没食子酸丙酯增效抗猪链球菌抗生素的新用途

1.本发明涉及一种抗猪链球菌的药物组合物，属于动物细菌病的防治领域。


背景技术：

2.猪链球菌(streptococcus suis，ss)是一种猪常见的恶性细菌病，会引起断奶仔猪关节炎、脑膜炎和猝死。ss也可引起人畜共患病，造成人的脑膜炎、败血症、心内膜炎甚至猝死。临床猪链球菌感染常用抗猪链球菌抗生素，如β
‑
内酰胺类、磺胺类，氨基糖苷类等抗菌药物进行治疗。但就目前畜牧兽医临床细菌性感染的具体情况来看，当前的疾病发生不再是由单一的细菌引起，多是混合感染导致的复杂的病理变化，且随着细菌耐药性的严重，针对链球菌引起的原发及混合感染，兽医临床面临着抗生素敏感性降低，且无新药可用的境况。因此除了合理使用抗菌药物及寻找新型抗菌药物的应对策略以外，通过联合用药来恢复已有抗菌药物对细菌的抗菌活性是另一项重要应对策略。
3.链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素。属于氨基糖甙碱性化合物，链霉素的反复使用，细菌极易产生耐药性，且一旦产生，停药后不易恢复。因此，临床上常采用联合用药，以减少或延缓耐药性的产生。
4.庆大霉素(gentamicin，正泰霉素(gentamycin))系从放线菌科单孢子属发酵培养液中提得的抗菌化合物，是常用的氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌引起的感染。庆大霉素常规的用法用量为肌内注射：一次量，家畜2
‑
4mg/kg，犬、猫3
‑
5mg/kg，家禽5
‑
7.5mg/kg。每日2次，连用2
‑
3天；静脉滴注(严重感染)：用量同肌内注射。内服：一次量，驹、犊、羔羊、仔猪5
‑
10mg/kg。每日2次，连用2
‑
3天。(陈杖榴.兽医药理学[m].中国农业出版社，2009.)。没食子酸(gallic acid)亦称五倍子酸或棓酸，是一种有机酸，可见于五倍子、漆树、茶等植物中。具有抗菌抗病毒作用：体外对金黄色葡萄球菌、八叠球菌、α
‑
型链球菌、奈瑟氏球菌、绿脓杆菌、弗氏痢疾杆菌、伤寒杆菌hd、副伤寒杆菌a等有抑制作用，其抑菌浓度为5mg/ml。体外，在3％的浓度下对17种真菌有抑菌作用，对流感病毒亦有一定抑制作用。
[0005]
以没食子酸为原料可以合成没食子酸酯类化合物，没食子酸的烷基酯根据烷基碳原子个数可分为低级酯(如甲酯、乙酯、丙酯等)和高级酯(如辛酯、月桂酯、十八碳醇酯等)，这些酯类化合物都是性能优良的食品抗氧化剂。或用于制造噻嗪染料、恶嗪染料、药物等。
[0006]
没食子酸丙酯(propyl gallate，pg)是没食子酸的衍生物，是食品和农业组织(fao)/世界卫生组织(who)两大组织认可合成食品抗氧化剂之一，它具有杀菌、抑菌、防腐作用(李敢.没食子酸丙酯的合成研究进展[j].现代盐化工，2016，000(001):25
‑
26.)。没食子酸丙酯ld50为862.2982mg/kg，大鼠皮下注射致死量为4g/kg(刘宁.抗氧化纤维素酯的制备及其性能研究.东北林业大学，2009.)。
[0007]
没食子酸丙酯可以口服，也可以其他方式给药。通过对口服30mg/kg的没食子酸丙酯在大鼠体内生物利用度的考察，发现在人工胃、肠液中没食子酸丙酯稳定。但没食子酸丙酯在小鼠肝微粒体液中代谢明显，肝脏的首过效应会造成药物口服生物利用度低，得出其
生物利用度(f)为1.0386(梁静，徐风，尚明英，等.赤芍化学成分没食子酸丙酯在大鼠体内的代谢研究[j].中国中药杂志，2013(22):3970
‑
3976.)。


技术实现要素：

[0008]
链霉素和庆大霉素常各自单独使用，可以治疗猪链球菌感染，但如何提高疗效需要进一步研究。
[0009]
本发明通过联合用药提高了链霉素和庆大霉素的药效。
[0010]
没食子酸及其盐具有良好的抑菌效果，但是其对于兽医临床的研究还比较少。
[0011]
本发明对没食子酸盐进行了研究，将其用于猪链球菌感染。
[0012]
本发明筛选到了抑菌效果最佳的烷基酯盐，之后再将抑制效果较好的没食子酸烷基酯盐与氨基糖苷类抗生素联用，比较没食子酸盐与抗生素联用对猪链球菌的联合作用，以得到能够提高抗生素的敏感性、减少抗生素用量的没食子酸盐与抗生素协同增效的组合。并且验证该组合能通过消除猪链球菌的生物被膜从而有效杀灭包被在生物被膜内的猪链球菌。
[0013]
本发明的技术方案如下：
[0014]
一种抗猪链球菌的药物组合，所述组合包括没食子酸盐和抗猪链球菌抗生素。
[0015]
本发明所述的药物组合，其中所述的没食子酸盐选自：没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、没食子酸丁酯，没食子酸辛酯或没食子酸正十二酯；所述抗猪链球菌抗生素为氨基糖苷类抗生素。
[0016]
本发明所述的药物组合，优选的所述的没食子酸盐是没食子酸丙酯，所述的氨基糖苷类抗生素选自链霉素和庆大霉素，优选庆大霉素。
[0017]
本发明所述的药物组合，特别优选的，是没食子酸丙酯和庆大霉素的组合，两者的重量比例为10
‑
20:1。更优选的，两者的重量比例为14
‑
20:1。最优选的，两者的重量比例为16:1。在具有疗效的情况下，没食子酸丙酯用量是庆大霉素的16倍，这样服用可以起到协同增效的作用。
[0018]
本发明所述的药物组合，所述组合，包括没食子酸丙酯和庆大霉素混合在一起制成药物组合物，使用时同时应用，或者没食子酸丙酯和庆大霉素分别制成药物组合物，使用时联合使用。其中，所述没食子酸丙酯和庆大霉素混合在一起制成的药物组合物中，还可以包括其他成分，所述两者分别制成药物组合物，使用时联合使用，还可以包括联合使用其他成分。
[0019]
本发明所述的药物组合物，为药物制剂形式，选自口服制剂和非口服制剂，其中非口服制剂包括注射剂。
[0020]
本发明以猪链球菌为研究目标，将没食子酸丙酯和庆大霉素联用，发现其具有消除猪链球菌被膜形成的作用，且具有协同增效作用。
[0021]
为此，本发明进一步提供没食子酸丙酯的应用，所述应用在于，其与庆大霉素联合可以使抗猪链球菌最小抑菌浓度明显降低。所述联合，其中没食子酸丙酯和庆大霉素的重量比例为10
‑
20:1。
[0022]
所述没食子酸丙酯的应用在于，没食子酸丙酯具有增加庆大霉素抗猪链球菌的作用。其中没食子酸丙酯和庆大霉素的重量比例为10
‑
20:1时，两者具有协同作用。本发明通
过试验发现，将没食子酸丙酯和庆大霉素抗生素按照16:1的重量比例组成得到的复方药物具有最佳的治疗效果，且消除猪链球菌被膜形成的作用最强。本发明发现，没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯和没食子酸丁酯均可以作为庆大霉素抗猪链球菌的增效剂的候选药物。优选的没食子酸丙酯与庆大霉素联用对猪链球菌的协同作用是最强的。该联用组合可以起到增强庆大霉素抗猪链球菌的作用。
[0023]
以下通过实验数据，说明本发明的有益效果。
[0024]
实验例1没食子酸盐和链霉素，庆大霉素对猪链球菌mic值的测定
[0025]
一、实验药物：
[0026]
没食子酸(98.8％)、没食子酸甲酯(99.9％)、没食子酸乙酯(98.8％)、没食子酸丙酯(99.6％)、没食子酸丁酯(98.9％)、没食子酸辛酯(98.7％)、没食子酸十二酯(99.9％)等单体均购于成都瑞芬思生物科技有限公司。
[0027]
链霉素为硫酸链霉素，庆大霉素为硫酸庆大霉素，均由山东信得生物科技有限公司赠送。
[0028]
药物储备液的制备：以少量的乙醇(100μl)溶解没食子酸盐，再用水稀释终浓度含1％乙醇，配制终浓度为5120μg/ml药物储备液，用0.22μm滤膜过滤后分装到无菌2ml离心管中，
‑
80℃保存。
[0029]
没食子酸盐抑菌药物工作液制备：取一管保存有原液的离心管，提前半小时于4℃中自然升温融化后，在超净工作台中取1ml原液加入4ml无菌水中，制备1024μg/ml药物工作液。同时制备1％乙醇溶液作为溶剂对照。
[0030]
链霉素和庆大霉素药物储备液的制备：以少量的水(100μl)溶解药物，再用水稀释配制终浓度为5120μg/ml药物储备液，用0.22μm滤膜过滤后分装到无菌2ml离心管中，
‑
80℃保存。
[0031]
链霉素和庆大霉素药物工作液制备：取一管保存有原液的离心管，提前半小时于4℃中自然升温融化后，在超净工作台中取1ml原液加入4ml无菌水中，制备1024μg/ml药物工作液。
[0032]
猪链球菌(cvcc3928)购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
[0033]
二、实验方法：
[0034]
采用微量肉汤稀释法测定单药的最低抑菌浓度。
[0035]
1、接种环刮取少量的猪链球菌冻干粉末于含tsb肉汤或含5％血清的tsb肉汤的离心管中后，置于37℃震荡培养箱中进行培养，培养5
‑
6h(静置培养18
‑
24h)后仔细观察是否由澄清透明溶液转化为浑浊，判断是否长菌，根据浑浊度初步判断生长状态，并用25％甘油保种制成甘油菌，保存于
‑
80℃冰箱。后期使用再从冰箱中取出静置0.5h恢复至室温后并充分震荡混匀，接种到4ml lb肉汤或tsb肉汤或含5％血清的tsb肉汤，37℃培养过夜后于mh琼脂培养基或tsa琼脂培养基上传代并形成单菌落(暂存于4℃冰箱备用)。用一次性无菌接种环刮取37℃过夜培养的第5代单菌落到生理盐水(0.9％nacl)中，制备0.5麦氏浊度可溶菌悬液，用无菌mh肉汤或camh肉汤100倍稀释菌悬液，即得到约含1
×
106cfu/ml的菌液，备用。
[0036]
2、取无菌的96孔板，第一孔加入200μl的1024μg/ml没食子酸或没食子酸烷基酯盐或氨基糖苷类抗生素溶液，第二孔至第十一孔分别依次加入100μl的无菌mh或无菌camh+5％胎牛血清的肉汤。从第一孔分别依次吸取100μl药液加入第二孔中混匀，再分别吸取100
μl至第三孔，以此类推，第十孔后吸取100μl弃除。此时各孔中各种药物浓度依次为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2μg/ml，第十一孔加入100μl菌悬液(用于阳性对照)，第十二孔加入200μl无菌mh或camh+5％胎牛血清的肉汤(用于阴性对照)。
[0037]
3、然后在1
‑
10孔各孔处加入100μl之前预先准备好的菌悬液，使第一孔至第十孔的各种药物浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml(若在此浓度范围内试验结果显示不抑菌则扩大了药物浓度范围继续测定)。并将96孔板放置于37℃培养箱培养24h后观察。做abc三排平行试验，三排1％乙醇溶液抑菌对照(与抑菌药物操作相同)。
[0038]
三、试验结果
[0039]
见表1，表2，通过观察96孔板中培养物的透明度，根据表1可知，没食子酸辛酯和没食子酸正十二酯对猪链球菌的mic大于1024μg/ml，没食子酸的最小抑菌浓度为1024μg/ml，没食子酸甲酯对猪链球菌的mic为64μg/ml，没食子酸乙酯、没食子酸丙酯对猪链球菌的mic为256μg/ml，而没食子酸丁酯对猪链球菌的mic为128μg/ml，由此可知，没食子酸甲酯对猪链球菌的抑菌效果最好。其次是没食子酸丁酯，没食子酸乙酯及没食子酸丙酯抑菌效果次之，而且没食子酸乙酯和没食子酸丙酯的抑菌强度基本相同。
[0040]
表1不同没食子酸盐对猪链球菌的最小抑菌浓度
[0041][0042]
表2链霉素，庆大霉素对猪链球菌的最小抑菌浓度
[0043]
抗生素链霉素庆大霉素mic(μg/ml)2μg/ml4μg/ml
[0044]
文献中曾报道庆大霉素对临床分离的猪链球菌的mic为10μg/ml(王嘉怡，刘宝宝，张港琛，等.亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素影响猪链球菌生物被膜形成和毒力因子表达的研究.)。另有文献报道链霉素对三株临床分离猪链球菌的mic分别为＞256μg/ml、16μg/ml、32μg/ml；庆大霉素对三株临床分离猪链球菌的mic分别为16μg/ml、1μg/ml、0.0625μg/ml(江超，姚飞虹，张之怡，等.地锦草与5种抗菌药联用对猪链球菌的体外抑菌效果[j].安徽农业科学,2019(24).)。由于本测定中使用的是标准菌株，所示结果基本吻合。
[0045]
实验例2棋盘法测定没食子酸盐联合链霉素，庆大霉素的药物敏感性(fic)测定
[0046]
一、试验药物
[0047]
没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、没食子酸丁酯；硫酸链霉素和硫酸庆大霉素。
[0048]
二、试验方法
[0049]
根据测定的mic值，将各种治疗药物的原液从2倍mic浓度开始，取6
‑
8个浓度梯度后使用含5％胎牛血清无菌camh肉汤稀释。取无菌96孔板一个，采用棋盘法，将不同浓度的两种无菌药物依次各取50μl分别均匀排列在96孔板的横列和纵列中形成不同浓度组合的；两种药物混合液。在已经2次加药的96孔板中每孔再加入100μl稀释好的1
×
106cfu/ml猪链
球菌菌悬液，混匀后再置于37℃培养箱中培养14
‑
16h后观察结果。
[0050]
分级抑菌浓度指数fic值可以用来作为各类联合用药敏感菌试验的结果评价和疗效判断依据基础，其计算公式简述如下：
[0051][0052]
其中当fic≤0.5时，判定为“协同作用”；当0.5<fic≤1时，判定为“相加作用”；当1<fic≤2时，判定为“无关作用”；当2<fic时，判定为“拮抗作用”。
[0053]
三、试验结果
[0054]
1、选择相应96孔板无细菌生长孔统计药物用量，根据fic计算公式，重复试验后得到没食子酸烷基酯盐与链霉素联合作用的fic均值，见表3。由表3可知，没食子酸甲酯、没食子酸丙酯与链霉素联合使用的fic值大于1小于2，因此没食子酸甲酯、没食子酸丙酯与链霉素联用具有无关作用，没食子酸乙酯与链霉素联合使用的fic为0.75小于1，因此没食子酸乙酯与链霉素具有相加作用；而没食子酸丁酯与链霉素联用的fic大于2，因此没食子酸丁酯与链霉素联用具有拮抗作用。
[0055]
表3没食子酸烷基酯盐和链霉素联用指数(fic)结果
[0056]
联用药物没食子酸甲酯没食子酸乙酯没食子酸丙酯没食子酸丁酯fic1.3850.751.08>2
[0057]
注：链霉素和没食子酸甲酯联用时，注：链霉素和没食子酸甲酯联用时，
[0058]
链霉素和没食子酸乙酯联用时，fic＝[(1
÷
2+128
÷
256)+(1/64
÷
2+128
÷
256
÷
2＝0.75；
[0059]
链霉素和没食子酸丙酯联用时，fic＝[(1
÷
2+128
÷
256)+(2
÷
2+256
÷
256+1/64
÷
2+64
÷
256
÷
3＝1.08；
[0060]
链霉素和没食子酸丁酯联用时，fic＝[(2
÷
2+128
÷
128)+(2
÷
2+128
÷
128+2
÷
2+128
÷
128
÷
3＝2；
[0061]
其中药物用量单位为μg/ml。
[0062]
2、选择相应96孔板无细菌生长孔统计药物用量，根据fic计算公式，重复试验后得到没食子酸烷基酯盐与庆大霉素联合作用的fic值，见表4。由表4可知，没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、没食子酸丁酯与庆大霉素联合使用的fic值均小于判定标准规定的0.5。因此没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯及没食子酸丁酯与庆大霉素作用均具有协同作用，其中没食子酸丙酯与庆大霉素的协同作用最强。因此选择没食子酸丙酯与庆大霉素组合进一步探究两药联用的抑菌机制。
[0063]
表4没食子酸烷基酯盐和庆大霉素联用指数(fic)结果
[0064][0065]
[0066]
注：庆大霉素和没食子酸甲酯联用
[0067][0068]
庆大霉素和没食子酸乙酯联用fic＝[(2
÷
4+8
÷
256)+(1/32
÷
4+8
÷
256
÷
2＝0.285；
[0069]
庆大霉素和没食子酸丙酯联用fic＝[(1
÷
4+16
÷
256)+(1
÷
4+8
÷
256)+1/32
÷
4+8
÷
256
÷
3＝0.211；
[0070]
庆大霉素和没食子酸丁酯联用fic＝[(2
÷
4+4
÷
128)+(2
÷
4+4
÷
128)+1
÷
4+4
÷
128
÷
3＝0.448；
[0071]
其中药物用量单位为μg/ml。
[0072]
实验例3没食子酸丙酯与庆大霉素联用对猪链球菌生物被膜的影响
[0073]
一、试验药物
[0074]
没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、没食子酸丁酯；硫酸链霉素和硫酸庆大霉素。
[0075]
二、试验方法
[0076]
1、结晶紫染色法测定生物膜形成影响
[0077]
取96孔板一个，按100μl/孔依次加入细菌悬液，按照每个试验组分别设计不同没食子酸丙酯质量浓度组、庆大霉素组、庆大霉素与没食子酸丙酯复合联用组、对照组(未添加任何药物)，每一个孔加入100μl相应样品溶液，且每个孔的样品重复3个孔后置于37℃恒温培养箱中培养24h，弃去样品上清液。沉淀用无菌pbs溶液洗涤2次，加入100μl 0.1％结晶紫染色液，对其形成的生物膜染色15min后弃去染色液，用无菌pbs溶液冲洗2次并干燥，然后在每一个孔中加入100μl95％乙醇溶液溶解后，采用全波长酶标仪于540nm波长处测定其od值。根据上述fic结果选用1/4mic(1μg/ml)庆大霉素联合不同浓度没食子酸丙酯进行后续试验。
[0078]
三、试验结果由试验结果可以得到1/4mic庆大霉素与不同浓度没食子酸丙酯联用对猪链球菌的生物膜形成的抑制结果如表5。结合图1可以看出相对于未接触任何药物的细菌来说，不论庆大霉素与没食子酸丙酯如何组合均对细菌生物膜的形成有抑制作用。而1/16mic没食子酸丙酯与1/4mic庆大霉素联用(重量比为16:1)对细菌生物膜的形成的抑制作用最强。
[0079]
表5 1/4mic庆大霉素与不同浓度没食子酸丙酯联用时猪链球菌生物膜od值
[0080]
附图说明
[0081]
图1 1/4mic庆大霉素与不同浓度没食子酸丙酯联用对猪链球菌的生物膜形成抑
制结果图。
具体实施方式
[0082]
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0083]
实施例1
[0084]
没食子酸丙酯药物制剂的处方及包装：
[0085]
将没食子酸丙酯3.2g用5ml注射用水配合助溶剂溶解后，经无菌处理后，作为溶剂。
[0086]
庆大霉素药物制剂的制备：
[0087]
将硫酸庆大霉素0.2g以超微粉末形式包装，经无菌处理后作为溶质。
[0088]
组合包装：
[0089]
将制备得到的没食子酸丙酯药物制剂，和庆大霉素药物制剂分别包装成各自药品，然后将两种药品，再一同装入同一个大的包装盒中，使用前用没食子酸丙酯溶液溶解庆大霉素粉末后，注射使用。
[0090]
实施例2
[0091]
没食子酸丙酯药物制剂的制备：
[0092]
将没食子酸丙酯3.2g以超微粉末形式包装。
[0093]
庆大霉素药物制剂的制备：
[0094]
将硫酸庆大霉素0.2g以超微粉末形式包装。
[0095]
组合包装：
[0096]
将制备得到的没食子酸丙酯药物制剂，和庆大霉素药物制剂分别包装成各自药品，然后将两种药品，再一同装入同一个大的包装盒中，使用时没食子酸丙酯和庆大霉素，联合注射使用。
[0097]
实施例3
[0098]
将没食子酸丙酯3.2g和硫酸庆大霉素0.2g混合，以超微粉末形式包装。使用时没食子酸丙酯和庆大霉素用溶剂溶解后注射使用。
[0099]
实施例4
[0100]
将没食子酸甲酯1.6g和硫酸庆大霉素0.2g混合，以超微粉末形式包装。使用时没食子酸丙酯和庆大霉素用溶剂溶解后注射使用。
[0101]
实施例5
[0102]
将没食子酸乙酯51.2g和硫酸庆大霉素0.2g混合，以超微粉末形式包装。使用时没食子酸丙酯和庆大霉素用溶剂溶解后注射使用。
[0103]
实施例6
[0104]
将没食子酸丁酯0.8g和硫酸庆大霉素0.2g混合，以超微粉末形式包装。使用时没食子酸丙酯和庆大霉素用溶剂溶解后注射使用。