正丁醇在低离子休克条件下配合氨基糖苷类抗生素快速杀灭耐受菌的方法

1.本发明属于抗生素杀菌领域，具体涉及正丁醇在低离子休克条件下配合氨基糖苷类抗生素快速杀灭耐受菌的方法。


背景技术：

2.自抗生素被发现以来，人们在利用抗生素药物抵抗细菌感染疾病的同时，也由于抗生素滥用，使得细菌耐药的现象愈加严重，陷入抗生素用量越来越大的恶性循环。金黄色葡萄球菌是医院和社会人群获得性感染的主要菌群之一，给医疗保健造成了重大负担。平台期金黄色葡萄球菌对许多抗生素表现出完全的耐受性，这是该病原体与大肠杆菌的一个重要区别。金色葡萄球菌可引起许多严重感染。主要包括急性感染，如细菌血症和皮肤脓肿等。
3.金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性人兽共患病病原菌，关于金黄色葡萄球菌杀灭手段及耐药机制的研究，一直以来都是国内外相关科研人员的努力的重点。造成金黄色葡萄球菌耐药的主要原因有3个：1.可附着在生物或非生物固体表面形成生物膜；2.具有形成持留菌(persister)的能力；3.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)。
4.形成生物膜的金黄色葡萄球菌对抗生素的耐受性增强，金黄色葡萄球菌生物膜的形成也会阻碍某些类型的人体免疫防御的进攻。此外，被生物膜包裹的金黄色葡萄球菌易扩散到身体其他部位，形成新的感染灶，造成反复感染。
5.持留菌(persister)是细菌细胞休眠，代谢不活跃状态的表型突变体，其对多种抗生素的杀灭表现出耐受性。持留菌的形成常常伴有慢性感染和抗生素治疗失败。初步研究证明，金黄色葡萄球菌中持留菌存在是由于细胞随机进入平台期状态，伴随着细胞内三磷酸腺苷(atp)的下降而产生的。atp的减少可能降低了依赖atp的抗生素靶标的活性例如螺旋酶，拓扑异构酶以及rna合成酶，致使产生对抗生素的耐受性，并且之前atp曾被证明影响抗生素处理的存活率，更加能证明这点。
6.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)是临床上常见的毒性较强的细菌，随着内酰胺类抗生素的广泛应用，mrsa随之增加，且引起的感染和病死率有逐年增加的趋势。mrsa可通过接触途径进行传播，即易感人群从携带者或感染者身上获得mrsa，导致传播流行。自1961年英国学者jevons发现首例mrsa感染患者至今，世界各地mrsa已成为院内和社区感染的重要病原菌之一。mrsa除对甲氧西林耐药外，对其它所有与甲氧西林相同结构的β
‑
内酰胺类和头孢类抗生素均耐药。mrsa还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，降低膜通透性产生大量paba等不同机制，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药，唯对万古霉素敏感。mrsa的治疗是对卫生保健的长期挑战，常常伴随着转移感染、传播途径广、治疗失败和高死亡率，已成为临床治疗的难点。mrsa几乎可以在身体的任何部分引起感染，并且常常与转移到其他部位的感染有关。鉴于mrsa感染的复杂性，目前的研究受到感染过程的异质性和现有证据的限制。mrsa治疗失败与心内膜炎
或骨髓炎的治疗失败有很大不同。今后研究的考虑因素应包括治疗失败定义的标准化、主要来源和转移灶的识别和管理以及治疗成功的标准化。
7.为了预防及减少金黄色葡萄球菌的传播感染致病。当然，最好的方法就是阻断传染源，做好前期预防工作，防止带菌人群对各种食物的污染，需要定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染(如疥疮、手指化脓等)、上呼吸道感染(如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等)的人员要暂时停止其工作或调换岗位。防止金黄色葡萄球菌对肉类及其制品的污染，肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成，应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6h，并且食用前要彻底加热等。
8.针对金黄色葡萄球菌感染，如果能够大幅度提高氨基糖苷类抗生素的杀菌效率，将有效降低病原菌产生耐药的风险，同时在达到同样治疗效果的前提下，减少用药量和给药时间，从而降低其副作用。本发明公开的方法就是遵循这种思路探索发明的。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种正丁醇在低离子休克条件下配合氨基糖苷类抗生素杀灭耐受菌的方法。
10.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
11.正丁醇在低离子休克条件下配合氨基糖苷类抗生素杀灭耐受菌的方法：用一定浓度的正丁醇溶液配制的氨基糖苷类抗生素得到抗生素工作液，然后将待杀灭细菌加入上述抗生素工作液中，得到细菌与抗生素的混合物。然后混合物重悬混匀，处理1
‑
5分钟后，离心，去除抗生素并洗涤，检测杀菌效果。
12.进一步地，所述正丁醇溶液是指将正丁醇溶于纯水中，得到浓度为0.02
‑
1.0m的正丁醇溶液。优选为0.3m，0.3m为与0.9％nacl摩尔质量相同的浓度。
13.所述细菌与抗生素的混合物中，抗生素的终浓度为1
‑
600μg/ml。
14.所述氨基糖苷抗生素为由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的抗生素，如妥布霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星、安普霉素、达苄霉素、奈替米星或西索米星。
15.所述细菌为革兰氏阳性菌，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌或藤黄八叠球菌。
16.所述细菌为革兰氏阴性菌，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌或志贺氏菌
17.本发明采用以上技术方案，正丁醇可以显著增强氨基糖苷类抗生素的杀菌效率。针对平台期金黄色葡萄球菌，与单纯的低离子休克(h2o)配合氨基糖苷类抗生素相比，细菌经正丁醇配合氨基糖苷类抗生素(以妥布霉素为例)处理后的杀菌效率能提高3个以上数量级(图2)；针对使用的抗生素浓度，正丁醇配合妥布霉素的浓度梯度可以看出，在妥布霉素为15μg/ml时，杀菌效果就达到了三个数量级以上(图1)；针对处理时间，正丁醇配合妥布霉素在处理细菌1分钟以上就可以杀灭几乎全部的细菌(图4)，并且这种方法配合其他种类的氨基糖苷类抗生素同样有很好的杀菌效果(图3)。此外，进一步研究发现，正丁醇配合氨基
糖苷类抗生素对其他种类的革兰氏阳性菌(图5)(如表皮葡萄球菌，粪肠球菌，藤黄八叠球菌)，革兰氏阴性菌(图6)(如大肠杆菌，铜绿假单胞菌，志贺氏菌)和耐受菌(如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，persister
‑
like细菌)(图7和8)也有很好的杀菌效果。可见，本发明的方法可以大幅度提高氨基糖苷抗生素的杀菌效率，有效降低病原菌产生耐药的风险，同时在达到同样治疗效果的前提下，减少用药量和给药时间，降低其副作用。
附图说明
18.图1为低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合不同浓度妥布霉素处理平台期金黄色葡萄球菌的定量和定性图。
19.图2为低离子休克条件下，不同浓度正丁醇配合妥布霉素处理平台期金黄色葡萄球菌的定量和定性图。
20.图3为低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合其他种类氨基糖苷类抗生素处理平台期金黄色葡萄球菌的定量和定性图。
21.图4为低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合妥布霉素处理平台期金黄色葡萄球菌不同时间后的杀菌效果的定量和定性图。
22.图5低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合氨基糖苷类抗生素处理几种革兰氏阳性菌杀菌效果的定性图。
23.图6低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合妥布霉素处理几种革兰氏阴性菌杀菌效果的定性图。
24.图7低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合妥布霉素处理persister
‑
like细菌的杀菌效果的定性图。
25.图8低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合链霉素处理mrsa的杀菌效果的定性图。
具体实施方式
26.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
27.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
28.下述实施例中的菌种来源及特性见表1
29.表1菌种来源及特性
[0030][0031][0032]
实施例1
[0033]
低离子休克条件下，正丁醇配合不同浓度妥布霉素处理平台期金黄色葡萄球菌
[0034]
1)将4℃保存的静止期细菌1:200接于新鲜的无菌lb液体培养基中(配制成分：1l培养基含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，用单蒸水补齐，高压蒸汽灭菌20分钟)，37℃条件下培养24小时。
[0035]
2)分别吸取平台期金黄色葡萄球菌培养物33μl置于做好标记的1.5ml离心管中，13000rpm，离心1分钟，吸去上清。
[0036]
实验组分别加入100μl 0.3m正丁醇配制的不同种类及浓度抗生素如下：妥布霉素(tobramycin)：1μg/ml，3μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml。
[0037]
对照组加入100μl 0.3m正丁醇。
[0038]
不处理组加入100μl 10mm灭菌磷酸盐缓冲液(pbs)。
[0039]
将以上所有样品同时重悬至混合均匀，静置3分钟。
[0040]
3)处理结束后，所有将处理后的菌液离心(13000rpm，1min)，去除上清，用100μl 10mm灭菌磷酸盐缓冲液重悬菌体，洗涤2次，最终重悬于33μl 10mm磷酸盐缓冲液中(与初始的菌液相同的体积)。
[0041]
4)将菌液按照每次10倍的梯度用10mm磷酸盐缓冲液依次稀释，每个稀释度取4μl菌液点滴在lb固体培养基平板上，置于37℃培养箱培养20小时后，检查细菌死亡，菌落计数，计算大肠杆菌经处理后的存活率。
[0042]
结果如图1显示，正丁醇在低离子休克条件下配合较低妥布霉素对平台期金黄色葡萄球菌就有很好的杀菌效果。在妥布霉素浓度为3μg/ml时，就可以杀灭约90％的细菌。妥布霉素浓度为100μg/ml时，可以达到最好的杀菌效果，即杀灭全部的细菌。
[0043]
实施例2
[0044]
低离子休克条件下，不同浓度正丁醇配合妥布霉素处理平台期金黄色葡萄球菌
[0045]
1)将4℃保存的静止期细菌1:200接于新鲜的无菌lb液体培养基中(配制成分：1l培养基含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，用单蒸水补齐；高压蒸汽灭菌20分钟)，37℃条件下培养24小时。
[0046]
2)分别吸取平台期金黄色葡萄球菌培养物33μl置于做好标记的1.5ml离心管中，13000rpm，离心1分钟，吸去上清。
[0047]
实验组分别加入100μl不同浓度正丁醇配制妥布霉素(100μg/ml)分别为：
[0048]
h2o，0.02m，0.04m，0.06m，0.1m，0.2m，0.3m，0.6m，1.0m
[0049]
对照组加入100μl对应不同浓度梯度正丁醇。
[0050]
不处理组加入100μl 10mm灭菌磷酸盐缓冲液(pbs)。
[0051]
将以上所有样品同时重悬至混合均匀，静置3分钟。
[0052]
其余操作同实施例1的步骤3)，4)。
[0053]
结果如图2显示，将正丁醇溶入水中，比如0.02m正丁醇配合妥布霉素比单纯的低离子休克条件配合妥布霉素处理平台期金黄色葡萄球菌提高三个数量级，并且随着正丁醇浓度增大，杀菌效果也逐渐变好，当正丁醇浓度达到0.3m时，可以杀灭几乎全部的细菌。但随着正丁醇的浓度增大，其本身就会有杀菌作用(比如0.6m及以上浓度)。
[0054]
表2低离子休克条件下，不同浓度正丁醇配合妥布霉素处理平台期金黄色葡萄球菌的相对杀菌效率
[0055][0056]
注：0.3m正丁醇是指与0.9％nacl摩尔质量相同的浓度，其他浓度依此推算。
[0057]
a.有抗生素存活率＝正丁醇配合抗生素处理存活菌落数/无正丁醇(纯水)无抗生素存活菌落数；
[0058]
b.无抗生素存活率＝正丁醇无抗生素处理的存活菌落数/无正丁醇(纯水)无抗生素存活菌落数；
[0059]
c.相对杀菌效率＝正丁醇无抗生素处理存活率
×
纯水配合抗生素的存活率/正丁醇配合抗生素处理存活率。
[0060]
实施例3
[0061]
低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合其他种类氨基糖苷类抗生素处理平台期金黄
色葡萄球菌
[0062]
1)将4℃保存的静止期细菌1:200接于新鲜的无菌lb液体培养基中(配制成分：1l培养基含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，其余用单蒸水补齐；高压蒸汽灭菌20分钟)，37℃条件下培养24小时。
[0063]
2)分别吸取平台期金黄色葡萄球菌培养物33μl置于做好标记的1.5ml离心管中，13000rpm，离心1分钟，吸去上清。
[0064]
实验组分别加入100μl 0.3m正丁醇配制的不同种类及浓度抗生素如下：
[0065]
庆大霉素gentamicin：25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，250μg/ml，500μg/ml；
[0066]
卡那霉素kanamycin：50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml，600μg/ml；
[0067]
链霉素streptomycin：50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml，600μg/ml。
[0068]
对照组加入100μl 0.3m正丁醇。
[0069]
不处理组加入100μl 10mm灭菌磷酸盐缓冲液(pbs)。
[0070]
将以上所有样品同时重悬至混合均匀，静置3分钟。
[0071]
其余操作同实施例1的步骤3)，4)。
[0072]
如图3所示，除了妥布霉素以外，正丁醇也具有配合其他种类氨基糖苷类抗生素杀灭平台期金黄色葡萄球菌的效果，并且研究中我们发现卡那霉素，链霉素两种抗生素与妥布霉素有类似的趋势。但意外的是，正丁醇配合庆大霉素处理平台期金黄色葡萄球菌，当庆大霉素达到一定浓度后，较高浓度却没有较低浓度的杀菌效果好的“高反”现象，而其原因尚不清楚。
[0073]
实施例4
[0074]
低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合妥布霉素对平台期金黄色葡萄球菌的不同时间处理
[0075]
1)将4℃保存的静止期细菌1:200接于新鲜的无菌lb液体培养基中(配制成分：1l培养基含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，并用单蒸水补齐，高压蒸汽灭菌)，37℃条件下培养24小时。
[0076]
2)分别吸取平台期金黄色葡萄球菌培养物33μl置于做好标记的1.5ml离心管中，13000rpm，离心1分钟，吸去上清。
[0077]
实验组分别加入100μl 0.3m正丁醇配制的不同种类及浓度抗生素(100μg/ml)。
[0078]
对照组加入100μl 0.3m正丁醇。
[0079]
不处理组加入100μl 10mm灭菌磷酸盐缓冲液(pbs)。
[0080]
将以上所有样品同时重悬至混合均匀，分别静置0秒，10秒，30秒，1分钟，3分钟，5分钟。
[0081]
其余操作同实施例1的步骤3)，4)。
[0082]
实验结果表明(如图4)，采用本发明方法的这种杀菌效果是瞬时的，即在很短的处理时间内就可起到很好的杀菌效果。0.3m正丁醇配合妥布霉素(100μg/ml)，处理金黄色葡萄球菌仅30秒的时间，就可以杀灭99％以上的平台期金黄色葡萄球菌。在3分钟以上就可以达到最佳的杀菌效果，即几乎全部的细菌。
[0083]
实施例5
[0084]
低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合氨基糖苷类抗生素处理其他几种革兰氏阳性
菌
[0085]
1)将4℃保存的静止期细菌1:200接于新鲜的无菌lb液体培养基中，(配制成分：1l培养基含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，并用单蒸水补齐，高压蒸汽灭菌20分钟)37℃条件下培养24小时。
[0086]
2)分别吸取细菌培养物33μl置于做好标记的1.5ml离心管中，13000rpm，离心1分钟，吸去上清。
[0087]
实验组分别加入100μl 0.3m正丁醇配制的不同种类及浓度抗生素如下：
[0088]
tobramycin:0μg/ml(对照)，50μg/ml，100μg/ml，250μg/ml，500μg/ml(用于处理粪肠球菌，表皮葡萄球菌)；
[0089]
streptomycin：0μg/ml(对照)，50μg/ml，100μg/ml，250μg/ml，500μg/ml(用于藤黄八叠球菌)；
[0090]
对照组加入100μl 0.3m正丁醇。
[0091]
不处理组加入100μl 10mm灭菌磷酸盐缓冲液(pbs)。
[0092]
将以上所有样品同时重悬至混合均匀，静置3分钟。
[0093]
其余操作同实施例1的步骤3)，4)。
[0094]
实验结果如图5显示，表皮葡萄球菌(具有链霉素抗性)总体妥布霉素比较敏感，不管是低离子休克或是本发明的处理方法处理都有不同程度的杀伤，但正丁醇配合氨基糖苷类抗生素杀伤效果更明显。
[0095]
粪场球菌细胞壁较厚，总体对抗生素比较不敏感，普通的方法一般不能将其杀死。我们分别尝试了低离子休克及低离子休克条件下，正丁醇配合氨基糖苷类抗生素对其的杀伤效果。结果显示，正丁醇配合妥布霉素可将其杀死，且有抗生素浓度依赖效应。当妥布霉素浓度为500μg/ml时，正丁醇配合妥布霉素可杀灭99.999％以上的平台期的粪肠球菌。
[0096]
对于藤黄八叠球菌，敏感性测试实验发现它对妥布霉素和卡那霉素耐受。研究中我们发现，低离子休克及低离子休克条件下，正丁醇配合链霉素可杀灭99.9％以上的藤黄八叠球菌。
[0097]
表3低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合氨基糖按类抗生素处理其他几种革兰氏阳性菌的相对杀菌效率
[0098][0099]
注：a.有抗生素存活率＝0.3m正丁醇配合抗生素处理存活菌落数/无正丁醇(纯水)无抗生素
·
存活菌落数；
[0100]
b无抗生素存活率＝0.3m正丁醇无抗生素处理的存活菌落数/无正丁醇(纯水)无抗生素存活菌落数；
[0101]
c相对杀菌效率＝0.3m正丁醇无抗生素处理的存活率
×
纯水配合有抗生素的存活率/0.3m正丁醇配合抗生素处理存活率。
[0102]
d.相对杀菌效率的计算是正丁醇在低离子休克条件下配合抗生素相对于纯水条件下相同抗生素浓度下的杀菌效率。
[0103]
实施例6
[0104]
低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合妥布霉素处理几种革兰氏阴性菌杀菌效果
[0105]
1)将4℃保存的静止期细菌1:200接于新鲜的无菌lb液体培养基中(配制成分：1l培养基含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，并用单蒸水补齐，高压蒸汽灭菌20分钟)，37℃条件下培养24小时。
[0106]
2)分别吸取细菌培养物33μl置于做好标记的1.5ml离心管中，13000rpm，离心1分钟，吸去上清。
[0107]
实验组分别加入100μl 0.3m正丁醇配制的不同种类及浓度抗生素如下：
[0108]
tobramycin:0μg/ml(对照)，5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，500μg/ml；
[0109]
对照组加入100μl 0.3m正丁醇。
[0110]
不处理组加入100μl 10mm灭菌磷酸盐缓冲液(pbs)，将以上所有样品同时重悬至混合均匀，静置2分钟。
[0111]
其余操作同实施例1的步骤3)，4)。
[0112]
实验结果如图6所示，在妥布霉素浓度低于25μg/ml时，正丁醇配合妥布霉素处理平台期大肠杆菌比单纯的水处理配合妥布霉素的杀伤效果增强3个以上数量级。而当抗生素高于一定浓度时，细菌的整体的死亡率增大，本发明们的处理方法对比单纯的水处理的效果明显减弱或者两者的杀菌效果相同。这也更说明了本发明的这种方法在降低抗生素浓度下依然可以达到很好的杀菌效果的优势。
[0113]
低离子休克条件下，正丁醇配合妥布霉素对平台期铜绿假单胞菌的杀伤效果更加明显，当妥布霉素浓度仅为50μg/ml时，可以杀灭全部的细菌。
[0114]
志贺氏菌总体上对抗生素比较敏感，但对其的杀伤趋势基本与大肠杆菌一致，当妥布霉素浓度为10μg/ml时，正丁醇配合妥布霉素处理平台期大肠杆菌比单纯的水处理配合妥布霉素的杀伤效果增强2个以上数量级，随着妥布霉素浓度增大，细菌死亡率增大，本发明的处理方法对比单纯的水处理的效果明显减弱，但始终要比单纯的水处理配合妥布霉素杀菌效果好。
[0115]
表4低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合妥布霉素处理几种革兰氏阴性菌的相对杀菌效率
[0116][0117]
注：a.有抗生素存活率＝0.3m正丁醇配合抗生素处理存活菌落数/无正丁醇(纯水)无抗生素存活菌落数；
[0118]
b.无抗生素存活率＝0.3m正丁醇无抗生素处理的存活菌落数/无正丁醇(纯水)无抗生素存活菌落数；
[0119]
c.相对杀菌效率＝0.3m正丁醇无抗生素处理的存活率
×
纯水配合有抗生素的存活率/0.3m正丁醇配合抗生素处理存活率。
[0120]
d.相对杀菌效率的计算是正丁醇在低离子休克条件下配合抗生素相对于纯水条件下相同抗生素浓度下的杀菌效率。
[0121]
实施例7
[0122]
低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合妥布霉素处理persister
‑
like菌的杀菌效果
[0123]
1.营养转换菌的制备
[0124]
将平台期金黄色葡萄球菌1:500转接培养至600nm下od＝0.5
‑
0.6，用等体积m9培养基洗涤两次后，转入等体积的m9+延胡索酸(2g/l)(m9+f)极限培养基中继续培养4个小
时。
[0125]
2.饥饿诱导菌的制备
[0126]
从4℃保存的金黄色葡萄球菌按照体积比例为1:500取40μl接入体积为20ml的新鲜mhb培养基中，37℃，在摇床培养24小时，取2ml菌液于离心管中，用等体积的ynb培养基洗涤两次后，10倍稀释于ynb培养基中，在摇床中继续培养5个小时。
[0127]
3.处理方法
[0128]
1)分别吸取细菌培养物100μl置于做好标记的1.5ml离心管中，13000rpm，离心1分钟，吸去上清。实验组分别加入100μl 0.3m正丁醇配制的妥布抗生素(100μg/ml)。对照组加入100μl 0.3m正丁醇。不处理组加入100μl 10mm灭菌磷酸盐缓冲液(pbs)，将以上所有样品同时重悬至混合均匀，静置5分钟。
[0129]
其余操作同实施例1的步骤3)，4)。
[0130]
实验结果如图7所示，正丁醇在低离子休克条件下配合妥布霉素处理营养转圜后的和饥饿诱导后的金黄色葡萄球菌。对比单纯的低离子休克条件下，妥布霉素处理营养转换菌有两个数量级以上的增强作用，而对饥饿诱导菌杀菌作用却没有预想增强效果。相对杀菌效率见表5。
[0131]
表5低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合妥布霉素处理persister
‑
like菌的相对杀菌效率
[0132][0133][0134]
注：a.有抗生素存活率＝0.3m正丁醇配合抗生素处理存活菌落数/无正丁醇(纯水)无抗生素存活菌落数；
[0135]
b.无抗生素存活率＝0.3m正丁醇无抗生素处理的存活菌落数/无正丁醇(纯水)无抗生素存活菌落数；
[0136]
c.相对杀菌效率＝0.3m正丁醇无抗生素处理的存活率
×
纯水配合有抗生素的存活率/0.3m正丁醇配合抗生素处理存活率。
[0137]
实施例8
[0138]
低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合链霉素处理平台期mrsa
[0139]
1)将4℃保存的静止期细菌1:200接于新鲜的无菌lb液体培养基中(配制成分：1l培养基含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，并用单蒸水补齐，高压蒸汽灭菌20分钟)，37℃条件下培养24小时。
[0140]
2)分别吸取细菌培养物33μl置于做好标记的1.5ml离心管中，13000rpm，离心1分钟，吸去上清。实验组分别加入100μl 0.3m正丁醇或h2o配制妥布霉素(100μg/ml)，对照组
加入100μl 0.3m正丁醇或h2o，不处理组加入100μl 10mm灭菌磷酸盐缓冲液(pbs)，将以上所有样品同时重悬至混合均匀，静置2分钟。
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其余操作同实施例1的步骤3)，4)。
[0142]
本研究中，我们选取了mrsa标准菌株atcc43300尝试了多种抗生素尝试对其杀伤效果。结果显示，其只对链霉素敏感。接下来，我们发现，正丁醇配合链霉素(400μg/ml，处理5分钟)可杀灭99.99％以上的平台期mrsa。而单纯的低离子休克和低离子休克条件下，正丁醇配合链霉素对其杀伤效果仅为90％左右，结果如图8所示。
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表6低离子休克条件下，0.3m正丁醇配合链霉素处理mrsa的相对杀菌效率
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注：a.有抗生素存活率＝0.3m正丁醇配合抗生素处理存活菌落数/无正丁醇(纯水)无抗生素存活菌落数；
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b.无抗生素存活率＝0.3m正丁醇无抗生素处理的存活菌落数/无正丁醇(纯水)无抗生素存活菌落数；
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c.相对杀菌效率＝0.3m正丁醇无抗生素处理的存活率
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纯水配合有抗生素的存活率/0.3m正丁醇配合抗生素处理存活率。