1.本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法。
背景技术：2.随着人们物质生活水平的逐渐提高，吃饱穿暖对人们来说不再是难题，生活的富裕使得人们开始追求更高层面的生活。
3.细胞是我们人体的基本组成单位，人体衰老的原因就是体内细胞的衰老。随着年龄的增长，人体内细胞增殖和分化能力减弱，新生细胞补充不足，衰老细胞不能及时被替代。细胞的老化促使人体的各生理系统功能下降和衰变，从而导致各种疾病的发生，最终引起死亡。
4.干细胞是一类具有自我更新，多向分化的多潜能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。
5.干细胞第一次从脂肪组织提取是在2001年的时候，用于在很多医疗应用都已被广泛承认，而且脂肪提取的难度不高、增加了脂肪干细胞的优势。自从那时候，脂肪干细胞的密集研究和成功的医疗应用已在全球广泛实施。
6.但是，目前干细胞治疗疾病还存在以下问题：
7.1、无法将自体脂肪干细胞裂解液用于治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复；
8.2、对于的方法治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的疗效较差，甚至起不到治疗效果；
9.3、技术不成熟，成本高。
10.基于上述情况，本发明提出了一种二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法，可有效解决以上问题。
技术实现要素：11.本发明的目的在于提供一种二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法。本发明的二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法可很好地将自体脂肪干细胞裂解液用于治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复；且对于的方法治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的疗效好，治疗效果显著；且技术路线成熟，所用的脂肪组织来源广泛、取材容易且不涉及伦理问题，成本较低，便于大规模工业化生产。
12.为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是：
13.一种二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法，包括下列步骤：
14.(1)在无菌条件下式采集脂肪；
15.(2)将步骤(1)采集的脂肪搅碎，收集于离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静置分层，收集上层部分用磷酸盐缓冲液洗涤；
16.(3)加入1
‑
1.5倍体积的胶原酶消化，然后加入1
‑
1.5倍体积的含12
‑
14％血清dmem
‑
lg终止消化，充分混均后室温静置12
‑
15min分层，去掉上层，离心，并收集下层部分；
17.(4)加入2.2
‑
2.5倍体积的红细胞裂解液重悬3
‑
5min，离心并弃上清；用pbs液清洗，采用50
‑
60μm滤膜过滤后，向所得细胞中加含12
‑
14％血清dmem
‑
lg培养液，离心收集细胞，并于100
‑
120u/ml青霉素或链霉素、12
‑
14％血清dmem
‑
lg中培养，即获得脂肪干细胞；
18.(5)将步骤(4)中获得的脂肪干细胞所述进行传代培养；
19.(6)将步骤(5)步获得的传代细胞调整细胞浓度为2
‑5×
106，溶解于生理盐水中，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量(g)的比例为7：3，于
‑
85℃冰箱中冷冻至完全冻结，后置于39℃温度条件下加热，完成冻融操作，离心获得细胞悬液x1和沉淀x1，收集细胞悬液x1，获得初步裂解物；
20.(7)向步骤(6)步获得的沉淀x1中加入含有体积浓度为0.15％的动物细胞裂解液的生理盐水，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量质量(g)的比例为7：3，于振幅为25％、5℃的超声条件下超声处理，离心获得细胞悬液x2和沉淀x2，收集细胞悬液x2，获得深度裂解物，弃去沉淀b；
21.(8)将步骤(6)步获得的细胞悬液x1和步骤(7)步获得的细胞悬液x2分别用生理盐水溶解并混合，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量(g)的比例为1：1，获得混合裂解液；
22.(9)将混合裂解液离心获得细胞悬液x3和沉淀x3，弃去沉淀x3，收集细胞悬液x3，获得最终裂解物；
23.(10)将步骤(9)获得的最终裂解物用于男性勃起障碍及女性海绵体修复的治疗。
24.本发明的二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法可很好地将自体脂肪干细胞裂解液用于治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复；且对于的方法治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的疗效好，治疗效果显著；且技术路线成熟，所用的脂肪组织来源广泛、取材容易且不涉及伦理问题，成本较低，便于大规模工业化生产。
25.优选的，步骤(1)中，所述脂肪为人体脂肪。
26.优选的，步骤(3)和(4)中，所述血清为自体血清。
27.优选的，所述步骤(5)步中，将步骤(4)中获得的脂肪干细胞传代培养至p3代细胞。
28.优选的，将所述步骤(6)步中的冻融操作重复3
‑
5次。
29.优选的，所述步骤(6)步中的冻融操作的加热时间为18
‑
24min。
30.优选的，所述步骤(6)步中的超声处理的时间为8
‑
12min。
31.本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
32.本发明的二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法可很好地将自体脂肪干细胞裂解液用于治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复；且对于的方法治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的疗效好，治疗效果显著；且技术路线成熟，所用的脂肪组织来源广泛、取材容易且不涉及伦理问题，成本较低，便于大规模工业化生产。
具体实施方式
33.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是不能理解为对本专利的限制。
34.实施例1：
35.一种二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法，包括下列步骤：
36.(1)在无菌条件下式采集脂肪；
37.(2)将步骤(1)采集的脂肪搅碎，收集于离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静置分层，收集上层部分用磷酸盐缓冲液洗涤；
38.(3)加入1
‑
1.5倍体积的胶原酶消化，然后加入1
‑
1.5倍体积的含12
‑
14％血清dmem
‑
lg终止消化，充分混均后室温静置12
‑
15min分层，去掉上层，离心，并收集下层部分；
39.(4)加入2.2
‑
2.5倍体积的红细胞裂解液重悬3
‑
5min，离心并弃上清；用pbs液清洗，采用50
‑
60μm滤膜过滤后，向所得细胞中加含12
‑
14％血清dmem
‑
lg培养液，离心收集细胞，并于100
‑
120u/ml青霉素或链霉素、12
‑
14％血清dmem
‑
lg中培养，即获得脂肪干细胞；
40.(5)将步骤(4)中获得的脂肪干细胞所述进行传代培养；
41.(6)将步骤(5)步获得的传代细胞调整细胞浓度为2
‑5×
106，溶解于生理盐水中，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量(g)的比例为7：3，于
‑
85℃冰箱中冷冻至完全冻结，后置于39℃温度条件下加热，完成冻融操作，离心获得细胞悬液x1和沉淀x1，收集细胞悬液x1，获得初步裂解物；
42.(7)向步骤(6)步获得的沉淀x1中加入含有体积浓度为0.15％的动物细胞裂解液的生理盐水，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量质量(g)的比例为7：3，于振幅为25％、5℃的超声条件下超声处理，离心获得细胞悬液x2和沉淀x2，收集细胞悬液x2，获得深度裂解物，弃去沉淀b；
43.(8)将步骤(6)步获得的细胞悬液x1和步骤(7)步获得的细胞悬液x2分别用生理盐水溶解并混合，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量(g)的比例为1：1，获得混合裂解液；
44.(9)将混合裂解液离心获得细胞悬液x3和沉淀x3，弃去沉淀x3，收集细胞悬液x3，获得最终裂解物；
45.(10)将步骤(9)获得的最终裂解物用于男性勃起障碍及女性海绵体修复的治疗。
46.优选的，步骤(1)中，所述脂肪为人体脂肪。
47.优选的，步骤(3)和(4)中，所述血清为自体血清。
48.优选的，所述步骤(5)步中，将步骤(4)中获得的脂肪干细胞传代培养至p3代细胞。
49.优选的，将所述步骤(6)步中的冻融操作重复3
‑
5次。
50.优选的，所述步骤(6)步中的冻融操作的加热时间为18
‑
24min。
51.优选的，所述步骤(6)步中的超声处理的时间为8
‑
12min。
52.实施例2：
53.一种二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法，包括下列步骤：
54.(1)在无菌条件下式采集脂肪；
55.(2)将步骤(1)采集的脂肪搅碎，收集于离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静置分层，收集上层部分用磷酸盐缓冲液洗涤；
56.(3)加入1倍体积的胶原酶消化，然后加入1倍体积的含12％血清dmem
‑
lg终止消化，充分混均后室温静置12min分层，去掉上层，离心，并收集下层部分；
57.(4)加入2.2倍体积的红细胞裂解液重悬3min，离心并弃上清；用pbs液清洗，采用50μm滤膜过滤后，向所得细胞中加含12％血清dmem
‑
lg培养液，离心收集细胞，并于100u/ml青霉素或链霉素、12％血清dmem
‑
lg中培养，即获得脂肪干细胞；
58.(5)将步骤(4)中获得的脂肪干细胞所述进行传代培养；
59.(6)将步骤(5)步获得的传代细胞调整细胞浓度为2
×
106，溶解于生理盐水中，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量(g)的比例为7：3，于
‑
85℃冰箱中冷冻至完全冻结，后置于39℃温度条件下加热，完成冻融操作，离心获得细胞悬液x1和沉淀x1，收集细胞悬液x1，获得初步裂解物；
60.(7)向步骤(6)步获得的沉淀x1中加入含有体积浓度为0.15％的动物细胞裂解液的生理盐水，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量质量(g)的比例为7：3，于振幅为25％、5℃的超声条件下超声处理，离心获得细胞悬液x2和沉淀x2，收集细胞悬液x2，获得深度裂解物，弃去沉淀b；
61.(8)将步骤(6)步获得的细胞悬液x1和步骤(7)步获得的细胞悬液x2分别用生理盐水溶解并混合，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量(g)的比例为1：1，获得混合裂解液；
62.(9)将混合裂解液离心获得细胞悬液x3和沉淀x3，弃去沉淀x3，收集细胞悬液x3，获得最终裂解物；
63.(10)将步骤(9)获得的最终裂解物用于男性勃起障碍及女性海绵体修复的治疗。
64.步骤(1)中，所述脂肪为人体脂肪。
65.步骤(3)和(4)中，所述血清为自体血清。
66.所述步骤(5)步中，将步骤(4)中获得的脂肪干细胞传代培养至p3代细胞。
67.将所述步骤(6)步中的冻融操作重复3次。
68.所述步骤(6)步中的冻融操作的加热时间为18min。
69.所述步骤(6)步中的超声处理的时间为8min。
70.实施例3：
71.一种二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法，包括下列步骤：
72.(1)在无菌条件下式采集脂肪；
73.(2)将步骤(1)采集的脂肪搅碎，收集于离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静置分层，收集上层部分用磷酸盐缓冲液洗涤；
74.(3)加入1.5倍体积的胶原酶消化，然后加入1.5倍体积的含14％血清dmem
‑
lg终止消化，充分混均后室温静置15min分层，去掉上层，离心，并收集下层部分；
75.(4)加入2.5倍体积的红细胞裂解液重悬5min，离心并弃上清；用pbs液清洗，采用60μm滤膜过滤后，向所得细胞中加含14％血清dmem
‑
lg培养液，离心收集细胞，并于120u/ml青霉素或链霉素、14％血清dmem
‑
lg中培养，即获得脂肪干细胞；
76.(5)将步骤(4)中获得的脂肪干细胞所述进行传代培养；
77.(6)将步骤(5)步获得的传代细胞调整细胞浓度为5
×
106，溶解于生理盐水中，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量(g)的比例为7：3，于
‑
85℃冰箱中冷冻至完全冻结，后置于39℃温度条件下加热，完成冻融操作，离心获得细胞悬液x1和沉淀x1，收集细胞悬液x1，获得初步裂解物；
78.(7)向步骤(6)步获得的沉淀x1中加入含有体积浓度为0.15％的动物细胞裂解液的生理盐水，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量质量(g)的比例为7：3，于振幅为25％、5℃的超声条件下超声处理，离心获得细胞悬液x2和沉淀x2，收集细胞悬液x2，获得深度裂解物，弃去沉淀b；
79.(8)将步骤(6)步获得的细胞悬液x1和步骤(7)步获得的细胞悬液x2分别用生理盐水溶解并混合，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量(g)的比例为1：1，获得混合裂解液；
80.(9)将混合裂解液离心获得细胞悬液x3和沉淀x3，弃去沉淀x3，收集细胞悬液x3，获得最终裂解物；
81.(10)将步骤(9)获得的最终裂解物用于男性勃起障碍及女性海绵体修复的治疗。
82.步骤(1)中，所述脂肪为人体脂肪。
83.步骤(3)和(4)中，所述血清为自体血清。
84.所述步骤(5)步中，将步骤(4)中获得的脂肪干细胞传代培养至p3代细胞。
85.将所述步骤(6)步中的冻融操作重复5次。
86.所述步骤(6)步中的冻融操作的加热时间为24min。
87.所述步骤(6)步中的超声处理的时间为12min。
88.实施例4：
89.一种二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法，包括下列步骤：
90.(1)在无菌条件下式采集脂肪；
91.(2)将步骤(1)采集的脂肪搅碎，收集于离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静置分层，收集上层部分用磷酸盐缓冲液洗涤；
92.(3)加入1.25倍体积的胶原酶消化，然后加入1.25倍体积的含13％血清dmem
‑
lg终止消化，充分混均后室温静置13min分层，去掉上层，离心，并收集下层部分；
93.(4)加入2.4倍体积的红细胞裂解液重悬4min，离心并弃上清；用pbs液清洗，采用55μm滤膜过滤后，向所得细胞中加含13％血清dmem
‑
lg培养液，离心收集细胞，并于110u/ml青霉素或链霉素、13％血清dmem
‑
lg中培养，即获得脂肪干细胞；
94.(5)将步骤(4)中获得的脂肪干细胞所述进行传代培养；
95.(6)将步骤(5)步获得的传代细胞调整细胞浓度为3.5
×
106，溶解于生理盐水中，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量(g)的比例为7：3，于
‑
85℃冰箱中冷冻至完全冻结，后置于39℃温度条件下加热，完成冻融操作，离心获得细胞悬液x1和沉淀x1，收集细胞悬液x1，获得初步裂解物；
96.(7)向步骤(6)步获得的沉淀x1中加入含有体积浓度为0.15％的动物细胞裂解液的生理盐水，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量质量(g)的比例为7：
3，于振幅为25％、5℃的超声条件下超声处理，离心获得细胞悬液x2和沉淀x2，收集细胞悬液x2，获得深度裂解物，弃去沉淀b；
97.(8)将步骤(6)步获得的细胞悬液x1和步骤(7)步获得的细胞悬液x2分别用生理盐水溶解并混合，所用生理盐水的体积(ml)与步骤(5)步中脂肪干细胞质量(g)的比例为1：1，获得混合裂解液；
98.(9)将混合裂解液离心获得细胞悬液x3和沉淀x3，弃去沉淀x3，收集细胞悬液x3，获得最终裂解物；
99.(10)将步骤(9)获得的最终裂解物用于男性勃起障碍及女性海绵体修复的治疗。
100.步骤(1)中，所述脂肪为人体脂肪。
101.步骤(3)和(4)中，所述血清为自体血清。
102.所述步骤(5)步中，将步骤(4)中获得的脂肪干细胞传代培养至p3代细胞。
103.将所述步骤(6)步中的冻融操作重复4次。
104.所述步骤(6)步中的冻融操作的加热时间为21min。
105.所述步骤(6)步中的超声处理的时间为11min。
106.本发明的二段式自体脂肪干细胞裂解液治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的方法可很好地将自体脂肪干细胞裂解液用于治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复；且对于的方法治疗男性勃起障碍及女性海绵体修复的疗效好，治疗效果显著；且技术路线成熟，所用的脂肪组织来源广泛、取材容易且不涉及伦理问题，成本较低，便于大规模工业化生产。
107.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。