一种生物组织修复用自体活细胞制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及组织工程和生物材料技术领域，具体涉及一种生物组织修复用自体活细胞制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.皮肤损伤因素有很多种，最常见的有烧伤、烫伤、机械伤、晒伤等。皮肤受损后对机体的健康造成不可避免的威胁，常见的有永久性皮肤毛囊受损和疤痕增生。
3.现代医学一般采用“皮肤移植”来取代受损的皮肤，皮肤移植往往伴随新的皮肤创伤，而且严重损伤的皮肤组织不能被完全修复，常伴有毛囊、汗腺等结构功能的永久性缺陷，治疗效果不尽理想，给患者生活造成一定程度的影响。皮肤的再生修复能力取决于皮下组织中的干细胞，皮下的干细胞种类有很多种，比如表皮干细胞(又称毛囊干细胞)、脂肪干细胞等。这些间充质干细胞主要起到增殖、分化，更新替代衰老和损伤的细胞，这种特性让皮肤有了自动愈合伤口的能力。皮肤中的毛囊是由上皮细胞和间充质细胞组成，包含大量干细胞，并有周围腺体相互附着，结构复杂，一旦被破坏很难修复。


技术实现要素：

4.为了解决上述背景技术中存在的问题，本发明提供一种生物组织修复用自体活细胞制剂，其有效修复受损皮肤，促进皮肤再生和改善，修复毛囊，而且注入至皮肤组织后不会引起免疫排斥。为此，本发明还提供一种上述生物组织修复用自体活细胞制剂的制备方法和应用。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.本发明的第一方面，提供一种生物组织修复用自体活细胞制剂，包括脂肪间充质干细胞悬浮液和纳米脂肪，所述脂肪间充质干细胞悬浮液和所述纳米脂肪的体积比为1：(3-5)；
7.其中，所述脂肪间充质干细胞悬浮液由脂肪间充质干细胞悬浮于生理盐水中制得，每毫升生理盐水中含有脂肪间充质干细胞的个数为(1-3)
×
105个。
8.在实际使用时，可以根据待移植的受体部分及需要达到的效果来调整自体活细胞制剂中脂肪间充质干细胞和纳米脂肪的配比比例。
9.优选的是，所述脂肪间充质干细胞和所述纳米脂肪均来源于自体脂肪组织。
10.本发明的第二方面，提供一种上述生物组织修复用自体活细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
11.s1、脂肪间充质干细胞的制备：
12.(1)对自体脂肪组织进行前处理；
13.(2)将处理后的脂肪组织剪碎，用缓冲液反复冲洗，再用含i型胶原酶与胰蛋白酶的消化液消化处理30-50min，得到组织悬浮液；
14.(3)将组织悬浮液进行机械分离，再经离心，弃上清液，用缓冲液对底部细胞沉淀
冲洗；
15.(4)将得到的细胞转移至含血清的dmem培养基中进行培养，待观察到贴壁细胞后，更换培养液培养，将第三代的细胞分离出，即得所需脂肪间充质干细胞；
16.s2、纳米脂肪的制备：
17.(1)对自体脂肪组织进行前处理；
18.(2)采用无菌注射器和纳米脂肪转换器将处理后的脂肪组织制备得到纳米脂肪；
19.s3、将步骤s1中制得的脂肪间充质干细胞按照特定配比悬浮于生理盐水中制得脂肪间充质干细胞悬浮液，再将脂肪间充质干细胞悬浮液与步骤s2中制得的纳米脂肪按照特定配比混合，即得生物组织修复用自体活细胞制剂。
20.抽脂手术抽出的颗粒脂肪直径较大，只适合注射到深部的组织内进行容量充填，不适合面部浅表皮皮下注射，限制了自体脂肪组织在光老化皮肤治疗中的应用。但是本技术中对自体脂肪组织进行处理得到纳米脂肪，其具有促进皮肤再生及功能改善的作用，纳米脂肪中存在的干细胞可以促进成纤维细胞的胶原合成及血管内皮细胞的血管生成，进而促进受损细胞再生。
21.优选的是，所述步骤s1和所述步骤s2中，自体脂肪组织为抽脂手术中新鲜的自体脂肪组织。即所制得的自体活细胞制剂中脂肪间充质干细胞和纳米脂肪均来自于自体，将其注射至人体受损的生物组织后不会发生免疫排斥。
22.优选的是，所述步骤s1和所述步骤s2中，自体脂肪组织的前处理过程如下：将自体脂肪组织用组织液冲洗，然后置于无菌培养皿中，剔除结缔组织和小血管。
23.优选的是，所述步骤s1中，消化液由0.1wt％的i型胶原酶和0.1wt％的胰蛋白酶按照体积比为1:1的比例配置而成，消化液的用量为脂肪组织体积的3倍，消化处理温度为35-37℃。
24.本发明的第三方面，提供一种上述生物组织修复用自体活细胞制剂的应用，其特征在于，将自体活细胞制剂以皮下注射的方式注入至受损的生物组织中。
25.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
26.本发明中采用皮下注射方式将脂肪间充质干细胞与纳米脂肪以一定比例配置而成的混合物注入至受损的生物组织中，其有效修复受损皮肤，促进皮肤再生和改善，修复毛囊，而且注入至皮肤组织后不会引起免疫排斥。
附图说明
27.下面结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细说明。
28.图1为本发明中he染色表征各组的组织病理情况图；
29.图2为本发明中vg表征各组皮肤胶原纤维的含量分布图；
30.图3为本发明中各组皮肤表皮厚度的数据统计结果图；
31.图4为本发明中标记绿色荧光的脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪移植7天后皮肤切片测试图。
具体实施方式
32.实施例1
33.生物组织修复用自体活细胞制剂的制备：
34.s1、脂肪间充质干细胞的制备：
35.(1)取抽脂手术中新鲜的自体脂肪组织，经组织液冲洗，置于无菌培养皿中，剔除结缔组织和小血管；
36.(2)将处理后的脂肪组织用眼科剪刀剪碎，用磷酸缓冲液反复冲洗3次，除去红细胞，由0.1wt％的i型胶原酶和0.1wt％的胰蛋白酶按照体积比为1:1的比例配置得到消化液，按脂肪组织3倍体积加入至脂肪组织中，37℃水浴消化30min，得到组织悬浮液；
37.(3)将组织悬浮液经70-100目筛网进行机械分离，再经离心5min，转速1000r/min，弃上清液，用无菌磷酸缓冲液对底部细胞沉淀冲洗3次；
38.(4)将得到的细胞转移至含血清的dmem培养基中进行培养，待观察到贴壁细胞后，更换培养液培养，将第三代的细胞分离出，即得所需脂肪间充质干细胞；
39.s2、纳米脂肪的制备：
40.(1)取抽脂手术中新鲜的自体脂肪组织，经组织液冲洗，置于无菌培养皿中，剔除结缔组织和小血管；；
41.(2)采用无菌注射器和孔径为1mm的纳米脂肪转换器将处理后的脂肪组织制备得到纳米脂肪；
42.s3、将步骤s1中制得的脂肪间充质干细胞按照特定配比悬浮于生理盐水中制得脂肪间充质干细胞悬浮液，每毫升生理盐水中含有脂肪间充质干细胞的个数为2
×
105个,再将制得的脂肪间充质干细胞悬浮液与步骤s2中制得的纳米脂肪按照体积比为1：3的比例混合，即得生物组织修复用自体活细胞制剂。
43.实施例2
44.生物组织修复用自体活细胞制剂的制备：
45.s1、脂肪间充质干细胞的制备：
46.(1)取抽脂手术中新鲜的自体脂肪组织，经组织液冲洗，置于无菌培养皿中，剔除结缔组织和小血管；
47.(2)将处理后的脂肪组织用眼科剪刀剪碎，用磷酸缓冲液反复冲洗5次，除去红细胞，由0.1wt％的i型胶原酶和0.1wt％的胰蛋白酶按照体积比为1:1的比例配置得到消化液，按脂肪组织3倍体积加入至脂肪组织中，35℃水浴消化40min，得到组织悬浮液；
48.(3)将组织悬浮液经70-100目筛网进行机械分离，再经离心5min，转速1000r/min，弃上清液，用无菌磷酸缓冲液对底部细胞沉淀冲洗3次；
49.(4)将得到的细胞转移至含血清的dmem培养基中进行培养，待观察到贴壁细胞后，更换培养液培养，将第三代的细胞分离出，即得所需脂肪间充质干细胞；
50.s2、纳米脂肪的制备：
51.(1)取抽脂手术中新鲜的自体脂肪组织，经组织液冲洗，置于无菌培养皿中，剔除结缔组织和小血管；；
52.(2)采用无菌注射器和孔径为1mm的纳米脂肪转换器将处理后的脂肪组织制备得到纳米脂肪；
53.s3、将步骤s1中制得的脂肪间充质干细胞按照特定配比悬浮于生理盐水中制得脂肪间充质干细胞悬浮液，每毫升生理盐水中含有脂肪间充质干细胞的个数为1
×
105个,再
将制得的脂肪间充质干细胞悬浮液与步骤s2中制得的纳米脂肪按照体积比为1：4的比例混合，即得生物组织修复用自体活细胞制剂。
54.实施例3
55.生物组织修复用自体活细胞制剂的制备：
56.s1、脂肪间充质干细胞的制备：
57.(1)取抽脂手术中新鲜的自体脂肪组织，经组织液冲洗，置于无菌培养皿中，剔除结缔组织和小血管；
58.(2)将处理后的脂肪组织用眼科剪刀剪碎，用磷酸缓冲液反复冲洗3次，除去红细胞，由0.1wt％的i型胶原酶和0.1wt％的胰蛋白酶按照体积比为1:1的比例配置得到消化液，按脂肪组织3倍体积加入至脂肪组织中，37℃水浴消化30min，得到组织悬浮液；
59.(3)将组织悬浮液经70-100目筛网进行机械分离，再经离心5min，转速1000r/min，弃上清液，用无菌磷酸缓冲液对底部细胞沉淀冲洗3次；
60.(4)将得到的细胞转移至含血清的dmem培养基中进行培养，待观察到贴壁细胞后，更换培养液培养，将第三代的细胞分离出，即得所需脂肪间充质干细胞；
61.s2、纳米脂肪的制备：
62.(1)取抽脂手术中新鲜的自体脂肪组织，经组织液冲洗，置于无菌培养皿中，剔除结缔组织和小血管；；
63.(2)采用无菌注射器和孔径为1mm的纳米脂肪转换器将处理后的脂肪组织制备得到纳米脂肪；
64.s3、将步骤s1中制得的脂肪间充质干细胞按照特定配比悬浮于生理盐水中制得脂肪间充质干细胞悬浮液，每毫升生理盐水中含有脂肪间充质干细胞的个数为3
×
105个,再将制得的脂肪间充质干细胞悬浮液与步骤s2中制得的纳米脂肪按照体积比为1：5的比例混合，即得生物组织修复用自体活细胞制剂。
65.动物试验：
66.利用波长为290-320nm(波峰为313nm)的中波紫外光照射背部剃毛(5厘米*5厘米)大鼠，照射高度为40厘米，每天持续照射20分钟，连续30天，获得皮肤老化大鼠。在皮肤老化大鼠背部皮下左右分区域注射试剂以对比治疗效果。
67.动物分组如下：1.紫外照射后在皮肤老化大鼠背部皮下区域注射pbs(磷酸缓冲盐溶液)，记为阴性对照组(pbs-uvb)，2.紫外照射后在皮肤老化大鼠背部皮下区域移植纳米脂肪，记为纳米脂肪移植实验组(nanofat-uvb)，3.紫外照射后在皮肤老化大鼠背部皮下区域注射脂肪间充质干细胞，记为脂肪间充质干细胞移植实验组(hadsc-uvb)，4.紫外照射后在皮肤老化大鼠背部皮下区域注射由实施例1制得的生物组织修复用自体活细胞制剂，记为脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪移植实验组(hadsc-nanofat-uvb)，5.不进行紫外照射处理的具有正常皮肤的大鼠，记为正常对照组(sham)。
68.在治疗30d用水合氯醛腹腔麻醉牺牲掉大鼠，剥离剃毛处大鼠皮肤，迅速浸入4％多聚甲醛进行固定，之后进行皮肤病理切片，再进行he(hematoxylin-eosin)组织染色鉴定，从染色结果可以看出并计算出皮肤厚度变化，胶原纤维的多少，真皮组织的排列状态等。阴性对照组(pbs-uvb)、纳米脂肪移植实验组(nanofat-uvb)、脂肪间充质干细胞移植实验组(hadsc-uvb)、脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪移植实验组(hadsc-nanofat-uvb)、正
常对照组的he染色表征结果如图1所示。
69.由图1中各组的染色表征结果可看出，与阴性对照组(pbs-uvb)相比，纳米脂肪移植实验组(nanofat-uvb)、脂肪间充质干细胞移植实验组(hadsc-uvb)、脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪移植实验组(hadsc-nanofat-uvb)的表皮厚度明显减少；纳米脂肪移植实验组(nanofat-uvb)、脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪移植实验组(hadsc-nanofat-uvb)的皮下组织明显增厚，显示出对皮肤组织的修复效果。
70.采用vg(van gieson)表征以上各组皮肤胶原纤维的含量分布，表征结果如图2所示。
71.由图2中的表征结果可看出，与阴性对照组(pbs-uvb)相比，纳米脂肪移植实验组(nanofat-uvb)、脂肪间充质干细胞移植实验组(hadsc-uvb)、脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪移植实验组(hadsc-nanofat-uvb)的胶原纤维明显增加，其中脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪移植实验组(hadsc-nanofat-uvb)效果更明显。
72.根据he组织染色结果统计各组皮肤表皮厚度，统计结果见图3。
73.由图3中各组表皮厚度结果统计，发现与阴性对照组(pbs-uvb)相比，纳米脂肪移植实验组(nanofat-uvb)、脂肪间充质干细胞移植实验组(hadsc-uvb)、脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪移植实验组(hadsc-nanofat-uvb)的表皮厚度明显减少，而且接近正常对照组(sham)。
74.在实验中利用表达绿色荧光蛋白的慢病毒(lenti-virus-gfp)标记技术追踪脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪移植实验组(hadsc-nanofat-uvb)中脂肪间充质干细胞在皮肤中的去向，先用包装好的的表达绿色荧光蛋白的慢病毒感染细胞感染脂肪间充质干细胞，然后再将转染有绿色荧光蛋白的脂肪间充质干细胞与纳米脂肪联合注入紫外照射后大鼠背部皮肤，注射7天后的皮肤切片，对皮肤切片进行观察见图4，绿色荧光显示外源脂肪间充质干细胞在组织内的存活和迁移分布情况。
75.stratum basale为皮肤基底层，fat tissue为脂肪层，图4显示了标记绿色荧光的脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪移植后能够被追踪到定位到脂肪层。
76.综上，本发明中采用皮下注射方式将脂肪间充质干细胞与纳米脂肪以一定比例配置而成的混合物注入至受损的生物组织中，其有效修复受损皮肤，促进皮肤再生和改善，修复毛囊，而且注入至皮肤组织后不会引起免疫排斥。
77.以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。