一种排钱草总生物碱提取物及其应用的制作方法

本发明涉及一种中药提取物及其应用，具体涉及一种排钱草总生物碱提取物及其抗肝纤维化的应用。

背景技术：

排钱草别名龙鳞草、尖叶阿婆钱，为豆科植物排钱草phyllodiumpulchellum(l.)desv的干燥根，主要分布于广西、广东、江西等区域。具有活血化瘀、清热散水的作用。常使用于肋骨疼痛、月经不调、闭经等症状。医学文献介绍，排钱草可以用于感冒发热，咽喉肿痛，牙疳，风湿痹痛，水肿，肝脾肿大，跌打肿痛，毒虫咬伤等症，目前，对排钱草药材的化学成分（【题名】phenolicconstituentsfromtherootsofphyllodiumpulchellum【作者】zongy，zhongm，lidm，etal，大连医科大学【刊名】journalofasiannaturalproductsresearch，2014(07):741-746，【题名】壮药排钱草根的抗肝纤维化成分研究【作者】王超，钟鸣，张宝璟，等，大连医科大学【刊名】中药材，2014(03):424-427，【题名】phytochemicalcomposition，hepatoprotectiveandantioxidantactivitiesofphyllodiumpulchellum(l.)desv【作者】ya-chuf，shi-juny，zhong-longg，etal，中国海洋大学【刊名】molecules，2018(06):1361-1375，【题名】排钱草化学成分的研究【作者】范亚楚，郭中龙，信兰婷，等，中国海洋大学【刊名】中成药，2017(06):1195-1198）、质量评价（【题名】排钱草药材质量评价方法的研究【作者】钟鸣，张宝璟，王超，等，广西民族医药研究院【刊名】中成药，2016(01):130-133）以及药理活性（【题名】壮药排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞胶原和细胞因子生成的影响【作者】陈少锋，赵湘培，余胜民，广西民族医药研究院【刊名】中国民族医药杂志，2017(03):49-51，【题名】排钱草生物碱对乙醛刺激的人源肝星状细胞增殖及细胞外基质的影响【作者】钟鸣，张宝璟，王超，等，广西民族医药研究院【刊名】中国现代应用药学，2017(01):4-7，【题名】排钱草总生物碱对hsc-t6细胞胶原蛋白及细胞因子mrna表达的影响【作者】陈少锋，赵湘培，余胜民，等，广西民族医药研究院【刊名】现代医药卫生，2017(24):3709-3711，【题名】排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞相关细胞因子蛋白表达的影响【作者】陈少锋，赵湘培，余胜民，等，广西民族医药研究院【刊名】广西医学，2018(02):174-176，【题名】排钱草总生物碱对人肝星状细胞增殖及肝纤维化相关胶原蛋白、细胞因子的影响【作者】黄洁玲，钟鸣，余胜民，广西中医药大学【刊名】中国实验方剂学杂志，2013(13):283-286，【题名】排钱草总生物碱对肝纤维化大鼠血清干扰素-γ和肝脏组织病理学的影响【作者】黄琳芸，钟鸣，杨增艳，等，广西民族医药研究所【刊名】中国中医药科技，2006(02):101-102，【题名】排钱草总生物碱对免疫性肝纤维化大鼠ⅰ、ⅲ、ⅳ型胶原及tgf-β_1表达的影响【作者】钟鸣，余胜民，杨增艳，等，广西民族医药研究所【刊名】中西医结合肝病杂志，2005(01):38-40等方面的研究比较深入，而对排钱草总生物碱提取物的制备及质量检测相关问题并未见相关研究报道。

随着药学科技的发展，精制的天然植物提取物低毒高效的特性受到人们越来越多的青睐。研究表明，排钱草主要药效成分为生物碱类成分。另外，排钱草药用部位为根，应用中具有重量大、储存难、运输不便等缺点。制备排钱草总生物碱提取物即能保证与药材主要功效的一致性，又能弥补上述不足，起到增效减毒、提升质量的作用。因此研发一种排钱草总生物碱提取物的制备及质量检测方法，保证提取物质量是非常有必要的，利于开发排钱草新的药用途径，并为药材资源的充分利用及提高其应用价值提供科学的依据。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供排钱草总生物碱提取物及其在制备抗肝纤维化药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明排钱草总生物碱提取物及其应用包括如下制备方法及应用中的一种或多种。

1、排钱草总生物碱提取物的制备

1.1排钱草药材提取液的制备：取排钱草干燥药材，粉碎，按干燥药材重量，加10~20倍的体积含量60%~80%乙醇回流提取2~4次，每次1~2小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇并减压浓缩无醇味，浓缩至料液比为1﹕10~1﹕15的排钱草提取液；（以下乙醇含量都指体积含量）；

1.2大孔树脂的处理：取大孔树脂（d101），用95%的乙醇浸泡24h，湿法装柱，然后再用95%的乙醇溶液洗涤，直到洗脱液与水混合（体积比为1∶3）不成白色浑浊为止，再水洗至无醇味；

1.3操作法：取上述提取液以1~3bv/h速度置已处理好的大孔树脂柱吸附，先用1~2bv水洗脱，弃去洗脱液，再用3~5bv量50%~70%乙醇以3~5bv/h速度洗脱，收集乙醇液洗脱液，洗脱液减压浓缩至浸膏，50℃真空干燥，即得到排钱草总生物碱提取物。

排钱草总生物碱提取物的制备方法还可以是：取排钱草干燥药材，粉碎，按干燥药材重量，第一次加20倍体积含量的70%乙醇回流1.5小时，第二次加15倍的70%乙醇回流1.5小时，第三次加10倍的70%乙醇回流1.5小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇并减压浓缩无醇味，浓缩至料液比为1﹕10的排钱草提取液；取上述提取液以2bv/h速度置已处理好的大孔树脂（xad1180或xad1600n）柱吸附，先用1bv水洗脱，弃去洗脱液，再用4bv量60%乙醇以4bv/h速度洗脱，收集乙醇液洗脱液，洗脱液减压浓缩至浸膏，50℃真空干燥，即得到排钱草总生物碱提取物。

排钱草总生物碱提取物的质量检测包括以下步骤：

（1）排钱草总生物碱提取物采用5-甲氧基-n,n-二甲基色胺对照品与排钱草对照药材进行色谱比较鉴别；

（2）排钱草总生物碱提取物中5-甲氧基-n,n-二甲基色胺成分的质谱定性分析；

（3）排钱草总生物碱提取物中总生物碱含量用紫外-可见分光光度法进行定量分析。

首先，我们先给出排钱草总生物碱提取物的检测方法：

一、排钱草总生物碱提取物的鉴别（薄层色谱法）

1.对照品溶液的制备：取5-甲氧基-n,n-二甲基色胺对照品适量，加甲醇制成约每1ml含1mg的溶液，0.45µm微孔滤膜滤过，即得；

2.排钱草对照药材溶液的制备：取排钱草对照药材粗粉约5g，加15倍的70%乙醇回流提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇，稠膏加甲醇溶解，0.45µm微孔滤膜滤过，即得；

供试品溶液的制备：取排钱草总生物碱提取物适量，加甲醇溶解，0.45µm微孔滤膜滤过，即得；

3.测定法：分别吸取对照品溶液、排钱草对照药材溶液和供试品溶液各5~10µl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-氨水（8:1:0.1）为展开剂，预饱和10min，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液显色，日光下检视，供试品色谱在与排钱草对照药材和对照品色谱相应位置上，显相同橙红色斑点。

二、排钱草总生物碱提取物主要化学成分鉴别（高效液相色谱-质谱联用法）

1.供试品溶液的制备：取排钱草总生物碱提取物适量，加甲醇溶解，制成每1ml含排钱草总生物碱提取物约1mg的溶液，0.22µm微孔滤膜滤过，即得；

2.仪器：thermouitimate3000超高效液相色谱仪，配置在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱、自动进样器；thermoq-exactivefocus高分辨质谱仪；十万分之一天平；

3、色谱条件：thermoaccucorec18色谱柱（100×2.1mm，2.6µm）；流动相为甲醇（a）-水（b）；梯度洗脱（0~10min，10%~90%a）；流速为0.3ml/min，柱温为20℃；进样量：1μｌ；

4.质谱条件离子源：电喷雾（hesi）；检测模式：正离子模式；质量扫描范围：m/z100～1200；毛细管温度：320℃；鞘气体积流量：40psi，辅助气体积流量：10psi；喷雾电压：3.3kv；探头加温器温度：350℃；质量分辨率：70000；碰撞能量（ce）：20，40，60ev；

5.测定法：吸取供试品溶液，按2.2.3，2.2.4项下色谱、质谱条件进行分析，分别得到总离子流图（tic）及质谱图，采用xcalibur软件进行峰提取、峰匹配等数据处理，用compounddiscover2.3软件进行预处理，以精确质量数提取主成分5-甲氧基-n,n-二甲基色胺的质谱图；

6.测定结果与分析：ms（esi）m/z219.15、174.09、159.07、143.07，hrms[m+h]⁺准分子离子峰m/z219.14906与5-甲氧基-n,n-二甲基色胺的质量数（c13h19on2，理论值：218.1414）相符，分子量为218，二级质谱符合5-甲氧基-n,n-二甲基色胺的裂解规律。ms裂解过程如下：[m+h]⁺产生准分子离子峰m/z219.15，支链二甲胺基裂解后产生[m-45+h]⁺m/z174.09碎片，5号位甲氧基进一步裂解，分别裂去甲基和甲氧基产生m/z159.07和143.07的碎片，裂解式如下：

总生物碱提取物主要化学成分为：5-甲氧基-n,n-二甲基色胺。

三、排钱草总生物碱提取物的含量测定（紫外-可见分光光度法）

1.供试品溶液：取排钱草总生物碱提取物约13mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，测定紫外光谱，供试品溶液在275±1nm波长处有最大吸收。

2.对照品：排钱草中含有色胺以及5-甲氧基-n,n-二甲基色胺、n,n-二甲基色胺、5-羟基-n,n-二甲基色胺等以色胺为结构母核的生物碱成分，色胺紫外光谱在275±1nm波长处有最大吸收，故选色胺作为总生物碱含量测定的对照品；

3.对照品溶液的制备：精密称取色胺对照品适量，加甲醇制成每1ml含500µg的溶液，即得；

4.标准曲线的制备：精密量吸取色胺对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法在275±1nm测定吸光度，以浓度（µg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线；回归方程为y=0.02750x+0.01593，r=0.9998；

5.测定法：取排钱草总生物碱提取物约13mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法测定，在275±1nm波长处有最大吸收，测定其吸光度，计算生物碱含量，排钱草总生物碱提取物含量以色胺（c10h12n2）计算不得少于50.0%。

排钱草总生物碱提取物色胺（c10h12n2）在作为制备抗肝纤维化药物中的应用：

1.模型建立与分组：spf级雌性wistar大白鼠，体重（180±12）g，饲养于控温控湿12小时光照的环境中，不限饮食，采用腹腔注射猪血清的方法造模，随机分为模型对照组、排钱草总生物碱高剂量组（30mg/kg）、排钱草总生物碱中剂量组（20mg/kg）、排钱草总生物碱低剂量组（10mg/kg）、秋水仙碱药物对照组（0.1mg/kg）。

2.试验方法：正常组和模型组大鼠灌以等体积蒸馏水，1次/d。8周后，全部实验动物禁食1晚，经腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉后行颈椎错位处死，迅速取出肝脏右叶，经40g/l甲醛固定，石蜡包埋和he染色，光镜下观察。

3.测定法：应用cmias彩色医学图像分析仪，对各组大鼠肝脏切片随机选取10个视野测量，计算阳性染色面积占肝脏视野面积比，考察ⅰ、ⅲ、ⅳ型胶原表达程度。试验结果显示，排钱草总生物碱通过抑制肝纤维化大鼠肝脏ⅰ、ⅲ、ⅳ型胶原蛋白及tgf-β1的合成表达，起到良好的抗肝纤维化作用。

与现有技术相比，本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

1、本发明首次从排钱草中制备出总生物碱含量色胺（c10h12n2）达50%以上的排钱草总生物碱提取物，并建立其质量检测方法。

2、本发明采用薄层色谱法鉴别排钱草总生物碱提取物，方法简单易行，能适应工业生产的需要。

3、本发明采用高效液相色谱-质谱联用法对排钱草总生物碱提取物中主要的化学成分进行鉴别，方法准确可靠，专属性强。

4、本发明采用紫外-可见分光光度法直接测定排钱草总生物碱的含量，方法准确、简单，可有效的控制排钱草总生物碱提取物的质量。

5、本发明排钱草总生物碱提取物具有一定纯度，减少杂质干扰，用作药用及其原料，可降低不良反应风险，提升药效，具有良好应用前景。

6、本发明通过对排钱草总生物碱进行研究，建立了一种排钱草总生物碱提取物的制备方法及质量检测方法，有利于排钱草相关产品的进一步开发利用，而且对于开发广西特色药材，开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，将会产生潜在的社会效益与经济效益。

附图说明

图1是本发明排钱草总生物碱提取物的制备工艺流程图，从图1可见，本发明所述的排钱草总生物碱提取物的制备方法包括以下步骤：排钱草干燥药材-粉碎-乙醇或水加热回流提取-浓缩-回收乙醇-粗浸膏加水混悬-大孔吸附树脂柱层析-（乙醇-水）洗脱-浓缩-真空干燥，得排钱草总生物碱提取物；

图2是本发明排钱草总生物碱提取物的薄层色谱图，从图2可见排钱草总生物碱提取物色谱、排钱草对照药材色谱和5-甲氧基-n,n-二甲基色胺对照品色谱在相应位置显相同的橙红色斑点；

图3是本发明排钱草总生物碱提取物中主成分5-甲氧基-n,n-二甲基色胺一级质谱图，从图3可见准分子离子峰m/z219.14906[m+h]⁺符合5-甲氧基-n,n-二甲基色胺的质量数（c13h19on2，理论值：218.1414）；

图4是本发明排钱草总生物碱提取物中主成分5-甲氧基-n,n-二甲基色胺二级质谱图，从图4可见二级质谱中裂解碎片与5-甲氧基-n,n-二甲基色胺的裂解规律一致；

图5是本发明排钱草总生物碱提取物和色胺对照品的紫外吸收光谱图，从图5可见对照品色胺和排钱草总生物碱提取物均在275±1nm有最大吸收，二者吸收光谱基本一致。

具体实施方式

排钱草总生物碱提取物的制备：

实施例1

取排钱草干燥药材粉碎成粗粉1kg，加20kg体积含量70%乙醇回流提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇并减压浓缩无醇味，浓缩至料液比为1﹕10的排钱草提取液；取上述提取液以2bv/h速度置已处理好的大孔树脂（d101）柱吸附，先用1bv水洗脱，弃去洗脱液，再用4bv量60%乙醇以4bv/h速度洗脱，收集乙醇液洗脱液，洗脱液减压浓缩至浸膏，50℃真空干燥，即得到排钱草总生物碱的提取物，采用本发明的质量检测方法对制得的排钱草总生物碱提取物进行质量检测，检出5-甲氧基-n,n-二甲基色胺，测得总生物碱含量为51.79%。

实施例2

取排钱草干燥药材粉碎成粗粉0.5kg，加5kg体积含量的65%乙醇回流提取4次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇并减压浓缩无醇味，浓缩至料液比为1﹕15的排钱草提取液；取上述提取液以2bv/h速度置已处理好的大孔树脂（d101）柱吸附，先用2bv水洗脱，弃去洗脱液，再用4bv量60%乙醇以4bv/h速度洗脱，收集乙醇液洗脱液，洗脱液减压浓缩至浸膏，50℃真空干燥，即得到排钱草总生物碱的提取物，采用本发明的质量检测方法对制得的排钱草总生物碱提取物进行质量检测，检出5-甲氧基-n,n-二甲基色胺，测得总生物碱含量为50.14%。

实施例3

取排钱草干燥药材粉碎成粗粉0.5kg，第一次加10kg体积含量的70%乙醇回流提取1.5小时，第二次加8kg70%乙醇回流提取1.5小时，第三次加5kg70%乙醇回流提取1.5小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇并减压浓缩无醇味，浓缩至料液比为1﹕10的排钱草提取液；取上述提取液以2bv/h速度置已处理好的大孔树脂（d101）柱吸附，先用1bv水洗脱，弃去洗脱液，再用4bv量60%乙醇以4bv/h速度洗脱，收集乙醇液洗脱液，洗脱液减压浓缩至浸膏，50℃真空干燥，即得到排钱草总生物碱的提取物，采用本发明的质量检测方法对制得的排钱草总生物碱提取物进行质量检测，检出5-甲氧基-n,n-二甲基色胺，测得总生物碱含量为50.90%。

实施例4

取排钱草干燥药材粉碎成粗粉0.5kg，加10kg体积含量的80%乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇并减压浓缩无醇味，浓缩至料液比为1﹕10的排钱草提取液；取上述提取液以2bv/h速度置已处理好的大孔树脂（xad1600n）柱吸附，先用1bv水洗脱，弃去洗脱液，再用4bv量60%乙醇以4bv/h速度洗脱，收集乙醇液洗脱液，洗脱液减压浓缩至浸膏，50℃真空干燥，即得到排钱草总生物碱的提取物，采用本发明的质量检测方法对制得的排钱草总生物碱提取物进行质量检测，检出5-甲氧基-n,n-二甲基色胺，测得总生物碱含量为51.11%。

实施例5：

取排钱草干燥药材粉碎成粗粉0.5kg，加10kg体积含量的70%乙醇回流提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇并减压浓缩无醇味，浓缩至料液比为1﹕10的排钱草提取液；取上述提取液以2bv/h速度置已处理好的大孔树脂（xad1180）柱吸附，先用1bv水洗脱，弃去洗脱液，再用4bv量60%乙醇以4bv/h速度洗脱，收集乙醇液洗脱液，洗脱液减压浓缩至浸膏，50℃真空干燥，即得到排钱草总生物碱的提取物，采用本发明的质量检测方法对制得的排钱草总生物碱提取物进行质量检测，检出5-甲氧基-n,n-二甲基色胺，测得总生物碱含量为50.21%。

实施例6（排钱草总生物碱提取物的质量检测方法）

1、排钱草总生物碱提取物的鉴别（薄层色谱法）

1.1对照品溶液的制备：取5-甲氧基-n,n-二甲基色胺对照品适量，加甲醇制成约每1ml含1mg的溶液，0.45µm微孔滤膜滤过，即得；

1.2排钱草对照药材溶液的制备：取排钱草药材粗粉约5g，加15倍的70%乙醇回流提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇，稠膏加甲醇溶解，0.45µm微孔滤膜滤过，即得；

1.3供试品溶液的制备：取排钱草总生物碱提取物适量，加甲醇溶解，0.45µm微孔滤膜滤过，即得；

1.4测定法：分别吸取对照品溶液、排钱草药材对照溶液和供试品溶液各5~10µl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-氨水（8:1:0.1）为展开剂，预饱和10min，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液显色，日光下检视，供试品色谱在与排钱草药材和对照品色谱相应位置上，显相同橙红色斑点。

2、排钱草总生物碱提取物的含量测定（紫外-可见分光光度法）

2.1供试品溶液：取排钱草总生物碱提取物约13mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，测定紫外光谱，供试品溶液在275±1nm波长处有最大吸收。

2.2对照品的选择：现有研究表明，排钱草中含有色胺以及5-甲氧基-n,n-二甲基色胺、n,n-二甲基色胺、5-羟基-n,n-二甲基色胺等以色胺为结构母核的生物碱成分，色胺紫外光谱在275±1nm波长处有最大吸收，故选色胺作为总生物碱含量测定的对照品；

2.3对照品溶液的制备：精密称色胺对照品适量，加甲醇制成每1ml含503µg的溶液，即得；

2.4标准曲线的制备：精密量吸取色胺对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法在275±1nm测定吸光度，以浓度µg/ml为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为y=0.02750x+0.01593，r=0.9998；

2.5测定法：取排钱草总生物碱提取物约13mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法测定，在275±1nm波长处有最大吸收，测定其吸光度，计算生物碱含量，排钱草总生物碱含量以色胺c10h12n2计算不得少于50.0%。

含量测定方法学试验如下：

1、标准曲线的制备：精密量吸取色胺对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法在275±1nm测定吸光度，以浓度µg/ml为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为y=0.02750x+0.01593，r=0.9998，表明在5~30µg/ml范围内时，色胺线性关系良好。

2、精密度试验：取同一供试品溶液，连续测定6次，结果rsd为0.09%。

3、稳定性试验：取同一供试品溶液，分别在0、30、45、60、90、120min测定，结果

rsd为1.1%，表明供试品溶液在120min内稳定。

4、重复性试验：取同一批样品制备供试品溶液6份，按拟定方法测定，结果rsd为

1.01%。

5、回收率试验：取已知含量的排钱草总生物碱提取物，分别精密加入色胺对照品适量，按拟定方法测定含量，并计算回收率，回收率平均值为95.16%，rsd为2.3%。

方法学试验结果表明该方法准确、稳定、操作简单，可确保产品的质量。

实施例7（排钱草总生物碱提取物主要化学成分定性鉴别）

1、供试品溶液的制备：取排钱草总生物碱提取物适量，加甲醇溶解，制成每1ml含排钱草总生物碱提取物约1mg的溶液，0.22µm微孔滤膜滤过，即得；

2、仪器：thermouitimate3000超高效液相色谱仪，配置在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱、自动进样器；thermoq-exactivefocus高分辨质谱仪；十万分之一天平；

3、色谱条件：thermoaccucorec18色谱柱（100×2.1mm，2.6µm）；流动相为甲醇（a）-水（b）；梯度洗脱（0~10min，10%~90%a）；流速为0.3ml/min，柱温为20℃；进样量：1μｌ；

4、质谱条件：离子源：电喷雾（hesi）；检测模式：正离子模式；质量扫描范围：m/z100～1200；毛细管温度为320℃；鞘气体积流量为40psi，辅助气体积流量为10psi；喷雾电压为3.3kv；探头加温器温度为350℃；质量分辨率70000；碰撞能量（ce）：20，40，60ev；

5、测定法：吸取供试品溶液，按2.2.3，2.2.4项下色谱、质谱条件进行分析，分别得到总离子流图（tic）及质谱图，采用xcalibur软件进行峰提取、峰匹配等数据处理，用compounddiscover2.3软件进行预处理，以精确质量数提取主成分5-甲氧基-n,n-二甲基色胺的质谱图；

6、测定结果与分析：ms（esi）m/z219.15、174.09、159.07、143.07，hrms[m+h]⁺准分子离子峰m/z219.14906与5-甲氧基-n,n-二甲基色胺质量数（c13h19on2，理论值：218.1414）相符，分子量为218，二级质谱符合5-甲氧基-n,n-二甲基色胺的裂解规律。ms裂解过程如下：[m+h]⁺产生准分子离子峰m/z219.15，支链二甲胺基裂解后产生[m-45+h]⁺m/z174.09碎片，5号位甲氧基进一步裂解，分别裂去甲基和甲氧基产生m/z159.07和143.07的碎片，裂解式如下：

总生物碱提取物主要化学成分为：5-甲氧基-n,n-二甲基色胺。

实施例8（排钱草总生物碱提取物的抗肝纤维化作用）

用本发明所述排钱草总生物碱提取物进行药效学试验，结果如下：

1、模型建立与分组：spf级雌性wistar大白鼠，体重（180±12）g，饲养于控温控湿12小时光照的环境中，不限饮食，采用腹腔注射猪血清的方法造模，随机分为模型对照组、排钱草总生物碱高剂量组（30mg/kg）、排钱草总生物碱中剂量组（20mg/kg）、排钱草总生物碱低剂量组（10mg/kg）、秋水仙碱药物对照组（0.1mg/kg）。

2、试验方法：正常组和模型组大鼠灌以等体积蒸馏水，1次/d。8周后，全部实验动物禁食1晚，经腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉后行颈椎错位处死，迅速取出肝脏右叶，经40g/l甲醛固定，石蜡包埋和he染色，光镜下观察。

3、指标测定：应用cmias彩色医学图像分析仪，对各组大鼠肝脏切片随机选取10个视野测量，计算阳性染色面积占肝脏视野面积比，考察ⅰ、ⅲ、ⅳ型胶原表达程度。

4、结果：排钱草总生物碱高、中、低剂量组与药物对照组大鼠肝脏中ⅰ、ⅲ、ⅳ型胶原均明显减少，纤维间隔较薄。将胶原免疫组化结果进行图像分析，经计算机图像灰度扫描数字转换，各组ⅰ、ⅲ、ⅳ型胶原蛋白面密度（胶原面积/肝组织视野面积100%）测量值见表1。试验结果显示，排钱草总生物碱通过抑制肝纤维化大鼠肝脏ⅰ、ⅲ、ⅳ型胶原蛋白及tgf-β1的合成表达，起到良好的抗肝纤维化作用。

综上所述，本发明采用大孔吸附树脂柱层析制备排钱草总生物碱提取物，采用薄层色谱法对排钱草总生物碱提取物进行定性鉴别，采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用法对排钱草总生物碱提取物主要的化学成分进行定性鉴别，采用紫外-可见分光光度法测定排钱草总生物碱提取物中总生物碱含量，方法准确、稳定、操作简单，分析测试成本低，能适应工业生产的需要，可有效的控制排钱草总生物碱提取物的质量。排钱草总生物碱提取物抗肝纤维化作用确切，就有较好应用前景。