小白菊内酯在制备MCR-1酶抑制剂中的应用

本发明公开了小白菊内酯的一种新的用途，进一步讲涉及小白菊内酯在制备mcr-1酶抑制剂中的医用用途，属于医学制药技术领域。

背景技术：

现有抗生素并不能有效治疗多重耐药革兰氏阴性菌所引起的感染，加之新型抗生素研发周期较长并且十分困难，多黏菌素被用作治疗革兰氏阴性“超级细菌”感染的最后一线药物。目前，广谱抗生素的不合理使用导致细菌对其耐药性增加，而质粒介导的粘菌素耐药基因mcr-1(编码介导多粘菌素耐药蛋白酶mcr)的出现对多药耐药肠杆菌科的严重感染构成了巨大的临床威胁。因此应迫切寻找新的应对策略解决这一难题，寄希望能够寻找到与多黏菌素协同发挥杀菌效力的天然化合物。

中药作为我国的瑰宝，其具有安全、绿色、环保，细菌耐药性不敏感，多靶点标本兼治等特点。其中菊花是一种需求量大的药食同源药材，具有散风清热，平肝明目，清热解毒的功效，有的供药用或作消暑清凉饮料如滁菊、杭白菊等，有清凉镇静的功效，治头痛、眩晕、血压亢进，神经性头痛及眼结膜炎等症。现代药理学研究表明，菊花的主要活性成分包括小白菊内酯、小蘖碱、菊色素以及黄酮等化合物。小白菊内酯具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药理作用，同时对白血病和肺纤维化、肝脏疾病等也有一定的疗效。但截至目前国内外未见小白菊内酯在制备mcr-1抑制剂中的相关报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种小白菊内酯在制备mcr-1抑制剂中的医用用途，公开了小白菊内酯抑制mcr-1酶的活性，恢复多黏菌素e对mcr-1大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性肠杆菌的杀菌活性。

本发明所述的小白菊内酯，其分子式：c15h20o3，分子量：248.32；

本发明通过棋盘法最小抑菌浓度试验和时间-杀菌曲线法验证小白菊内酯能够抑制mcr-1酶的活性并恢复多黏菌素e对mcr-1阳性肠杆菌的抗菌活性，试验所用肠杆菌主要包括mcr-1阳性大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和沙门氏菌。进一步通过建立小鼠肺炎感染模型证明小白菊内酯联用多黏菌素e对能够产生mcr-1阳性菌造成的感染具有良好的治疗效果。

本发明的积极效果在于：

提供了小白菊内酯在制备mcr-1酶抑制剂中的新医用用途，公开了小白菊内酯能够抑制mcr-1酶的活性，恢复多黏菌素e对mcr-1肠杆菌的杀菌活性。体内实验中，小白菊内酯联用多黏菌素e对mcr-1阳性肺炎克雷伯菌引起的感染具有良好的治疗效果，具有广泛的医用用途。

附图说明

图1为：小白菊内酯对mcr-1阳性肺炎克雷伯菌的生长曲线；

图2为：小白菊内酯联合多黏菌素e对mcr-1阳性肺炎克雷伯菌的时间-杀菌曲线；

图3为：小白菊内酯联合多黏菌素e对肺炎克雷伯氏菌小鼠肺炎感染的治疗率；

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

试验例1

最小抑菌浓度试验

于96孔无菌微孔板内按棋盘法进行小白菊内酯、多黏菌素e单用及二者联用抗产mcr-1大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和沙门氏菌的抑菌活性实验，确定二者单独应用及联合应用mic值，计算部分抑菌浓度指数(fic)。fic＝mic(多黏菌素e联合)/mic(多黏菌素e单用)+mic(小白菊内酯联合)/mic(小白菊内酯单用)，结果见表1：

表1小白菊内酯联用多黏菌素e对mcr-1阳性菌分离株的mic及fic值

结论：小白菊内酯单独应用不具备抑菌效果，与多黏菌素e联用能够降低多黏菌素e对mcr-1阳性大肠杆菌的mic值4倍，对mcr-1阳性肺炎克雷伯氏菌mic值16倍，对mcr-1阳性沙门氏菌mic值8倍，fic数值表明二者具有协同作用。

试验例2

生长曲线试验

取mcr-1阳性肺炎克雷伯氏菌分离株接种至lb液体培养基中过夜培养(37℃，200rpm)，次日1:100扩培至od600nm为0.3左右，分装于5个锥形瓶(20ml/瓶)中，设定不加药物组和不同浓度小白菊内酯处理组。37℃，200rpm继续培养，每隔0.5h测定并记录每组样品的od600nm，直至细菌生长至平台期，绘制生长曲线(图1)。

结论：在6或8h的培养时间内，小白菊内酯处理组(32～512μg/ml)与未加药物处理组相比，细菌生长至平台期od600nm值无显著差异，表明小白菊内酯在有效浓度范围内不影响细菌正常生长。

试验例3

时间-杀菌曲线试验

取mcr-1阳性肺炎克雷伯氏菌分离株过夜培养物，调整至1×10⁸cfus/ml，备用。取无菌试管4组(无药对照组、64或128μg/m小白菊内酯组、4或8μg/ml多黏菌素e组及小白菊内酯联用多黏菌素e组)，每组标记为1、3、5、7、9h，所有试管内均加入1ml高压灭菌的lb培养基，之后，每管内均加入10μl调整后的菌液，使每个试管内的菌液浓度为5×10⁵cfus/ml。其中小白菊内酯组、多黏菌素e组及小白菊内酯联用多黏菌素e组分别加入对应用量的抗生素及抑制剂，混匀之后立即将无抗生素对照组的菌液进行涂板计数，作为0h的菌落数。之后，每1、3、5、7及9h分别取对应试管内的菌液，涂板计数，绘制时间-杀菌曲线(图2)。

结论：小白菊内酯与多黏菌素e联用组在10h内均比无药对照组、小白菊内酯组和多黏菌素e组杀菌效果显著，且效果稳定。

试验例4

小鼠肺炎感染模型治疗试验

小鼠肺炎克雷伯氏菌感染模型

c57bl/6小鼠(雌性，约20g)麻醉后，经滴鼻方式接种mcr-1阳性肺炎克雷伯氏菌悬液(5×10⁷cfus/只小鼠)，建立肺炎克雷伯氏菌小鼠肺炎感染模型。

治疗实验

将感染的小鼠随机分为5组，每组包括10只小鼠，每个组小鼠分别给予多黏菌素e(5mg/kg体重)、小白菊内酯(25mg/kg)、小白菊内酯(25mg/kg)联用多黏菌素e(5mg/kg)，溶剂对照组(dmso)与空白对照组(无任何处理组)。所有组小鼠均通过皮下注射给药，每12h给药一次。观察小鼠状态并记录死亡时间，结果见附图3。

结论：经小白菊内酯联用多黏菌素e治疗后，显著降低小鼠死亡率，小白菊内酯或多黏菌素e单独治疗组不具有显著的效果。

技术特征：

1.小白菊内酯在制备mcr-1酶抑制剂中的应用，其特征在于，小白菊内酯可抑制mcr-1的活性，恢复多粘菌素e对mcr-1阳性病原菌的杀菌活性。

2.如权利要求1所述的mcr-1阳性病原菌，其特征在于mcr-1阳性大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和沙门氏菌。

技术总结
本发明涉及小白菊内酯在制备MCR‑1酶抑制剂中的应用，通过棋盘法和时间‑杀菌曲线法验证小白菊内酯能够恢复多粘菌素对MCR‑1大肠杆菌、肺炎克雷氏菌和沙门氏菌等革兰氏阴性肠杆菌的杀菌活性，通过建立小鼠肺炎感染模型证明小白菊内酯联用多粘菌素对产MCR‑1阳性菌感染具有良好的治疗效果。因此小白菊内酯是一种有效的MCR‑1耐药酶抑制剂，与多粘菌素联用，对携带MCR‑1耐药菌感染具有良好的实验治疗学作用。

技术研发人员：王建锋;张思琪;周永林;吕强华;邓旭明;冯海华;王琳;邓彦宏
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2021.04.20
技术公布日：2021.06.15