一种中药组合物在制备提升卵巢储备功能的药物中的新用途的制作方法

1.本发明属于中药领域，具体涉及一种中药组合物在制备提升卵巢储备功能的药物中的新用途。


背景技术：

2.近年来，由于环境污染严重、工作压力加大、饮食习惯改变、生殖系统疾病等因素对正常受孕造成不利影响，不孕症患者数量呈上升势头，发病率约为12.5％～15％，且有逐年增加趋势。因此世界卫生组织(who)宣布将不孕症与心血管病、肿瘤并列为当今影响人类生活和健康的三大主要疾病。
3.导致不孕的因素众多，卵巢储备功能下降(decreasing ovarian reservation, dor)即为其中之一。卵巢储备功能反映女性卵巢内存留卵泡的质量和数量，反映女性的排卵能力和性激素分泌能力。是女性生育能力的一项重要指标。此病在女性人群中发病率约10％，且有逐渐年轻化趋势，随着二胎政策的开放，越来越多的女性受卵巢功能低下疾病的困扰。卵巢功能低下，在早期普遍表现为卵巢储备功能下降(diminished ovarian reserved)，临床表现为月经周期、量、经期的异常，潮热盗汗等症状，如不及早治疗，可很快发展为卵巢早衰(premature ovarian failure,pof)，有研究表明，大概历时1～6年[3]，卵巢储备功能下降可以发展成为卵巢早衰。
[0004]
补肾类的中药介入辅助生殖技术，具有调经、助孕、促进早期胚胎发育的作用，已得到证实。如，专利cn102784267b公开了一个补肾复方，它包括熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16 份、鹿角胶8-16份，其可以促卵母细胞体外成熟，专利cn 104257987b的专利申请还公开了上述复方具有提高母胎免疫耐受的作用。但是，目前还未见其提升卵巢储备功能的相关报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供了一种中药组合物的新用途。
[0006]
中药组合物在制备提升卵巢储备功能的药物中的用途，所述中药组合物由如下重量配比的原料药组成：熟地10-20份、山茱萸10-20份、山药10-20 份、枸杞子10-20份、菟丝子10-20份、鹿角胶或鹿角霜1-15份。
[0007]
进一步地，上述原料药的重量配比如下：熟地10-15份、山茱萸10-15 份、山药10-15份、枸杞子10-15份、菟丝子10-15份、鹿角胶或鹿角霜1-10 份。
[0008]
进一步地，上述原料药的重量配比如下：熟地15份、山茱萸15份、山药15份、枸杞子15份、菟丝子15份、鹿角胶或鹿角霜10份。
[0009]
进一步地，上述提升卵巢储备功能的药物是改善卵巢血供的药物；优选为增加卵巢微血管密度和/或相对血管面积的药物。
[0010]
进一步地，上述提升卵巢储备功能的药物是提升性激素水平的药物。
[0011]
进一步地，上述提升卵巢储备功能的药物是促进卵泡发育和/或降低闭锁卵泡发
生的药物。
[0012]
进一步地，上述提升卵巢储备功能的药物是提高卵子数量和/或提升卵子质量的药物；优选地，所述提高卵子数量的药物是保护卵母细胞有丝分裂的药物，和/或所述提升卵子质量的药物是降低异常卵子数量的药物。
[0013]
进一步地，上述提升卵巢储备功能的药物是改善冲任虚寒卵巢储备功能低下的药物。
[0014]
进一步地，上述药物是以权利要求1～3任意一项所述中药组合物为活性成分，加上药物上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
[0015]
进一步地，所述的制剂是口服制剂、外用制剂；优选地，所述口服制剂是丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、片剂或口服液；所述的外用制剂是灌肠剂、栓剂。
[0016]
实验结果表明，本发明中药组合物对冲任虚寒(卵巢功能低下)小鼠生殖功能有正向调节作用，一方面能够抑制no异常高水平表达，使线粒体内氧化磷酸化趋近正常，增加
△
ψm，增强线粒体呼吸水平，加强atp合成，保护卵母细胞减数分裂，改善卵子功能，增强卵巢储备；另一方面能平衡线粒体动力学蛋白水平，改善线粒体功能及分布，加强线粒体能量代谢，促进卵母细胞成熟，并抑制细胞过度凋亡，减少异常卵子及闭锁卵泡发生；最终实现能够改善月经情况，提升性激素水平，提升生殖区位热值的效果。由此可知，本发明药物组合物可以有效提升卵巢储备功能，进一步调节生殖功能，在辅助生殖技术领域具有应用前景。
[0017]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0018]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
[0019]
实施例1本发明药物组合物的制备
[0020]
称取原料：熟地15g、山茱萸15g、山药15g、枸杞子15g、菟丝子15g、鹿角胶10g；
[0021]
制备方法：以上六味，除鹿角胶外，其余熟地黄等五味粉碎成细粉，过筛混匀。取鹿角胶烊化，与上述细粉混匀，烘干密封保存，为粉末散剂。
[0022]
实施例2本发明药物组合物的制备
[0023]
称取原料：熟地20g、山茱萸20g、山药20g、枸杞子20g、菟丝子20g、鹿角胶15g；
[0024]
按实施例1方法制备。
[0025]
实施例3本发明药物组合物的制备
[0026]
称取原料：熟地10g、山茱萸10g、山药10g、枸杞子10g、菟丝子10g、鹿角胶1g；
[0027]
按实施例1方法制备。
[0028]
实施例4本发明药物组合物的制备
[0029]
称取原料：熟地15g、山茱萸15g、山药15g、枸杞子15g、菟丝子15g、鹿角霜10g；
[0030]
按实施例1方法制备。
[0031]
实施例5本发明药物组合物的制备
[0032]
称取原料：熟地150g、山茱萸150g、山药150g、枸杞子150g、菟丝子 150g、鹿角胶
100g；
[0033]
每100g粉末加炼蜜10g与适量的水，泛丸，干燥，得丸剂；或取粉末，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液。
[0034]
上述原料可以用原生药，也可以用原生药的炮制品。
[0035]
以下通过实验例证明本发明的有益效果：
[0036]
本发明所用材料、设备均为市售产品，通过购买市售产品所得。
[0037]
实验例1、本发明药物组合物提升卵巢储备功能
[0038]
1、冲任虚寒卵巢储备功能下降模型小鼠制备
[0039]
4℃羟基脲建模：于每日上午9时按体重灌胃400mg/kg浓度的4℃羟基脲混悬液，21天后出现虚寒虚损表现并见肛门溏便粘粘症状，肛温、体重、卵巢指数显著下降，无法产出胎儿，或所产均为死胎，获卵数下降，异常卵比率增高，amh值及e2、p水平低下，病理观察提示原始卵泡数、黄体数均显著下降，闭锁卵泡数目增加；而且，建模小鼠活动减少、反应迟缓、弓背蜷缩、毛发枯涩减少、饮水饮食减少、大小便正常，出现四肢和尾部发凉、抓爬等动作无力、胡须脱落、肛门处可见溏便粘黏等表现，说明建模小鼠的阳虚表征明显，并且卵巢储备功能明显下降，造模成功。
[0040]
2、实验方法
[0041]
分组干预：
[0042]
(1)自然周期组：于每日上午9时灌胃0.2ml生理盐水，连续灌胃15 天，不进行促排处理；
[0043]
(2)单次促排组：于每日上午9时灌胃0.2ml生理盐水，连续灌胃15 天，采用孕马血清促性腺激素(pmsg)结合绒毛膜促性腺激素(hcg)的方式进行超促排卵：第1天腹腔注射pmsg 5iu，48h后第3天同一时间腹腔注射hcg 5iu。
[0044]
(3)模型组：于每日上午9时灌胃0.2ml生理盐水，连续灌胃15天，采用孕马血清促性腺激素(pmsg)结合绒毛膜促性腺激素(hcg)的方式进行超促排卵：第1天腹腔注射pmsg 5iu，48h后第3天同一时间腹腔注射hcg 5iu。
[0045]
(4)药物干预组：取实施例1制得的药物于每日上午9时灌胃1.70g/kg，连续灌胃15天，采用孕马血清促性腺激素(pmsg)结合绒毛膜促性腺激素 (hcg)的方式进行超促排卵：第1天腹腔注射pmsg 5iu，48h后即第3 天同一时间腹腔注射hcg 5iu。
[0046]
3、实验结果
[0047]
3.1改善性激素水平
[0048]
检测各组干预后小鼠的抗缪勒管激素(amh)水平、卵泡期和黄体期的雌二醇(e2)水平以及黄体期的孕酮(p)水平，实验结果如表1所示：
[0049]
表1
[0050][0051]
*是指：与自然周期组相比有显著性差异(p《0.1),**是指与自然周期组相比有显著性差异(p《0.05)；#是指：与单次促排组相比有显著性差异 (p《0.1),##是指与单次促排组相比有显著性差异(p《0.05)；
△
是指：与模型组相比有显著性差异(p《0.1),
△△
是指与模型组相比有显著性差异 (p《0.05)。
[0052]
上述结果说明，本发明中药组合物可以有效改善性激素水平。
[0053]
3.2促进卵泡成熟，降低闭锁卵泡发生
[0054]
通过he染色，反映各组小鼠原始卵泡、成熟卵泡和闭锁卵泡的数量，结果如表2所示：
[0055]
表2
[0056] 原始卵泡成熟卵泡闭锁卵泡自然周期组10.00
±
2.530.5
±
0.841.5
±
1.38单次促排组9.17
±
3.312.00
±
1.10
*
1.50
±
0.84模型组3.67
±
1.37
**##
0.17
±
0.41
##
8.83
±
1.47
**##
药物干预组10.17
±
3.19
△△
2.00
±
0.89
*
△△
3.50
±
2.07
*#
△△
[0057]
*是指：与自然周期组相比有显著性差异(p《0.1),**是指与自然周期组相比有显著性差异(p《0.05)；#是指：与单次促排组相比有显著性差异 (p《0.1),##是指与单次促排组相比有显著性差异(p《0.05)；
△
是指：与模型组相比有显著性差异(p《0.1),
△△
是指与模型组相比有显著性差异 (p《0.05)。
[0058]
上述结果说明，本发明药物组合物可以有效促进卵泡成熟，降低闭锁卵泡发生，增强卵巢储备。
[0059]
3.3提高卵子质量，上调卵子数量
[0060]
取卵方法参照《小鼠胚胎操作实验手册》。各组小鼠于最后一次注射hcg 后取卵，取卵时间参考文献及预实验结果，确定为hcg后14小时。小鼠予麻醉后按照常规解剖术式解剖。摘取双侧输卵管置于培养皿中，于显微镜下使用1ml注射器针头划破输卵管壶腹部，释放卵丘复合体。将卵丘复合体移至含有透明质酸酶的培养皿中，分离颗粒细胞，将分离出的卵母细胞移至含有 m2培养液的培养皿内，显微镜下观察卵母细胞并进行分期及计数。结果如表 3所示：
[0061]
表3
[0062] 总卵数mii期卵数异常卵数mii卵率(％)自然周期组10.17
±
1.606.50
±
0.843.00
±
1.1065.99
±
11.16单次促排组26.17
±
4.07
**
15.50
±
1.87
**
6.83
±
2.32
*
59.93
±
8.36
模型组14.17
±
3.31
##
3.83
±
1.17
##
8.67
±
2.16
##
27.16
±
6.94
**##
药物干预组17.00
±
3.69
*#
7.33
±
1.75
##
△
5.67
±
3.3943.12
±
4.99
**##
△△
[0063]
*是指：与自然周期组相比有显著性差异(p《0.1),**是指与自然周期组相比有显著性差异(p《0.05)；#是指：与单次促排组相比有显著性差异 (p《0.1),##是指与单次促排组相比有显著性差异(p《0.05)；
△
是指：与模型组相比有显著性差异(p《0.1),
△△
是指与模型组相比有显著性差异 (p《0.05)。
[0064]
上述结果说明，本发明药物组合物可以显著降低异常卵发生比率，提高卵子质量，上调卵子数量，有效保护了卵母细胞的有丝分裂，因而mii卵率较模型组有显著提升。
[0065]
3.4改善卵巢血供
[0066]
检测各组小鼠卵巢微血管密度(mdv)和相对血管面积(rva)水平，结果如表4所示：
[0067]
表4
[0068] mdvrva(％)自然周期组14.93
±
5.211.45
±
0.47单次促排组15.50
±
5.381.95
±
.64模型组7.85
±
1.98
#
0.66
±
0.76
#
药物干预组18.83
±
8.18
△△
1.71
±
0.72
△
[0069]
*是指：与自然周期组相比有显著性差异(p《0.1),**是指与自然周期组相比有显著性差异(p《0.05)；#是指：与单次促排组相比有显著性差异 (p《0.1),##是指与单次促排组相比有显著性差异(p《0.05)；
△
是指：与模型组相比有显著性差异(p《0.1),
△△
是指与模型组相比有显著性差异 (p《0.05)。
[0070]
上述结果说明，本发明药物组合物可以显著提升小鼠的卵巢微血管密度和相对血管面积水平，改善卵巢血供。
[0071]
3.5改善冲任虚寒状态
[0072]
检测各组小鼠血清中三磷酸腺苷(atp)、一氧化氮(no)、3’,5
’‑
环腺苷酸(camp)和3’,5
’‑
环鸟苷酸(cgmp)的表达量，结果如表5所示：
[0073]
表5
[0074][0075]
*是指：与自然周期组相比有显著性差异(p《0.1),**是指与自然周期组相比有显著性差异(p《0.05)；#是指：与单次促排组相比有显著性差异 (p《0.1),##是指与单次促排组相比有显著性差异(p《0.05)；
△
是指：与模型组相比有显著性差异(p《0.1),
△△
是指与模型组相比有显著性差异 (p《0.05)。
[0076]
进一步用荧光探针探索本发明组合物对卵母细胞线粒体膜电位(
△
ψm) 的改善
作用，结果如表6所示，荧光强度越高说明
△
ψm越高：
[0077]
表6
[0078] 荧光强度自然周期组1.18
±
0.67单次促排组1.11
±
0.59模型组0.73
±
0.55
**#
药物干预组1.11
±
0.49
△
[0079]
*是指：与自然周期组相比有显著性差异(p《0.1),**是指与自然周期组相比有显著性差异(p《0.05)；#是指：与单次促排组相比有显著性差异 (p《0.1),##是指与单次促排组相比有显著性差异(p《0.05)；
△
是指：与模型组相比有显著性差异(p《0.1),
△△
是指与模型组相比有显著性差异 (p《0.05)。
[0080]
可见，本发明药物组合物能够显著提升卵母细胞的线粒体膜电位，促进了卵母细胞的能量转换，从而显著增加小鼠血清中的atp含量，下调no表达，纠正camp/cgmp比率，改善小鼠冲任虚寒状态。
[0081]
实验例2、本发明药物组合物改善冲任虚寒小鼠受孕
[0082]
造模方式和分组方式同实施例1。小鼠注射hcg后，按照雌性小鼠：雄性小鼠2：1的比例进行合笼，次日清晨检查小鼠阴道口，见阴栓则视为合笼成功。饲养孕鼠至子代小鼠出生后1周，观察各组产仔数及出生1周的子代存活情况，各组小鼠的合笼子代数量结果如表7所示：
[0083]
表7
[0084] 产仔数活胎数死胎数自然周期组10.33
±
1.8610.33
±
1.860.00
±
0.00单次促排组11.5
±
2.4311.5
±
2.430.00
±
0.00模型组1.67
±
2.88
**##
0.5
±
0.84
**##
1.17
±
2.04药物干预组8.17
±
2.14
#
△
7.67
±
1.63
*##
△△
0.5
±
0.84
[0085]
*是指：与自然周期组相比有显著性差异(p《0.1),**是指与自然周期组相比有显著性差异(p《0.05)；#是指：与单次促排组相比有显著性差异 (p《0.1),##是指与单次促排组相比有显著性差异(p《0.05)；
△
是指：与模型组相比有显著性差异(p《0.1),
△△
是指与模型组相比有显著性差异 (p《0.05)。
[0086]
上述结果表明，本发明药物显著改善了冲任虚寒小鼠的受孕结果，活胎数显著增加，死胎数降低，说明本发明药物对助孕有积极作用。
[0087]
实验例3、本发明药物组合物临床试验结果
[0088]
一、临床资料
[0089]
1、研究对象及方法
[0090]
1.1研究对象
[0091]
2018年5月至2020年1月在成都中医药大学附属医院，并且在门诊诊断为dor的患者。
[0092]
1.2方法
[0093]
(1)采用配对设计中的自身前后对照研究方法，分析、比较患者治疗前，和治疗1个
疗程后的中医证候积分、月经情况积分、amh、fsh、afc以及红外扫描的生殖区位热值(非经期)情况。
[0094]
(2)病例分组：根据fsh数值分层，将41例患者进行分组，分为低 fsh组(10＜fsh≤25)25人，高fsh组(25＜fsh≤40)16人，分别观察，两组患者治疗前后amh、fsh、afc的变化情况。
[0095]
2、诊断标准
[0096]
2.1 dor西医诊断标准
[0097]
参照《卵巢低反应专家共识》(2015年中华医学会生殖医学分会)、《实用妇科内分泌学》(第2版)和相关文献并结合临床，制定dor的诊断标准：
[0098]
(1)18岁≤年龄＜40岁；
[0099]
(2)临床表现：经量减少，或周期推迟，甚或闭经。
[0100]
(3)激素水平(在6个月内两次性激素水平测定)：
①
基础血清卵泡刺激素10u/l＜fsh≤40u/l，
②
fsh/lh》2-3.6；
③
amh《1.1ng/ml。
④
双侧卵巢窦卵泡数afc＜6个。
[0101]
以上标准(1)必备，(2)中具备其中任何一点即可，(3)具备
①
和
③
即可诊断dor。
[0102]
2.2中医诊断标准
[0103]
祖国医学对dor并没有明确的记载，古籍也未曾出现过这个病名，但是在“月经后期”、“不孕症”、“月经过少”、“闭经”等病证中可以见到类似的症状。
[0104]
2.2.1中医辨病诊断标准
[0105]
综合参考《中药新药临床研究指导原则》(2002年制定)和普通高等教材中医药规划教材《中医妇科学》月经后期、月经过少肾虚证的标准制定：
[0106]
主证：(1)月经过少(经量较以往减少明显，或点滴即净，经期小于两天，伴或不伴周期的异常。(2)月经后期(连续2个或2个月以上月经周期延后大于7天，伴或不伴量的异常)。(3)闭经。
[0107]
2.2.2中医证候诊断标准
[0108]
主症:(1)月经后期(2)月经过少(3)经色淡，质清稀。
[0109]
次症:(4)腰膝酸痛(5)头晕耳鸣(6)潮热(7)失眠多梦(8)性欲减退(9)疲倦乏力。
[0110]
舌脉:舌黯淡，苔薄白，脉沉弱或沉迟。
[0111]
具备主症任一，或次症满足一项及以上。
[0112]
3、纳入标准：
[0113]
(1)18岁≤年龄＜40岁；
[0114]
(2)符合西医纳入标准的dor；
[0115]
(3)未服用任何激素类及对生殖内分泌有影响的药品(治疗前3个月)；
[0116]
4、排除标准：
[0117]
(1)不符合纳入标准者；
[0118]
(2)妊娠期或哺乳期妇女；
[0119]
(3)因子宫病变、pcos等造成的月经紊乱；
[0120]
(4)精神病患者、严重的心血管、肝、肾或造血系统等全身性疾病，；
[0121]
(5)病例资料不完善；
[0122]
(6)有其他内分泌方面的疾病的患者。(如：高泌乳素血症)；
[0123]
(7)其他原因引起的月经不调者。(如：生殖器官畸形)
[0124]
(8)在治疗过程中，并没有按医嘱规律服药，或因其他原因影响对疗效判定者。
[0125]
5、剔除标准：
[0126]
(1)不符合纳入标准而误入者；
[0127]
(2)所收集材料不全，导致最终疗效评价不准确者。
[0128]
(3)私自服用其他影响研究结果药物。
[0129]
二、研究内容
[0130]
1、一般资料
[0131]
1.1年龄分布
[0132]
41例患者年龄在26-39岁之间，其中最小年龄为26岁，最大年龄为39 岁，平均年龄35.4
±
4.1岁。(见表8)
[0133]
表8：年龄分布表
[0134][0135]
1.2病程情况
[0136]
从表9来看，研究对象中最短的病程为2月，最长病程36月，平均病程 12.4
±
9.4月，1-10个月病程的患者占一半以上。
[0137]
表9：病程情况表
[0138][0139]
1.3初潮年龄分布
[0140]
最小初潮年龄9岁，最大初潮年龄15岁，平均初潮年龄12.7
±
1.4岁，从表10来看初潮年龄在13-14岁段的人数最多，占51.2％，其次是11-12岁年龄段。
[0141]
表10：初潮年龄情况分布表
[0142][0143]
1.4中医体质评价
[0144]
共30例dor患者完成了体质评价，体质情况资料均由门诊经过专门培训的妇科研究生进行统计、操作、判定，发现患者体质多种多样，30例患者体质总频次111次，根据表11、表12看出，频次从高往低排列顺序依次是阳虚质、气虚质、气郁质、血瘀质、湿热质、阴虚质、痰湿质、平和质和特禀，对应频率依次是：17.1％、15.3％、14.4％、14.4％、10.8％、9.90％、9.0％、 6.3％、2.7％。且患者以兼夹体质多见，占66.7％。单一体质的占33.3％共计10 人，其中平和质7例，气郁质1例，阳虚1例，气虚1例。
[0145]
表11：体质频数统计表
[0146][0147]
表12：兼夹体质分类表
[0148][0149]
2、入选患者的治疗方案
[0150]
患者煎服方法：取实施例1的药物组合物加水煎服，日一剂，日三服，早中晚三次温服，每次200m1，经期停服。
[0151]
疗程：服药3个月(或3个月经周期)为一个疗程，治疗一个疗程后，进行疗效评价。
[0152]
3、观察指标
[0153]
3.1患者一般情况
[0154]
包括年龄、病程、妇科手术史、身高体重、bmi、中医体质、初潮年龄情况。
[0155]
3.2疗效性指标
[0156]
(1)实验室指标:在月经周期第2-3天(停经时间超过3月的患者，无时间要求)抽血检测amh、卵泡刺激素(fsh)。比较治疗前后血清amh、fsh 水平变化情况。
[0157]
(2)超声指标：治疗前、治疗后于经期2-5天经阴道超声测定患者双侧卵巢窦卵泡数量(闭经患者按疗程测治疗前后值)。
[0158]
(3)红外热成像扫描(ttm)：在治疗前、治疗1个疗程后进行生殖区位的红外热成像扫描(治疗前后于相同的月经周期进行扫描，经期除外)，比较治疗前后生殖区位热值变化。
[0159]
(4)各个证候积分:根据中医症状评分表，对治疗前后各个症状进行评分，计算各个症状积分，来评价经治疗后患者各个症状的改善情况。
[0160]
(5)调经疗效:根据调经疗效的评分，对比治疗前后的月经情况积分，计算疗效指数。
[0161]
(6)中医总体疗效:根据中医证候评分表计算中医总体疗效指数。
[0162]
3.3调经疗效评价标准
[0163]
(1)无效:月经量、色、质、周期未见明显改善，积分未见降低。
[0164]
(2)有效:经量有所增加或周期较前有所缩短或经色质改善，以上三项改善一项及以上，积分降低一个等级。
[0165]
(3)显效:经量较前增加或周期较以前有所缩短或经色质改善，以上三项改善一项及以上，积分降低两个等级。
[0166]
(4)痊愈:月经量、色、质、周期基本恢复至正常水平。
[0167]
3.4中医证候疗效判定标准
[0168]
根据《中药新药临床研究指导原则》制定：
[0169]
疗效指数(n)＝(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分*100％
[0170]
(1)无效:月经的经量、周期、色质均无明显改变，临床症状均无改善，或甚至加重，n《30％。
[0171]
(2)有效:各个临床症状部分消失，月经各项参数(量、色、质、周期) 稍有改善，30％≤n＜75％。
[0172]
(3)显效:临床症状得到明显改善，月经各项参数明显改善，经量较以往明显增加，色质明显改善，75％≤n＜90％。
[0173]
(4)治愈:临床症状基本消失，月经经量、色质、周期恢复正常，n≥90％。
[0174]
3.5中医症候评分表
[0175]
参照新世纪教材《中医妇科学》、2002年《中药新药临床研究指导原则》拟定中医月经量少/月经后期肾虚证的评分表。
[0176][0177]
注:治疗前和治疗后各记录1次。舌脉:不计分。
[0178]
中医证候评估标准为:
[0179]
痊愈:n≥90％；
[0180]
显效:75％≤n＜90％；
[0181]
有效:30％≤n《75％；
[0182]
无效:n＜30％。
[0183]
注：中医症候疗效指数n＝(治疗前评分一治疗后评分)/治疗前评分 *100％
[0184]
3.6综合疗效评价标准
[0185]
临床综合疗效标准参照根据《中药新药临床研究指导原则》[15]制定按照尼莫地平法计算疗效指数“n”：
[0186]
痊愈:治疗后fsh、amh基本恢复正常或伴afc增加，中医证候积分减少≥90％；
[0187]
显效:治疗后fsh、amh较前明显改善或伴afc增加，90％》中医证候积分减少》_75％；
[0188]
有效:治疗后fsh、amh.有所改善或伴afc增加，75％》中医证候积分减少》_30％；
[0189]
无效:治疗后fsh、amh、afc无改善或升高，中医证候积分减少《30％。
[0190]
4、统计学分析
[0191]
应用spss 22.0数据分析软件对临床数据统计分析。所有的研究数据均先进行正态分布检验及方差齐性检验，如果是服从正态分布，采用配对t检验，结果用平均值
±
标准差来表示；如果数据不服从正态分布就采用非参数检验(秩和检验)，比较采用wilcoxon秩和检验，得出的结果全部用中位数、四分位数表示。检验均是双侧检验，p＜0.05，差异具有统计学意义；当p ＜0.01，差异具有显著统计学意义。
[0192]
三、结果
[0193]
1、治疗前后中医证候、月经情况比较
[0194]
中医各个症状积分均不服从正态分布，采用秩和检验方法统计。除了性欲减退，各个中医症候积分在治疗前后均存在显著的差异，p均＜0.01。具有显著统计学意义。
[0195]
月经情况(月经过少+月经后期)：治疗前后数据不服从正态分布，用秩和检验方法统计，p＜0.01，差异有显著统计学意义。
[0196]
表13：治疗前后中医症候积分对比
[0197][0198]
注：p＜0.01，差异有显著统计学意义；p＞0.05，差异不具有统计学意义。
[0199]
2、中医证候总积分比较
[0200]
中医证候总积分：对治疗前以及治疗后总积分差值进行计算，计量数据不符合正态分布，采用wilcoxon带符号秩检验比较差异。表14和表15结果表示，中医证候总积分在治疗前后存在显著差异，p＜0.01，治疗后的中医积分显著低于治疗前。经治疗后，中医综合疗效显著，痊愈6例、显效8例、有效18例、无效9例，无效21.95％、有效43.90％、显效19.51％、痊愈14.63％，总有效率78.04％。
[0201]
表14：中医证候总积分比较
[0202][0203]
注：p＜0.01，差异有显著统计学意义。
[0204]
表15中医综合疗效
[0205][0206]
3、调经疗效
[0207]
资冲汤调经疗效：无效8例、有效12例、显效9例、痊愈12例，分别占19.51％、29.27％、21.95％、29.27％，总有效率80.49％。
[0208]
表16：调经疗效
[0209][0210]
4、治疗前后amh、fsh、afc比较
[0211]
因数据不服从正态分布，41例患者治疗前后测得的amh水平数据采用 wilcoxon带符号秩检验比较差异，p＜0.01，差异有显著统计学意义。并且治疗后的amh水平显著高于治疗前。
[0212]
治疗前后fsh水平：数据服从正态分布，用t检验，p＜0.01，差异有显著统计学意义。
[0213]
治疗前后窦卵泡数：数据不服从正态分布，用秩和检验方法统计，p＜ 0.01，差异有显著统计学意义。
[0214]
表17：治疗前后amh、fsh水平、窦卵泡数对比
[0215][0216][0217]
注：p＜0.01，差异有显著统计学意义。p＜0.05，差异有统计学意义。
[0218]
5、综合疗效
[0219]
观察的41例dor患者经治疗后，痊愈率6例占14.63％，显效8例占 19.51％，有效18例占43.90％，总有效率为78.04％，无效9例占21.95％。
[0220]
表18综合疗效
[0221][0222]
6、治疗前后生殖区位热值比较
[0223]
有16例患者完成了治疗前与治疗的红外热成像扫描，治疗前后16例患者的生殖区位的热值均呈现升高趋势。
[0224]
治疗前后“神阙”数据呈非正态分布，而其他指标治疗前后均呈正态分布。神阙在治疗前后的差异比较采用wilcoxon带符号秩检验比较差异。由表 19可见，神阙在治疗后的热值较治疗前有升高。
[0225]
表19：神阙在治疗前后的差异比较
[0226][0227]
督脉、下腹、子宫、左附件、右附件在治疗前后的差异比较采用配对样本t检验比较差异。由表20可见，督脉、下腹、子宫、左附件、右附件治疗后的区位热值均高于治疗前，说明本发明药物组合物能升高生殖区位的热值。
[0228]
表20：督脉、下腹、子宫、左附件、右附件治疗前后差异比较
[0229][0230]
7、fsh数值分层比较
[0231]
无论是低fsh组(10miu/ml＜fsh≤25miu/ml)还是高fsh组(25 miu/ml＜fsh≤40miu/ml)，治疗后患者的amh、fsh较前都有明显改善。
[0232]
在25例低fsh组患者中，amh、fsh、afc较前都有明显改善，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；
[0233]
在16例高fsh组的患者中，amh较前升高，差异具有显著统计学意义 (p＜0.01)；fsh较前有下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)；afc较前变化不大，差异无统计学意义(p＞0.05)。
[0234]
表21：低fsh和高fsh患者治疗前后amh、fsh、afc比较
[0235][0236]
注：p＜0.01，差异具有显著统计学意义；p＜0.05，差异有统计学意义； p＞0.05，差异无统计学意义。
[0237]
上述临床试验结果说明，本发明的中药组合物能够有效提升卵巢储备功能，具体而言，能够改善月经情况，提升性激素水平，提升生殖区位热值。对dor的中医综合疗效高达78.04％，调经疗效高达80.49％，综合疗效达 78.04％。
[0238]
综上，本发明中药组合物对冲任虚寒卵巢功能低下小鼠生殖功能有正向调节作用，一方面能够抑制no异常高水平表达，使线粒体内氧化磷酸化趋近正常，增加
△
ψm，增强线粒体呼吸水平，加强atp合成，保护卵母细胞减数分裂，改善卵子功能，增强卵巢储备；另一方面能平衡线粒体动力学蛋白水平，改善线粒体功能及分布，加强线粒体能量代谢，促进卵母细胞成熟，并抑制细胞过度凋亡，减少异常卵子及闭锁卵泡发生；最终实现能够改善月经情况，提升性激素水平，提升生殖区位热值的效果。由此可知，本发明药物组合物可以有效提升卵巢储备功能，进一步调节生殖功能，在辅助生殖技术领域具有应用前景。