一种双面支架及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物材料和干细胞技术领域，具体涉及一种双面支架及其制备方法和应用，尤其涉及一种组织修复研究领域植入式载细胞支架材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.牙周组织由牙龈、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨组成，是一个层次分明的组织，其主要作用是为牙齿提供物理和机械支持。严重的牙周炎是由口腔细菌生物膜引发的炎症，可导致牙周组织的软硬组织遭到严重破坏，从而损害牙齿功能和美观。虽然，目前的治疗方法可以通过控制炎症方面来限制疾病的进展，但完全的牙周再生是无法预测的。牙周治疗的最终目的是再生失去的牙周组织，包括牙周韧带重新附着在新形成的牙骨质和牙槽骨上。这需要高度协调的时空愈合反应，包括牙周韧带纤维重新附着到先前被污染的根表面，以及牙周缺损内的骨形成。除了牙周组织的复杂结构所带来的挑战外，牙周愈合还会因牙面无血管的特性而更加复杂。所以利用各种组织工程的方法控制关键的伤口愈合事件实现牙周再生是非常必要的。
3.牙周的创面愈合原理与身体其他部位相同。首先，在创面产生了皮瓣边缘与根面之间的纤维蛋白凝块，维持了再生的空间。纤维蛋白凝块破裂后，长上皮细胞先附着在根表面，再生失败。纤维蛋白是一种临时基质，促进细胞募集，调节干细胞的生长和分化。当损伤面积较大时，纤维凝块容易崩塌，导致上皮细胞附着在根表面。20世纪80年代，人们提出了利用物理屏障膜促进牙周再生的引导组织再生，它具有空间维持和选择性细胞再生的功能。然而，由于口腔环境、无血管根表面、微生物膜和炎症的复杂性，gtr技术的治疗效果表现出较大的差异性。
4.目前，牙周组织修复重建中选择的支架材料主要为：脱细胞组织基质，可降解高分子材料和天然高分子材料。脱细胞组织基质的理化性质(孔隙率，力学性能等)，可修饰性能较差；可降解高分子材料缺乏细胞识别信号，不利于细胞识别粘附，而且降解时所形成的酸性物质会引起周围炎症；天然高分子材料虽然具有良好的细胞相容性，但是其力学性能和容易降解限制了其在牙周再生中的应用。
5.因此，结合相应组织的间充质干细胞治疗的多功能支架材料需要进一步的研究。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种双面支架及其制备方法和应用，尤其涉及一种组织修复研究领域植入式载细胞支架材料及其制备方法和应用，所述双面支架弥补现有辅助牙周组织再生材料的缺陷。
7.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种双面支架，所述双面支架包括：壳聚糖胶原复合纤维层和羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层。
9.在本发明中，所述双面支架包括壳聚糖胶原复合纤维层和羟基磷灰石修饰的壳聚
糖胶原复合纤维层，其中，壳聚糖胶原复合纤维层为未经修饰的壳聚糖胶原复合纤维层，是致密层(compact layer)，致密层较小的孔径阻碍上皮细胞的入侵，为功能层在牙根表面矿化提供一定的时间；而羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层为功能层(functional layer)，功能层较大的孔径有利于细胞和羟基磷灰石的接触，提高局部钙、磷离子浓度促进成骨分化。采用所述双面支架接种干细胞时，细胞在功能层和致密层的细胞形态较好，表明二者具有良好的生物相容性；且细胞在支架材料上铺展形态、增殖、迁移能力较好。
10.优选地，所述壳聚糖胶原复合纤维层是由含rgd(arg
‑
gly
‑
asp)的壳聚糖胶原纺丝液经静电纺丝制备得到。
11.优选地，所述含rgd的壳聚糖胶原纺丝液按质量百分含量计包括：壳聚糖1
‑
3％、胶原1
‑
15％、聚氧化乙烯0.25
‑
0.75％，余量为溶剂。
12.以所述含rgd的壳聚糖胶原纺丝液质量为100％计，所述壳聚糖含量为1
‑
3％，例如1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％等。
13.以所述含rgd的壳聚糖胶原纺丝液质量为100％计，所述胶原含量为1
‑
15％，例如1％、2％、4％、6％、8％、9％、10％、12％、13％、14％、15％等。
14.以所述含rgd的壳聚糖胶原纺丝液质量为100％计，所述聚氧化乙烯含量为0.25
‑
0.75％，例如0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.75％等。
15.优选地，所述含rgd的壳聚糖胶原纺丝液中rgd的浓度为0.02
‑
1mg/ml，例如0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.08mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml等。
16.优选地，所述壳聚糖的分子量为104‑
105da，例如1
×
104da、2.5
×
104da、4
×
104da、5
×
104da、6
×
104da、7
×
104da、8
×
104da、9
×
104da、1
×
105da等。
17.优选地，所述胶原为ⅰ型胶原，优选为牛肌腱的ⅰ型胶原。
18.优选地，所述聚氧化乙烯的分子量为104‑
105da，例如104da、2.5
×
104da、4
×
104da、5
×
104da、6
×
104da、7
×
104da、8
×
104da、9
×
104da、105da等。
19.优选地，所述溶剂为乙酸水溶液，优选为85
‑
95wt％(例如85wt％、86wt％、87wt％、88wt％、90wt％、92wt％、94wt％、95wt％等)的乙酸水溶液。
20.优选地，所述羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层包括所述壳聚糖胶原复合纤维层和沉积在所述壳聚糖胶原复合纤维层间的羟基磷灰石。
21.优选地，所述羟基磷灰石的质量占所述羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层总质量的5
‑
20％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、14％、16％、18％、20％等。
22.优选地，所述双面支架的纤维直径为0.5
‑
1.5μm，例如0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm等。
23.优选地，所述壳聚糖胶原复合纤维层的孔径为10μm以下，例如10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm等。
24.优选地，所述羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层的孔径为20
‑
30μm，例如20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm等。其中，孔径大小以孔的直径表示。
25.优选地，所述双面支架还包括纤维蛋白原和凝血酶。其中，添加纤维蛋白的作用是进一步增强制备得到的支架材料的力学性能，获得更小的孔径，从而进一步地促进伤口修
复。凝血酶的作用是促进所述支架材料纤维网络交联程度。
26.优选地，所述双面支架中纤维蛋白的含量为1
‑
20％，例如1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％等。
27.优选地，所述双面支架中凝血酶的含量为10
‑
30u/cm2，例如10u/cm2、12u/cm2、15u/cm2、18u/cm2、20u/cm2、22u/cm2、25u/cm2、30u/cm2等。
28.第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的双面支架的制备方法，所述双面支架的制备方法包括以下步骤：
29.(1)通过静电纺丝制备得到壳聚糖胶原复合纤维层；
30.(2)将壳聚糖胶原复合纤维层置于羟基磷灰石沉积液中浸泡，得到所述羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层；
31.(3)将所述壳聚糖胶原复合纤维层和所述羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层进行粘合，得到所述双面支架。
32.优选地，步骤(1)中，所述壳聚糖胶原复合纤维层的具体制备方法为：将壳聚糖、胶原、聚氧化乙烯、rgd和溶剂混合得到纺丝液，再通过静电纺丝技术制备壳聚糖胶原复合纤维，洗涤，干燥，得到所述壳聚糖胶原复合纤维层。
33.优选地，所述静电纺丝技术的参数为：使用20
‑
23号针头(例如20号、21号、22号、23号)，0.1
‑
1cm/min(例如0.1cm/min、0.2cm/min、0.4cm/min、0.6cm/min、0.8cm/min、1cm/min等)的挤出速率，低压
‑
5～0kv(例如
‑
5kv、
‑
4kv、
‑
3kv、
‑
2kv、
‑
1kv、0kv等)，高压15
‑
25kv(例如15kv、16kv、18kv、20kv、22kv、24kv、25kv等)。
34.在本发明中，以上述静电纺丝技术的参数进行纺丝，能够纺丝得到适宜粗细的纤维直径，以干燥得到适宜的致密层的孔径。
35.优选地，所述浸泡结束后还需进行洗涤，先采用乙醇洗涤至少3次(例如3次、4次、5次、6次等)，再采用水洗涤至少3次(例如3次、4次、5次、6次等)。
36.优选地，所述干燥为冷冻干燥，所述干燥的温度为
‑
90～
‑
70℃，例如
‑
90℃、
‑
85℃、
‑
82℃、
‑
80℃、
‑
78℃、
‑
75℃、
‑
70℃等，所述干燥的时间为12
‑
24h，例如12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等。
37.优选地，步骤(2)中，所述羟基磷灰石沉积液的浓度为0.1
‑
10mg/ml，例如0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml等。
38.优选地，步骤(2)中，所述浸泡需摇床上震荡，所述震荡的频率为70
‑
90rpm，例如70rpm、75rpm、80rpm、85rpm、90rpm等，所述震荡的时间为20
‑
60min，例如20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min等。
39.优选地，步骤(2)中，所述浸泡结束后还需进行洗涤，所述洗涤采用体积浓度为40
‑
60％(例如40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％等)乙醇，所述洗涤次数至少为3次，例如3次、4次、5次、6次等。
40.优选地，步骤(3)中，所述粘合的具体步骤为：将所述壳聚糖胶原复合纤维层和所述羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层进行贴合后，从所述壳聚糖胶原复合纤维层一侧加入纤维蛋白原溶液和凝血酶，进行反应，得到所述双面支架。
41.在本发明中，选择从未经修饰的壳聚糖胶原复合纤维层一侧，即致密层加入纤维
蛋白原溶液和凝血酶的原因是：可以提高致密层的孔径，从而达到减小孔径的目的。
42.优选地，所述纤维蛋白原溶液的浓度为1
‑
9mg/ml，例如1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml等，溶剂为生理盐水。
43.优选地，所述凝血酶的浓度为5
‑
50u/ml，例如5u/ml、10u/ml、15u/ml、20u/ml、25u/ml、30u/ml、35u/ml、40u/ml、45u/ml、50u/ml等。
44.优选地，所述反应的温度为30
‑
40℃，例如30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃等，所述反应的时间为20
‑
30h，例如20h、22h、24h、26h、28h、30h等。
45.优选地，所述反应需在恒温摇床中震荡，所述震荡的频率为70
‑
90rpm，例如70rpm、75rpm、80rpm、85rpm、90rpm等。
46.第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的双面支架在制备组织再生辅助材料中的应用。
47.在本发明中，所述的双面支架具有促进成骨的作用，同时干细胞的旁分泌作用可以构建一个良好的再生微环境，促进组织再生方面具有一定的临床应用。
48.优选地，所述组织为牙周组织。
49.该支架材料具有良好的促进成牙和成骨的能力，促进组织更好的修复。其中，该支架材料具有阻隔上皮细胞附着根面，避免牙周不完全再生。
50.第四方面，本发明提供一种组织再生辅助材料，所述组织再生辅助材料包括干细胞和如第一方面所述的双面支架。
51.优选地，所述干细胞为牙齿干细胞。
52.优选地，所述干细胞的代数小于5，例如4、3、2等。
53.优选地，所述干细胞的负载量为107‑
109个细胞/cm2，例如107个细胞/cm2、5
×
107个细胞/cm2、108个细胞/cm2、5
×
108个细胞/cm2、109个细胞/cm2等。
54.第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的组织再生辅助材料的制备方法，所述组织再生辅助材料的制备方法为：
55.(a)将如第一方面所述的双面支架进行润湿；
56.(b)将所述干细胞接种于所述双面支架的壳聚糖胶原复合纤维层一侧，进行培养，得到所述组织再生辅助材料。
57.优选地，步骤(a)中，所述润湿采用pbs缓冲液。
58.优选地，步骤(a)中，所述润湿的温度为35
‑
40℃，例如35℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，所述润湿的时间为2
‑
4h，例如2h、2.5h、3h、3.5h、4h等。
59.优选地，步骤(b)中，所述干细胞的接种量为107‑
109个细胞/cm2，例如107个细胞/cm2、5
×
107个细胞/cm2、108个细胞/cm2、5
×
108个细胞/cm2、109个细胞/cm2等。
60.优选地，步骤(b)中，所述培养的温度35
‑
40℃，例如35℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，培养的时间为2
‑
3天，例如2天、2.5天、3天等。
61.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
62.(1)本发明所述的支架材料具有双层结构，壳聚糖胶原复合纤维层为阻隔层，维持组织再生的空间；羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层为功能层，为组织再生提供活性物质；阻隔层联合干细胞粘附于功能层，为组织再生提供良好的微环境，从而达到较好的修复效果；具有良好的生物相容性，促进细胞增殖和分化的能力，细胞在支架材料上铺展形
态，增殖，迁移能力较好；
63.(2)本发明所述支架材料制备方法简单、添加温和、成本低，易于储存；制备过程中未使用有机试剂，避免有机试剂残留对组织造成的危害；
64.(3)本发明所述双面支架具有良好的促进成牙和成骨的能力，促进组织更好的修复，具有阻隔上皮细胞附着根面，避免牙周不完全再生；本发明所述双面支架联合干细胞用于组织再生，有利于外源性干细胞在损伤部位的停留，并且为内源性干细胞和外源性干细胞提供了一个较好的组织再生微环境，对组织再生在临床上的应用具有指导意义。
附图说明
65.图1为实施例1提供的双面支架的功能层在倍率1.0k下的扫描电镜图。
66.图2为实施例1提供的双面支架的致密层在倍率1.0k下的扫描电镜图。
67.图3为实施例1提供的双面支架的功能层在倍率5.0k下的扫描电镜图。
68.图4为实施例1提供的双面支架的致密层在倍率5.0k下的扫描电镜图。
69.图5为实施例2提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图。
70.图6为实施例3提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图。
71.图7为实施例4提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图。
72.图8为实施例5提供的双面支架接种干细胞后的细胞粘附荧光图。
73.图9为实施例6提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图。
74.图10为实施例7提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图。
75.图11为实施例8提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图。
76.图12为实施例9提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图。
77.图13为实施例10提供的羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图。
78.图14为实施例11提供的羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图。
79.图15为实施例12提供的双面支架的纤维的扫描电镜图。
80.图16为实施例13提供的双面支架的纤维的扫描电镜图。
81.图17为细胞在实施例1提供的双面支架的功能层上的形貌的电镜图。
82.图18为细胞在实施例1提供的双面支架的致密层上的形貌的电镜图。
83.图19为细胞在实施例1提供的双面支架的功能层上的形貌的二维荧光图。
84.图20为细胞在实施例1提供的双面支架的致密层上的形貌的二维荧光图。
85.图21为细胞在实施例1提供的双面支架的功能层上的形貌的3d荧光图。
86.图22为细胞在实施例1提供的双面支架的致密层上的形貌的3d荧光图。
87.图23为实施例1
‑
3提供的双面支架的纤维直径分布图。
88.图24为实施例1
‑
3提供的双面支架清洗前后的纤维直径柱状图。
89.图25为原料和实施例1提供的双面支架的红外谱图。
90.图26为原料和实施例1提供的双面支架的dsc谱图。
91.图27为成骨分化条件培养下，牙髓间充质干细胞在实施例1提供的双面支架的上的增殖曲线图。
92.图28a为实施例1提供的双面支架功能层一侧28天后的电镜图和牙髓间充质干细胞的扫描电镜图(70μm)。
93.图28b为实施例1提供的双面支架功能层一侧28天后的电镜图和牙髓间充质干细胞的扫描电镜图(10μm)。
94.图28c为实施例1提供的双面支架功能层一侧28天后的电镜图和牙髓间充质干细胞的活死染色(am，70μm)荧光图。
95.图28d为实施例1提供的双面支架功能层一侧28天后的电镜图和牙髓间充质干细胞的活死染色(pi，70μm)荧光图。
96.图29为成骨分化培养基中，在2d平面和双面支架材料上培养的干细胞的碱性磷酸酶活性示意图。
97.图30a为支架材料的降解溶液对人源牙龈上皮细胞的毒性实验图。
98.图30b为支架材料的降解溶液对人源牙髓间充质干细胞的毒性实验图。
99.图31为干细胞双面支架材料在裸鼠皮下异位矿化的he和免疫组化图。
100.图32为裸鼠皮下植入后的心肝脾肺肾的he染色图。
101.图33为干细胞双面支架材料修复大鼠牙周缺损后的牙周ct和he切片图。
102.图34为干细胞双面支架材料修复小型猪牙周缺损后的牙周的ct图。
具体实施方式
103.下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
104.实施例1
105.本实施例提供一种双面支架，所述双面支架由以下制备方法制备得到：
106.(1)配置含rgd的壳聚糖胶原纺丝液：将3wt％壳聚糖(m
w
3.1
×
105～3.75
×
105da)、3wt％胶原(m
w 1.2
×
106da)、0.50wt％聚氧化乙烯(m
w
9.5
×
104da)、0.02mg/ml rgd(arg
‑
gly
‑
asp)和90wt％的乙酸水溶液混合，得到纺丝液；
107.将纺丝液加入10ml的针管中，用23号针头，以0.5cm/min的挤出速率，在低压
‑
2kv，高压20kv的条件下，进行静电纺丝，用铝箔接收纺丝得到的复合纤维；再依次采用乙醇洗涤三次，去离子水洗涤三次；最后在
‑
80℃下干燥18h，得到壳聚糖胶原复合纤维层；
108.(2)取2g的壳聚糖胶原复合纤维层置于5ml的1mg/ml的羟基磷灰石沉积液中浸泡，所述浸泡需放置于摇床上室温震荡，所述震荡的频率为80rpm，所述震荡的时间为40min；再依次采用50v％的乙醇水溶液洗涤三次；最后在
‑
80℃下干燥18h，得到羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层；
109.(3)取2g、10mm2的壳聚糖胶原复合纤维层和2g、10mm2的羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层贴合；再从所述壳聚糖胶原复合纤维层一侧加入9mg/ml纤维蛋白原溶液和20u/ml的凝血酶；最后将材料放置于恒温摇床中充分反应，反应的温度为35℃，所述反应的时间为24h，震荡的频率为80rpm，在
‑
80℃下干燥18h，得到双面支架。
110.试验例1
111.双面支架材料的表征
112.采用电镜(厂家：hitachi，型号：su8220)观测实施例1制备得到的支架的功能层和致密层；
113.其中，图1
‑
图4为实施例1提供的双面支架的功能层和致密层在不同倍率下的扫描
电镜图，如图1
‑
图4所示，双面支架材料的电镜图可以看到功能层(functional layer，即羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维层)和致密层(compact layer，即未经修饰的壳聚糖胶原复合纤维层)具有不同的孔径大小。功能层较大的孔径有利于细胞和羟基磷灰石的接触，提高局部钙、磷离子浓度促进成骨分化；致密层较小的孔径阻碍上皮细胞的入侵，为功能层在牙根表面矿化提供一定的时间。
114.实施例2
115.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，所述纺丝液中聚氧化乙烯的含量为0.25wt％，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
116.图5为实施例2提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图，如图5所示，peo含量的较少，纤维直径较低，但是纤维的均一度较好。
117.实施例3
118.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，所述纺丝液中聚氧化乙烯的含量为0.75wt％，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
119.图6为实施例3提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图，如图6所示，peo含量的较多，纤维直径较高，但是纤维的均一度有所下降。
120.实施例4
121.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，所述纺丝液中壳聚糖的含量为1wt％，其他组分含量及制备步骤同实施例1。改变壳聚糖含量之后纤维直径会有所降低。
122.图7为实施例4提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图，如图7所示，调整壳聚糖的浓度之后，制备得到的双面支架的纤维直径会有所降低。
123.实施例5
124.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，所述纺丝液中rgd的浓度为0.5mg/ml，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
125.图8为实施例5提供的双面支架接种干细胞后的细胞粘附荧光图，如图8所示，制备得到的双面支架的纤维的直径不会随着rgd浓度的改变而改变，但是会影响细胞的粘附程度，细胞粘附量会增加。
126.实施例6
127.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，所述纺丝液中胶原的含量为1wt％，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
128.图9为实施例6提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图，如图9所示，调整胶原的浓度之后，制备得到的双面支架的直径会有所降低。
129.实施例7
130.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，所述纺丝液中，所述乙酸水溶液的浓度为50wt％，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
131.图10为实施例7提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图，如图10所示，由于水含量较高，纺丝液挥发较慢，可能会出现串珠状的现象。
132.实施例8
133.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，静电纺丝参数
为：18号针头，0.05cm/min的挤出速率，低压
‑
6kv，高压10kv，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
134.图11为实施例8提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图，如图11所示，随着电压的降低，纤维直径变粗，可能会出现串珠状。
135.实施例9
136.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，静电纺丝参数为：25号针头，2cm/min的挤出速率，低压1kv，高压30kv，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
137.图12为实施例9提供的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图，如图12所示，升高电压，增加挤出速率，纤维制备的稳定性下降，但是纺丝的效率增加。
138.实施例10
139.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，所述羟基磷灰石沉积液浓度为0.1mg/ml，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
140.图13为实施例10提供的羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图，如图13所示，纤维表面的羟基磷灰石纳米颗粒的沉积与沉积液的浓度密切相关，当沉积液的浓度为0.1mg/ml的时候，纤维表面的纳米颗粒的数目比会有所减少。
141.实施例11
142.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，所述羟基磷灰石沉积液浓度为10mg/ml，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
143.图14为实施例11提供的羟基磷灰石修饰的壳聚糖胶原复合纤维的扫描电镜图，如图14所示，沉积液的浓度为10mg/ml的时候，纤维表面的羟基磷灰石纳米颗粒的密度增加，纤维几乎被羟基磷灰石纳米颗粒包覆，但是会有一定的纳米颗粒聚集。
144.实施例12
145.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(3)中，所述纤维蛋白原溶液浓度为1mg/ml，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
146.图15为实施例12提供的双面支架的纤维的扫描电镜图，如图15所示，纤维表面的交联程度低，孔径大。
147.实施例13
148.本实施例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(3)中，所述凝血酶浓度为5mg/ml，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
149.图16为实施例13提供的双面支架的纤维的扫描电镜图，如图16所示，凝血酶的浓度也会影响交联程度，凝血酶的溶度下降导致纤维网络交联程度下降，孔径增加。
150.对比例1
151.本对比例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，不添加壳聚糖，胶原含量增至6wt％，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
152.结果：纤维整体的稳定向下降，在水中会出现溶胀现象。
153.对比例2
154.本对比例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，不添加胶原，壳聚糖含量增至6wt％，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
155.结果：整体纤维的细胞粘附性能下降。
156.对比例3
157.本对比例提供一种双面支架，与实施例1的区别仅在于，将0.50wt％聚氧化乙烯替换为0.50wt％的聚乳酸，其他组分含量及制备步骤同实施例1。
158.结果：聚乳酸在后期降解产物会造成局部的ph下降，对组织工程的细胞再生产生不利的影响。
159.试验例2
160.细胞在支架材料上的表征
161.本试验例提供一种组织再生辅助材料，所述组织再生辅助材料的制备方法包括以下步骤：
162.(1)干细胞提取和培养：用75％的乙醇浸泡人的第三颗磨牙，取出牙髓组织，将牙髓组织剪成1cm3的小块，加入5倍体积的3mg/ml的一型胶原酶和4mg/ml的分散酶，在37℃孵育2
‑
4小时，用70μm的细胞筛过滤收集单细胞溶液，用a
‑
mem完全培养基进行培养。
163.(2)采用pbs将所述双面支架润湿，在37℃的环境中；
164.(3)将人牙髓间充质干细胞接种于所述双面支架的壳聚糖胶原复合纤维层一侧，37℃培养的时间为2
‑
3天，得到所述组织再生辅助材料；
165.其中，图17
‑
18分别为细胞在实施例1提供的双面支架的功能层、致密层上的形貌的电镜图。图19
‑
22为细胞在实施例1提供的双面支架的功能层、致密层上的形貌的荧光图。如图19
‑
22所示，细胞骨架荧光染料为tritc phalloidin(罗丹明标记鬼笔环肽)，细胞和染料为dapi(即4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚即4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚)，激发波长分别为f
‑
actin 561nm和405nm。如图17
‑
22所示，细胞在功能层和致密层的细胞形态较好，二者具有良好的生物相容性。
166.试验例3
167.支架材料的物理表征
168.对各实施例制备得到的双面支架进行物理表征，具体测试方法如下所示：
169.(1)纤维直径：利用sem(厂家：hitachi，型号：su8220)，采集支架材料的不同位置的图片，通过测量的方式，统计100个纤维的直径进行统计；
170.(2)红外：傅立叶变换红外光谱仪(厂家：珀金埃尔默仪器有限公司，型号：s
‑
one)，用200i聚光灯对材料进行傅里叶变换红外光谱检测，检测范围为4000～600cm
‑1；
171.(3)dsc：机械制冷差示扫描量热仪(厂家：珀金埃尔默仪器有限公司，仪器型号：diamond dsc)，检测温度范围为20
‑
200℃，升温速率为10℃/min；
172.其中，图23、24为不同比例的peo制备出的纤维直径分布，随着peo含量的增加，纤维直径逐渐增加，但是纤维的均一度逐渐下降。图25的红外结果表明，胶原和壳聚糖二者之间存在着氢键相互作用导致特征峰的偏移。其中，图26的dsc表明与红外结果相一致，胶原和壳聚糖二者之间存在着氢键相互作用导致特征峰的偏移。
173.试验例4
174.活性测试
175.(1)对实施例1制备得到的双面支架进行细胞增殖测试，具体测试方法为：将细胞悬液滴加到双面支架材料中，加完全培养基，用quant
‑
it pico green ds dna regent试剂
盒检测不同时间点的dna含量；时间点分别为3天，5天，7天，14天，21天；
176.其中，图27为细胞在2d和支架材料上的细胞增殖曲线，可以看出，三维支架材料促进细胞增殖，具有良好的生物相容性。
177.(2)对实施例1制备得到的双面支架进行成骨分化28天细胞形态进行测试，具体测试方法为：将分化后的干细胞贴片的培养基中加入am/pi的染料，利用激光共聚焦显微镜(厂家：珀金埃尔默仪器，型号：ultraview vox)进行观察；将分化后的干细胞双面支架材料进行2.5％的戊二醛固定2小时，用酒精梯度脱水后利用冷冻干燥或者二氧化碳干燥的手段得到可以观察的sem样品；
178.其中，图28a
‑
28d为细胞在材料上成骨分化28天后的sem和荧光图，支架上的细胞形态发生了成骨分化，并且支架材料还具有清晰的网状结构。同时通过am和pi的结果表明这些成骨分化的细胞具有较好的活性。
179.(3)对实施例1制备得到的双面支架上的成骨分化过程中磷酸酶的活性进行测试，具体测试方法为：将不同时间点的样品进行三次冷冻和复融裂解细胞，1000rpm离心取上清，检测上清中的alp活性(索莱宝，bc2145)，用酶标仪检测(厂家：美国md公司，型号：spectramax m5)；
180.其中，图29为成骨分化培养基中，在二维平面和双面支架材料上培养的干细胞的碱性磷酸酶活性示意图，表明在支架材料上的成骨分化过程中碱性磷酸酶的活性高于二维平面的成骨分化的细胞。
181.(4)对实施例1制备得到的双面支架进行细胞毒性检测，具体测试方法为：将双面支架材料浸泡到不含血清的培养基中，分别取7天，14天，21天和28天的培养基，配成完全培养基后，培养牙龈上皮细胞和牙髓间充质干细胞，利用cck
‑
8进行细胞毒性检测，用酶标仪检测上清的荧光(厂家：美国md公司，型号：spectramax m5)。
182.其中，图30a、30b为细胞毒性检测，4周的材料浸泡液对牙髓间充质干细胞和牙龈上皮细胞没有影响，细胞活性与对照组无显著性差异。
183.(5)对实施例1制备得到的双面支架的成骨和成牙指标检测，具体测试方法为：将干细胞双面支架材料移植到裸鼠的皮下，三个月后将移植部位进行蜡块包埋，进行组织切片染色；
184.其中，图31为干细胞双面支架材料在裸鼠皮下异位矿化的he和免疫组化图。如图31所示，表明在小鼠皮下可以成功异位矿化，对成骨和成牙指标检测均为阳性。但是此过程依赖于外源干细胞的加入，未增加外源干细胞的支架材料的免疫组化结果显示为阴性，但是可以看到局部支架内部有血管生成，表明支架具有良好的生物相容性。加入外源细胞的支架成骨和成牙的免疫组化的结果为阳性，表明负载干细胞的支架材料对于牙周修复具有一定的应用前景。图32为裸鼠皮下植入后的心肝脾肺肾的he染色图。如图32所示，并未发现异常，表明本发明提供的干细胞双面贴片具有较好的生物安全性。
185.试验例5
186.双面支架材料修复牙周组织缺损
187.细胞提取和培养：将牙齿用含有双抗的pbs缓冲液浸泡冲洗后，将牙髓组织取出后切成1mm3的立方块，用一型胶原酶和分散酶将组织块酶后，用细胞筛过滤为单细胞悬液。将细胞用含有10％的fbs的α
‑
mem培养，首次5日后换液，之后每三天换一次液，待细胞融合至
70％～80％后冻存备用。
188.在灭菌后的实施例1提供的双面支架材料一侧接种牙髓间充质干细胞，在培养基中培养2～3天后。通过翻瓣手术紧贴被清理干净的根面，治疗牙周缺损。
189.其中，图33为干细胞双面支架材料修复大鼠牙周缺损后的牙周ct和he切片图，说明大鼠牙周缺损的修复效果，负载牙源性干细胞的贴片的修复效果优于未负载细胞的贴片材料的修复效果优于未经处理的修复效果。表明干细胞和支架材料共同在缺损部位起到了一定的促进组织修复的功能。图34为干细胞双面支架材料修复小型猪牙周缺损后的牙周的ct图，为小型猪的牙周缺损的修复效果，与大鼠牙周缺损修复效果一致。
190.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明所述所述双面支架及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。