一种一点红提取物及其制备方法和护肤应用与流程

1.本发明属于植物提取研究领域，具体涉及一种一点红提取物的制备方法及护肤应用。


背景技术：

2.一点红，又名羊蹄草、叶下红，为菊科一点红属植物，以全草入药，性凉，味苦，在《全国中草药汇编》、《中药大辞典》中均有详细记载，具有清热解毒之效。现代研究表明，一点红主要含黄酮类物质、酚酸类物质、生物碱、多糖类等多种生理活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑菌等功效。
3.一点红为传统中药，现有技术研究多集中在提取方式及药理作用方面。其中，文献(廖莉,罗建华,蒙春越,等.一点红总黄酮的提取及对羟自由基的清除作用研究[j].时珍国医国药,2008(02):415-416.)公开了一点红提取物超声提取技术及清除自由基功效，将鲜一点红草干燥
→
粉碎、称量6g
→
80ml95％乙醇
→
超声提取2.5h，抽滤；滤渣再次加入80ml 95％乙醇
→
超声波提取2.5h，合并二次滤液，浓缩后60ml乙醇定容100ml，黄酮含量为0.81mg/ml，得率为1.36％，且当一点红提取物黄酮含量3.2％时，其羟自由基清除率达22％；此外，文献(george k gilcy,msc1,girija kuttan,phd.evaluation of the anti-inflammatory and urotoxicity ameliorative effects ofγ-humulene containing active fraction of emilia sonchifolia(l.)dc[j].inflammopharmacology,2019,27(2):409-20.)报道了一点红提取物可有效减轻足部水肿，是其通过显著降低了促炎细胞因子的水平，并且有效地下调了环氧合酶-2和诱导型一氧化氮的表达；文献(胡文海,纪敏琳,黄锐涛,等.一点红中总黄酮的提取与测定方法研究[j].广东化工,2015,42(17):160-161.)公开了一种连续回流提取法提取一点红中的黄酮，在固液比1:25、75％乙醇浓度下回流3h，得到的黄酮含量为8.773mg/g，同时使用超声波提取法，在固液比1:20、65％乙醇浓度下震荡1h，得到黄酮含量高达9.945mg/g。上述一点红黄酮提取方法存在黄酮得率低、提取时间长、黄酮含量低等问题，直接做成液体制剂或固体制剂受外界环境影响(如空气中的湿度、溶氧等)极易产生氧化和吸潮，影响其质量和实用性。
[0004]
目前，一点红提取物尚未广泛应用于化妆品或护肤品领域，开发一种一点红活性成分含量高、质量可控的制备方法，并将所得一点红提取物应用于护肤品领域，对一点红的深度开发及广泛应用具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
基于上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的问题是提供一种一点红提取物及其制备方法。本发明所得一点红提取物的总黄酮含量高，解决了现有技术中一点红提取工艺总黄酮得率低，一点红提取物中总黄酮含量低，产品在后续存储过程中吸潮、板结等问题；
[0006]
本发明制备方法得到的一点红提取物具有抗氧化、抗光损伤等功效。
[0007]
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方式来实现的：
[0008]
本发明第一方面提供了一种一点红提取物。
[0009]
根据本发明，所述一点红提取物中总黄酮含量为61mg/g-67mg/g。
[0010]
根据本发明，所述一点红提取物通过闪式提取联合超声辅助提取工艺制备。
[0011]
根据本发明，所述一点红提取物通过包括以下步骤的制备方法制备：
[0012]
1)原料预处理；
[0013]
2)将步骤1)预处理所得一点红按一定料液比加入提取溶剂中进行闪式提取，得一点红闪式提取液；
[0014]
3)将步骤1)所得一点红闪式提取液进行超声处理。
[0015]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述料液比为1:10-1:30(m/m)。
[0016]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述一点红和提取溶剂料液比为1:10-1:30(m/m)，例如可以是1:10(m/m)、1:11(m/m)、1:12(m/m)、1:15(m/m)、1:17(m/m)、1:20(m/m)、1:25(m/m)、1:30(m/m)，以及上述数值之间的点值。
[0017]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述一点红和提取溶剂料液比为1:15-1:30(m/m)。
[0018]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述提取溶剂为30％-90％乙醇溶液。
[0019]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述提取溶剂为45％-75％乙醇溶液。
[0020]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述闪式提取电压为75-125v，例如可以是75v、80v、85v、90v、95v、100v、110v、125v，以及上述数值之间的点值。
[0021]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述提取时间为15-120s，例如可以是15s、16s、17s、20s、25s、30s、40s、50s、70s、100s、120s，以及上述数值之间的点值。
[0022]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤2)所述提取时间为30s-120s。
[0023]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取功率为200-500w，例如可以是200w、300w、400w、500w。
[0024]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取温度为35℃-75℃，例如可以是35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，以及上述数值之间的点值。
[0025]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取温度为45℃-75℃。
[0026]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取时间为15min-120min，例如可以是15min、16min、17min、20min、25min、30min、40min、50min、70min、100min、120min，以及上述数值之间的点值。
[0027]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取时间为30min-120min。
[0028]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤1)所述原料预处理包括粉碎。
[0029]
本发明第二方面提供了一种一点红提取物。
[0030]
根据本发明，所述一点红提取物中总黄酮含量为147mg/g-232mg/g。
[0031]
根据本发明，所述一点红提取物通过闪式提取联合超声辅助提取工艺和大孔吸附树脂纯化工艺制备。
[0032]
根据本发明，所述一点红提取物通过包括以下步骤的制备方法制备：
[0033]
1)原料预处理；
[0034]
2)将步骤1)预处理所得一点红按一定料液比加入提取溶剂中进行闪式提取，得一点红闪式提取液；
[0035]
3)将步骤2)所得一点红闪式提取液进行超声处理，得一点红超声提取液；
[0036]
4)将步骤3)所得一点红超声提取液与树脂按照一定重量比混合，加入预处理好的大孔树脂柱，洗脱，收集洗脱液，干燥得一点红提取物。
[0037]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述一点红和提取溶剂料液比为1:10-1:30(m/m)，例如可以是1:10(m/m)、1:11(m/m)、1:12(m/m)、1:15(m/m)、1:17(m/m)、1:20(m/m)、1:25(m/m)、1:30(m/m)，以及上述数值之间的点值。
[0038]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述一点红和提取溶剂料液比为1:15-1:30(m/m)。
[0039]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述提取溶剂为30％-90％乙醇溶液。
[0040]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述提取溶剂为45％-75％乙醇溶液。
[0041]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备方法中步骤2)中闪式提取电压为75-125v，例如可以是75v、80v、85v、90v、95v、100v、110v、125v，以及上述数值之间的点值。
[0042]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述提取时间为15s-120s，例如可以是15s、16s、17s、20s、25s、30s、40s、50s、70s、100s、120s，以及上述数值之间的点值。
[0043]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤2)所述提取时间为30s-120s。
[0044]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取功率为200-500w，例如可以是200w、300w、400w、500w。
[0045]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取温度为35-75℃，例如可以是35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，以及上述数值之间的点值。
[0046]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取温度为45-75℃。
[0047]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取时间为15-120min，例如可以是15min、16min、17min、20min、25min、30min、40min、50min、70min、100min、120min，以及上述数值之间的点值。
[0048]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取时间为30-120min。
[0049]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述一点红粗提液与树脂重量比为1:8-1:15(m/m)。
[0050]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述大孔树脂柱型号为d101、ab-8或s-8型。
[0051]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤4)所述中大孔树脂柱型号为ab-8型。
[0052]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述大孔树脂柱的径高比为1:6-1:15。
[0053]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述大孔树脂柱的径高比为1:10-1:15。
[0054]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述洗脱液为水和/或20％-80％乙醇溶液。
[0055]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述洗脱方式为梯度洗脱。
[0056]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤4)所述梯度洗脱的洗脱液中水的体积流量为0.5-2bv/h。
[0057]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤4)所述梯度洗脱的洗脱液中20％-80％乙醇溶液的体积流量为1-5bv/h。
[0058]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述干燥为化妆品领域常规干燥方式。
[0059]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤1)所述原料预处理包括粉碎。
[0060]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述中大孔树脂柱预处理包括清洗、除杂、再生及活化。
[0061]
本发明第三方面提供一种本发明第一方面和/或第二方面所述一点红提取物的制备方法。
[0062]
根据本发明，所述制备方法包括以下步骤：
[0063]
1)原料预处理；
[0064]
2)将步骤1)预处理所得一点红按1:10-1:30(m/m)料液比加入30-90％乙醇溶液中，在提取电压为75-125v条件下闪式提取15-120s，得一点红闪式提取液；
[0065]
3)将步骤2)所得一点红闪式提取液在提取功率为200-500w，提取温度为35-75℃条件下超声提取15-120min。
[0066]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述一点红和提取溶剂料液比为1:10-1:30(m/m)，例如可以是1:10(m/m)、1:11(m/m)、1:12(m/m)、1:15(m/m)、1:17(m/m)、1:20(m/m)、1:25(m/m)、1:30(m/m)，以及上述数值之间的点值。
[0067]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述一点红和提取溶剂料液比为1:15-1:30(m/m)。
[0068]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述提取溶剂为45-75％乙醇溶液。
[0069]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述闪式提取电压为75-125v，例如可以是75v、80v、85v、90v、95v、100v、110v、125v，以及上述数值之间的点值。
[0070]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述提取时间为15-120s，例如可以是15s、16s、17s、20s、25s、30s、40s、50s、70s、100s、120s，以及上述数值之间的点值。
[0071]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤2)所述提取时间为30-120s。
[0072]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取功率为200-500w，例如可以是200w、300w、400w、500w。
[0073]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取温度为35-75℃，例如可以是35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，以及上述数值之间的点值。
[0074]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取温度为45-75℃。
[0075]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取时间为15-120min，例如可以是15min、16min、17min、20min、25min、30min、40min、50min、70min、100min、120min，以及上述数值之间的点值。
[0076]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取时间为30-120min。
[0077]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤1)所述原料预处理包括粉碎。
[0078]
根据本发明，所述制备方法中一点红的总黄酮得率为12.17mg/g-18.31mg/g。
[0079]
本发明第四方面提供一种本发明第一方面和/或第二方面所述一点红提取物的制备方法。
[0080]
根据本发明，所述制备方法包括以下步骤：
[0081]
1)原料预处理；
[0082]
2)将步骤1)预处理所得一点红按1:10-1:30(m/m)料液比加入30-90％乙醇溶液中，在提取电压75-125v条件下闪式提取15-120s，得一点红闪式提取液；
[0083]
3)将步骤2)所得一点红闪式提取液在提取功率为200-500w，提取温度为35-75℃条件下超声提取15-120min，得一点红闪式提取液；
[0084]
4)将步骤3)所得一点红闪式提取液与树脂按照1:8-1:15(m/m)重量比混合，加入预处理好大孔树脂柱，用水和/或20％-80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，干燥得一点红提取物。
[0085]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述一点红和提取溶剂料液比为1:10-1:30(m/m)，例如可以是1:10(m/m)、1:11(m/m)、1:12(m/m)、1:15(m/m)、1:17(m/m)、1:20(m/m)、1:25(m/m)、1:30(m/m)，以及上述数值之间的点值。
[0086]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述一点红和提取溶剂料液比为1:15-1:30(m/m)。
[0087]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述提取溶剂为45-75％乙醇溶液。
[0088]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述闪式提取电压为75-125v，例如可以是75v、80v、85v、90v、95v、100v、110v、125v，以及上述数值之间的点值。
[0089]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤2)所述提取时间为15-120s，例如可以是15s、16s、17s、20s、25s、30s、40s、50s、70s、100s、120s，以及上述数值之间的点值。
[0090]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤2)所述提取时间为30-120s。
[0091]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取功率为200-500w，例如可以是200w、300w、400w、500w。
[0092]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取温度为35-75℃，例如可以是35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，以及上述数值之间的点值。
[0093]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取温度为45-75℃。
[0094]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取时间为15-120min，例如可以是15min、16min、17min、20min、25min、30min、40min、50min、70min、100min、120min，以及上述数值之间的点值。
[0095]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤3)所述超声提取时间为30-120min。
[0096]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述大孔树脂柱型号为d101、ab-8或s-8型。
[0097]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤4)所述大孔树脂柱型号为ab-8型。
[0098]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述大孔树脂柱的径高比为1:6-1:15。
[0099]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述大孔树脂柱的径高比为1:10-1:15。
[0100]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述洗脱液为水和/或20％-80％乙醇溶液。
[0101]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述洗脱方式为梯度洗脱。
[0102]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤4)所述梯度洗脱的洗脱液中水的体积流量为0.5-2bv/h。
[0103]
根据本发明的又一些具体实施方式，步骤4)所述梯度洗脱的洗脱液中20％-80％乙醇溶液的体积流量为1-5bv/h。
[0104]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述干燥为化妆品领域常规干燥方式。
[0105]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤1)所述原料预处理包括粉碎。
[0106]
根据本发明的一些具体实施方式，步骤4)所述大孔树脂柱预处理包括清洗、除杂、再生及活化。
[0107]
本发明第五方面提供本发明第一方面和/或第二方面所述一点红提取物和/或本发明第三方面和/或第四方面所述一点红提取物制备方法制备得到的一点红提取物在护肤品中的应用。
[0108]
根据本发明，所述一点红提取物在制备具有抗衰老和/或抗光老化护肤品中的应用。
[0109]
根据本发明，所述护肤品和/或化妆品例如可以是面霜、护肤水、精华、面膜等，不做具体限制。
[0110]
根据本发明，所述护肤品和/或化妆品剂型例如可以是膏霜类、粉剂类、水剂类、乳液类、凝胶类、块状粉或固体类等，不做具体限制。
[0111]
本发明有益效果：
[0112]
(1)本发明通过闪式提取联合超声辅助提取工艺制备一点红提取物，该制备方法提高了一点红的总黄酮得率，制备得到的一点红提取物中总黄酮含量高，解决了现有技术中一点红总黄酮得率低，一点红提取物中总黄酮含量低，产品在后续存储过程中吸潮、板结等问题。
[0113]
(2)本发明制备的一点红提取物可显著降低氧化应激损伤，具有抗氧化、抗光损伤等功效，可将其应用于抗衰老和/或抗光老化护肤品中。
附图说明
[0114]
图1是实施例25置于室温密封放置5d、10d的观测图；
[0115]
图2是实施例28置于室温密封放置5d、10d的观测图；
[0116]
图3是实施例25置于室温密封放置1个月、2个月的观测图；
[0117]
图4是实施例28置于室温密封放置1个月、2个月的观测图；
[0118]
图5是实施例25清除abts自由基的测试结果图；
[0119]
图6是实施例28清除abts自由基的测试结果图；
[0120]
图7是实施例25和实施例28对hff-1细胞活率的影响曲线。
具体实施方式
[0121]
下面结合具体实例对本发明进行进一步阐述，但本发明并不局限于此。
[0122]
本领域的普通技术人员应当认识到，本发明并不限于上述实施例，任何对本发明的变换、变型都落入本发明的保护范围。
[0123]
下面实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述的实验材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0124]
下列实施例中，原料：一点红(市售)；产地：云南；供应商：河北嘉恒冷背药业有限公司。
[0125]
本发明中使用的仪器如表1所示。
[0126]
表1试验仪器信息
[0127]
名称型号供应商
闪式提取器jhbe-50t河南智晶生物科技股份有限公司数控超声波清洗器kq-500de昆山市超声仪器有限公司
[0128]
1、总黄酮测试方法：
[0129]
采用nano
2-al(no3)3比色法测试一点红提取物中的总黄酮(参考标准：gb/t 20574-2006蜂胶中总黄酮含量的测定方法分光光度比色法)。
[0130]
实施例1-5
[0131]
1)原料预处理：将一点红粉碎；
[0132]
2)闪式提取：将步骤1)预处理一点红按1:20(m/m)料液比加入30-90％乙醇溶液中，在提取电压为75v条件下闪式提取30s，得一点红闪式提取液；
[0133]
3)超声提取：将步骤2)一点红闪式提取液在提取功率为300w，提取温度为65℃条件下超声提取60min，得一点红提取物。
[0134]
实施例1-5闪式提取联合超声辅助提取工艺具体乙醇提取分数如表2所示。
[0135]
表2提取溶剂参数优化
[0136][0137]
实施例6-9
[0138]
1)原料预处理：将一点红粉碎；
[0139]
2)闪式提取：将步骤1)预处理一点红按1:10-1:30(m/m)料液比加入60％乙醇溶液中，在提取电压为75v条件下闪式提取30s，得一点红闪式提取液；
[0140]
3)超声提取：将步骤2)一点红闪式提取液在提取功率为300w，提取温度为65℃条件下超声提取60min，得一点红提取物。
[0141]
实施例6-9闪式提取联合超声辅助提取工艺具体料液比如表3所示。
[0142]
表3一点红与提取溶剂料液比参数优化
[0143][0144]
实施例10-13
[0145]
1)原料预处理：将一点红粉碎；
[0146]
2)闪式提取：将步骤1)预处理一点红按1:20(m/m)料液比加入60％乙醇溶液中，在提取电压为75v条件下闪式提取30s，得一点红闪式提取液；
[0147]
3)超声提取：将步骤2)一点红闪式提取液在提取功率为300w，提取温度为65℃条件下超声提取15-120min，得一点红提取物。
[0148]
实施例10-13闪式提取联合超声辅助提取工艺具体超声处理时间如表4所示。
[0149]
表4超声时间参数优化
[0150][0151]
实施例14-17
[0152]
1)原料预处理：将一点红粉碎；
[0153]
2)闪式提取：将步骤1)预处理一点红按1:20(m/m)料液比加入60％乙醇溶液中，在提取电压为75v条件下闪式提取30s，得一点红闪式提取液；
[0154]
3)超声提取：将步骤2)一点红闪式提取液在提取功率为200-500w，提取温度为65℃条件下超声提取60min，得一点红提取物。
[0155]
实施例14-17闪式提取联合超声辅助提取工艺具体超声功率如表5所示。
[0156]
表5超声功率参数优化
[0157][0158]
实施例18-21
[0159]
1)原料预处理：将一点红粉碎；
[0160]
2)闪式提取：将步骤1)预处理一点红按1:20(m/m)料液比加入60％乙醇溶液中，在提取电压为75v条件下闪式提取30s，得一点红闪式提取液；
[0161]
3)超声提取：将步骤2)一点红闪式提取液在提取功率为300w，提取温度为35-75℃条件下超声提取60min，得一点红提取物。
[0162]
实施例18-21闪式提取联合超声辅助提取工艺具体超声提取温度如表6所示。
[0163]
表6超声提取温度参数优化
[0164][0165]
实施例22-25
[0166]
1)原料预处理：将一点红粉碎；
[0167]
2)闪式提取：将步骤1)预处理一点红按1:20(m/m)料液比加入60％乙醇溶液中，在提取电压为75v条件下闪式提取15-120s，得一点红闪式提取液；
[0168]
3)超声提取：将步骤2)一点红闪式提取液在提取功率为200-500w，提取温度为65℃条件下超声提取60min，得一点红提取物。
[0169]
实施例22-25闪式提取联合超声辅助提取工艺具体闪式提取时间如表7所示。
[0170]
表7闪式提取时间参数优化
[0171][0172]
实施例26-27
[0173]
1)原料预处理：将一点红粉碎；
[0174]
2)闪式提取：将步骤1)预处理一点红按1:20(m/m)料液比加入60％乙醇溶液中，在不同电压下闪式提取30s，得一点红闪式提取液；
[0175]
3)超声提取：将步骤2)一点红闪式提取液在提取功率为300w，提取温度为65℃条件下超声提取60min，得一点红提取物。
[0176]
实施例26-27闪式提取联合超声辅助提取工艺具体闪式提取功率如表8所示。
[0177]
表8闪式提取电压参数优化
[0178][0179]
对比例1(超声辅助水提取法)
[0180]
一点红粉碎后，按料液比1:20(m/m)加入去离子水为提取溶剂，设置温度65℃，超声频率40khz，功率300w，超声1h，过滤得一点红提取物。
[0181]
对比例2(超声辅助乙醇提取法)
[0182]
一点红粉碎后，按料液比1:20(m/m)加入75％乙醇为提取溶剂，控制温度65℃，超声频率40khz，功率300w，超声1h，过滤得一点红提取物。
[0183]
对比例3(热回流提取法)
[0184]
一点红粉碎后，按料液比1:20(m/m)加入75％乙醇为提取溶剂，80-85℃提取1h，过滤得一点红提取物。
[0185]
对比例4(高温高压提取法)
[0186]
一点红粉碎后，按料液比1:20(m/m)加入去离子水为提取溶剂，设置温度121℃，提取压力0.13mpa，提取1h，过滤得一点红提取物。
[0187]
对比例5(闪式辅助热回流提取法)
[0188]
一点红粉碎后，按料液比1:20(m/m)加入75％乙醇溶液，使用闪式提取器在75v下提取1min，然后80-85℃提取1h，过滤得一点红提取物。
[0189]
对比例6(超声辅助闪式提取法)
[0190]
一点红粉碎后，按料液比1:20(m/m)加入75％乙醇溶液，在提取功率为300w，提取温度为65℃条件下超声提取60min，然后使用闪式提取器在提取电压为75v条件下闪式提取1min，得一点红提取物。
[0191]
实验结果：
[0192]
取原料一点红粉碎，以乙醇溶液提取溶剂，通过实施例和对比例工艺制备一点红提取物，并测试一点红总黄酮得率及一点红提取物中总黄酮含量，测试结果如表9-10所示：
[0193]
表9一点红的总黄酮得率
[0194][0195]
[0196]
表10干燥后一点红提取物中总黄酮含量
[0197][0198]
以总黄酮得率和总黄酮含量为研究目标，采用闪式提取联合超声辅助提取工艺，考察不同乙醇浓度、料液比、超声时间、超声功率、超声温度、闪式提取时间、闪式提取电压对一点红中目标黄酮得率的影响，优化出适宜的工艺参数为：乙醇体积分数45-75％，料液比1:15-1:30(m/m)，超声时间30-120min，超声功率200-500w，超声温度45-75℃，闪式提取时间30-120s，闪式提取电压75-125v，此时，一点红中总黄酮得率为14.11mg/g-18.31mg/g，干燥后一点红提取物中总黄酮含量为62mg/g-67mg/g。
[0199]
综上可知，闪式提取联合超声辅助提取法可显著提高一点红总黄酮得率。
[0200]
实施例28-30
[0201]
1)原料预处理：将一点红粉碎；
[0202]
2)闪式提取：将步骤1)预处理一点红按1:20(m/m)料液比加入60％乙醇溶液中，在提取电压为75-125v条件下闪式提取30s，得一点红闪式提取液；
[0203]
3)超声提取：将步骤2)一点红闪式提取液在提取功率为300w，提取温度为65℃条件下超声提取60min，得一点红粗提液；
[0204]
4)大孔吸附树脂纯化：将步骤3)中一点红粗提液与树脂按照1:10(m/m)重量比混合，加入预处理好的d101、ab-8或s-8大孔树脂柱，用水和60％乙醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，干燥得一点红提取物。
[0205]
实施例28-30闪式提取联合超声辅助提取和大孔吸附树脂纯化工艺具体大孔树脂柱型号如表11所示。
[0206]
表11大孔树脂柱型号优化
[0207]
序号树脂型号径高比乙醇溶液的浓度实施例28ab-81:1060％乙醇实施例29s-81:1060％乙醇实施例30d1011:1060％乙醇
[0208]
实施例31-35
[0209]
1)原料预处理：将一点红粉碎；
[0210]
2)闪式提取：将步骤1)预处理一点红按1:20(m/m)料液比加入60％乙醇溶液中，在提取电压为75-125v条件下闪式提取30s，得一点红闪式提取液；
[0211]
3)超声提取：将步骤2)一点红闪式提取液在提取功率为300w，提取温度为65℃条
件下超声提取60min，得一点红粗提液；
[0212]
4)大孔吸附树脂纯化：将步骤3)中一点红粗提液与树脂按照1:10(m/m)重量比混合，加入预处理好的ab-8大孔树脂柱，用水和60％乙醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，干燥得一点红提取物。
[0213]
实施例31-35闪式提取联合超声辅助提取和大孔吸附树脂纯化工艺具体大孔树脂柱的径高比如表12所示。
[0214]
表12大孔树脂柱的径高比优化
[0215]
序号树脂型号径高比乙醇溶液的浓度实施例31ab-81:1060％实施例32ab-81:1260％实施例33ab-81:1560％实施例34ab-81:660％实施例35ab-81:860％
[0216]
实施例36-39
[0217]
1)原料预处理：将一点红粉碎；
[0218]
2)闪式提取：将步骤1)预处理一点红按1:20(m/m)料液比加入60％乙醇溶液中，在提取电压为75-125v条件下闪式提取30s，得一点红闪式提取液；
[0219]
3)超声提取：将步骤2)一点红闪式提取液在提取功率为300w，提取温度为65℃条件下超声提取60min，得一点红粗提液；
[0220]
4)大孔吸附树脂纯化：将步骤3)中一点红粗提液与树脂按照1:10(m/m)重量比混合，加入预处理好的ab-8大孔树脂柱，用水和20％-80％乙醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，干燥得一点红提取物。
[0221]
实施例36-39闪式提取联合超声辅助提取和大孔吸附树脂纯化工艺具体洗脱液浓度如表13所示。
[0222]
表13洗脱液浓度优化
[0223]
序号树脂型号径高比乙醇溶液的浓度实施例36ab-81:1020％实施例37ab-81:1040％实施例38ab-81:1060％实施例39ab-81:1080％
[0224]
实验结果：
[0225]
取原料一点红粉碎，以乙醇溶液提取溶剂，通过实施例34-45工艺制备一点红提取物，并测试一点红提取物总黄酮含量及得率，测试结果如表14所示：
[0226]
表14一点红提取物中总黄酮含量
[0227][0228]
以总黄酮得率和总黄酮含量为研究目标，采用闪式提取联合超声辅助提取工艺，考察不同乙醇浓度、料液比、超声时间、超声功率、超声温度、闪式提取时间、闪式提取电压、大孔树脂型号、大孔树脂径高比、洗脱液对一点红中目标黄酮得率和黄酮含量的影响，优化出适宜的工艺参数为：乙醇体积分数45-75％，料液比1:15-1:30(m/m)，超声时间30-120min，超声功率200-500w，超声温度45-75℃，闪式提取时间30-120s，闪式提取电压75-125v，大孔树脂型号为d101型、ab-8型或s-8型，大孔树脂径高比为1:10-1:15，洗脱液为60％-80％乙醇，此时一点红总黄酮得率为12.17mg/g-18.31mg/g，树脂纯化后一点红提取物中的总黄酮含量为147-232mg/g。
[0229]
综上可知，闪式提取联合超声辅助提取和大孔吸附树脂纯化工艺可显著提高一点红总黄酮得率和总黄酮含量。
[0230]
1、提取物基本性质
[0231]
1.1电导率
[0232]
电导率，依照gb/t 6908-2018锅炉用水和冷却水分析方法电导率的测定。
[0233]
1.2吸潮率
[0234]
参考《中华人民共和国国家标准粉尘物性试验方法第6部分:吸湿性的测定》。
[0235]
1.3溶解性
[0236]
某温度下，物质在溶剂中溶解完全且放置24h无物质析出的最大量为其溶解度。
[0237]
1.4贮藏稳定性
[0238]
参照《中华人民共和国药典(2020版)》(四部)原料药物及制剂稳定性的指导原则开展稳定性考察。
[0239]
一点红提取物的基本性质如表15所示。
[0240]
表15一点红提取物基本理化性质
[0241][0242]
一点红提取物基本理化性质如表15和图1-4所示，大孔吸附树脂纯化工艺显著降低了提取物的电导率和吸潮性，扩大了提取物的剂型应用性；室温30天内密封保存期间样品呈均一粉末状，未出现板结、粘结现象，解决了产品在后续存储过程中容易出现吸潮、板结等问题；同时，大孔吸附树脂纯化工艺提高了提取物在50％丁二醇溶液中的溶解性，纯化后溶解率由5％增加至20％。
[0243]
1.5抗氧化试验
[0244]
清除abts自由基是分析抗氧化剂的一种常规方式。试验中用清除率表示受试物清除自由基的能力，清除率越大，则表示其抗氧化能力越强。
[0245]
对一点红提取物进行abts自由基清除率测定，具体试验方法如下：
[0246]
取0.0192g abts加入5.00ml去离子水溶解，混匀，制备成7mmol
·
l-1
的abts储备液。称取0.1892g过硫酸钾，加入5.000ml去离子水溶解，混匀，制备成140mmol
·
l-1
的储备液。将一定量的7mmol
·
l-1
的abts和140mmol
·
l-1
的过硫酸钾混合，在室温避光下静置一段时间后，形成abts自由基储备液。取一定量的abts自由基储备液，用50％乙醇稀释，使最终测试阴性对照吸光值为0.70
±
0.02。
[0247]
将一点红提取物用体积分数为50％乙醇稀释成一系列不同浓度的测试液。将测试液、abts自由基储备液依次加入，涡旋混匀，置于酶标仪避光孵育，每间隔20min，用酶标仪在波长734nm处测定其吸光值。按式(1)计算abts自由基清除率，借助origin 9.0软件分析其ic50值，该数值越小，表明效果越强。
[0248][0249]
式(1)中：a为测试液与abts溶液混合后od值，b为50％乙醇与abts溶液混合后od值，c为50％乙醇与测试液混合后od值。
[0250]
表16一点红提取物抗氧化性
[0251]
检测项目实施例25实施例28abts自由基清除率ic50值(％)0.00400.0015
[0252]
一点红提取物抗氧化性测试结果如表16和图5-6所示，由结果可知，本发明所制得的一点红，具有优异的清除abts自由基的效果，且实施例28清除abts的ic50值为实施例25的1/3左右，表明大孔吸附树脂纯化工艺可显著提高一点红提取物的抗氧化功效。
[0253]
2、抗光损伤作用
[0254]
基于uva诱导人皮肤成纤维细胞(hff-1)细胞损伤模型试验，评价样品对于细胞活力的影响，进而评估其对抗光损伤功效。
[0255]
2.1基于hff-1细胞毒性检测
[0256]
细胞毒性检测方法如下：
[0257]
(1)接种：取对数生长期细胞消化后接种至96孔板，将培养板放置在37℃、5％的co2培养箱中孵育培养24h。
[0258]
(2)配液：按表17中浓度设置，配制不同浓度的受试物。
[0259]
(3)给样：细胞生长24h后弃掉上清，加入含不同浓度受试物的培养基，将培养板放置在37℃、5％的co2培养箱中孵育培养24h。
[0260]
(4)检测：细胞孵育培养24h后，以mtt法进行细胞毒性测试。
[0261]
(5)相对细胞活率的计算公式：
[0262][0263]
表17受试浓度设定
[0264]
样品名称样品浓度(m/v)实施例250.0078％、0.0156％、0.0313％、0.0625％、0.125％、0.25％、0.5％、1％实施例280.0078％、0.0156％、0.0313％、0.0625％、0.125％、0.25％、0.5％、1％
[0265]
结果如图7所示，以85％相对细胞活率为标准筛选最大安全给药浓度得出：实施例28一点红提取物、实施例25一点红提取物的细胞测试浓度上限均为0.0625％，且与未纯化前(实施例25)相比，实施例28一点红提取物的细胞毒性较低。
[0266]
2.2基于uva辐照hff-1细胞活力检测
[0267]
(1)接种：将细胞按照105个/ml接种至6孔板。37℃，5％co2培养箱孵育24h。
[0268]
(2)配液：根据表18配制受试物和阳性对照。
[0269]
(3)给样：根据表18试验分组和浓度设置，待6孔板中细胞生长24h后，进行分组给样，每组设3个复孔。组1中，空白对照与阴性对照组均加入含1％dmso的细胞培养基，阳性对照加入含有10μg/ml维生素e的细胞培养基。组2中，空白对照与阴性对照组均加入细胞培养基，样品组加入含有相应浓度样品的细胞培养基，于37℃，5％co2培养箱继续培养24h。
[0270]
表18试验分组和浓度设置
[0271][0272]
[0273]
注：bc：空白对照；nc：阴性对照；sc：阳性物对应的阴性对照和空白对照。
[0274]
(4)照射：加样培养24h后，去除培养基，用预温的1ml pbs清洗两次，去除清洗溶液，加入1ml pbs，根据组别设置，需照射的组别在30j/cm
2 uva剂量下进行照射。达到照射剂量后，去除孔中的pbs，以1ml预温的pbs清洗一次，加入dmem培养基继续培养16-24h。
[0275]
(5)细胞活力检测：以mtt法进行细胞活力测试。细胞活力计算公式：
[0276][0277]
(6)数据处理：试验中取得的各项数据经过excel软件进行处理与作图。用spss 17.0进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(anova)，当p《0.05时判断为差异显著。
[0278]
表19细胞活力结果分析
[0279][0280]
备注：
▲▲
表示与sc(uva-，0.1％dmso)组相比，差异极显著，p《0.01；
[0281]
△
表示与bc(uva-)组相比，差异显著，p《0.05；
[0282]
##表示与sc(uva+，0.1％dmso)组相比，差异极显著，p《0.01；
[0283]
*表示与nc组相比，差异极显著，p《0.01；**表示与nc组相比，差异极显著，p《0.01。
[0284]
与uva无辐照(uva-)组相比，uva辐照(uva+)引起hff-1细胞活力显著下降；而与sc(uva+,0.1％dmso)相比，pc(ve)组可显著提高细胞活力，表明uva造模成功，且评价体系有效。
[0285]
与nc(una+)组相比，本发明实施例28制得一点红提取物在0.0156％～0.063％浓度下均可显著提高hff-1细胞活力，且对抗光损伤效果优于阳性对照组(表18)，与同等浓度下(0.0156％)实施例25制得一点红提取物相比，效果得到了增加。与其他浓度相比，抗光损伤效果由无效变为有效，且与对照相比具有显著性差异。