应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒及制备方法

本发明属于中药技术领域，尤其涉及一种应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒及制备方法。

背景技术：

目前，慢性前列腺炎是以下尿路症状和膀胱生殖区疼痛为主要表现的临床症侯群，常由数种不同原因所致的具有独特形式的疾病共同组成，故又称为慢性前列腺炎综合征(chronicprostatitissyndromes，cps)。慢性前列腺炎(chronicprostatitis，cp)是成年男性的常见病，估计在全世界男性中的患病率为9％～14％。在我国，其病理发病率为24.3％。有人估计50％的男性在其一生中可能曾有过前列腺炎的症状。由于对cp的病因及发病机制缺乏深入的了解，治疗的效果不令人满意。1995年美国国立卫生分析院(nih)提出将前列腺炎分为：i型为急性细菌性前列腺炎；ii型为慢性细菌性前列腺炎；iii型为慢性非细菌性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(cpps)，其中iiia型为炎症性，iiib型为非炎症性；iv型为无症状性炎症性前列腺炎。

cp的确切病因至今未明，影响因素众多，既有病理因素，又有生理因素；既有外部因素，又有体内因素；既有局部因素，又有全身因素；既有行为因素，又有心理因素。一般认为与病原微生物感染、尿液返流、自身免疫反应、盆腔植物神经功能紊乱及精神心理因素等有关。由于cp病因、病理改变、临床症状复杂多样，并对男性的性功能和生育功能有一定影响，严重地影响了患者的生活质量，使患者的精神与肉体遭受极大的折磨，对患者与社会的危害性极大。

对于慢性细菌性前列腺炎，根据药敏试验的结果选择抗生素，在美国最常用的抗生素是喹诺酮类药物，占60％；其次是磺胺类药物和四环素族，占24％和16％。对怀疑衣原体、支原体感染时，首选四环素或红霉素类药物。但是，抗感染药物治疗的效果远不及体外试验，一方面是由于药物难以通过血-前列腺屏障；另一方面，许多微生物的致病性仍受到质疑。因此，对前列腺炎的治疗仅寄希望于抗感染药物是远远不够的；对于有下尿路梗阻症状者，采用α-受体阻滞剂能使紧张的膀胱颈和前列腺松弛，改善排尿功能和后尿道高压，消除前列腺导管的尿流反流，进而改善或消除患者的症状。α-受体阻滞剂有竹林胺、哌唑嗪、特拉唑嗪和坦索罗辛等；非甾体抗炎药物如布洛芬、消炎痛等，对于cpps的治疗具有镇痛、抗炎作用，能减轻炎症，改善患者疼痛症状。舍尼通是花粉的提取物，能阻断雄激素与受体结合，抑制前列腺上皮细胞增殖，抑制内源性炎症介质合成，具有抗感染、抗水肿作用。此外，还有应用免疫抑制剂泼尼松、氧自由基清除剂维生素c和维生素e以及抗抑郁药帕罗西汀等进行治疗的报道。

慢性前列腺炎是泌尿男科常见疾病之一，可引起排尿异常和盆腔部位疼痛，严重可致性功能障碍、男性不育症及精神心理问题，严重影响男性生活质量。西医采用抗生素、α受体阻滞剂、抗炎药等治疗，疗效并不理想。

归黄方是中国中医科学院西苑医院男科的协定方，根据异病同治理论，采用“疮疡内消法”论治湿热瘀滞型慢性前列腺炎。前期研究表明，归黄方治疗6周后显著改善湿热瘀滞型慢性前列腺炎患者的临床症状，降低慢性前列腺炎症状指数评分(nih-cpsi)中的疼痛评分和排尿评分，降低中医症状评分，临床应用10余年，具有较好的安全性及有效性。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术主要采用西药控制前列腺炎的发展，而没有根治的相关药物。

解决以上问题及缺陷的难度为：1、慢性前列腺炎患病率高，治疗效果不佳：

慢性前列腺炎是泌尿男科常见疾病之一，流行病学调查发现国内患有前列腺炎症状者占8.4％，国外报道前列腺炎症状平均患病率为8.2％，患病率与缺血性心脏病和糖尿病相当。美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth，nih)将慢性前列腺炎与心肌梗死、不稳定心绞痛等一起列为影响居民生活质量最为严重的慢性疾病。慢性前列腺炎不仅引起患者疼痛和排尿异常，还与性功能障碍、男性不育症以及精神心理问题密切相关，严重影响了男性的生活质量。

慢性前列腺炎的发生与免疫、炎症、感染、尿液返流、盆底神经肌肉异常活动等密切相关，免疫耐受失调、免疫抑制细胞功能降低、促炎及抗炎介质失衡，共同导致疾病的发生。目前慢性前列腺炎的治疗以控制症状和提高生活质量为目的，常规干预措施包括抗生素、α受体阻滞剂、抗炎药等。以抗生素4-6周为主的治疗，常伴随胃肠道、神经、内分泌系统副作用出现，导致患者依从性差；α受体阻滞剂对ⅲ型前列腺炎有一定的缓解作用，仍有许多研究表明疗效并不明确，属于临床难治疾病。同时，慢性前列腺炎具有反复发作、缠绵难愈的特点，导致医生和患者对慢性前列腺炎的治疗均不满意，需要寻求更有效的治疗手段。

2、慢性前列腺炎从“疮疡内消法”论治：临床实践证明，中医药是治疗cp的重要方法之一。中医认为，慢性前列腺炎属“精浊”、“劳淋”等范畴，临床以湿热瘀滞型多见。本病多由嗜食肥甘，酿湿生热，流注下焦，蕴结精室，或房事不洁，湿热邪毒由下窍而入，上犯精室；欲念不遂，忍精不泄，败精瘀滞于精室，日久则瘀阻脉络。湿热、瘀血是该病进展的病理产物，湿热、瘀血彼此影响互为因果。

慢性前列腺炎与疮疡在中医病因病机、临床表现上存在共性之处，根据“异病同治”理论，慢性前列腺炎可从“疮疡内消法”论治。所谓“消法”，消者，尽也，即除之、散之，使初起的肿疡得到消散，不使邪毒结聚成脓，常用的有清热法、理湿法、行气法、和营法等。

根据慢性前列腺炎的病因病机特点，运用归黄方辨证治疗，体现“以消为贵”的治疗原则。归黄方是中国中医科学院西苑医院男科治疗湿热瘀滞型慢性前列腺炎的协定方，由仙方活命饮加减而来。仙方活命饮为治疗疮疡的经典代表方，化脓生肌、散瘀消肿力强，被后世誉为“疮疡之圣药，外科之首方”，其配伍严谨，有尚未成脓可消，已有脓者即溃的效果，经古今临床应用，疗效卓著。

解决以上问题及缺陷的意义为：本发明归黄方组成包括：当归12g，黄柏12g，金银花15g，姜黄10g，乳香5g，没药5g，白芷10g，陈皮10g，车前草15g，白花蛇舌草15g。本方具有清热除湿、化瘀止痛之功。①君药：当归质润性动，活血补血，行滞止痛，去瘀生新，引药内消。黄柏性寒润降，泻火燥湿力强，为“五脏肠胃清湿热之药”。当归、黄柏共为君药，奏活血、清湿热之功，清热而不伤阴，活血以消瘀滞。②臣药：金银花既清气分实热，又去血中热毒，解毒疗疮力佳。姜黄为血中气药，破血行气力佳，通经脉之结，行血中之滞。乳香、没药二药为树脂类药物，善透窍散瘀理气，行则气血利，通则肿痛止。张锡纯谓其虽走窜力强，但“不至耗伤气血，诚良药也”。③佐药：白芷气香味辛，以祛风散湿，解痉止痛见长，《本经》谓其“长肌肤”，其亦有消肿排脓之用。陈皮理气化痰，痰气同治，又兼有调和之用。佐以车前草利尿通淋、白花蛇舌草解毒利湿。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒及制备方法。本发明拟在“疮疡内消”理论指导下，在保证归黄方疗效的基础上，采用传统工艺配制方法，围绕归黄方的制备工艺、稳定性、质量标准等进行研究，将归黄方开发成安全有效、质量可控、使用方便的医疗机构制剂“归黄方颗粒”，为临床治疗湿热瘀滞型慢性前列腺炎提供一种工艺合理、质量可靠、稳定有效的医院制剂。

本发明是这样实现的，一种应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒，所述应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒按质量计由当归6～12g，黄柏3～12g，金银花6～15g，姜黄3～10g，乳香3～5g，没药3～5g，白芷3～10g，车前草9～30g，白花蛇舌草9～30g以及陈皮3～10g组成。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒的方法，所述应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒制备方法包括：

步骤一，按比例称取当归、黄柏、金银花、姜黄、乳香、没药、白芷、车前草、白花蛇舌草、陈皮，并制备得到应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒；

步骤二，进行应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒的有效性验证。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒制备的片剂。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒制备的口服剂。

本发明的另一目的在于提供一种验证应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒药效的动物模型的构建方法.

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：

本发明提供的归黄方方颗粒的药物组成源于以仙方活命饮为基础，加减化裁而来的西苑医院男科经验方——归黄方，由当归，黄柏，金银花，姜黄，乳香，没药，白芷，陈皮，车前草，白花蛇舌草共10味中药组成，课题组将依据《北京市医疗机构应用传统工艺配制中药制剂备案管理实施细则(试行)》有关技术要求，对归黄方制备工艺、质量标准、稳定性等方面进行实验研究，并进行急毒及长毒试验研究，以明确其安全性以及安全使用范围，形成长期合理、安全的临床用药。通过处方分析以及工艺参数优化筛选，将该方转化成颗粒剂，发挥中药颗粒剂生产效率高，便于运输、携带和储藏的优势，通过上述研究，在不改变归黄方颗粒原有的临床疗效基础上，将其开发为安全、合理、有效、高质量及便于携带的颗粒制剂，惠及更多的患者，迎合市场需要。

本发明能够显著降低cnp湿热瘀滞型患者nih-cpsi总评分、疼痛、排尿、生活质量评分，改善患者的症状。本发明能够减轻前列腺患者的炎症，提高抗氧化酶(t-sod、gsh-px)活性，抑制前列腺内的脂质过氧化产物(mda)水平。

附图说明

图1是本发明实施例提供的应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的两组治疗后nih-cpsi量表及nih-cpsi总评分示意图。

图3是本发明实施例提供的两组治疗后nih-cpsi量表及nih-cpsi疼痛评分示意图。

图4是本发明实施例提供的两组治疗后nih-cpsi量表及nih-cpsi排尿评分示意图。

图5是本发明实施例提供的两组治疗后nih-cpsi量表及nih-cpsi生活质量评分示意图。

图6是本发明实施例提供的两组治疗后nih-cpsi量表及治疗6周nih-cpsi评分意图。

图7是本发明实施例提供的两组治疗后nih-cpsi量表及中医症状评分示意图。

图8是本发明实施例提供的归黄方与cnp靶点映射韦恩图。

图9是本发明实施例提供的ppi蛋白互作网络分析图。

图10是本发明实施例提供的ppi蛋白互作网络靶点蛋白出现频次图。

图11是本发明实施例提供的go富集分析柱状图。

图12是本发明实施例提供的kegg通路富集分析气泡图。

图13是本发明实施例提供的核心靶点kegg富集分析圈图。

图14是本发明实施例提供的核心蛋白与活性化合物的对接结果热图。

图15是本发明实施例提供的药物-活性成分-作用靶点网络图。

图16是本发明实施例提供的大鼠前列腺组织he染色病理形态学变化示意图。

图17是本发明实施例提供的大鼠前列腺组织he评分结果示意图。

图18是本发明实施例提供的大鼠体重示意图。

图19是本发明实施例提供的大鼠前列腺指数示意图。

图20是本发明实施例提供的脾脏指数示意图。

图21是本发明实施例提供的胸腺脏器指数示意图。

图22是本发明实施例提供的大鼠前列腺组织的cd3免疫组化染色示意图。

图23是本发明实施例提供的大鼠前列腺组织的cd45免疫组化染色示意图。

图24是本发明实施例提供的大鼠血清组织il-1β变化示意图。

图25是本发明实施例提供的大鼠血清组织il-6变化示意图。

图26是本发明实施例提供的大鼠血清组织il-18变化示意图。

图27是本发明实施例提供的大鼠血清组织cox-2变化示意图。

图28是本发明实施例提供的大鼠血清组织tnf-α变化示意图。

图29是本发明实施例提供的大鼠血清组织mcp-1炎症细胞因子变化示意图。

图30是本发明实施例提供的大鼠血清组织大鼠血清组织mda变化示意图。

图31是本发明实施例提供的大鼠血清组织大鼠血清组织t-sod变化示意图。

图32是本发明实施例提供的大鼠血清组织gsh-px变化示意图。

图33是本发明实施例提供的免疫荧光双染图。

图34是本发明实施例提供的大鼠前列腺组织pi3kmrna表达示意图。

图35是本发明实施例提供的大鼠前列腺组织akt表达示意图。

图36是本发明实施例提供的大鼠前列腺组织p65nf-κbmrna表达示意图。

图37是本发明实施例提供的大鼠前列腺组织大鼠前列腺组织pi3k、p-pi3k、akt、p-akt、p65nf-κb、p-p65nf-κb蛋白的表达示意图。

图38是本发明实施例提供的大鼠前列腺组织大鼠前列腺组织pi3k、p-pi3k、akt、p-akt、p65nf-κb、p-p65nf-κb蛋白的表达水平。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒按质量计由当归6～12g，黄柏3～12g，金银花6～15g，姜黄3～10g，乳香3～5g，没药3～5g，白芷3～10g，车前草9～30g，白花蛇舌草9～30g以及陈皮3～10g组成。

如图1所示，本发明实施例提供的应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒制备方法包括：

s101，按比例称取当归、黄柏、金银花、姜黄、乳香、没药、白芷、车前草、白花蛇舌草、陈皮，并制备得到应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒；

s102，进行应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒的有效性验证。

本发明实施例提供的进行应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒的有效性验证包括：

(1)通过自身免疫法建立cnp大鼠模型，具体分为空白组、假手术组、模型组、归黄方低剂量组、归黄方中剂量组、归黄方高剂量组；

(2)分别于100倍及200倍光学显微镜下观察前列腺组织he染色切片，评估各组前列腺组织的组织病理学变化；

(3)对比空白组、假手术组、模型组、归黄方低剂量组、归黄方中剂量组、归黄方高剂量组的大鼠体重、脾脏、胸腺、前列腺脏器指数以及cd3和cd45细胞数；

(4)elisa法检测大鼠血清炎性il-1β、il-6、il-18、cox-2、tnf-α细胞因子水平，并通过免疫荧光双染联合共聚焦显微镜确定各组的巨噬细胞m1p1α和casp3变化；

(5)采用rt-pcr检测pi3k、akt、p65nf-κbmrn表达，westernblot检测大鼠前列腺组织pi3k、p-pi3k、akt、p-akt、p65nf-κb、p-p65nf-κb蛋白的表达，以β-action为内参，基于各组灰度值确定各组蛋白定量表达情况。

下面结合药理学分析对本发明的技术方案作进一步描述。

归黄方组成包括：当归12g，黄柏12g，金银花15g，姜黄10g，乳香5g，没药5g，白芷10g，陈皮10g，车前草15g，白花蛇舌草15g。本方具有清热除湿、化瘀止痛之功。①君药：当归质润性动，活血补血，行滞止痛，去瘀生新，引药内消。黄柏性寒润降，泻火燥湿力强，为“五脏肠胃清湿热之药”。当归、黄柏共为君药，奏活血、清湿热之功，清热而不伤阴，活血以消瘀滞。②臣药：金银花既清气分实热，又去血中热毒，解毒疗疮力佳。姜黄为血中气药，破血行气力佳，通经脉之结，行血中之滞。乳香、没药二药为树脂类药物，善透窍散瘀理气，行则气血利，通则肿痛止。张锡纯谓其虽走窜力强，但“不至耗伤气血，诚良药也”。③佐药：白芷气香味辛，以祛风散湿，解痉止痛见长，《本经》谓其“长肌肤”，其亦有消肿排脓之用。陈皮理气化痰，痰气同治，又兼有调和之用。佐以车前草利尿通淋、白花蛇舌草解毒利湿。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

本发明实施例提供的应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒按质量计由当归8g，黄柏8g，金银花10g，姜黄7g，乳香4g，没药4g，白芷7，车前草10g，白花蛇舌草20g以及陈皮7g组成。

实施例2

本发明实施例提供的应用于治疗慢性前列腺炎的中药复方归黄方颗粒按质量计由当归6g，黄柏3g，金银花6g，姜黄3g，乳香3g，没药3g，白芷3g，车前草9g，白花蛇舌草9g以及陈皮3g组成。

实施例3

优选地，由当归12g，黄柏12g，金银花15g，姜黄10g，乳香5g，没药5g，白芷10g，车前草15g，白花蛇舌草15g以及陈皮10g组成。

实施例4：

分析基础与工作条件

1.基础分析；

1.1临床分析：归黄方前期临床分析显示可显著降低cnp湿热瘀滞型患者nih-cpsi总评分、疼痛、排尿、生活质量评分，改善患者的症状。

申请人前期承担中国中医科学院西苑医院苗圃课题(no:2019xymp--23)，通过中国中医科学院西苑医院临床伦理委员会审查并取得伦理审查批件(批件号2019xla019-3)。本发明为探索性随机对照试验，按随机数字表法纳入66例cnp患者，分为归黄方组和盐酸坦洛新缓释胶囊组。结果显示，两组与治疗前比较，均可降低nih-cpsi的总评分、疼痛评分、排尿评分及生活质量评分(p<0.05)(见图2-图7)，归黄方在降低nih-cpsi的总评分、疼痛评分、生活质量评分及中医症状评分方面，优于盐酸坦洛新缓释胶囊(p<0.05)(见图2-图7)，两者在排尿评分方面未见明显统计学差异(p>0.05)(见图4、图6)。用药过程未见严重不良反应。

1.2机制探索：归黄方前期网络药理学及分子对接分析表明，归黄方可能通过casp3、il-1b、il-18等靶点治疗cnp，并涉及nf-κb等多条信号通路。

本发明运用网络药理学及分子对接的方法，探索归黄方治疗cnp的可能药理学机制，结果显示归黄方治疗cnp可能涉及111个潜在靶点(图8)；ppi分析主要与casp3、il-1b、il-18等有关(图9、图10)；go分析归黄方治疗cnp可能发生在囊泡腔、膜筏、核染色质等部位，通过调控细菌来源分子反应、氧化应激、凋亡、对脂多糖及类固醇激素的反应等生物途径，与磷酸酶、蛋白磷酸酶等结合而发挥作用(图11)；kegg通路富集分析结果提示，归黄方可能涉及nf-κb等多条信号通路(图12-图13)；分子对接结果提示主要活性成分与靶点蛋白具有较强的结合能力(图14)；“药物-活性成分-靶点”网络图提示药物之间的配伍展示了良好的“君臣佐使”配伍关系(图15)。

1.3动物实验分析

本发明的发明人前期承担中国中医科学院西苑医院国家自然科学基金培育项目(xy20-13)，实验通过中国中医科学院西苑医院动物伦理委员会审查，取得伦理审查批件(批件号2020xlc005-3)。实验通过自身免疫法建立cnp大鼠模型，具体分为空白组(ct)、假手术组(sham)、模型组(model)、归黄方低剂量(m+ghp(l))、归黄方中剂量(m+ghp(m))、归黄方高剂量(m+ghp(h))。动物实验主要有以下分析发现：

1.3.1成功复制cnp大鼠模型，并发现归黄方可有效改善cnp模型大鼠炎症损伤，减少前列腺内的cd3+和cd45+细胞浸润。

预实验成功制备cnp大鼠模型，分别于100倍及200倍光学显微镜下观察前列腺组织he染色切片，评估各组前列腺组织的组织病理学变化，如图16所示。空白组和假手术组大鼠前列腺组织结构完整，腺腔规则，腺体上皮和间质形态正常且排列整齐，腺腔间质未见明显炎性细胞浸润迹象。模型组可见大鼠前列腺组织腺上皮变性，被膜增厚，间质明显水肿且广泛的炎细胞浸润，炎细胞浸润主要局限于间质，腺腔也有炎性细胞浸润，可见血管扩张及充血现象。归黄方低中高治疗组腺泡周围浸润的炎细胞数量减少，腺上皮变性和间质水肿的严重程度也减轻。前列腺组织评分定量结果见图17。模型组与空白组有显著差异；归黄方低中高剂量组与模型组相比，有显著统计学差异，且中剂量组与高剂量组改善明显。

各组大鼠体重、脾脏、胸腺、前列腺脏器指数见图18-图21。大鼠正常情况下的脏器指数较为恒定，如果脏器发生充血水肿，则脏器指数将增大；如果脏器发生萎缩，则脏器指数缩小。可见大鼠脾脏指数各组无显著差异(图20)，前列腺指数(图19)、胸腺指数(图21)空白组与模型组相比有显著差异。前列腺指数随炎症进展而升高，被用于预测前列腺炎症的程度。而胸腺指数变化，表明胸腺作为免疫器官，参与了发病过程。模型组与药物组相比，有统计学差异，表明归黄方药物干预后，减轻了炎症反应过程。

cd3和cd45分别是总t细胞和白细胞的生物标志物。如图22-图23，使用归黄方后cd3+t细胞和cd45+白细胞计数明显少于模型组。

1.3.2cnp模型组发现il-1β、il-6、il-18、cox-2、tnf-α、mcp-1促炎细胞因子水平显著上升，抗氧化酶(t-sod、gsh-px)水平下降，氧化应激产物(mda)水平明显升高；而归黄方可下调炎症因子，提高抗氧化能力并抑制氧化应激。

elisa法检测大鼠血清炎性il-1β、il-6、il-18、cox-2、tnf-α细胞因子水平，结果见图24-图29。可见模型组与空白组相比，有显著统计学意义；归黄方药物组与模型组相比，有显著统计学意义。

氧化应激在前列腺炎的炎性损伤中起关键作用。为评估大鼠的抗氧化能力，对抗氧化酶(t-sod、gsh-px)和主要氧化应激产物(mda)进行了测量，结果见图30-图32。模型组的t-sod、gsh-px水平下降，mda水平则明显升高。而归黄方能提高抗氧化酶(t-sod、gsh-px)活性，抑制前列腺内的脂质过氧化产物(mda)水平。

1.3.3通过免疫荧光双染发现m1p1α和casp3。

免疫荧光双染联合共聚焦显微镜发现模型组的巨噬细胞m1p1α明显增多，凋亡蛋白casp3明显增加，且二者存在共定位现象，归黄方干预后m1p1α和casp3明显降低，提示可能是通过抑制巨噬细胞发生凋亡反应起到治疗cnp的作用。

1.5wb、pcr

根据网络药理学预测结果，采用rt-pcr检测pi3k、akt、p65nf-κbmrn表达，条带结果见图34-图36；westernblot检测大鼠前列腺组织pi3k、p-pi3k、akt、p-akt、p65nf-κb、p-p65nf-κb蛋白的表达，条带结果见图37；以β-action为内参，将各组灰度值与其比较可见各组蛋白定量表达情况见图38。发现归黄方可能通过pi3k/akt/nf-κb通路起到治疗cnp的作用。

下面结合技术路线对本发明技术方案作进一步描述。

①提取工艺研究

在提取工艺研究中，应以选择君药的成分制备为主要标准，故分别以归黄方君药当归中藁本内酯和黄柏中的小檗碱含量及固形物得率作为评价指标，通过综合加权评分，采用l9(3⁴)正交试验方法，对加水倍数、提取时间和提取次数进行考察，通过各项数据的统一分析，以综合加权评分为依据选取最佳提取工艺，并进行工艺验证。

②成型工艺研究

包括对辅料种类的选择和辅料与浸膏比例的考察，通过一步制粒工艺完成归黄方颗粒的成型工作。最佳制粒工艺参数的确定以喷雾速度、浸膏相对密度、雾化压力、物料温度、进料速度、进风温度、进风量的控制等因素为参考依据。

③中试研究

中试研究与药品的安全性、有效性和质量密切相关。本研究拟根据上述提取工艺和成型工艺参数，开展3批中试试验研究。同时对关键工艺参数及工艺与设备适应性的考察，判断工艺是否稳定可行，是否适用于大生产。

(1)剂型筛选

归黄方颗粒处方由当归、黄柏等10味中药组成，功效清热除湿、化瘀止痛，临床疗效确切。本方日服用量为109g，主要以汤剂形式运用于临床中，考虑到大规模生产、携带、患者接受程度以及药效发挥等问题，考虑将本方制成颗粒制剂。

(2)提取工艺研究

结合现代药理学的相关研究，根据归黄方颗粒处方中各中药主要活性成分的理化性质和活性成分的最佳提取方法，经过多方面考量，本研究决定采用中药饮片经水提取的工艺，并对相关工艺参数进行优化。

①正交试验设计

以水煎煮时的加水倍数、提取时间、提取次数等三个因素，每个因素分别设置三个水平，按照l9(3⁴)正交试验方案进行实验。因素水平表如表1。

表1因素水平设计表

②水提工艺研究

根据正交试验结果确定最佳水提工艺，结合实际生产情况，优选出水提工艺进行验证试验，测定归黄方主要评价指标的含量。

③藁本内酯、小檗碱含量的测定及评定

评价指标主要以方剂中君药的主要药理成含量的确定为依据。本方君药为当归、黄柏。当归中主要成分为藁本内酯，黄柏中的主要成分为小檗碱，这些有效成分已经多年研究，药理作用相对明确，且与本方主治相切合。因此，本研究以藁本内酯和小檗碱的含量及固形物得率为水提工艺的评价指标，采用综合加权评分来筛选水提工艺条件。采用hplc高效液相色谱法测定藁本内酯和小檗碱含量。拟定藁本内酯和小檗碱含量权重系数为0.7，固形物得率权重系数定为0.3，采用综合加权评分筛选水提工艺条件。

(3)成型工艺：采用一步制粒技术配制归黄方颗粒。

①辅料的选择

取干浸膏粉l00g，8份，分别加入乳糖、玉米淀粉、糊精、微晶纤维素各100g，平行制备2份，加入70％乙醇制成软材，以12目筛制成颗粒，置烘箱60℃干燥后，以10目筛和60目筛得整粒。在研究中以吸湿率、成型率、溶化率、堆密度、休止角为指标，进行综合性评价，对辅料种类、辅料用量进行筛选。综合指标的计算方法为：(15/最大成型性值)×成型性值+(15/最大堆密度值)×堆密度值+(最小休止角值×15)/休止角值+(20/最大溶化性值)×溶化性值+(最小吸湿率值×35)/吸湿率值。

②制粒工艺考察

以吸湿率、成型率、溶化率、堆密度、休止角为指标，采用一步制粒技术，考察物料温度、喷雾速度、浸膏相对密度、进风温度、进料速度、雾化压力等因素对颗粒成品率和质量的影响。以确定最佳制粒参数。

(4)中试研究

根据上述参数，进行多批次中试试验(三次以上)，保证颗粒剂成品质量。同时对关键工艺参数进行考察，以确定其是否适用于大规模生产。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。