本发明涉及中成药应用领域，具体涉及一种中成药颗粒组合物在制备抗呼吸道病毒药物中的应用。
背景技术：
：新型冠状病毒肺炎(covid-19)是由新型冠状病毒引起的急性感染性肺炎，具有传染性强和流行性高的特点，人群普遍易感。该病毒症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。cn111467451a是本发明人在先申请的专利技术，在该项技术中治疗新型冠状病毒肺炎的重要组合物由柴胡、黄芩、法半夏、党参、全瓜蒌、槟榔、草果、厚朴、知母、芍药、甘草、陈皮、虎杖等组成。目前该中药组合物主要用于治疗新型冠状病毒肺炎，且主要是通过人用经验形式使用，对其真实抗病毒效果及对抗其他呼吸道病毒作用方面尚无研究报道。技术实现要素：本发明的目的就是通过现有的中成药组方基础上，获得不同中成药颗粒的有效成分含量，从而得到不同的抗病毒效果。本发明提供的抗呼吸道病毒领域中的应用具体包括甲型流感病毒h1n1、甲型流感病毒h3n2、h5n1病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、腺病毒(adv)、sars-cov-2病毒等。本发明的技术方案如下：一种中成药颗粒组合物在制备抗甲型流感病毒h1n1和甲型流感病毒h3n2药物中的应用，以15g中成药颗粒组合物计，含有黄芩苷120mg-180mg，柴胡皂苷d≥4mg，芍药苷15mg-30mg，虎杖苷20mg-40mg和芒果苷10-20mg。一种中成药颗粒组合物在制备抗h5n1病毒药物中的应用，以15g中成药颗粒组合物计，含有黄芩苷150mg-200mg，厚朴酚与和厚朴酚总量≥5mg，芍药苷15mg-30mg，虎杖苷20mg-40mg，芒果苷10-20mg。一种中成药颗粒组合物在制备抗呼吸道合胞病毒(rsv)药物中的应用，以15g中成药颗粒组合物计，含有黄芩苷90mg-150mg，柴胡皂苷d≥6mg，厚朴酚与和厚朴酚总量≥5mg，橙皮苷30mg-60mg，虎杖苷15mg-30mg，芒果苷30-60mg，甘草酸≥10mg。一种中成药颗粒组合物在制备抗腺病毒(adv)药物中的应用，以15g中成药颗粒组合物计，含有黄芩苷250mg-350mg，柴胡皂苷d≥4mg，芍药苷≥25mg，橙皮苷15mg-30mg，虎杖苷≥40mg，甘草酸≥10mg。一种中成药颗粒组合物在制备抗sars-cov-2新型冠状病毒药物中的应用，以15g中成药颗粒组合物计，含有黄芩苷180mg-240mg，柴胡皂苷d≥4mg，芍药苷20mg-60mg，橙皮苷30mg-70mg，虎杖苷15mg-30mg，厚朴酚与和厚朴酚总量≥5mg，甘草酸≥10mg。优选的，所述中成药颗粒组合物浓度控制在0.25-1mg/ml之间，对sars-cov-2病毒在veroe6细胞上的复制有抑制作用。优选的，所述中成药颗粒组合物为中药药材经提取、浓缩、干燥、制粒工艺步骤制成。本发明提供的中成药颗粒组合物在抗呼吸道病毒中的应用，不但治疗效果显著，而且安全无毒，大鼠单次经口给药毒性试验最大耐受量大于24.0g/kg/天，30天重复经口给药最大耐受量大于16.0g/kg/天。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做出详细说明，应当了解，实施例只用于说明本发明，而不是用于对本发明进行限定，任何在本发明基础上所做的修改、等同替换等均在本发明的保护范围内。作为优选的实施方式，所述中成药颗粒组合物可以由柴胡13-25份、黄芩6-25份、法半夏3-8份、全瓜蒌2-5份、党参7-20份、槟榔7-15份、草果3-10份、厚朴3-15份、知母6-15份、赤芍5-20份、甘草3-10份、陈皮3-15份、虎杖8-25份的组方配比组成，经提取、浓缩、干燥、制粒等工艺步骤制成颗粒剂。本发明中测定其中抗病毒成分，具体抗病毒成分测定方法包括如下内容1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.2-0.4％磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流动相中乙腈水溶液的体积比分别为：0-40min，乙腈10-40％；40-45min，乙腈40-70％；45-50min，乙腈70％；50-55min，乙腈70-10％；55-60min，乙腈10％；检测波长为230nm，理论板数按黄芩苷计算应不低于2800。2)对照品溶液的制备：取黄芩苷、柴胡皂苷d、橙皮苷、芍药苷、芒果苷、虎杖苷、厚朴酚、和厚朴酚、甘草酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成一定浓度的混合对照品溶液。3)供试品溶液的制备：取本品粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)20分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。4)测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。现代研究表明，抗病毒治疗指数(ti)是药物体外抗病毒效果的评价指标，3＜ti＜5表示药物抗病毒作用为有毒有效，ti﹥5表示药物发挥高效低毒的抗病毒作用，ti值越大，药物抑制呼吸道病毒作用越强。ti＝tc50/ic50，其中tc50为药物致半数细胞毒性浓度，ic50为药物半数有效浓度，其计算方法通过体外抗病毒实验确定。优选地，所述呼吸道病毒为甲型流感病毒h1n1、甲型流感病毒h3n2，所述中成药颗粒组合物由柴胡13-16份、黄芩6-8份、法半夏3-5份、全瓜蒌2-4份、党参11-13份、槟榔11-13份、草果3-5份、厚朴3-5份、知母6-8份、赤芍11-13份、甘草3-5份、陈皮3-5份、虎杖11-13份组成，其中抗甲型流感病毒h1n1、抗甲型流感病毒h3n2成分含量每袋黄芩苷应为120mg-180mg，柴胡皂苷d≥4mg，芍药苷应为15mg-30mg，虎杖苷应为20mg-40mg，芒果苷应为10-20mg，中成药颗粒组合物对甲型流感病毒h1n1治疗指数(ti)大于20，对甲型流感病毒h3n2治疗指数(ti)大于15。优选地，所述呼吸道病毒为h5n1病毒，所述中成药颗粒组合物由柴胡13-16份、黄芩10-14份、法半夏3-5份、全瓜蒌2-4份、党参13-15份、槟榔11-13份、草果3-5份、厚朴12-15份、知母6-8份、赤芍11-13份、甘草5-7份、陈皮3-5份、虎杖11-13份组成，其中抗h5n1病毒成分含量黄芩苷应为150mg-200mg，柴胡皂苷d≥4mg，厚朴酚与和厚朴酚总量≥5mg，芍药苷应为15mg-30mg，虎杖苷应为20mg-40mg，芒果苷应为10-20mg，中成药颗粒组合物对h5n1病毒治疗指数(ti)大于25。优选地，所述呼吸道病毒为呼吸道合胞病毒(rsv)，所述中成药颗粒组合物由柴胡20-25份、黄芩6-8份、法半夏5-7份、全瓜蒌2-4份、党参7-10份、槟榔7-9份、草果5-7份、厚朴8-10份、知母12-15份、赤芍5-8份、甘草7-10份、陈皮12-15份、虎杖8-10份组成，其中抗呼吸道合胞病毒(rsv)成分含量黄芩苷应为90mg-150mg，柴胡皂苷d≥6mg，厚朴酚与和厚朴酚总量≥5mg，橙皮苷应为30mg-60mg，虎杖苷应为15mg-30mg，芒果苷应为30-60mg，甘草酸≥10mg，中成药颗粒组合物对呼吸道合胞病毒(rsv)治疗指数(ti)大于35。优选地，所述呼吸道病毒为腺病毒(adv)，所述中成药颗粒组合物由柴胡13-15份、黄芩22-25份、法半夏4-5份、全瓜蒌3份、党参7-10份、槟榔9-11份、草果5-7份、厚朴4-6份、知母8-10份、赤芍17-20份、甘草7-10份、陈皮5-8份、虎杖20-25份组成，其中抗腺病毒(adv)成分含量黄芩苷应为250mg-350mg，柴胡皂苷d≥4mg，芍药苷≥25mg，橙皮苷应为15mg-30mg，虎杖苷≥40mg，甘草酸≥10mg，中成药颗粒组合物对腺病毒(adv)治疗指数(ti)大于40。优选地，所述呼吸道病毒为新型冠状病毒(sars-cov-2)，中成药颗粒组合物在0.25-1mg/ml时，对sars-cov-2病毒在veroe6细胞上的复制有抑制效果。本发明的中成药颗粒组合物在抗呼吸道病毒中的应用不但治疗效果显著，而且安全无毒，大鼠单次经口给药毒性试验最大耐受量大于24.0g/kg/天，30天重复经口给药最大耐受量大于16.0g/kg/天。实施例1不同处方药味比例中成药颗粒组合物制备及抗病毒成分含量测定1、按下表1各药味用量比例制备用于抗甲型流感病毒h1n1、甲型流感病毒h3n2的中成药颗粒组合物，并按说明书正文中记载方法测定各抗病毒成分，结果见下表1。表1药材名称用量比例抗病毒成分每袋含量(mg)柴胡15柴胡皂苷d6.11黄芩6黄芩苷160.23半夏4瓜蒌3党参12槟榔12草果4厚朴4厚朴酚与和厚朴酚——知母7芒果苷14.58赤芍12芍药苷22.35甘草4甘草酸——陈皮4橙皮苷——虎杖13虎杖苷31.872、按下表2各药味用量比例制备抗h5n1病毒的中成药颗粒组合物，并按说明书正文中记载方法测定各抗病毒成分，结果见下表2。表23、按下表3各药味用量比例制备抗呼吸道合胞病毒(rsv)的中成药颗粒组合物，并按说明书正文中记载方法测定各抗病毒成分，结果见下表3。表34、按下表4各药味用量比例制备抗腺病毒(adv)的中成药颗粒组合物，并按说明书正文中记载方法测定各抗病毒成分，结果见下表4。表4药材名称用量比例抗病毒成分每袋含量(mg)柴胡14柴胡皂苷d6.96黄芩24黄芩苷326.43半夏4瓜蒌3党参8槟榔9草果6厚朴5厚朴酚与和厚朴酚——知母9芒果苷——赤芍20芍药苷36.54甘草10甘草酸16.54陈皮5橙皮苷22.87虎杖23虎杖苷54.345、按下表5各药味用量比例制备抗新型冠状病毒(sars-cov-2)的中成药颗粒组合物，并按说明书正文中记载方法测定各抗病毒成分，结果见下表5。表5药材名称用量比例抗病毒成分每袋含量(mg)柴胡20柴胡皂苷d7.44黄芩10黄芩苷200.87半夏10瓜蒌10党参15槟榔10草果15厚朴15厚朴酚与和厚朴酚9.48知母10芒果苷——赤芍10芍药苷55.95甘草10甘草酸14.74陈皮10橙皮苷51.04虎杖10虎杖苷24.12实施例2中成药颗粒组合物抗甲型流感病毒h1n1、甲型流感病毒h3n2、h5n1病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、腺病毒(adv)作用1、根据mtt法检测中成药颗粒组合物对犬肾细胞(mdck)和hep-2细胞的毒性作用。2、分别于96孔板接种mdck细胞1×104/孔，37℃、5％co2培养24h；在中成药颗粒组合物半数毒性浓度(tc50)范围内，按照倍比稀释选取5个浓度，每个浓度重复4孔，不同浓度的药物作用于已长成单层的mdck细胞中，37℃、5％co2孵育24h；同时设正常细胞对照组(不感染病毒)和病毒对照组(不给药物干预)。pbs洗2次，洗去未结合的药物；分别将10tcid50甲型流感病毒h1n1、甲型流感病毒h3n2、h5n1病毒接种于mdck细胞中，37℃、5％co2孵育1h；用50μl/孔pbs洗涤细胞2次，洗去未结合的病毒；加入细胞维持液，37℃、5％co2培养。每天于倒置显微镜下观察细胞变化，48h后应用mtt法测不同浓度中成药颗粒组合物的病毒抑制率。3、分别于已长成单层的hep-2细胞96孔板上，每孔接种100μl的100tcid50的rsv、adv病毒液,于33℃吸附90min，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果，在药物无毒浓度范围内,按倍比稀释加入5个不同浓度的含药维持液每孔0.2ml，每日观察cpe，隔天换新鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑对照。约在病毒对照cpe为“+++～++++”(cpe记录方法为：“-”为无cpe；“+”为25％细胞出现cpe；“++”为50％细胞出现cpe；“+++”为75％细胞出现cpe；“++++”为100％细胞出现cpe)时弃培养液上清，用mtt法检测病毒抑制率。病毒抑制率计算方法如下：4、运用统计软件graphpadprism8构建的剂量-存活率曲线，进行数据分析并计算中成药颗粒组合物的致半数细胞毒性浓度(tc50)，将同种方式下不同浓度中成药颗粒组合物对呼吸道病毒的抑制率，用graphpadprism8构建抑制率的回归模型，再对模型进行拟合优度检验，计算药物半数有效浓度(ic50)。用药物治疗指数(ti)评价中成药颗粒组合物在不同方式下的抗呼吸道病毒作用效率。采用ti作为评价指标，衡量药物对呼吸道病毒的抑制效力，ti＝tc50/ic50，ti值越大，药物抑制呼吸道病毒作用越强，计算结果如下表5。表5实施例3中成药颗粒组合物对新型冠状病毒(sars-cov-2)复制的抑制效果新型冠状病毒sars-cov-2感染实验所用细胞系为猴肾细胞系veroe6，主要步骤如下：1、veroe6细胞去上清，每孔加入100μl含2％fbs的dmem维持培养基(2-dmem)及梯度稀释的中成药颗粒组合物(按实施例1中表4配比制得)样品稀释液50μl，并轻摇混匀。实验设置双复孔。实验设置只加150μl培养基的孔为细胞对照孔。将细胞板放入37℃、5％co2培养箱中培养，48h后观察样品对细胞的毒性作用。2、veroe6细胞去上清，每孔加入50μl2-dmem维持培养基及梯度稀释的样品稀释液50μl，同时加入用2-dmem稀释的50μl病毒稀释液(moi为0.02)，轻摇混匀。实验设置双复孔。实验设置只加150μl维持培养基的孔为细胞对照孔，加100μl维持培养基及50μl病毒稀释液的孔为病毒对照孔。将细胞板放入37℃、5％co2培养箱中培养，48h后观察样品对病毒复制的抑制作用。3、结果表明，在veroe6细胞加药加病毒培养48h后，样品中成药颗粒组合物在2mg/ml及以上浓度对细胞具有明显的毒性作用；样品中成药颗粒组合物在1mg/ml、0.5mg/ml和0.25mg/ml浓度时对sars-cov-2病毒在veroe6细胞上的复制有抑制效果(细胞毒性试验及抗病毒抑制作用详见下表6、表7)。表6中成药颗粒组合物对veroe6细胞的毒性作用表7中成药颗粒组合物对sars-cov-2病毒的抑制作用实施例4中成药颗粒组合物非临床安全性研究参照《药物单次给药毒性研究技术指导原则》，在湖北省预防医学科学院(食品药品安全评价中心)开展实验，将40只大鼠，随机分为2组，即受试物组和溶媒对照组，每组20只，雌雄各半，受试物组24小时内累计2次经口灌胃给予剂量为24.0g/kg/天的中成药颗粒组合物干膏粉混悬液，溶媒对照组给予相同体积的蒸馏水。给药后，连续观察14天，观察期结束，所有动物麻醉放血后剖检。观察指标包括濒死/死亡率、临床症状、体重、摄食量、大体剖检等。结果表明，本实验过程中未发生意外死亡，受试物组雄鼠摄食量和雌雄鼠体重，与溶媒对照组相比较均无显著性差异，表明受试物对雄鼠摄食量和雌雄鼠体重增长均无明显影响；受试物组和溶媒对照组动物临床观察、大体剖检均未见异常。说明本品对大鼠24小时内累计2次经口灌胃给予中成药颗粒组合物干膏粉混悬液，最大耐受量大于24.0g/kg/天，安全性良好。同时，参照《药物重复给药毒性试验技术指导原则》，采用120只大鼠，雌雄各半，随机分为4组，每组雌雄各15只。所有动物经灌胃给予受试物水混悬液或溶媒，连续给予4周。给药28天后，于d29每组雌雄各取前10只动物，麻醉采血后剖检，检查各项指标。余下动物在给药结束后继续观察4周，于d57麻醉采血后剖检，检测毒性的可逆性、持续性及延迟效应。所有组织均置于10％的中性缓冲福尔马林液中固定，分析重复给药毒性，结果表明，中成药颗粒组合物干膏粉混悬液30天重复经口给药最大耐受量大于16.0g/kg/天，进一步说明本品安全性良好。以上实验结果表明，虽然实施例二、实施例三中细胞毒性试验表明中成药颗粒组合物在细胞水平表现一定毒性，但经体外实验非临床安全性研究表明，中成药颗粒组合物实际毒性较少，安全性良好，可再更大浓度条件下发挥抗病毒治疗作用。当前第1页12