两次灭菌的温度均为95℃。

优选，两次灭菌的时间均为30分钟。

优选，两次灭菌间隔的时间为14小时。

优选地，两次灭菌的温度均为95℃，灭菌时间均为30分钟，两次灭菌间隔的时间为14小时。

采用此组合方式进行灭菌，既利于有效杀灭浓缩液中生长型致病菌和芽孢杆菌，产品在常温状态下储存90天后，经微生物检测杀菌率达100％，且与非高温处理的产品相比黑色素前体物质仅减少0.003％，达到了有效杀灭产品微生物和最大限度的保留黑色素前体物质及有效营养成分的效果。

本发明中，所述辅料为染发剂常用助剂和水。

本发明中，所述染发剂常用助剂的组成及所述染发剂常用助剂和水在所述染发剂中的用量与中国专利cn106109258b或cn106038411b相同。

本发明还提供一种染发剂，其根据上述的制备方法制备得到。

所述染发剂中还可包括复合防腐剂。

优选地，复合防腐剂为苯氧乙醇、苯甲酸或山梨酸钾配伍。

优选地，山梨酸钾和苯甲酸在膏体中的配比质量分数为0.3％和0.25％。

优选地，山梨酸钾和苯氧乙醇在膏体中的配比质量分数为0.3％和0.5％。

优选地，苯甲酸和苯氧乙醇在膏体中的配比质量分数为0.25％和0.5％。

优选地，所述染发剂为膏体，其粘附性高，染色效果稳定。

优选地，所述染发剂常用助剂为润湿渗透剂、增稠剂、表面活性剂、保湿剂、ph值调节剂。具体在染发剂中的组合和含量可参见中国专利cn106109258和cn106038411b中的配方。

所述染发剂无菌、对皮肤无刺激无致敏作用，安全性高，可保持自然黑的染发效果。

本发明还提供一种黑色素前体物灭菌溶液，其根据上述的制备方法中，制备灭菌后的黑色素前体物溶液的方法制备得到。

该黑色素前体物灭菌溶液相较于现有技术中的以生物发酵方式制备的黑色素前体物溶液具有完全不含微生物，且功效成分和营养物质均得到很好保留的特点。

本发明制备方法具体包括：

(1)食用菌复合酶液的提取；

(2)进行发酵转化，得到含黑色素前体物质的溶液；

(3)将步骤(2)中得到的溶液进行浓缩、成分调整(主要是将多巴色素转化成5，6-二羟基吲哚，5，6-二羟基吲哚-2-羧酸中的一种或多种)得到浓缩的黑色素前体物溶液；

(4)对步骤(3)中得到浓缩的黑色素前体物溶液，进行分段式高温灭菌；灭菌步骤：

(a)将浓缩的黑色素前体物溶液装入可加热的密闭容器中，装入到灭菌设备中；

(b)开启灭菌设备温度开关，将温度设定在90℃-95℃。当容器内溶液温升到设定温度时，保持温度并进行30分钟-40分钟灭菌，灭菌后，自然冷却；

(c)放置14小时-16小时后，再进行第二次高温90℃-95℃，30分钟-40分钟灭菌；

(5)灭菌后，取样，微生物检测，添加染色剂辅料制成膏体。

所述可加热的密闭容器可以是耐高温玻璃瓶或发酵罐。

所述灭菌设备可以是水浴锅、干燥箱、发酵罐中的一种。

制膏设备可采用搅拌机、乳化锅，发酵罐中的一种。

步骤(1)-(3)、(5)具体可参见中国专利cn106109258和cn106038411中的记载。

本发明的有益效果至少在于：

经生物发酵转化制备的染发产品，由于原料来自植物和食用菌等，其内不仅含有黑发有效成分和丰富的营养成分，还携带有大量的微生物(例如，蘑菇来源带入的细菌，霉菌等)，如生产工序缺乏灭菌环节而使得微生物容易残留繁殖，造成产品无法上市销售。本发明解决了以生物发酵方式制备黑色素前体物溶液的灭菌问题，并最终获得了安全性和有效性佳的染色产品。同时兼顾到了功效成分和营养物质的保留，实现了常规灭菌方法都无法达到的技术效果。

具体地，常规利用巴式低温灭菌的方法，不能达到完全灭菌和长期无菌效果；单纯使用复合防腐剂起不到应有的作用；利用超高温会使生物染色剂中有效成分失活，使原有的营养价值降低或失活，染色养护功效降低或失效；间歇蒸汽灭菌法需要特定设备，且需连续重复3天以上的工序，操作费时、工效低。均不适用于本发明的特定待灭菌对象的工业生产。

本发明通过在现有黑色素前体物质染色剂的制备工艺中，添加分段式高温杀菌工艺，解决了生物黑色素产品的杀菌问题，且此工艺简单易行，利用现有设备条件，不需要特殊的高压和超高温设备，在100℃以下的常压状态下，即将黑色素产品中的微生物(病原体、芽孢等)彻底杀灭，产品在常温状态下储存90天后，微生物菌落总数检测仍为零，且产品中的有效物极少损失，与非高温处理的产品相比仅减少0.003％，终产品的染色功效不减。最大限度的保留了黑色素前体物质及有效营养成分的效果，且整体工艺简单易行，利于工业化推广。

附图说明

图1为本发明实验例2中不同处理后的样品肉眼检测结果；

图2为本发明实验例2中不同处理后的样品微观检测结果；

图3为本发明实验例2中储存90天后的样品微观检测结果；

其中，图2、图3中的背景是衬托纸的颜色；

图4为本发明实验例3中利用紫外分光光度计检测对照处理的有效成分的吸收光谱；

图5为本发明实验例3中利用紫外分光光度计检测实施例3的膏体的有效成分的吸收光谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明具体实施方式部分所记载的以生物发酵方式制备的黑色素前体物溶液由中国专利cn106038411的实施例3的方法制备得到的。

对比例1

本对比例对以生物发酵方式制备的黑色素前体物溶液进行灭菌操作，具体步骤如下：

(1)将发酵后获得的黑色素前体物溶液经8倍浓缩获得的浓缩液装入耐高温玻璃瓶子内，密封，将瓶子放置于水浴锅中，向水浴锅中加入清水至瓶子中浓缩液的高度，将水浴锅温度设定至85℃，当水温达到85℃时，保持温度20分钟，完成后将密封的瓶子从水浴锅中拿出，室温放置。

(2)间隔14小时后再次放置于水浴锅中，以与上述步骤相同的方法进行第二次高温灭菌。完成后在无菌操作台将浓缩液倒出，加入检测无菌的各辅料制备成生物黑色素染色膏体后(膏体制作方式具体参见中国专利cn106038411的实施例4)，灌装。

对比例2

本对比例对以生物发酵方式制备的黑色素前体物溶液进行灭菌操作，具体步骤如下：

(1)将发酵后获得的黑色素前体物溶液经8倍浓缩获得的浓缩液装入耐高温玻璃瓶子内，密封，将瓶子放置于水浴锅中，向水浴锅中加入清水至瓶子中浓缩液的高度，将水浴锅温度设定至85℃，当水温达到85℃时，保持温度30分钟，完成后将密封的瓶子从水浴锅中拿出，室温放置。

(2)间隔14小时后再次放置于水浴锅中，以与上述步骤相同的方法进行第二次高温灭菌。完成后在无菌操作台将浓缩液倒出，加入检测无菌的各辅料制备成生物黑色素染色膏体后(膏体制作方式具体参见中国专利cn106038411的实施例4)，灌装。

实施例1

本实施例对以生物发酵方式制备的黑色素前体物溶液进行灭菌操作，具体步骤如下：

(1)将发酵后获得的黑色素前体物溶液经8倍浓缩获得的浓缩液装入耐高温玻璃瓶子内，密封，将瓶子放置于水浴锅中，向水浴锅中加入清水至瓶子中浓缩液的高度，将水浴锅温度设定至90℃，当水温达到90℃时，保持温度30分钟，完成后将密封的瓶子从水浴锅中拿出，室温放置。

(2)间隔14小时后再次放置于水浴锅中，以与上述步骤相同的方法进行第二次高温灭菌。完成后在无菌操作台将浓缩液倒出，加入检测无菌的各辅料制备成生物黑色素染色膏体后(膏体制作方式具体参见中国专利cn106038411的实施例4)，灌装。

实施例2

本实施例对以生物发酵方式制备的黑色素前体物溶液进行灭菌操作，具体步骤如下：

(1)将发酵后获得的黑色素前体物溶液经8倍倍浓缩获得的浓缩液装入耐高温玻璃瓶子内，密封，将瓶子放置于水浴锅中，向水浴锅中加入清水至瓶子中浓缩液的高度，将水浴锅温度设定至95℃，当水温达到95℃时，保持温度30分钟，完成后将密封的瓶子从水浴锅中拿出，室温放置。

(2)间隔14小时后再次放置于水浴锅中，以与上述步骤相同的方法进行第二次高温灭菌。完成后在无菌操作台将浓缩液倒出，加入检测无菌的各辅料制备成生物黑色素染色膏体后(膏体制作方式具体参见中国专利cn106038411的实施例4)，灌装。

实施例3

本实施例对以生物发酵方式制备的黑色素前体物溶液进行灭菌操作，具体步骤如下：

(1)将发酵后获得的黑色素前体物溶液经8倍浓缩获得的浓缩液装入发酵罐内，密封，温度设定至95℃，开启搅拌当罐内温达到95℃时，保持温度30分钟，杀菌完成后，关闭搅拌开关，室温放置自然冷却。

(2)间隔14小时后，以与上述步骤相同的方法进行第二次高温灭菌。灭菌完成后在10万级洁净度工作间中加入检测无菌的各辅料制备生物黑色素染色膏体后(膏体制作方式具体参见中国专利cn106038411的实施例4)，灌装。

实验例1

本实验例分别对对比例1-2、实施例1-3制备成的膏体样品随机取样，进行微生物菌落总数检测，并设对照处理，对照处理为未进行高温处理的样品(浓缩液未经高温处理后直接制成的染色膏)。

微生物菌落总数的检测步骤，参照《食品微生物学实验技术》第二版，具体步骤为：

1.制备营养琼脂培养基后，经121℃20分钟灭菌；

2.在超净工作台中将各膏体样品稀释10倍和稀释100倍，以1毫升的接种量，接种在灭菌的培养皿中，每个浓度样品设3个重复。将灭菌冷却到45℃左右的培养基20毫升左右倾倒到培养皿中与样品摇匀。

3.在37℃恒温箱中培养48小时后进行计数，数据为3个重复的平均菌落数。

检测结果见表1。

表1不同处理的浓缩液中微生物菌落总数检测结果

由表1数据可知，浓缩液在85℃，20分钟，灭菌一次的浓缩液微生物生长不可计数，在灭菌2次的浓缩液稀释10倍的培养基中有少量菌落的生长(10cfu/ml)，制成膏后的微生物生长情况不可计数，以及在85℃，30分钟，稀释10倍的培养基中有少量菌落的生长(20cfu/ml)外，其他灭菌处理例均无菌落的生长。对照处理的菌落均为不可计数。本发明灭菌效果佳。

本实验例进一步将对比例2、实施例1-3制备成的膏体样品和对照处理样品放在室温(23℃-27℃)下，30天、60天、90天后进行上述测试，除对照处理样品外，各样品微生物检测均无菌落生长，而对照处理样品菌落总数均为不可计数。具体检测结果见表2。

表2不同处理不同储藏期间膏体样品微生物菌落总数检测结果

由表2数据可知，本发明灭菌工艺方法在不开封条件下防腐效果佳，在室温下存放可长达90天。

实验例2

本实验例分别对实施例1-3制备成的膏体样品对白发的上色能力进行检测，并设对照处理，对照处理为未进行高温处理的样品。

具体检测步骤如下：

1.将一束白色头发用洗发液清洗后，将膏体样品均匀涂于头发表面，40分钟后用清水清洗；

2.将助染剂b剂(具体参见中国专利cn106038411的实施例4)均匀涂于头发表面，15分钟后，用清水清洗。

3.肉眼检测：利用照相机对染发结果进行照相，结果参见图1。

4.微观检测：利用皮肤镜对染发结果进行照相，结果参见图2。

由图1-图2可知，经过高温处理并不会改变产品的染色效果。

本实验例进一步对室温(25℃-30℃)下，储存90天后的对照处理和实施例3的膏体样品对白发的上色能力进行微观检测，检测结果见图3。

由图3可知，经过高温处理的膏体在常温下放置90天后并未失去活性，仍然能够将头发染黑。

实验例3

本实验例对实施例3制备成的膏体样品中的黑色素前体物质的含量进行检测，并设对照处理，对照处理为未进行高温处理的样品。

生物黑色素前体物质含量的检测方法为：取样品稀释10倍，利用紫外分光光度计检测黑色素有效成分的吸收光谱。黑色素前体物质溶液的最大吸收峰在300nm处。检测结果见图4-图5。

由图4可知，对照处理未经高温杀菌制成的膏体中有效成分(5，6-二羟基吲哚)的含量为0.412％。由图5可知，实施例3高温杀菌后制成的膏体中有效成分(5，6-二羟基吲哚)的含量为0.409％，高温灭菌后有效成分仅损失0.003％，由此表明本发明的灭菌方式对以生物发酵方式制备的黑色素前体物中的有效成分含量影响极小。

实验例4

本实验例对实施例3制备成的膏体样品在室温(23℃-27℃)下，储存90天和延后(半年、一年)时间的微生物的生长情况进行测试(测试方法同实验例1)。具体结果见表3。

表3

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。