一种铂类药物脂质衍生物及其应用

1.本发明属于医药技术领域，涉及一种铂类药物脂质衍生物及其应用。


背景技术：

2.化疗是癌症治疗中最常用的策略之一，尤其是对于那些不能通过手术切除的和转移扩散的肿瘤。但大部分化疗药是细胞毒性药物，且存在稳定性差、治疗窗窄和药动学性质不佳等缺点。且现有的制剂策略递送效率低，肿瘤靶向性较差，导致化疗临床效果不佳且毒副作用严重。例如，奥沙利铂(oxaliplatin，oxa)作为一线化疗药在临床上被广泛用于治疗结直肠癌和卵巢癌等。但是，由于奥沙利铂非特异性的细胞毒作用，市售的溶液剂会引起严重的毒副作用，给药后周围神经病变的发生率很高，极大地限制了其在临床上的应用。因此，如何改善化疗药物的不良性质并提高递送效率是临床上亟待解决的难题。
3.近年来，化学结构修饰和纳米技术在药物传递领域的广泛应用极大地丰富了抗肿瘤药物的递送策略，且已经有多个制剂成功上市，如伊立替康脂质体，紫杉醇白蛋白纳米粒，阿霉素脂质体等。衍生化策略可以通过巧妙的结构修饰来改善化疗药物的不良性质，包括稳定性差，毒副作用大等。此外，基于纳米技术构建新型的纳米给药系统可以显著改善药物的药动学性质，延长化疗药物的体内循环时间，并能够通过主动靶向或被动靶向提高药物在肿瘤部位的蓄积，增加药物的细胞摄取，控制药物的释放速度，进而提高抗肿瘤效果，降低毒副作用。
4.在此基础上，基于小分子药物衍生化的自稳定型纳米药物递送系统将衍生化策略和纳米技术的优点结合到一起，以其载药量高、稳定性好、毒副作用低等优势，已成为近几年化疗药物递送研究的热点。
5.自组装纳米颗粒，如聚合物胶束、脂质纳米颗粒或纳米乳，被广泛用作难溶性药物的递送载体。这些能实现药物控释的载体通常将化疗药物包裹在或吸附在颗粒的疏水核心，然而，大多自组装结构载体都会和内源性成分发生相互作用，存在药物负载稳定性差等问题，例如血液中的许多蛋白成分能与药物竞争性结合，导致纳米载体体内的高泄漏率和低载药量。因此，深入了解体内的“药物-载体”结合稳定性和解离动力学有助于提高药物递送效率，从而提高治疗效果。
6.自稳定型脂质衍生物能够自组装成纳米粒，其化学结构对纳米粒组装稳定性、体内命运甚至抗肿瘤效果都有决定性影响。自稳定型纳米粒与蛋白质、磷脂双层、核酸和细胞器等内源性生物成分之间的相互作用，影响着机体对药物的处置情况。通过合理设计衍生物的化学结构，使其组装成稳定性良好、表面性质(粒径、电位、形状等)俱佳的纳米制剂，对药物递送效率的提高和药效发挥具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明所解决的技术问题是提供一种四价铂-脂质衍生物，并将该衍生物用于自稳定型纳米粒的制备，从而实现高载药量、高稳定性、低毒性和肿瘤细胞内特异性快速释药
的应用。
8.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
9.一种铂类药物脂质衍生物，衍生物由铂类药物和疏水性脂质长链构成如通式1或通式2所示，
[0010][0011]
通式1中，a为铂类药物，铂类药物中
○
为非离去基团，方块为离去基团； x为s，s-s，se，se-se；r为疏水性脂质长链；n＝1-3的整数；
[0012][0013]
通式2中，a为铂类药物，铂类药物中
○
为非离去基团，方块为离去基团；r为疏水性脂质长链；n1＝1-4的整数。
[0014]
所述通式1和通式1中铂类药物为顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂或环硫铂；r为c18-c36的脂肪醇。
[0015]
所述脂肪醇可为直链或支链的疏水性脂质长链，例如正十八醇，油醇，亚麻醇，正十九醇，正二十醇，正二十二醇，二十二碳六烯醇，正二十四醇等，优选为正十八醇、正二十二醇、正二十四醇。
[0016]
所述的自稳定脂质衍生物疏水脂质碳链越长，则其形成的自稳定型纳米粒的粒径越小，胶体稳定性越好，抗肿瘤药效越强。
[0017]
铂类药物脂质衍生物的制备方法，首先将二价铂类化合物氧化为双侧轴向羟基的四价铂，然后使用酸酐使四价铂的双侧羟基形成酯，得到含双侧羧基的中间产物，最后羧基再与脂肪醇成酯得到通式1或通式2所示的双侧脂质长链连接的四价铂衍生物。
[0018]
将二酸溶解于乙酸酐中，室温下搅拌1-2小时，所得产物溶于n,n-二甲基甲酰胺中，加入氧化后的四价羟基铂和4-二甲氨基吡啶，30-45℃下搅拌12-48小时，得到中间产物；将中间产物和1-乙基-3(3-二甲基丙胺) 碳二亚胺溶于n,n-二甲基甲酰胺冰浴搅拌1-2小时，然后加入4-二甲氨基吡啶和脂肪醇，室温下搅拌12-48小时得到终产物，上述所有反应全程在氮气保护下避光进行，即得到通式1或通式2所示衍生物；
[0019]
其中，二酸酐与氧化后的四价羟基铂投料的摩尔比值为0.6～1.5，氧化后的四价羟基铂和4-二甲氨基吡啶的摩尔比值为0.5～4；中间产物和1
‑ꢀ
乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺摩尔比值为1～4；中间产物和4-二甲氨基吡啶摩尔比值为0.5～4；4-二甲氨基吡啶和脂肪醇摩尔比值为0.5～4。
[0020]
其中，二酸为丙二酸，丁二酸，戊二酸，己二酸，，2,2'-硫代二乙酸， 2,2'-硒代二乙酸，2,2'-二硫代二乙酸，2,2'-二硒代二乙酸，3,3'-二硫代二丙酸或3,3'-二硒代二丙酸。
[0021]
进一步具体为：
[0022]
本发明选择卡铂和不同链长脂肪醇作为模型药物，将卡铂氧化后通过二硫键分别与正己醇(a)、正十二醇(b)和正十八醇(c)相连制备自稳定脂质衍生物，其结构式如下式所示：
[0023][0024]
具体地，本发明提供了系列卡铂-正十八醇衍生物的制备方法：
[0025]
将己二酸或2,2'-二硫代二乙酸溶解于乙酸酐中，室温下搅拌1-2小时，所得产物溶于n,n-二甲基甲酰胺中，加入氧化后的四价羟基卡铂和4-二甲氨基吡啶，35℃下搅拌12-48小时，得到中间产物。将中间产物和1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺溶于n,n-二甲基甲酰胺冰浴搅拌1-2小时，然后加入4-二甲氨基吡啶和正十八醇，室温下搅拌12-48小时得到终产物，上述所有反应全程在氮气保护下避光进行。
[0026]
一种述衍生物的应用，所述通式1或通式2所示衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0027]
一种自稳定脂质衍生物纳米粒，纳米粒的组成包括权利要求1所示自稳定脂质衍生物和稳定剂；脂质衍生物与稳定剂的质量比例为99:1～ 70:30。
[0028]
所述稳定剂为药学中常用的表面活性剂和/或空间稳定剂中的一种或几种。
[0029]
所述稳定剂为dspe-peg
2000
等药学中常用的表面活性剂或空间稳定剂。
[0030]
自稳定脂质衍生物纳米粒的制备方法，将所述脂质衍生物与稳定剂溶解分散到有机溶剂中得分散体系，所得分散体系缓慢逐滴滴加到水中或使用微流控的交叉流微混合等方法，使衍生物组装成稳定的纳米粒，而后去除有机溶剂，即得自稳定脂质衍生物纳米粒。
[0031]
进一步的说，将的脂质衍生物与稳定剂溶解分散到有机溶剂中，将该有机溶剂溶液缓慢逐滴滴加到水中或使用超声、交叉流微混合等方法，使衍生物稳定地组装成纳米粒，最后，采用减压蒸发、透析或超滤等方法除去纳米粒中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
[0032]
一种药物组合物，含所述的自稳定脂质衍生物。
[0033]
一种应用，所述自稳定脂质衍生物纳米粒或所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0034]
所述抗肿瘤药物的给药方式为注射给药、口服给药或局部给药。
[0035]
本发明的优势在于：
[0036]
本发明合成脂质衍生物由不同疏水脂质长链长度、不同连接键以及不同侧链位置
设计所得，并利用其制备自稳定型纳米粒，使得所得纳米粒组装能力、稳定性、还原响应性、细胞毒性、药动学、组织分布和药效学的影响均得以提升；具体为：
[0037]
1)本发明合成的系列脂质衍生物，合成方法简单易行；
[0038]
2)利用本发明所得脂质衍生物制备均匀的衍生物自稳定型纳米粒，制备方法简单易行，稳定性好，稳定剂使用量少，载药量高。
[0039]
3)本发明由不同脂质碳链长度所获得的脂质衍生物，随碳链延长，脂质衍生物的纳米组装能力增强，脂质衍生物自稳定纳米粒的粒径变小，稳定性增加，细胞毒性更强，体内长循环效果更好，在肿瘤部位的药物分布更多，显著提高了纳米粒的抗肿瘤疗效，对衍生物的合理结构设计和活性药物的高效递送具有重要意义，在疾病治疗领域前景广阔。
附图说明
[0040]
图1为本发明实例1的二硫键桥连卡铂-正己醇衍生物(css6)的1hmr 谱图和质谱图。
[0041]
图2为本发明实例2的二硫键桥连卡铂-正十二醇衍生物(css12)的1hmr谱图和质谱图。
[0042]
图3为本发明实例3的二硫键桥连卡铂-正十八醇衍生物(css18)的1hmr谱图和质谱图。
[0043]
图4为本发明实例4的己二酸酯键桥连卡铂-正十八醇衍生物(c-18) 的1hmr谱图和质谱图。
[0044]
图5为本发明实例5的二硫键桥连单侧卡铂-正十八醇衍生物(mcss18) 的1hmr谱图和质谱图。
[0045]
图6为本发明实例6的卡铂-脂质衍生物的合成路线，dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的外观图透射电镜图、粒径分布图和丁达尔现象外观图，其中a为卡铂-脂质衍生物的合成路线图、b为dspe-peg修饰的卡铂
ꢀ‑
脂质衍生物纳米粒的透射电镜图、c为dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的外观图、d为dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的粒径分布图、e为dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的外观图、f为dspe-peg 修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的丁达尔现象图。
[0046]
图7为本发明实例7的dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的粒径-储存时间图，其中a为pbs 7.4中dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的粒径-储存时间图、b为10％fbs中dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的粒径-储存时间图。
[0047]
图8为本发明实例8的dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的药物释放图，其中a为0mm gsh中dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的药物释放图、b为1mm gsh中dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的药物释放图、c为10mm gsh中dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的药物释放图。
[0048]
图9为本发明实例10的dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的血药浓度-时间曲线图和药物体内组织分布图，其中a为dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的dna-pt加合物含量图、b为dspe-peg修饰的卡铂
‑ꢀ
脂质衍生物纳米粒的血药浓度-时间曲线图、c为4小时dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的血药浓度-时间曲线图、d为12小时dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的血药浓度-时间曲线图。
[0049]
图10为本发明实例11的dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的体内抗肿瘤药效图，其中a为每只4t1荷瘤小鼠的dspe-peg修饰的卡铂
‑ꢀ
脂质衍生物纳米粒的抗肿瘤药效肿瘤体积曲线图、b为4t1荷瘤小鼠的 dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的抗肿瘤药效肿瘤体积曲线图、c 为4t1荷瘤小鼠的dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的抗肿瘤药效肿瘤重量曲线图、d为给药后4t1荷瘤小鼠的体重变化曲线图。
[0050]
图11为本发明实例11的dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的体内抗肿瘤药效图，其中a为每只b16-f10荷瘤小鼠的dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的抗肿瘤药效肿瘤体积曲线图、b为b16-f10荷瘤小鼠的dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的抗肿瘤药效肿瘤体积曲线图、c为b16-f10荷瘤小鼠的dspe-peg修饰的卡铂-脂质衍生物纳米粒的抗肿瘤药效肿瘤重量曲线图、d为给药后b16-f10荷瘤小鼠的体重变化曲线图。
具体实施方式
[0051]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
[0052]
所述衍生物为自稳定型纳米组装材料，铂类活性药物基团与疏水性的脂质长链通过不同连接键桥连，形成小分子的四价铂-脂质衍生物。在少量稳定剂的辅助下，该衍生物能在水溶液中自发组装成纳米粒，实现给药后体内的长循环。随衍生物疏水碳链的延长，自稳定型纳米粒的组装效率提高，粒径更小，稳定性提高，药物的抗肿瘤药效更强。
[0053]
实施例1：二硫键桥连卡铂-正己醇衍生物(css6)的合成
[0054]
将600mg卡铂溶解于20ml去离子水中，溶液澄清后向其中加入2ml 30％h2o2并避光在氮气保护下50℃持续搅拌6小时。将反应溶液置于4℃过夜重结晶，6000转15分钟离心收集沉淀，依次用-20℃预冷的乙醇和乙醚各洗涤3次，干燥后得到氧化后的四价双羟基卡铂。将5mmol 2,2'-二硫代二乙酸溶解在8ml醋酸酐中，25℃下搅拌2小时。将6ml甲苯加入反应溶液中混合均匀，减压蒸馏除去甲苯和未反应的醋酸酐，此过程重复三次，得到产物2,2'-二硫代二乙酸酐。将0.5mmol四价羟基卡铂分散于20 ml dmf中，35℃搅拌下加入1.2mmol 2,2'-二硫代二乙酸酐和0.2mmol 4-二甲氨基吡啶，然后持续反应12小时。然后加入1mmol 1-乙基-3(3
‑ꢀ
二甲基丙胺)碳二亚胺活化20分钟，将1.5mmol正己醇加入反应混合溶液中，搅拌过夜。过滤所得溶液，使用油泵减压蒸发至约2ml，并加入50 ml乙醚收集沉淀，继续用乙醚洗涤三次，并在真空下干燥得到目标产物。上述反应全程都在氮气保护下避光进行。
[0055]
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例中衍生物的结构，结果及峰归属如图1所示，核磁共振选用的溶剂为氘代dmso，波谱解析结果如下：
[0056]
esi-ms(m/z):[c
26h46
n2o
12
pts4]-[m-h]-＝901.02(calculated m:901.99)
[0057]
实施例2：二硫键桥连卡铂-正十二醇衍生物(css12)的合成
[0058]
将600mg卡铂溶解于20ml去离子水中，溶液澄清后向其中加入2ml 30％h2o2并避光在氮气保护下50℃持续搅拌6小时。将反应溶液置于4℃过夜重结晶，6000转15分钟离心收集沉淀，依次用-20℃预冷的乙醇和乙醚各洗涤3次，干燥后得到氧化后的四价羟基卡铂。将5mmol 2,2'-二硫代二乙酸溶解在8ml醋酸酐中，25℃下搅拌2小时。将6ml甲苯加入反应溶液中混合均匀，减压蒸馏除去甲苯和未反应的醋酸酐，此过程重复三次，得到产物2,2'-二硫代二乙酸酐。将0.5mmol四价羟基卡铂分散于 20ml dmf中，35℃搅拌下加入1.2mmol 2,
2'-二硫代二乙酸酐和0.2mmol 4-二甲氨基吡啶，然后持续反应12小时。然后加入1mmol 1-乙基-3(3
‑ꢀ
二甲基丙胺)碳二亚胺活化20分钟，将1.5mmol正十二醇加入反应混合溶液中，搅拌过夜。过滤所得溶液，使用油泵减压蒸发至约2ml，并加入50 ml乙醚收集沉淀，继续用乙醚洗涤三次，并在真空下干燥得到目标产物。上述反应全程都在氮气保护下避光进行。
[0059]
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例中衍生物的结构,结果及峰归属如图2所示，核磁共振选用的溶剂为氘代dmso,波谱解析结果如下：
[0060]
esi-ms(m/z):[c
38h70
n2o
12
pts4]-[m-h]-＝1069.25(calculated m:
[0061]
1070.31)
[0062]
实施例3：二硫键桥连卡铂-正十八醇衍生物(css18)的合成
[0063]
将600mg卡铂溶解于20ml去离子水中，溶液澄清后向其中加入2ml 30％h2o2并避光在氮气保护下50℃持续搅拌6小时。将反应溶液置于4℃过夜重结晶，6000转15分钟离心收集沉淀，依次用-20℃预冷的乙醇和乙醚各洗涤3次，干燥后得到氧化后的四价羟基卡铂。将5mmol 2,2'-二硫代二乙酸溶解在8ml醋酸酐中，25℃下搅拌2小时。将6ml甲苯加入反应溶液中混合均匀，减压蒸馏除去甲苯和未反应的醋酸酐，此过程重复三次，得到产物2,2'-二硫代二乙酸酐。将0.5mmol四价羟基卡铂分散于 20ml dmf中，35℃搅拌下加入1.2mmol 2,2'-二硫代二乙酸酐和0.2mmol 4-二甲氨基吡啶，然后持续反应12小时。然后加入1mmol 1-乙基-3(3
‑ꢀ
二甲基丙胺)碳二亚胺活化20分钟，将1.5mmol正十八醇加入反应混合溶液中，搅拌过夜。过滤所得溶液，使用油泵减压蒸发至约2ml，并加入50 ml乙醚收集沉淀，继续用乙醚洗涤三次，并在真空下干燥得到目标产物。上述反应全程都在氮气保护下避光进行。
[0064]
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例中衍生物的结构,结果及峰归属如图3所示，核磁共振选用的溶剂为氘代dmso,波谱解析结果如下：
[0065]
esi-ms(m/z):[c
50h94
n2o
12
pts4]-[m-h]-＝1237.5(calculated m:1238.63)
[0066]
实施例4：己二酸酯键桥连卡铂-正十八醇衍生物(c-18)的合成
[0067]
将600mg卡铂溶解于20ml去离子水中，溶液澄清后向其中加入2ml 30％h2o2并避光在氮气保护下50℃持续搅拌6小时。将反应溶液置于4℃过夜重结晶，6000转15分钟离心收集沉淀，依次用-20℃预冷的乙醇和乙醚各洗涤3次，干燥后得到氧化后的四价羟基卡铂。将5mmol己二乙酸溶解在8ml醋酸酐中，25℃下搅拌2小时。将6ml甲苯加入反应溶液中混合均匀，减压蒸馏除去甲苯和未反应的醋酸酐，此过程重复三次，得到产物己二酸酐。将0.5mmol四价羟基卡铂分散于20ml dmf中，35℃搅拌下加入1.2mmol 2,2'-二硫代二乙酸酐和0.2mmol 4-二甲氨基吡啶，然后持续反应12小时。然后加入1mmol 1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺活化20分钟，将1.5mmol正十八醇加入反应混合溶液中，搅拌过夜。过滤所得溶液，使用油泵减压蒸发至约2ml，并加入50ml乙醚收集沉淀，继续用乙醚洗涤三次，并在真空下干燥得到目标产物。上述反应全程都在氮气保护下避光进行。
[0068]
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例中衍生物的结构,结果及峰归属如图4所示，核磁共振选用的溶剂为氘代dmso,波谱解析结果如下：
[0069]
esi-ms(m/z):[c
54h102
n2o
12
pts4]-[m-h]-＝1165.42(calculated m:
[0070]
1166.47)
[0071]
实施例5：二硫键桥连单侧卡铂-正十八醇衍生物(mcss18)的合成
[0072]
将600mg卡铂溶解于20ml去离子水中，溶液澄清后向其中加入2ml 30％h2o2并避光
在氮气保护下50℃持续搅拌6小时。将反应溶液置于4℃过夜重结晶，6000转15分钟离心收集沉淀，依次用-20℃预冷的乙醇和乙醚各洗涤3次，干燥后得到氧化后的四价羟基卡铂。将5mmol 2,2'-二硫代二乙酸溶解在8ml醋酸酐中，25℃下搅拌2小时。将6ml甲苯加入反应溶液中混合均匀，减压蒸馏除去甲苯和未反应的醋酸酐，此过程重复三次，得到产物2,2'-二硫代二乙酸酐。将0.5mmol四价羟基卡铂分散于 20ml dmf中，35℃搅拌下加入0.6mmol 2,2'-二硫代二乙酸酐和0.2mmol 4-二甲氨基吡啶，然后持续反应12小时。然后加入1mmol 1-乙基-3(3
‑ꢀ
二甲基丙胺)碳二亚胺活化20分钟，将0.8mmol正十八醇加入反应混合溶液中，搅拌过夜。过滤所得溶液，使用油泵减压蒸发至约2ml，并加入50 ml乙醚收集沉淀，继续用乙醚洗涤三次，并在真空下干燥得到目标产物。上述反应全程都在氮气保护下避光进行。
[0073]
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例中衍生物的结构,结果及峰归属如图5所示，核磁共振选用的溶剂为氘代dmso,波谱解析结果如下：
[0074]
esi-ms(m/z):[c
38h70
n2o
12
pts4]-[m-h]-＝820.89(calculated m:
[0075]
821.94)
[0076]
实施例6：dspe-peg修饰的脂质衍生物自稳定型纳米粒的制备
[0077]
精密称取7mg dspe-peg
2000
溶解于1ml无水乙醇中，配制成7mg/ml 的储备液备用。精密称取4mg上述各实施例制备获得衍生物分别溶解分散于0.2ml dspe-peg
2000
储备液中，用移液管将混合溶液逐滴滴加至2ml去离子水中，维持搅拌转速为600rpm，搅拌15min后得到脂质衍生物自稳定纳米粒。之后在30℃下减压旋转蒸发除去所有纳米粒中残余的乙醇。
[0078]
通过透射电子显微镜测定实施例6中制备的脂质衍生物自稳定纳米粒的粒径和形态，结果如图6b，透射电镜图表明纳米粒为均一的球形。如表 1和表2所示，系列脂质衍生物纳米粒的粒径和多分散系数呈现出与衍生物的脂质链长明显的相关性：css18≈c-18《css12《css6，即链长越长，纳米粒的粒径越小，粒径分布越均匀。同时对于相同碳链长度的卡铂-脂质衍生物，双侧碳链枝接的衍生物比单侧粒径更小，粒径分布更均匀(css18《mcss18)。当纳米粒药物浓度提高时(1mgpt/ml和1.5mg pt/ml)，上述相关性更明显。css6和mcss18纳米粒在1.5mg pt/ml浓度下制备过程中出现明显沉淀，而css18纳米粒在浓度高达6mg pt/ml时依然呈现均匀透明的外观，如图6c所示。在图6e中，除了瓶底产生沉淀的css6纳米粒外，所有纳米粒(1.5 mg pt/ml)在激光束下均观察到丁达尔效应。上述结果说明，短碳链的脂质衍生物css6在高浓度下组装稳定性很差。mcss18纳米粒上清液中可见微弱的光束，但仍有沉淀存在，说明其稳定性较差，组装能力较弱。在所有纳米颗粒中，css18具有最佳的物理化学性质，甚至稳定在1.5mg pt/ml，具有淡蓝色和清澈的外观(图6c)。这些结果表明脂肪族链的长度和位置对卡铂-脂质衍生物的自稳定组装方式起着至关重要的作用。与单侧碳链和短侧链的衍生物相比，双侧和长碳链的衍生物具有更好的组装性能。
[0079]
表1.dspe-peg修饰的低浓度(0.5mg pt/ml)卡铂-脂质衍生物自稳定纳米粒的粒径、粒径分布和表面电位
[0080]
pt(iv)npssize(nm)pdizeta(mv)css6150.4
±
21.530.409
±
0.030-19.1
±
1.501css12102.4
±
3.1080.113
±
0.033-25.4
±
1.992css1884.39
±
1.0540.132
±
0.022-22.5
±
1.768c-1887.53
±
4.8050.193
±
0.032-29.7
±
2.326
mcss18117.3
±
4.5130.290
±
0.024-14.6
±
1.147
[0081]
表2.dspe-peg修饰的高浓度(1mg pt/ml、1.5mg pt/ml)卡铂-脂质衍生物自稳定纳米粒的粒径和粒径分布
[0082][0083]
实施例7：dspe-peg修饰的脂质衍生物自稳定型纳米粒的胶体稳定性试验
[0084]
将实施例6中制备的各dspe-peg修饰的脂质衍生物自稳定型纳米粒取出1ml，加入到20ml磷酸盐缓冲液(pbs，ph为7.4)(图7a)中37℃孵育7天或加入到含有10％fbs的磷酸盐缓冲液(pbs，ph为7.4)(图7b) 中37℃的条件下孵育24小时，并且在预定的时间点通过动态光散射法测定其粒径变化(参见图7)。由图7a和b结果显示，除css6 nps外其余纳米粒在10mm pbs 7.4中的粒径和pdi保持稳定一周，css6 nps的粒径和pdi 显著增加，这表明由短链脂质衍生物构成的纳米粒稳定性较差。在10％fbs 中，长链脂质衍生物纳米粒(c-18、css12和css18 nps)在24小时内保持稳定，外观和大小无明显变化。
[0085]
在体外释放试验中使用0mm，1mm和10mm gsh的磷酸盐缓冲液(pbs， ph为7.4)为释放介质分别来模拟非还原环境，血液循环中的还原环境和肿瘤部位的还原环境。分别将含有1ml游离卡铂溶液(car)和五种脂质衍生物纳米粒(css6，css12，css18，c-18和mcss18纳米粒)的透析袋(截留分子量1kd)浸入20ml相应的释放介质中，置于37℃下并在100rpm 的速度下恒温恒速震荡。在时间点1、2、4、8、12和24小时分别取1ml 游离卡铂溶液和五种脂质衍生物纳米粒组的释放介质，测定释放的药物含量(参见图8)。
[0086]
如图8a所示，在0mm gsh缓冲液中，各组纳米粒的累积药物释放量均小于10％。如图8b所示，在1mm gsh释放缓冲液中，含二硫键的css6、 css12、css18和mcss18纳米粒释药速度略高于c-18纳米粒。而如图8c所示，在10mm gsh的释放介质中，脂质衍生物自稳定纳米粒(css6、css12、 css18和mcss18纳米粒)在4小时药物释放量大于70％，24小时药物释放超过80％，在任一时间点的释药量都明显超过了非二硫键的脂质衍生物 c-18纳米粒。说明含二硫键的卡铂-脂质衍生物纳米粒比非二硫键插入的脂质衍生物纳米粒对gsh更敏感，响应性更强。根据前述纳米粒表征和稳定性实验结果，最长碳链的脂质衍生物css18具有最优的自稳定组装行为和良好的胶体稳定性，对gsh的响应性与其它二硫键衍生物基本相当。这说明通过化学结构调整的策略来增强脂质衍生物纳米粒的组装和稳定性并不会影响其对细胞内gsh的特异响应性。
[0087]
实施例9.dspe-peg修饰的脂质衍生物自稳定型纳米粒的细胞毒性
[0088]
采用mtt法考察dspe-peg修饰的脂质衍生物自稳定型纳米粒对三种肿瘤细胞，小鼠前列腺癌(rm-1)细胞，小鼠乳腺癌(4t1)细胞、人卵巢癌细胞 (a2780)和人正常肝(l02)细胞的毒性。首先将形态良好的细胞消化，使用细胞培养基稀释至5000cells/ml细胞吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100μl，置培养箱中孵育24小时使其贴壁。待细胞贴壁后加入实施例 6中制备的脂质衍生物纳米粒。受试溶液每孔加入100μl，每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药液，单一补加100μl培养液，置培养箱中和细胞共同孵育。于加药后48小时，将96孔板取出，每孔加入5mg/mlmtt溶液20μl，置培养箱中孵育4小时后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μl dmso于振荡器上振荡10分钟以溶解蓝紫色结晶物。设定a1孔(只含有200μl dmso)为调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。
[0089]
细胞毒结果如表3所示。css6纳米粒对所有细胞系的细胞毒作用最弱，其活性甚至低于不含二硫键的衍生物纳米粒c-18nps。在所有自稳定纳米粒中，css18纳米颗粒在三种癌细胞系中表现出最强的细胞毒性，甚至与卡铂溶液的ic
50
相近。在l-02细胞中培养48 小时后，所有衍生物纳米粒显示出比游离卡铂更弱的细胞毒性，这说明gsh响应型的脂质衍生物策略有望实现肿瘤的选择性杀伤和正常组织的低毒副作用。
[0090]
表3.不同脂质衍生物溶液和纳米粒处理48小时后4t1，b16,a2780和 l-02细胞的ic
50
值(μm)
[0091]
sample4t1b16a2780l-02car sol24.372.242206.547.28css6 nps818.1155.6》1000684.7css12nps34.371.88235.6276.95css18nps10.622.6248.875191.2c-18nps115.947.28403.2439.4mcss18nps62.4228.62186.5321.4
[0092]
实施例10.dspe-peg修饰的脂质衍生物自稳定纳米粒的药物动力学和组织分布研究
[0093]
取体重在200-250g之间的sd大鼠，随机分组，给药前禁食12 小时，自由饮水。分别静脉注射卡铂溶液以及实施例6中制备的 dspe-peg修饰的脂质衍生物自稳定型纳米粒。给药剂量均为3mg/kg。于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。通过电感耦合等离子质谱仪测定血浆中的药物浓度(参见图9和表4)。
[0094]
药动学研究结果如图9a-b和表4所示，css18和c-18纳米粒的auc提高最明显，为36.11mg
·h·
l-1，比溶液剂提高约8倍。 css6纳米粒在血浆中快速消除，auc(2.2倍)和t
1/2
略有增加。脂质衍生物纳米粒的auc排序为：css18≈c-18》css12≈mcss18》 css6，表明纳米粒的长循环特性与衍生物的碳链长度相关，即碳链越长，纳米粒越稳定，体循环时间越长。给药后4小时和12小时的体内分布实验结果分别如图9c和d所示，脂质衍生物纳米粒的瘤内蓄积量排序为：css18≈c-18》css12》mcss18》css6，表明纳米粒的长循环特性与衍生物的碳链长度相关，即碳链越长，纳米粒越稳定，体循环时间越长，在肿瘤部位的蓄积也越多。
[0095]
表4.脂质衍生物自稳定纳米粒的药动学参数
[0096]
sampleauc
0-12ha)
t
1/2b)
cl
c)vd)
car4.236
±
2.1434.635
±
4.6021.669
±
1.28115.83
±
2.633css6 nps9.418
±
5.2904.506
±
3.9851.016
±
1.79414.75
±
3.093css12nps19.63
±
5.1364.426
±
4.6300.999
±
1.80114.62
±
3.173css18nps36.11
±
18.533.669
±
4.2000.837
±
1.87913.88
±
3.513c-18nps33.99
±
21.553.802
±
4.1200.847
±
1.87513.93
±
3.493mcss18nps18.84
±
10.344.632
±
4.0550.892
±
1.85314.26
±
3.333
[0097]
实施例11.dspe-peg修饰的脂质衍生物自稳定纳米粒的药效学研究
[0098]
将4t1细胞悬液即接种于雌性balb/c小鼠右侧背部侧皮下。待肿瘤体积生长至150mm3时，将荷瘤小鼠随机分为7组，每组5只，分别为5％葡萄糖对照组,奥沙利铂溶液组，css6纳米粒组，css12 纳米粒组，css18纳米粒组，c-18纳米粒组，mcss18纳米粒组。隔天给药次，连续给药4次。b16-f10荷瘤小鼠模型的建立与上述4t1 模型一致。
[0099]
由图10和图11肿瘤生长抑制的结果，从两种类型的肿瘤模型小鼠的肿瘤体积、重量来表征，图10a和图11a图是每只小鼠的瘤体积，图 10b图11b图是平均值，具体图10a-d图11a-d中，5％葡萄糖注射液作为对照组肿瘤体积最大，第14天高达1200mm3，css6纳米粒和c-18 纳米粒肿瘤生长抑制作用有限，可能是由于较差的稳定性和药物的延迟释放。css18,css12和mcss18纳米粒组显示出明显的肿瘤抑制作用(第14天肿瘤体积分别为400，700和900mm3)，css18纳米粒处理后的荷瘤小鼠肿瘤生长速度最低，第14天肿瘤体积最小。 b16-f10荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制规律与4t1荷瘤小鼠基本一致，衍生物纳米粒的在体抗肿瘤效果与脂质衍生物碳链长度的关系为： css18》css12》mcss18(相当于“css9”)》css6，表明卡铂-脂质衍生物的碳链越长，其自稳定纳米粒的抗肿瘤效果越强。