一种表面改性人工颅骨修复体的制作方法与流程

1.本发明涉及生物医学材料技术领域，特别是一种表面改性人工颅骨修复体的制作方法。


背景技术：

2.颅骨缺损是颅颌面外科的临床常见病，常见修补方式包括：钛网修补、peek材料修补等，其中peek材料学名为聚醚醚酮（英文poly
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ether
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ether
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ketone，简称peek），拥有比强度高、弹性模量与自体骨接近（不会造成应力遮蔽）、ct无伪影、无磁性（能做核磁共振）、低导热性（不会因外界环境温度变化刺激人体）等优点，临床反馈优秀，市场份额也在稳步提升。
3.然而peek材料现阶段存在以下问题：1、peek材料作为高分子聚合物，表面自由能低，亲水性差，不利于细胞黏附，因此存在生物惰性，难以与组织结合，导致peek颅骨修复体上表面与皮下组织分离并摩擦，产生局部炎症和脑积液。
4.2、现有peek材料的改性主要为共混改性和表面涂层改性，共混改性为在peek粉料中添加ha羟基磷灰石再挤压注塑成型，表面涂层改性包括ha或钛涂层。两种方法都可以促进骨组织结合，但对皮下组织结合无帮助，且ha共混会降低peek材料的韧性。
5.为了改善peek修复体与软组织的结合，可以采用胶原蛋白对peek表面进行改性，但是胶原蛋白对peek表面改性存在以下难点或问题：现有改性主要使用化学交联法，包括
①
戊二醛交联法、
②1‑
乙基
‑3‑
（3
‑
二甲基氨丙基）
‑
碳化二亚胺（edc）联合n
‑
羟基琥珀酰亚胺（nhs）交联法。通过化学交联将胶原蛋白分子由线性分子链接成立体网状结构，然后用有机溶液和纯水充分冲洗，以去除残留的化学交联剂。化学交联的问题在于戊二醛交联法残留的戊二醛及官能团存在细胞毒性问题，且化学交联法步骤复杂，造成大量水资源浪费。
6.公开号为cn105802252a的专利文献公开了一种胶原蛋白改性方法，其利用辐照处理胶原蛋白和交联促进剂的混合物，进而得到可用于骨修复材料的改性胶原蛋白，其具有交联度高、稳定性好且不含交联剂的特点，然而其还具有如下问题：1. 其利用富羟基交联促进剂来提高胶原蛋白的交联度，同时采用较高的辐照剂量及辐照剂量率，再综合其它因素，虽然其获得了交联度高稳定性好的改性胶原蛋白，但其获得的改性胶原蛋白几乎为致密的实心结构体，这种结构体的改性胶原蛋白与peek材料结合后，并不利于皮下组织细胞的长入。
7.2. 该专利虽然公开了其改性胶原蛋白可应用于骨修复材料，即该专利是对胶原蛋白本身进行改性而获得骨修复材料，并不涉及对peek材料表面的改性，尤其对于具体如何将其应用于颅骨修复体没有任何涉及，而如何利用胶原蛋白对peek颅骨修复体表面进行改性是决定后期皮下组织细胞能否与peek颅骨修复体长久有效结合的关键因素。
8.3. 该专利通过对比实验直接粗略判定在辐照剂量较低的情况下交联效果不理想
（明书第00192段），其仅关注了胶原带白的交联度和稳定性，没有综合考虑其应用于颅骨修复体材料时的软组织结合性能，忽略了辐照剂量率的考量和其它因素，直接否定了较低辐照剂量的作用效果。


技术实现要素：

9.为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种表面改性人工颅骨修复体的制作方法，在peek表面形成了稳定的多孔结构胶原蛋白吸附层，进而显著改善了peek材料与皮下组织的结合性能，同时不使用任何化学交联剂及促进剂，完全避免了生物安全性问题，且步骤相对简单，节约水资源。
10.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种表面改性人工颅骨修复体的制作方法，包括按顺序进行的如下步骤：步骤s1 使用3d打印机打印实体peek颅骨修复体；步骤s2 用活柄百叶轮及砂纸把实体peek颅骨修复体打磨至无明显毛刺和划痕，然后将其置于90%浓硫酸中100℃水浴条件下表面腐蚀1分钟，使其表面腐蚀形成蚀孔；然后在去离子水中超声波清洗5分钟，重复3遍；再置于75%乙醇中5分钟，最后取出放入无菌玻璃培养皿，室温干燥后转移至生物安全箱；步骤s3 在生物安全箱内使用pbs缓冲液配置浓度为0.8~1.2mg/ml的i型胶原蛋白溶液，把peek颅骨修复片浸入i型胶原蛋白溶液中，超声震荡30min，之后继续浸泡18~24小时后取出，用去离子水清洗3~5次以去除多余胶原蛋白，获得外表面吸附有i型胶原蛋白层的颅骨修复体；步骤s4 将表面吸附有i型胶原蛋白层的颅骨修复体使用co
‑
60进行辐照交联处理，其辐照剂量为3~4kgy，辐照剂量率为140~150gy/min；步骤s5 将经辐照处理的颅骨修复体放入冷冻干燥机中，在冷冻条件下利用真空泵将干燥机内部抽成真空，真空干燥后获得所述表面改性人工颅骨修复体。
11.优选的，步骤s2中所述蚀孔的直径分布为0.01
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0.8mm。
12.优选的，步骤s3中所述i型胶原蛋白溶液中i型胶原蛋白浓度为1mg/ml。
13.优选的，步骤s4中辐照剂量为3.5kgy，辐照剂量率为145gy/min。
14.本发明的积极效果：本发明提供了一种相对安全、有效、易实现的胶原蛋白表面改性的颅骨修复体制作方法，即第一步使用3d打印机打印实体peek颅骨修复体；第二步对peek颅骨修复体进行预处理，以上两步会形成带有多孔表面的peek颅骨修复体；第三步对将ⅰ型胶原蛋白通过物理作用吸附固定在peek修复体表面，形成胶原蛋白吸附层；第四步采用co
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60辐照对i型胶原蛋白交联，其中辐照剂量为3.5kgy，辐照剂量率为145gy/min，以保证在实现交联的同时避免胶原蛋白吸附层水分流失率过高；最后一步采用冷冻真空干燥，使得具有足够水分的胶原蛋白吸附层中的水分直接升华，进而获得内部具有微孔结构的改性胶原蛋白吸附层，对细胞长入起到支架和锚定作用，非常有利于皮下细胞黏附，随着胶原蛋白的分解，降解形成的氨基酸类营养物质会促进组织细胞的生长，而当胶原蛋白完全分解时皮下细胞已经长入多孔表面结构中，组织与假体多孔表面稳定地联结在一起。总之，该方法能显著改善peek材料与皮下组织的结合性，同时不使用化学交联剂，生物相容性好，步骤相对简单，节约水资源。
附图说明
15.图1是实施例3步骤s2得到的颅骨修复体蚀孔表面扫描电镜图；图2是实施例3所获得的表面改性人工颅骨修复体胶原蛋白空间结构扫描电镜图；图3是实施例3的颅骨修复体在改性前后的表面亲水性测试结果对比；图4是对比例所获得的改性i型胶原蛋白的扫描电镜图。
具体实施方式
16.本发明提供一种表面改性人工颅骨修复体的制作方法，包括按顺序进行的如下步骤：步骤s1 使用3d打印机打印实体peek颅骨修复体（具体为：使用cura切片软件，peek颅骨修复体与皮下组织接触面垂直向上放置，主要参数设置为：丝径1.75mm，喷嘴直径0.2mm，将切片文件导入3d打印机，使用植入级peek材料进行打印）；步骤s2 用活柄百叶轮及砂纸把颅骨修复体打磨至无明显毛刺和划痕，避免与皮下组织摩擦产生炎症，同时利于胶原蛋白附着；然后将打磨后的实体颅骨修复体先在90%浓硫酸中100℃水浴条件下表面腐蚀1分钟，表面腐蚀形成蚀孔，所述蚀孔的孔径分布在0.01
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0.1mm，形成蚀孔的目的是为了提升胶原蛋白吸附层与颅骨修复体间的吸附结合强度，同时也便于胶原蛋白进入到蚀孔后的辐照交联，进而起到一定的锚定作用利于组织（骨组织及皮下组织）的长入，而孔径过大及过小（若硫酸浓度高腐蚀时间短获得的孔径相对较大，若硫酸浓度低腐蚀时间长则获得的孔径相对较小）的孔一方面会影响吸附力及交联效果，另一方面并不利于生物组织的长入；取出后在去离子水中超声波清洗5分钟，重复3遍，以清洗打磨过程中生成的碎屑和粉末及其它杂物，再置于75%乙醇中5分钟消毒，最后取出放入无菌玻璃培养皿，室温干燥后转移至生物安全箱；步骤s3 在生物安全箱内使用pbs缓冲液（ph7.4，使用海博生物生产的货号为hb8507的pbs缓冲剂制成的 1
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pbs缓冲液）配置浓度为0.8~1.2mg/ml的i型胶原蛋白溶液，把peek颅骨修复片浸入i型胶原蛋白溶液中，超声震荡30分钟以使得型胶原蛋白溶液充分进入蚀孔中，之后继续浸泡18~24小时后取出，用去离子水清洗3~5次以去除多余胶原蛋白，获得外表面吸附有i型胶原蛋白层的颅骨修复体；步骤s4 将表面吸附有i型胶原蛋白层的颅骨修复体使用co
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60进行辐照交联处理，其辐照剂量为3~4kgy，辐照剂量率为140~150gy/min；需要说明的是，i型胶原蛋白交联时留下足够的水分在下一步冷冻干燥时升华才能形成孔隙结构，如果交联时失去大量水分，剩下的胶原蛋白会变成致密的实心层，冷冻干燥后也无法形成孔隙结构，因此水分流失越少越好，而只有在上述辐照剂量以及辐照剂量率下，该胶原蛋白吸附层在实现交联的同时水分流失率较低，且此情况下辐照交联不会破坏i型胶原蛋白分子内部的三螺旋结构，保证胶原蛋白本身的生物活性。
17.步骤s5 将经辐照交联处理的颅骨修复体放入冷冻干燥机中，在冷冻条件下利用真空泵将干燥机内部抽成真空，胶原蛋白在冷冻条件下保持外观不塌陷，内部水分凝结为冰晶后直接升华，在i型胶原蛋白内部形成网状结构，利于皮下组织细胞的长入。真空干燥后获得所述表面改性人工颅骨修复体。
18.下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
19.实施例1本发明实施例1提供一种表面改性人工颅骨修复体的制作方法，包括按顺序进行的如下步骤：步骤s1使用3d打印机打印实体peek颅骨修复体；步骤s2用活柄百叶轮及砂纸把实体peek颅骨修复体打磨至无明显毛刺和划痕，然后将其置于90%浓硫酸中100℃水浴条件下表面腐蚀1分钟，使其表面腐蚀形成蚀孔，所述蚀孔的直径分布在0.01
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0.1mm；然后在去离子水中超声波清洗5分钟，重复3遍；再置于75%乙醇中5分钟，最后取出放入无菌玻璃培养皿，室温干燥后转移至生物安全箱；步骤s3 在生物安全箱内使用pbs缓冲液配置浓度为0.8mg/ml的i型胶原蛋白溶液，把peek颅骨修复片浸入i型胶原蛋白溶液中，超声震荡30min，之后继续浸泡24小时后取出，用去离子水清洗3次以去除多余胶原蛋白，获得外表面吸附有i型胶原蛋白层的颅骨修复体；步骤s4 将表面吸附有i型胶原蛋白层的颅骨修复体使用co
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60进行辐照交联处理，其辐照剂量为3kgy，辐照剂量率为150gy/min；步骤s5 将经辐照处理的颅骨修复体放入冷冻干燥机中，在冷冻条件下利用真空泵将干燥机内部抽成真空，真空干燥后获得所述表面改性人工颅骨修复体。
20.实施例2本发明实施例2提供一种表面改性人工颅骨修复体的制作方法，包括按顺序进行的如下步骤：步骤s1使用3d打印机打印实体peek颅骨修复体；步骤s2用活柄百叶轮及砂纸把实体peek颅骨修复体打磨至无明显毛刺和划痕，然后将其置于90%浓硫酸中100℃水浴条件下表面腐蚀1分钟，使其表面腐蚀形成蚀孔，所述蚀孔的直径分布在0.01
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0.1mm；然后在去离子水中超声波清洗5分钟，重复3遍；再置于75%乙醇中5分钟，最后取出放入无菌玻璃培养皿，室温干燥后转移至生物安全箱；步骤s3 在生物安全箱内使用pbs缓冲液配置浓度为1.2mg/ml的i型胶原蛋白溶液，把peek颅骨修复片浸入i型胶原蛋白溶液中，超声震荡30min，之后继续浸泡18小时后取出，用去离子水清洗5次以去除多余胶原蛋白，获得外表面吸附有i型胶原蛋白层的颅骨修复体；步骤s4 将表面吸附有i型胶原蛋白层的颅骨修复体使用co
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60进行辐照交联处理，其辐照剂量为4kgy，辐照剂量率为140gy/min；步骤s5 将经辐照处理的颅骨修复体放入冷冻干燥机中，在冷冻条件下利用真空泵将干燥机内部抽成真空，真空干燥后获得所述表面改性人工颅骨修复体。
21.实施例3本发明实施例3提供一种表面改性人工颅骨修复体的制作方法，包括按顺序进行的如下步骤：步骤s1 使用3d打印机打印实体peek颅骨修复体；步骤s2 用活柄百叶轮及砂纸把实体peek颅骨修复体打磨至无明显毛刺和划痕，然后将其置于90%浓硫酸中100℃水浴条件下表面腐蚀1分钟，表面腐蚀形成蚀孔，所述蚀孔的直径分布在0.01
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0.1mm（如图1所示）；然后置于去离子水中超声波清洗5分钟，重复3遍，
再置于75%乙醇中5分钟，最后取出放入无菌玻璃培养皿，室温干燥后转移至生物安全箱；步骤s3 在生物安全箱内使用pbs缓冲液配置浓度为1mg/ml的i型胶原蛋白溶液，把peek颅骨修复片浸入i型胶原蛋白溶液中，超声震荡30min，之后继续浸泡20小时后取出，用去离子水清洗4次以去除多余胶原蛋白，获得外表面吸附有i型胶原蛋白层的颅骨修复体；步骤s4 将表面吸附有i型胶原蛋白层的颅骨修复体使用co
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60进行辐照交联处理，其辐照剂量为3.5kgy，辐照剂量率为145gy/min；步骤s5 将经辐照处理的颅骨修复体放入冷冻干燥机中，在冷冻条件下利用真空泵将干燥机内部抽成真空，真空干燥后获得所述表面改性人工颅骨修复体。
22.实施例3中所述颅骨修复体在胶原蛋白改性前后的表面亲水性测试结果如图3所示，表面改性前后接触角：（a）改性前接触角83
°
（b）胶原蛋白改性后接触角35
°
。
23.实施例3所得i型胶原蛋白吸附层体外降解测试：准备两根试管，配置ph=7.4，浓度100μg/ml的胶原蛋白酶溶液各10ml，称取约5mg的未交联i型胶原蛋白和辐射交联的i型胶原蛋白置于胶原蛋白酶溶液中，试管放置于37℃恒温箱中，每隔1小时观察分解情况，i型胶原蛋白吸附层体外降解测试分解率如下表所示。时间/h123456对比例分解率50%80%100%100%100%100%实施例3分解率15%25%30%35%40%40%
24.上表表明了本专利的胶原蛋白在peek颅骨修复体表面的辐照交联有效性。
25.实施例3辐照交联且冷冻干燥后获得的i型胶原蛋白扫描电镜图如图2所示，可见其内部呈现多孔网状结构。
26.对比例将10g交联促进剂peg800添加到90g i型胶原蛋白原液(其中胶原蛋白的含量为0.5％( m/m ))中，在辐射剂量为15kgy的条件下采用钴
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60辐射处理60min；将辐照所得产物在冻干机中在
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30℃下冷冻干燥140min，得到改性胶原蛋白，其扫描电镜图如图4所示，可见其基本呈现实心结构，并未获得如实施例3所示的内部具有孔洞的网状结构。
27.以上所述的仅为本发明的优选实施例，所应理解的是，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的思想和原则之内所做的任何修改、等同替换等等，均应包含在本发明的保护范围之内。