一种稳定的眼用制剂的制作方法

1.本发明属于药物制剂学领域，涉及一种抗vegf药物眼用制剂。


背景技术：

2.血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,vegf)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。在vegf的机制中，异常的血管生成与眼科疾病例如湿性年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿和视网膜静脉阻塞中的黄斑水肿等有关(min kim,journal of the korean medical association 57(7):614july 2014)。
3.用于上述眼科治疗的上市产品实例包括pegaptanib,bevacizumab,conbercept。然而，因为频繁的抗vegf药物治疗以及就诊，对患者来说其费用是昂贵的，给患者家庭带来了沉重的负担。而降低给药频次有助于降低治疗成本及提高患者顺应性，同时持续释药机制更有助于稳定性患者的视觉效果，开发一种可持续性递送抗vegf的药物是未来研发趋势(k.freund,s.mrejen,r.gallego-pinazoan update on the pharmacotherapy of neovascular age-related macular degeneration expert.opin.pharmacother.,14(2013),pp.1017-1028)。
4.控制释放速率以达到治疗水平的持续释放生物制剂一直是一个挑战(y.kim,b.chiang,x.wu,m.prausnitzocular delivery of macromolecules j.control.release,190(2014),pp.172-181)。其根本原因是蛋白稳定性面临挑战，在非最佳条件下，包括抗体药物的蛋白质药物中发生物理化学修饰。特别地，诸如温度、ph值、盐浓度、与空气接触、蛋白质浓度和缓冲剂类型等因素显著影响蛋白质的氧化、脱酰胺、异构化和聚合。这些修饰引起聚集，并产生蛋白质的片段、异构体，使得可能降低生物活性。这些性质在蛋白质中不同。特别地，对于fc融合蛋白，由于折叠问题，在疏水相互作用色谱中出现单独的3个峰(antibodies(2013),2,452-500)。
5.目前，通常采用缓释装置或聚合物基质来获得药物的持续释放，然而，由于药物的释放过程始终处于常温环境(如37℃)中，对于温度敏感性药物尤其是生物大分子药物是非常困难的，大分子不断的聚集和降解，最终失去活性，因此目前急需开发一种能稳定在常温条件(如37℃)下释放的眼用生物制剂。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的缺点，本发明人进行各种研究意外发现制备非水悬浮媒介的蛋白制剂可有效实现一种能在常温条件(如37℃)下长期稳定，安全且持续缓释的眼用制剂。
7.本发明提供一种眼用非水悬浮制剂，该制剂包括：1)治疗有效量的抗vegf药物，2)非水悬浮媒介。
8.本发明所述的抗vegf药物选择于阿柏西普、康柏西普、雷珠单抗、贝伐单抗、
brolucizumab中的一种或多种，更进一步的，所述的抗vegf药物为康柏西普，康柏西普为一种由flt-1的第二免疫球蛋白样区域2和kdr的第3-4免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3,4-fc，其在专利cn200610066257.2(融合蛋白fp3，具有如序列5所述的氨基酸序列)中也有所描述，在此将该专利的内容全部引入本技术。
9.本发明所述的抗vegf药物含量为1mg/g-350mg/g，更进一步的，20mg/g-264mg/g。
10.本发明所述的非水悬浮媒介为有机溶剂，所述非水溶剂包括但不限于乙醇、乙酸、甘油、乙酰柠檬酸三乙酯、苯甲酸苄酯、二乙二醇单乙酯、中链甘油三酯、聚乙二醇、聚乙二醇醚类、碳酸酯类、脂肪酸类等，进一步所述非水溶剂选自于甘油、中链甘油三酯和/或聚乙二醇。
11.本发明中，所述眼用非水悬浮制剂进一步包括糖类，所述糖类包括但不限于海藻糖、蔗糖、甘露醇中的一种和多种，优选海藻糖或/和蔗糖，更优选海藻糖。
12.本发明中，所述眼用非水悬浮制剂进一步包括缓冲剂，所述缓冲剂可以选自组氨酸缓冲剂、精氨酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂中的一种或多种。
13.本发明中，所述眼用非水悬浮制剂进一步包括表面活性剂，所述表面活性剂可以为聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物中的一种或多种。
14.本发明中，所述非水悬浮制剂的制备步骤包含：1)将抗vegf药物及糖类、缓冲剂和/或表面活性剂通过干燥工艺制备成干燥粉末，所述干燥工艺为液氮冷冻研磨、喷雾冷冻干燥、静电喷雾干燥、纳米喷雾干燥、超临界喷雾干燥，优选超临界喷雾干燥、静电喷雾干燥、纳米喷雾干燥，更优选静电喷雾干燥、纳米喷雾干燥；2)将干燥粉末悬浮于非水悬浮媒介。
15.本发明所述抗vegf药物粒径为d10》1.25μm，进一步的所述抗vegf药物粒径为d10》2.41μm。
16.本发明所述非水悬浮制剂ph值为5-8，进一步的，所述非水悬浮制剂ph值为8。
17.在本发明一个实施方案中，提供了一种眼用非水悬浮制剂，其包含：
18.处方组成含量康柏西普122mg/g海藻糖153mg/g精氨酸53mg/g枸橼酸6mg/g聚乙二醇400666mg/g
19.，进一步的，所述康柏西普粒径为d10》1.25μm。
20.在本发明一个实施方案中，提供了一种眼用非水悬浮制剂，其包含：
21.处方组成含量康柏西普122mg/g海藻糖153mg/g精氨酸53mg/g枸橼酸6mg/g聚乙二醇400666mg/g
22.，进一步的，所述康柏西普粒径为d10》2.41μm。
23.本发明进一步提供一种上述眼用非水悬浮剂在制备预防和/或治疗眼部疾病的药物的应用，所述眼部疾病为眼后段疾病，所述眼部疾病包括但不限于青光眼、葡萄膜炎、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉炎、增生性玻璃体视网膜病变、脉络膜新生血管、黄斑囊样水肿、年龄相关性黄斑变性、玻璃体黄斑粘连、黄斑裂孔、视神经炎、视盘水肿、视神经脑膜瘤、视神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤和脉络膜母细胞瘤。
24.本发明的有益效果：
25.1、本发明非水悬浮剂可在眼内持续缓慢释放活性药物成分。
26.2、本发明非水悬浮剂可在眼内保持稳定。
具体实施方式
27.通过参考下面的实施例会能够更加全面地理解本发明。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。通过述及将所有文献和专利引文收入本文。
28.实施例
29.本发明通过以下实施例对本发明的内容进一步详细说明，并不能用于限制本发明的保护范围。
30.本发明所使用的试剂及仪器列举如下：
31.仪器
[0032][0033][0034]
试剂
[0035][0036]
实施例一
[0037]
表1制剂组成
[0038][0039][0040]
制备方法
[0041]
缓冲液1配制：称取12g海藻糖、4.5g精氨酸、1.3g枸橼酸及0.15g吐温20溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0042]
切向流浓缩换液：取20mg/ml康柏西普原液(自制，辅料为枸橼酸、蔗糖、精氨酸、吐温20)40ml于100ml血清瓶中，采用膜包(xl cassette)进行切向浓缩流换液，将外部缓冲液置换为缓冲液1，换液体积400ml。采用紫外分光光度法测定蛋白含量，并用缓冲液
1稀释至20mg/ml，过0.22μm除菌滤器后保存于2-8℃冰箱。
[0043]
喷雾干燥：采用静电喷雾干燥机(polardry 1.0)进行喷雾干燥；工艺参数：气体流量27.0nm3/h，干燥气体温度80℃，雾化压力240kpa，出风温度42～45℃，静电压力20kv，进液流速4.5ml/min。制成康柏西普粉末，将康柏西普粉末与表1中的有机溶剂按比例，制备成混悬液。采用hplc-sec检测康柏西普纯度，并将混悬液放置于45度恒温箱中放置10天测定其与vegf的亲和力，结果如下表2：
[0044]
表2稳定性结果
[0045]
样品名称处方1处方2处方3处方4处方5纯度百分比％99.0498.6798.2799.0199.08亲和力(kd)值11316010651.9971.1
[0046]
实施例二
[0047]
表3
[0048][0049][0050]
配制3种不同缓冲液：
[0051]
缓冲液2：称取20g海藻糖及4.44g精氨酸溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0052]
缓冲液3：称取20g蔗糖及4.44g精氨酸溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0053]
缓冲液4：称取20g甘露醇及4.44g精氨酸溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0054]
切向流浓缩换液：分别取20mg/ml康柏西普原液(自制，辅料为枸橼酸、蔗糖、精氨酸、吐温20，康柏西普浓度为20mg/ml)40ml于100ml血清瓶中，采用膜包(xl cassette)进行切向浓缩流换液，将外部缓冲液分别置换为缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4，换液体积400ml。采用紫外分光光度法测定蛋白含量，并用缓冲液2、3或4稀释至20mg/ml，过0.22μm除菌滤器后保存于2-8℃冰箱。
[0055]
静电喷雾干燥：将上述置换并稀释后的康柏西普溶液(处方6-处方8)采用静电喷雾干燥机(polardry 1.0)进行喷雾干燥；工艺参数：气体流量27.0nm3/h，干燥气体温度80℃，雾化压力240kpa，出风温度42～45℃，静电压力20kv，进液流速4.5ml/min，得到康柏西普干燥粉末。
[0056]
纯度检测：取20mg康柏西普干燥粉末溶解于1ml水中，采用hplc-sec检测康柏西普纯度，结果见表4。
[0057]
表4稳定性结果
[0058]
样品名称处方6处方7处方8纯度百分比％98.8598.8792.42聚集百分比％1.141.127.55
[0059]
非水悬浮制剂制备：取0.5g康柏西普粉末加入2g聚乙二醇400充分涡旋混悬后制备成非水悬浮制剂。
[0060]
实施例三
[0061]
表5
[0062][0063]
制备方法
[0064]
配置缓冲液5：称取25g蔗糖、17.42g精氨酸及2.1g枸橼酸溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0065]
切向流浓缩换液：取20mg/ml康柏西普原液(自制，辅料为枸橼酸、蔗糖、精氨酸、吐温20)40ml于100ml血清瓶中，采用膜包进行切向浓缩流换液，将外部缓冲液置换为缓冲液5，换液体积400ml。采用紫外分光光度法测定蛋白含量，并用缓冲液5稀释至20mg/ml，过0.22μm除菌滤器后保存于2-8℃冰箱。
[0066]
喷雾干燥：将上述置换并稀释后的康柏西普溶液(处方9)喷入带有磁力搅拌的液氮罐中，搅拌液氮同时喷入处方9，使其冷冻成细小的微粒，雾化压力为2.4mpa；将冻干机预冷至-20℃，放入喷雾冷冻的微粒进行冷冻干燥。采用hplc-sec检测康柏西普纯度，喷雾冷冻干燥前后的纯度结果如下表6：
[0067]
表6稳定性结果
[0068]
样品名称处方9纯度百分比％98.72聚集百分比％1.28
[0069]
非水悬浮制剂制备：取0.5g康柏西普粉末加入2g聚乙二醇400充分涡旋混悬后制备成非水悬浮制剂。
[0070]
实施例四
[0071]
表7
[0072][0073][0074]
制备方法
[0075]
配制缓冲液6：称取25g海藻糖、8.7g精氨酸及1.05g枸橼酸溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0076]
切向流浓缩换液：取20mg/ml康柏西普原液(自制，辅料为枸橼酸、蔗糖、精氨酸、吐温20)40ml于100ml血清瓶中，采用膜包(xl cassette)进行切向浓缩流换液，将外部缓冲液置换为缓冲液6，换液体积400ml。采用紫外分光光度法测定蛋白含量，并用缓冲液6稀释至20mg/ml，过0.22μm除菌滤器后保存于2-8℃冰箱。
[0077]
喷雾干燥：将上述置换并稀释后的康柏西普溶液(处方10)采用静电喷雾干燥机(polardry1.0)进行喷雾干燥；工艺参数：气体流量27.0nm3/h，干燥气体温度80℃，雾化压力240kpa，出风温度42～45℃，静电压力20kv，进液流速4.5ml/min，得到康柏西普干燥粉末。
[0078]
纯度检测：取20mg康柏西普干燥粉末溶解于1ml水中，采用hplc-sec检测康柏西普纯度，结果如下表8：
[0079]
表8稳定性结果
[0080]
样品名称处方10纯度百分比％99.18聚集百分比％0.82
[0081]
非水悬浮制剂制备：取0.5g康柏西普粉末加入2g聚乙二醇400充分涡旋混悬后制备成非水悬浮制剂。
[0082]
实施例五
[0083]
表9
[0084]
[0085]
制备方法
[0086]
缓冲液7制备：称取25g海藻糖、17.42g精氨酸及2.1g枸橼酸溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0087]
切向流浓缩换液：取20mg/ml康柏西普原液(自制，辅料为枸橼酸、蔗糖、精氨酸、吐温20)40ml于100ml血清瓶中，采用膜包(xl cassette)进行切向浓缩流换液，将外部缓冲液置换为缓冲液7，换液体积400ml。采用紫外分光光度法测定蛋白含量，并用缓冲液7稀释至20mg/ml，过0.22μm除菌滤器后保存于2-8℃冰箱。
[0088]
喷雾干燥：将上述置换并稀释后的康柏西普溶液(处方11)采用纳米喷雾干燥机(buchi b-90)进行喷雾干燥；工艺参数：气流量130l/min，进风温度80℃，喷雾效率100％，模式空气开环，喷帽孔径5.5μm，出风温度35～43℃，雾化压力50～52bar。得到康柏西普干燥粉末。采用hplc-sec检测康柏西普纯度，静电喷雾干燥前后纯度结果如下表10：
[0089]
表10稳定性结果
[0090]
样品名称处方11纯度百分比％99.26聚集百分比％0.74
[0091]
非水悬浮制剂制备：取0.5g康柏西普粉末加入2g聚乙二醇400充分涡旋混悬后制备成非水悬浮制剂。
[0092]
实施例六
[0093]
表11
[0094][0095]
制备方法
[0096]
四种缓冲液配制；缓冲液8，称取12g海藻糖、4.44g精氨酸、1.3g枸橼酸及0.12g吐温20溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0097]
缓冲液9，称取6g海藻糖、4.44g精氨酸、1.3g枸橼酸及0.12g吐温20溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0098]
缓冲液10，称取2g海藻糖、7g精氨酸、2.05g枸橼酸及0.12g吐温20溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0099]
缓冲液11，称取17g海藻糖、2.22g精氨酸、0.65g枸橼酸及0.12g吐温20溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0100]
切向流浓缩换液：分别取20mg/ml康柏西普原液(自制，辅料为枸橼酸、蔗糖、精氨
酸、吐温20)40ml于100ml血清瓶中，采用膜包(xl cassette)进行切向浓缩流换液，将外部缓冲液分别置换为缓冲液8、缓冲液9、缓冲液10、缓冲液11，换液体积400ml。采用紫外分光光度法测定蛋白含量，并用缓冲液8、9、10、11稀释至20mg/ml，过0.22μm除菌滤器后保存于2-8℃冰箱。
[0101]
喷雾干燥：将上述置换并稀释后的康柏西普溶液(处方12-处方15)采用静电喷雾干燥机(polardry 1.0)进行喷雾干燥；工艺参数：气体流量27.0nm3/h，干燥气体温度80℃，雾化压力240kpa，出风温度42～45℃，静电压力20kv，进液流速4.5ml/min，得到康柏西普干燥粉末。采用hplc-sec检测康柏西普纯度，静电喷雾干燥前后纯度结果如下表12：
[0102]
表12稳定性结果
[0103]
样品名称处方12处方13处方14处方15纯度百分比％99.4299.3699.3899.37聚集百分比％0.580.610.620.63
[0104]
非水悬浮制剂制备：取0.5g康柏西普粉末加入2g聚乙二醇400充分涡旋混悬后制备成非水悬浮制剂。
[0105]
实施例七
[0106]
表13制剂组成
[0107]
处方组成处方16处方17处方18康柏西普122mg/g122mg/g122mg/g海藻糖153mg/g153mg/g153mg/g精氨酸53mg/g53mg53mg/g枸橼酸6mg/g6mg/g6mg/g聚乙二醇400666mg/g666mg/g666mg/g
[0108]
制备方法
[0109]
缓冲液12配制：称取25g海藻糖、8.7g精氨酸、1.0g枸橼酸溶解于980ml的超纯水中，用盐酸调节ph值至8.0，最终定容至1l，过0.22μm滤膜备用。
[0110]
切向流浓缩换液：取20mg/ml康柏西普原液(自制，辅料为枸橼酸、蔗糖、精氨酸、吐温20)40ml于100ml血清瓶中，采用膜包(xl cassette)进行切向浓缩流换液，将外部缓冲液置换为缓冲液12，换液体积400ml。采用紫外分光光度法测定蛋白含量，并用缓冲液12稀释至20mg/ml，过0.22μm除菌滤器后保存于2-8℃冰箱。
[0111]
喷雾干燥：采用静电喷雾干燥机(polardry 1.0)进行喷雾干燥；工艺参数：气体流量27.0nm3/h，干燥气体温度80℃，雾化压力240kpa，出风温度42～45℃，静电压力20kv，进液流速4.5ml/min，制成康柏西普粉末。
[0112]
非水悬浮制剂制备：取0.5g康柏西普粉末与0.2g聚乙二醇400混合，制备成混悬液，制剂组成由表13所示。过75μm标准筛装入15ml离心管，采用冷冻离心机进行离心分选，离心结束后去除1ml离心管上段混悬液，将剩余混悬液重新涡旋混匀，离心条件及康柏西普粒径测定如下表14：
[0113] 处方16处方17处方18离心条件1000rpm，5min1000rpm，10min1000rpm，15min
d100.94μm1.25μm2.41μm
[0114]
将上述混悬液放入37℃稳定性试验箱中进行稳定性考察，纯度检测结果如下表15：
[0115]
纯度％0天3天7天14天28天58天90天120天180天处方1698.6892.1688.0186.9186.8786.3586.4986.7086.33处方1798.5294.794.0693.1893.0593.1293.1093.2193.23处方1898.4697.9397.0296.8496.1596.0495.9895.9495.89