一种新型冠状病毒S1-E疫苗及其制备方法

一种新型冠状病毒s1
‑
e疫苗及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物制品领域，尤其涉及一种新型冠状病毒s1
‑
e疫苗及其制备方法。


背景技术：

2.sars
‑
cov
‑
2具有高度传染性，主要通过黏膜传播。sars
‑
cov
‑
2与sars 病毒相似，均属于冠状病毒，但其碱基序列和结构与sars病毒不同。目前还没有治疗sars
‑
cov
‑
2感染的专门药物，而且只有一小部分患者可以从免疫系统的影响中恢复。面对找到治愈方法的困难，研制疫苗已成为当务之急。据世界卫生组织统计，目前共有200多个疫苗开发项目，包括传统疫苗(减毒活疫苗、灭活疫苗)、亚单位疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等。其中，重组亚单位疫苗是利用微生物(抗原)的某种表面结构成分诱导机体产生不含核酸的抗体的一种疫苗。这些结构可以包括某些多糖、蛋白质或表位，但它们不包括整个病原体。在亚单位疫苗的基础上，负载纳米粒子形成纳米疫苗，这也是疫苗设计的一种流行方式。
3.plga是最成功的生物可降解聚合物之一。作为抗原交付系统,它有很多优点:(i)plga拥有良好的生物降解性和生物相容性,(ⅱ)fda和欧洲医疗机构批准的药物输送系统，用于肠外给药(ⅲ)描述的充分的准备和生产方法适用于各种各样的药物，如亲水或疏水分子或大分子，(ⅳ)可减少疫苗抗原的降解，(
ⅴ
)可持续释放的可能性，(
ⅵ
)可改变表面性质，提供隐形和/或与生物材料更好的相互作用等。
4.由于新型冠状病毒传染性极强，致病性高的问题。全病毒结构的疫苗并不能保证其安全性，可能使接种对象产生无效抗体。无效抗体的产生往往对应对病毒感染不能起到有利作用甚至会导致依赖性感染增强现象和增强呼吸系统疾病等副作用。而单一蛋白的亚单位疫苗可能没有很好的免疫原性，或者在一些新型冠状病毒突变株感染时面临失效的风险。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种新型冠状病毒s1
‑
e 疫苗及其制备方法。
6.为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
7.本发明提供的一种新型冠状病毒s1
‑
e疫苗，包括s1
‑
e蛋白，所述s1
‑
e蛋白的编码基因的核苷酸序列如seqid no.1所示。
8.进一步的，所述s1
‑
e蛋白的浓度为0.1
‑
0.2g/l。
9.进一步的，所述s1
‑
e蛋白由新型冠状病毒突刺蛋白s1亚基位点的受体结合域融合包膜蛋白e而成，所述白s1亚基位点的受体结合域的氨基酸序列如 seq id no:2所示，所述包膜蛋白e的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述 s1
‑
e蛋白的氨基酸序列如seq id no:4所示。
10.本发明还提供上述新型冠状病毒s1
‑
e疫苗的制备方法，包括以下步骤：
11.步骤s1，合成s1
‑
e蛋白的编码基因的核苷酸序列；
12.步骤s2，将步骤s1得到的s1
‑
e蛋白的编码基因克隆到质粒载体中；
13.步骤s3，将步骤s2的质粒载体转化到表达系统；
14.步骤s4，将步骤s3构建的表达系统的生物接种培养，进行重组s1
‑
e蛋白表达，得到所述s1
‑
e蛋白；
15.步骤s5，提取纯化步骤s4得到s1
‑
e蛋白；
16.步骤s6，将步骤s5得到的高纯度的s1
‑
e蛋白与佐剂混合孵育，形成稳定的混合物，沉淀、水洗和冻干，即得所述s1
‑
e疫苗。
17.进一步的，步骤s2中，所述质粒载体包括质粒pet
‑
28a。
18.进一步的，步骤s3中，所述宿主的表达系统包括原核表达系统、酵母表达系统、哺乳细胞和无细胞表达系统中的任意一种。
19.进一步的，步骤s3中，所述原核表达系统包括大肠杆菌；步骤s4中，将所述大肠杆菌的菌落接种于含卡那霉素的溶菌肉汤培养基中进行细菌培养，所述大肠杆菌的接种量为1～6％。
20.进一步的，步骤s5中的提取过程使用包涵体溶解液，所述包涵体溶解液包括tris缓冲液、nacl溶液和尿素，所述tris缓冲液和nacl溶液的摩尔浓度比为5:4，所述尿素的的摩尔浓度为8mol/l；所述纯化使用层析柱，所述层析柱为 ni
2+
金属螯合层析柱。
21.进一步的，步骤s6中，所述佐剂包括plga，所述plga在所述s1
‑
e纳米疫苗中的终浓度为1
‑
2mg/ml。
22.本发明还提供上述新型冠状病毒s1
‑
e疫苗在药物组合物中的应用，所述的药物组合物包含如权利要求1所述的s1
‑
e疫苗。
23.本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
24.(1)本发明提供的一种新型冠状病毒s1
‑
e疫苗，s1
‑
e蛋白是由两个独立的单一蛋白融合而成，其中新型冠状病毒突刺蛋白s1亚基位点的受体结合域是新型冠状病毒表面最凸起的结构，具有很强的免疫原性，而包膜蛋白e拥有高度的保守性。本发明将s1亚基位点的受体结合域与包膜蛋白e进行重组。该疫苗各组分相互协调补充，抗原性强，具有良好的免疫原性、安全性和生物学活性，能够诱导机体产生高滴度的中和抗体，有效抑制新型冠状病毒 (sars
‑
cov
‑
2)的生长，可有效预防感染新型冠状病毒(sars
‑
cov
‑
2)。
25.(2)本发明疫苗制备方法简单、易于纯化，安全性高，疫苗可较快的应用于临床试验。
附图说明
26.图1为本发明的一种新型冠状病毒s1
‑
e疫苗扫描电镜图；
27.图2为本发明实施例1提供的s1
‑
e疫苗的体外释放度曲线；
28.图3为本发明实施例1提供的s1
‑
e疫苗的粒径分布图；
29.图4为本发明实施例1提供的s1
‑
e疫苗的zeta电位图；
30.图5为本发明实施例1提供的s1
‑
e疫苗免疫小鼠产生的抗s1蛋白抗体滴度图；
31.图6为本发明实施例1提供的s1
‑
e疫苗免疫小鼠产生的抗e蛋白抗体滴度图；
32.图7为本发明实施例1提供的s1
‑
e疫苗的假病毒中和试验结果图；
33.图8为本发明实施例1提供的s1
‑
e疫苗免疫小鼠后第四周小鼠体内产生的免疫应
答图。
具体实施方式
34.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。
35.实施例1：
36.1、s1
‑
e蛋白疫苗的制备
37.1.1合成s1
‑
e蛋白的编码基因的核苷酸序列
38.在uniprot蛋白质数据库中找到新型冠状病毒的s1、rbd、e蛋白的氨基酸序列。利用dnaman软件进行序列分析，并且根据每个蛋白在新型冠状病毒上的位置不同，留下抗原性大的膜外序列，以e蛋白为5’序列和s1亚基序列为3’序列用柔性linker进行连接，合成s1
‑
e蛋白的编码基因的核苷酸序列如 seq id no.1所示。
39.1.2将步骤1.1得到的s1
‑
e蛋白的编码基因克隆到质粒载体中
40.在s1
‑
e蛋白的编码基因的5
′
端和3
′
端分别添加ncol、xhol酶切位点，与表达载体pet
‑
28a质粒连接，获得编码s1
‑
e蛋白的原核表达质粒pet
‑
28a
‑
s1
‑
e。
41.1.3将步骤1.2的质粒载体转入到表达系统
42.将表达质粒pet28a
‑
s1
‑
e构建到rostta(de3)感受态细胞中，涂板，挑取单菌落，筛选阳性克隆重组大肠杆菌rostta(de3)pet28a
‑
s1
‑
e。
43.1.4将步骤1.3构建的表达系统的生物接种培养，进行重组s1
‑
e蛋白表达，得到所述s1
‑
e蛋白
44.1.4.1挑取单个步骤3得到的rostta(de3)pet28a
‑
s1
‑
e基因工程菌菌落，将其接种于含50μg/ml卡那霉素的溶菌肉汤培养基(lb)中，20～37℃， 160～240rpm摇菌过夜，按1～6％的接种量将rostta(de3)pet28a
‑
s1
‑
e基因工程菌菌落接种于lb/kam培养液中，160～240rpm摇菌至od600为0.5～0.7时，加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)使其终浓度为0.1
‑
1.0mm，诱导4～6小时后， 2000～4000g在2～6℃离心5～15min，去上清，沉淀用1xpbs洗涤，将rosetta菌重悬于40ml 1xpbs中，加入四氢嘧啶至终浓度0.8
‑
1.6mmol/l，和吐温20至终浓度0.5
‑
1％，并于室温中振荡2
‑
5分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，
‑
80℃保存；
45.1.4.2将裂解液置于冰浴下50
‑
55w超声5
‑
20遍，超声20～40s、停20～40s，直至菌液不粘稠，10000～12000g 3～5℃离心10～20min，去上清，得rostta (de3)pet28a
‑
s1
‑
e基因工程菌包涵体。
46.1.5提取纯化步骤1.4得到s1
‑
e蛋白
47.1.5.1在冰浴下，用100ml包涵体洗液1重悬沉淀上述rostta(de3)pet28a
‑ꢀ
s1
‑
e基因工程菌包涵体，并磁力搅拌20～40min，10000～13000g 3～5℃离心 10～20min，去上清，再依次用包涵体洗液2和包涵体洗液3重悬，冰浴磁力搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000～12000g离心 30min，弃沉淀，得含有s1
‑
e蛋白的包涵体。其中包涵体洗液1为50mmol/l pbph8.0，100mmol/l nacl，5mmol/l edta；包涵体洗液2为50mmol/l pb ph8.0， 100mmol/l nacl，5mmol/l edta，2％triton x
‑
100；包涵体洗液3为50mmol/l pb ph8.0，100mmol/l nacl，5mmol/l edta，4mol/l尿素；包涵体溶解液为 50mmol/l pb ph8.0，300mmol/l nacl，20mmol/l咪唑，6mol/l尿素。
48.1.5.2由于s1
‑
e蛋白的n
‑
端带有6
‑
his标签，可以通过ni
2+
金属螯合层析进行s1
‑
e蛋白亲和层析纯化，得纯化的s1
‑
e蛋白。
49.1.6制备s1
‑
e蛋白疫苗
50.称取50mg plga溶于1ml二氯甲烷中，然后再加入100μl丙酮，混匀；取 s1
‑
e蛋白溶液，s1
‑
e蛋白含量10mg；将两溶液两相混合，在冰水浴中，超声细胞破碎仪，40w，间断超声(每5s间断5s)，20次，形成w1/o乳液；配制2ml 20g/l聚乙烯醇(pva)水溶液(溶于超纯水)，形成外水相w2；将w1/o 注入w2相，再次超声，条件同第3步，形成w1/o/w2复乳；将w1/o/w2乳液转移至50ml超纯水中，室温搅拌3～4h，使有机溶剂完全挥发，12000g 4℃高速离心15min，收集沉淀，超纯水洗3次；真空冷冻干燥，得到纳米级别的s1
‑
e 疫苗颗粒，即为s1
‑
e疫苗纳米颗粒，于4℃保存。
51.2、将本实施例制备的s1
‑
e疫苗进行表征分析试验
52.2.1将本实施例制备的s1
‑
e疫苗纳米颗粒进行sds
‑
page电泳、载药量(lc) 和包埋比(er)测定。lc(％)＝纳米颗粒中蛋白质的重量/纳米颗粒的重量100％ er(％)＝纳米颗粒中蛋白质的重量/饲养蛋白的重量100％。进行sem检测。
53.如图1所示，结果表明在3.6mm
×
10.0k se下，s1
‑
e疫苗呈椭圆形的胶囊样，完整的结构更能让抗原s1
‑
e蛋白降解更缓慢。
54.2.2将本实施例制备的s1
‑
e疫苗进行体外释放度检测
55.如图2所示，本实施例制备的s1
‑
e疫苗纳米颗粒呈典型的双相释放模式。第一阶段为12h内的快速释放，释放率为27.2％；可能的原因是s1
‑
e蛋白大多数附着在纳米颗粒表面或包裹在纳米表面蛋白中。在第二阶段，在12h后，扩散驱动的s1
‑
e通过刚性plga核心不断释放。在48h时，s1
‑
e疫苗的累积释放率达到66.98％的峰值，48h后，s1
‑
e疫苗的累积释放率缓慢，但释放完全。结果表明，本发明制备的s1
‑
e疫苗中的佐剂plga，有效降低了重组s1
‑
e蛋白的降解速度。
56.2.3将本实施例制备的s1
‑
e疫苗纳米颗粒进行粒径分布检测
57.如图3所示，本实施例制备的s1
‑
e疫苗纳米颗粒大小为670
±
145nm，结果表明，本发明制备的s1
‑
e疫苗的粒径较大，更容易引起免疫反应。
58.2.4将本实施例制备的s1
‑
e蛋白疫苗颗粒进行zeta电位检测
59.如图4所示，本实施例制备的s1
‑
e疫苗纳米颗粒的zeta电位值为
‑
22.3
±ꢀ
6.89，zeta电位的绝对值越大，颗粒粒子就越稳定。结果表明：本发明制备的 s1
‑
e疫苗稳定性较高。
60.3、将本实施例制备的s1
‑
e蛋白疫苗用于皮下免疫小鼠试验
61.将6
‑
8周龄雌性balb/c小鼠分为5组，每组8只小鼠。分别经鼻或肌注 40μg s1
‑
e
‑
plga疫苗颗粒、40μg s1
‑
e蛋白、40μg s1
‑
e弗氏佐剂、pbs+plga 40μg和200μl pbs免疫小鼠。将各种疫苗溶解在体积为200μl的pbs中。每次免疫前采集小鼠尾部静脉血样，分离血清进行抗体检测。血清样本在
‑
20℃保存至使用。
62.间接elisa法检测免疫小鼠血清中sars
‑
cov
‑
2特异性igg抗体水平和抗体滴度和。以10μg/ml的s1或者e蛋白包被elisa板，4℃过夜。用0.05％的 pbst洗三次，1％bsa
‑
pbst封闭液封闭，室温孵育1h。0.05％pbst洗5遍，加入100μl稀释后的血清(1：1000稀释)，37℃孵育2h；pbst洗5遍，加入hrp
‑ꢀ
羊抗小鼠igg(1：100稀释)，100μl/孔，室温孵育1h；pbst洗5遍，
加入200μl 底物液，室温避光孵育20分钟显色后，加50μl终止液终止，在od 450nm读数。
63.如图5和图6所示：开始免疫时抗s1蛋白抗体和抗e蛋白抗体滴度。s1
‑
e 蛋白疫苗组(p<0.05vs pbs)、s1
‑
e
‑
弗氏佐剂组(p<0.05)均产生抗s1抗体。初始免疫后0～6周，小鼠抗s1抗体和抗e抗体呈缓慢上升趋势。第6周(第三次接种)后，小鼠抗s1和抗e抗体均表现增加趋势。结果表明，本实施例提供的s1
‑
e 疫苗免疫小鼠后，在小鼠体内诱生了高水平的sars
‑
cov
‑
2特异性血清igg，显著高于s1
‑
e蛋白组。
64.4、假病毒中和试验
65.将1.5
×
104hek
‑
293t/ace2细胞/well分离到培养板中，在37℃、5％co2恒温培养箱中培养6h。血清在56℃水浴中灭活30min，用10％dmem连续稀释样品血清。每个稀释度，60μl血清样本与相同的假病毒混合稀释moi＝0.2和孵化的混合物在室温下60分钟。100μl孵化血清和假病毒添加到96孔细胞培养板,并设置
‑
控制和空白的控制。72h后在荧光显微镜下观察细胞。采用 reed
‑
muench法计算每个小鼠血清样品的ec50中和效价。
66.如图7所示，在第10周血清稀释10000倍仍然能检测到中和抗体。结果表明本实施例提供的s1
‑
e疫苗产生了高滴度的中和抗体。
67.5、细胞因子检测
68.balb/c小鼠脾细胞经70μm细胞滤器推脾，红细胞裂解，多次冲洗制备脾细胞。在37℃下，加入或不加入覆盖s1
‑
e蛋白的15
‑
氨基酸重叠肽，并加入 bd golgistoptm和bd golgiplugtm以阻断细胞因子分泌，刺激细胞6h。在培养皿中刺激后，用fitc hamster anti
‑
mouse cd3e(克隆145
‑
2c11,1:200稀释)、 apc rat an
‑
ti
‑
mouse cd4(克隆rm4
‑
5，1:200稀释)和pe rat anti
‑
mouse cd8a (克隆53
‑
6.7，1:200稀释)混合抗体对脾细胞进行洗涤和染色。用pbs洗一次后，细胞被cytofix/cytoperm(bd biosciences)固定和渗透，用perm/wash缓冲液洗涤(bd biosciences，usa)，并用percp
‑
cytm5.5大鼠抗小鼠il
‑
2(克隆 jes6
‑
5h4,1:200稀释)和percp
‑
cytm5.5大鼠抗小鼠tnf(克隆mp6
‑
xt22,1:200 稀释)染色。用perm/wash缓冲液和pbs依次洗涤细胞，并在pbs中重悬。每个样本至少收集了10000个事件。cd8
+
和cd4
+
t细胞依次由单细胞(fsc
‑
a vsfsc
‑
h)、淋巴细胞(fsc
‑
a vs ssc
‑
a)和活cd3
+
t细胞(cd3
+
vs近红外
‑
)门控，检测结果定义为细胞因子阳性细胞占cd8
+
或cd4
+
t细胞的百分比。
69.如图8所示，在4周的独立小鼠s1
‑
e、s1
‑
e
‑
plga、s1
‑
e弗氏佐剂三组中，脾脏细胞cd4
+
t细胞、cd8
+
t细胞有tnf
‑
α和il
‑
2显著变化。与pbs
‑
plga 组相比，其他三组tnf
‑
α+cd8
+
t细胞和cd4
+
t细胞(％)显著升高(p<0.001)。与pbs
‑
plga组相比，其余三组il
‑2+
cd8
+
t细胞和cd4
+
t细胞显著升高(％)(p ≤0.001)。结果表明，在本发明的s1
‑
e疫苗的刺激下，小鼠产生了强烈的细胞免疫应答。
70.综上所述，本实施例制备的s1
‑
e疫苗能有效抑制新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2 的生长，该疫苗能够有效预防感染新型冠状病毒(sars
‑
cov
‑
2)，还可应用于药物组合。
71.在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
72.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
73.74.75.76.77.78.79.80.81.82.