一种中药组合物及其制备方法和应用

1.本发明属于中医药技术领域，具体涉及一种中药组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.冠状病毒是自然界广泛存在的一大类病毒，感染脊椎动物，如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。新型冠状病毒(sars
‑
cov
‑
2)属于冠状病毒科中的β属冠状病毒，基因特征与sarsr
‑
cov和mersr
‑
cov有明显区别。病毒对紫外线和热敏感，75％乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。基于目前的流行病学调查和研究结果，潜伏期为1～14天，多为3～7天；传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，无症状感染者也可能成为传染源；主要传播途径为经呼吸道飞沫和接触传播，在相对封闭的环境长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能，其他传播途径尚待明确。
3.因此，如何治疗冠状病毒疾病、防止病毒侵害以及消除空气中滞留的病毒成为了当前抗冠状病毒疾病研究的重要课题。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种中药组合物及其制备方法和应用，以改善现有冠状病毒疾病、冠状病毒侵害以及空气中滞留的病毒所引起的危害。
5.本发明的第一方面，提供一种中药组合物，包括以下组分：白芷油、辛夷油、金银花油、厚朴油、陈皮油。
6.白芷油：为从伞形科当归属植物白芷的根经提取得到的挥发油。
7.辛夷油：为从木兰科木兰属植物望春花、玉兰或武当玉兰的干燥花蕾经提取得到的挥发油。
8.金银花油：为从忍冬科忍冬属植物忍冬的花蕾经提取得到的挥发油。
9.厚朴油：为从木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮经提取得到的挥发油。
10.陈皮油：为从芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮经提取得到的挥发油。
11.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物，按重量份数计，包括以下组分：8～30份白芷油，8～30份辛夷油，8～30份金银花油，8～30份厚朴油，8～30份陈皮油。
12.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物，按重量份数计，包括以下组分：15～28份白芷油，15～28份辛夷油，15～28份金银花油，15～28份厚朴油，15～28份陈皮油。
13.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物，按重量份数计，包括以下组分：20份白芷油，20份辛夷油，20份金银花油，20份厚朴油，20份陈皮油。
14.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物，还包括以下组分：连翘油、广藿香油、檀香油、羌活油和艾叶油中至少一个。
15.连翘油：为从木犀科植物连翘的干燥果实经提取得到的挥发油。
16.广藿香油：为从唇形科植物广藿香的干燥茎和叶经提取得到的挥发油；具有祛痰止咳平喘等功效，其中含有的广藿香酮具有抗菌活性。
17.檀香油：为从檀香科植物檀香的心材经蒸馏所得的挥发油。
18.羌活油：为从伞形科羌活属植物羌活或宽叶羌活的根茎和根经提取得到的挥发油。羌活油是中药羌活的有效成分之一，具有广泛的药理活性，具有抗炎、镇痛、解热、抑菌、抗过敏等作用。
19.艾叶油：为从菊科植物艾的干叶或鲜叶经提取得到的挥发油，其主要有效成分为蒲品烯醇
‑
4与α
‑
萜品烯醇。艾叶油为一种天然抗菌剂，抗菌谱广，对细菌、真菌及病毒均具有抗菌活性。艾叶油清热解毒，抗过敏，祛湿，治湿疹等功效。
20.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物，包括以下组分：白芷油、辛夷油、金银花油、厚朴油、陈皮油、连翘油、广藿香油、檀香油、羌活油和艾叶油。
21.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物，按重量组分计，包括以下组分：8～15份白芷油、8～15份辛夷油、8～15份金银花油、8～15份厚朴油、8～15份陈皮油、8～15份连翘油、8～15份广藿香油、8～15份檀香油、8～15份羌活油和8～15份艾叶油。
22.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物，按重量组分计，包括以下组分：10份白芷油、10份辛夷油、10份金银花油、10份厚朴油、10份陈皮油、10份连翘油、10份广藿香油、10份檀香油、10份羌活油和10份艾叶油。
23.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中白芷油、辛夷油、金银花油、厚朴油、陈皮油、连翘油、广藿香油、檀香油、羌活油以及艾叶油中至少一种为市售商品。
24.根据本发明的一些实施例，所述白芷油购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；辛夷油购自江西省吉水县赣旭香料油厂；金银花油购自吉安华新天然植物有限公司；厚朴油购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；陈皮油购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；连翘油购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；广藿香油购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；檀香油购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；羌活油购自江西省吉水县赣旭香料油厂；艾叶油购自吉水县金海天然香料油科技有限公司。
25.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中白芷油为白芷经水蒸气蒸馏法或超临界流体萃取法所得的提取物。
26.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中辛夷油为辛夷经水蒸气蒸馏法或超临界流体萃取法所得的提取物。
27.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中金银花油为金银花经水蒸气蒸馏法或超临界流体萃取法所得的提取物。
28.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中厚朴油为厚朴经水蒸气蒸馏法或超临界流体萃取法所得的提取物。
29.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中陈皮油为陈皮经水蒸气蒸馏法或超临界流体萃取法所得的提取物。
30.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中连翘油为连翘经水蒸气蒸馏法或超临界流体萃取法所得的提取物。
31.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中广藿香油为广藿香经水蒸气蒸馏法或超临界流体萃取法所得的提取物。
32.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中檀香油为檀香经水蒸气蒸馏法或超临界流体萃取法所得的提取物。
33.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中羌活油为羌活经水蒸气蒸馏法或超临界流体萃取法所得的提取物。
34.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中艾叶油为艾叶经水蒸气蒸馏法或超临界流体萃取法所得的提取物。
35.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中还包括在药学上可接受的辅料。
36.上述在药学上可接受的辅料，只要不对本发明的中药组合物的质量和性能产生不利的影响即可。
37.所述辅料包括稀释剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂中至少一种。
38.所述稀释剂为蔗糖、糊精、淀粉、乳糖、甘露醇、木糖醇、双歧糖中至少一种。
39.所述润湿剂为水或不同浓度的乙醇。
40.所述粘合剂为乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、海藻酸钠中至少一种。
41.所述崩解剂，为微晶纤维素、羧甲基淀粉钠中至少一种，可提高中药组合物的崩解度和释放度。
42.本领域技术人员可根据本说明书公开的内容能够选择和确定本发明的中药组合物中适用的辅料及其含量。
43.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物中还包括适用的添加剂，这些添加剂为本领域中已知的，例如乳化剂、芳香剂、增溶剂、抗结剂、消泡剂、粘合剂、缓冲剂、ph调节剂、推进剂、螯合剂以及防腐剂等。
44.根据本发明的一些实施例，根据使用需要，所述中药组合物的剂型为胶囊剂、滴丸剂、丸剂、注射剂、膏剂、合剂、凝胶剂、片剂、颗粒剂、微丸剂、气雾剂、乳剂、微球剂、纳米球剂、口服液体制剂、混悬剂或栓剂。
45.本发明的第二方面，提供上述中药组合物的制备方法，包括以下步骤：
46.(1)取所述中药组合物中各组分；
47.(2)将所述各组分混合、搅拌，得所述中药组合物。
48.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物的制备方法，包括以下步骤：
49.(1)取白芷油、辛夷油、金银花油、厚朴油、陈皮油；
50.(2)将以上各组分混合，搅拌均匀，得中药组合物。
51.根据本发明的一些实施例，所述中药组合物的制备方法，包括以下步骤：
52.(1)取白芷油、辛夷油、金银花油、厚朴油、陈皮油、连翘油、广藿香油、檀香油、羌活油和艾叶油；
53.(2)将以上各组分混合，搅拌均匀，得中药组合物。
54.本发明的第三方面，提供上述的中药组合物在制备预防或治疗冠状病毒性疾病的药物中的应用。
55.上述的冠状病毒是指属于冠状病毒科的病毒，特别是指冠状病毒属的病毒，更特别的是新型冠状病毒，包括他们的任何突变体。上述的冠状病毒性疾病是指冠状病毒科病毒，特别是冠状病毒属的病毒，更特别是新型冠状病毒，包括他们的任何突变体，引起的疾
病。
56.上述的治疗是指在患者中提升其免疫系统对抗冠状病毒的能力，在患者中减轻或消除冠状病毒性疾病中的一种或多种症状，防止轻症向重症转化，提高重症病人向普通病人转变的几率，缩短患者痊愈的时间，使病程缩短，以及促进核酸转阴。
57.本发明的第四方面，提供上述的中药组合物在制备杀灭和/或抑制微生物的药物中的应用。所述微生物，包括但不限于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌和甲型流感病毒。
58.本发明的第五方面，提供上述的中药组合物在制备空气消毒剂中的应用。
59.上述的中药组合物可以与基质配置成空气消毒剂，对多种微生物具有杀灭或抑制作用，尤其是空气中的致病菌或病毒药。所述空气消毒剂可以通过加热、喷雾、自然挥发等方式散发到空气中，或者用该空气消毒剂过滤、洗涤空气从而达到空气清新消毒的目的。上述的空气消毒剂具有使用安全、效果理想、气味芳香、对人体无害、对物品无腐蚀作用、无残留等优点。
60.本发明的第六方面，提供上述的中药组合物在制备用于预防冠状病毒的口罩中的应用。
61.目前，用于预防冠状病毒传播的口罩不具有杀灭病毒的作用，重复使用及其不安全，不能清洗和多次使用，且保质期较短；只能过滤空气中的粉尘和含毒飞沫。上述的中药组合物，可以填充在药剂盒或载药片中并应用于口罩上，用于预防冠状病毒疾病的效果更好。
62.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
63.(1)本发明的中药组合物采用白芷油、辛夷油、金银花油、厚朴油以及陈皮油为组分，各组分之间相互作用，使得该中药组合物无毒安全、细胞毒性低且对sars
‑
cov
‑
2冠状病毒具有显著的杀灭作用，可用于制备预防或治疗冠状病毒疾病的药物、制备用于预防冠状病毒的口罩以及制备空气消毒剂；
64.(2)本发明的中药组合物具有抗菌作用，能杀灭大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌以及空气中的自然菌；可用于制备杀灭和/或抑制微生物的药物。
附图说明
65.图1为本发明实施例1～2以及对照例1～3的中药组合物的细胞毒性试验结果图；
66.图2为本发明实施例1～2以及对照例1的中药组合物对sars
‑
cov
‑
2感染vero e6细胞致细胞病变的抑制作用图。
具体实施方式
67.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
68.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
69.实施例1
70.一种中药组合物，包括以下组分：20g白芷油、20g辛夷油、20g金银花油、20g厚朴
油、20g陈皮油。其中，白芷油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；辛夷油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂；金银花油为市售商品，购自吉安华新天然植物有限公司；厚朴油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；陈皮油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司。
71.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组合物。
72.实施例2
73.一种中药组合物，包括以下组分：10g的白芷油、10g辛夷油、10g金银花油、10g厚朴油、10g陈皮油、10g连翘油、10g广藿香油、10g檀香油、10g羌活油、10g艾叶油。其中，白芷油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；辛夷油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂；金银花油为市售商品，购自吉安华新天然植物有限公司；厚朴油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；陈皮油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；连翘油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；广藿香油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；檀香油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；羌活油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂；艾叶油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司。
74.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组合物。
75.实施例3
76.一种中药组合物，包括以下组分：18g的白芷油、18g辛夷油、18g金银花油、18g厚朴油、18g陈皮油、10g连翘油。其中，白芷油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；辛夷油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂；金银花油为市售商品，购自吉安华新天然植物有限公司；厚朴油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；陈皮油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；连翘油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司。
77.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组合物。
78.实施例4
79.一种中药组合物，包括以下组分：18g的白芷油、18g辛夷油、18g金银花油、18g厚朴油、18g陈皮油、10g广藿香油。其中，白芷油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；辛夷油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂；金银花油为市售商品，购自吉安华新天然植物有限公司；厚朴油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；陈皮油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；广藿香油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司。
80.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组合物。
81.实施例5
82.一种中药组合物，包括以下组分：18g的白芷油、18g辛夷油、18g金银花油、18g厚朴油、18g陈皮油、10g檀香油。其中，白芷油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限
公司；辛夷油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂；金银花油为市售商品，购自吉安华新天然植物有限公司；厚朴油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；陈皮油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；檀香油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司。
83.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组合物。
84.实施例6
85.一种中药组合物，包括以下组分：18g的白芷油、18g辛夷油、18g金银花油、18g厚朴油、18g陈皮油、10g羌活油。其中，白芷油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；辛夷油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂；金银花油为市售商品，购自吉安华新天然植物有限公司；厚朴油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；陈皮油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；羌活油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂。
86.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组合物。
87.实施例7
88.一种中药组合物，包括以下组分：18g的白芷油、18g辛夷油、18g金银花油、18g厚朴油、18g陈皮油、10g艾叶油。其中，白芷油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；辛夷油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂；金银花油为市售商品，购自吉安华新天然植物有限公司；厚朴油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；陈皮油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；艾叶油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司。
89.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组合物。
90.实施例8
91.一种中药组合物，包括以下组分：8g白芷油、30g辛夷油、15g金银花油、25g厚朴油、22g陈皮油。其中，白芷油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；辛夷油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂；金银花油为市售商品，购自吉安华新天然植物有限公司；厚朴油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；陈皮油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司。
92.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组合物。
93.对照例1
94.一种中药组合物，包括以下组分：28g连翘油、18g广藿香油、14g檀香油、20g羌活油以及20g艾叶油。连翘油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；广藿香油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；檀香油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；羌活油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂；艾叶油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司。
95.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组
合物。
96.对照例2
97.一种中药组合物，包括以下组分：25g厚朴油、25g广藿香油、25g檀香油、25g羌活油。其中，厚朴油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；广藿香油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；檀香油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；羌活油为市售商品，购自江西省吉水县赣旭香料油厂。
98.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组合物。
99.对照例3
100.一种中药组合物，与实施例2不同在于，该中药组合物包括以下组分：25g陈皮油、25g连翘油、25g艾叶油、25g白芷油。其中，陈皮油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；连翘油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；艾叶油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司；白芷油为市售商品，购自吉水县金海天然香料油科技有限公司。
101.以上中药组合物的制备方法为：将上述各组分混合，搅拌均匀，即可得到该中药组合物。
102.产品效果测试
103.1、对实施例1～2以及对照例1～3的中药组合物进行细胞毒性试验。
104.试验细胞：广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室病毒室提供的vero e6细胞。vero e6细胞，系一种非洲绿猴肾细胞系，用于病毒的培养，在抗病毒药物的研究中发挥了重要的作用，常用于筛选针对各种病毒的候选药物。
105.试验方法：
106.(1
‑
1)对96孔板单层vero e6细胞用的pbs(磷酸缓冲液)洗涤1次，弃上清，每孔分别加入100μl的2倍梯度稀释的实施例1～2以及对照例3的中药组合物。正常细胞组每孔加入等体积培养液，37℃、5％co2条件下培养3天。随后每孔加入浓度为5mg/ml的mtt(四氮唑盐)溶液20μl，继续孵育4小时。弃上清，每孔加入100μl dmso(二甲基亚砜)，低速振荡5分钟，490nm测定od值(吸光度)；
107.(1
‑
2)根据公式：药物对细胞的抑制率＝(正常组平均od值
‑
药物组平均od值)/(正常组平均od值)
×
100％，进行抑制率计算；
108.(1
‑
3)采用graphpad prism 8.0(一种科研统计作图软件)的非线性回归(nonlinear regression)方法，分别计算实施例1～2以及对照例1～3的中药组合物对细胞的半数毒性浓度(cc
50
)和最高无毒浓度(cc0)，得到图1所示本发明实施例1～2以及对照例1～3的中药组合物的细胞毒性试验结果图。
109.试验结果：
110.图1中，横坐标“log(dilution)
×
v”为稀释度对数；纵坐标“cell viability(％)”为细胞存活率，a图对应的是本发明实施例1中药组合物对vero e6细胞的细胞毒性试验结果图；b图对应的是本发明实施例2中药组合物对vero e6细胞的细胞毒性试验结果图；c图对应的是本发明对照例1中药组合物对vero e6细胞的细胞毒性试验结果图；d图对应的是本发明对照例2中药组合物对vero e6细胞的细胞毒性试验结果图；e图对应的是本发明对
照例3中药组合物对vero e6细胞的细胞毒性试验结果图。
111.依据图1，本发明实施例1～2以及对照例1～3的中药组合物的最高无毒浓度cc0分别为0.00250
×
v、0.000625
×
v、0.00250
×
v、0.00625
×
v、0.00125
×
v；半数毒性浓度cc
50
分别为0.00585
×
v、0.00217
×
v、0.00451
×
v、0.00128
×
v、0.00366
×
v，因此本发明实施例1～2以及对照例1～3的中药组合物对vero e6细胞的细胞毒性均为低，可用于正常的空气消毒或直接接触皮肤的洗涤类产品，且作为常用中药的提取物，亦可用于人体内服和外用。
112.2、对实施例1～2以及对照例1～3的中药组合物进行抗病毒药效实验。
113.试验细胞：vero e6细胞，由广州呼吸健康研究院(呼吸疾病国家重点实验室)病毒室提供。vero e6是一种非洲绿猴肾细胞系，用于病毒的培养，在抗病毒药物研究中发挥重要作用，常用于筛选针对各种病毒的候选药物。
114.试验病毒：sars
‑
cov
‑
2(基因库登录号为mt123290.1)为2019新型冠状病毒肺炎致病病毒的分离株，由广州海关技术中心bsl3实验室(呼吸疾病国家重点实验室高致病病原微生物研究室)保存，用于抗2019新型冠状病毒药物的筛选和药效研究。
115.试验方法：
116.(2
‑
1)96孔培养板每孔加入100μl浓度为2
×
105个/ml的vero e6细胞，37℃、5％co2培养24小时；药物实验组和病毒对照组加入50个半数细胞培养物感染量(tcid
50
)的sars
‑
cov
‑
2病毒液100μl/孔，37℃、5％co2培养箱吸附1小时。弃去培养液，加入100μl/孔的两倍梯度稀释的受试药物，每个浓度4个复孔，同时设细胞对照组、病毒对照组(病毒+细胞)、待测药物对照组(药物+细胞)、阳性药物瑞德西韦(remdesivir)对照组(病毒+remdesivir+细胞)。37℃、5％co2孵箱孵育3天后，光学显微镜下记录细胞病变作用(cpe)，程度按以下6级标准记录出现cpe的细胞占总细胞的百分比：
‑
：无；
±
：＜10％；+：25％；++：50％；+++：75％；++++：＞75％。记录cpe后，弃上清，mtt染色(方法同细胞毒性试验)，用cpe法确定药物对细胞的最大无毒浓度(cc0)；
117.(2
‑
2)采用数据处理软件graphpad prism8.0通过非线性回归法计算cpe减少法和mtt染色法中药物对病毒感染致细胞死亡的半数抑制浓度(ic
50
)，计算选择指数si(selective index：为cc0与ic
50
的比值，一般药理研究中认为：si>1，则表明该品种有效，越大越好；si>10，则表明该品种显著有效)。
118.cpe法试验结果：
119.本发明实施例1～2以及对照例1的中药组合物的ic
50
分别为0.0007476
×
v、0.0003162
×
v以及0.0008210
×
v；实施例1～2以及对照例1的中药组合物的ic
50
均小于cc0，si均大于1；因此，实施例1～2以及对照例1的中药组合物对病毒感染细胞引起细胞病变(cpe)均具有抑制作用。而对照例2～3的中药组合物的ic
50
大于cc0，si小于1，因此，对照组2～3的中药组合物对病毒感染细胞引起的细胞病变无抑制作用。
120.mtt染色法实验结果：
121.图2列出的是本发明实施例1～2以及对照例1的中药组合物对sars
‑
cov
‑
2感染vero e6细胞致细胞病变的抑制作用图，其中，横坐标log(dilution)
×
v为：稀释度对数，纵坐标inhibition(％)为抑制率，a图为本发明实施例1的中药组合物对sars
‑
cov
‑
2感染vero e6细胞致细胞病变的抑制作用图；b图为本发明实施例2的中药组合物对sars
‑
cov
‑
2感染vero e6细胞致细胞病变的抑制作用图；c图为本发明对照例1对sars
‑
cov
‑
2感染vero e6细
胞致细胞病变的抑制作用图。依据图2，本发明实施例1～2以及对照例1对sars
‑
cov
‑
2感染细胞引起的病毒感染细胞引起细胞病变均具有显著抑制作用，且本发明实施例1～2以及对照例1的中药组合物的si分别为18.49、6.68、14.22；因此，本发明实施例1和对照例1的中药组合物对于sars
‑
cov
‑
2(2019新型冠状病毒)的杀灭作用显著，且在药效强度上，本发明实施例1的中药组合物的药效强于本发明对照例1的中药组合物；本发明对照例1的中药组合物的药效强于本发明实施例2的中药组合物。
122.3、对实施例1的中药组合物进行抗菌实验。
123.试验菌株：
124.白色葡萄球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，由广州市微生物研究所有限公司提供。
125.中药消毒剂：
126.本发明实施例1的中药组合物。
127.染菌样片制备：
128.按照《消毒技术规范》(2002年版)2.1.1.2.3相关规定进行制备：取菌种第4～5代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18
‑
24h)，用胰蛋白酶大豆肉汤(即tsb营养肉汤)制含菌量约为1
×
108cfu/ml～5
×
108cfu/ml，可使用浊度计调整菌液浓度。滴染法染菌时，将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液，菌液滴加量每片为10μl，置室温下自然阴干后再使用。
129.菌液制备：
130.按照《消毒技术规范》(2002年版)2.1.1.2.3相关规定进行制备：取菌种第5代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18h～24h)，吸取3.0ml～5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔；将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s使细菌悬浮均匀；初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。
131.中和剂：
132.3g/l卵磷脂、30g/l吐温80、30g/l硫代硫酸钠的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tsb溶液)
133.中和剂鉴定试验：
134.按照《消毒技术规范》(2002年版)2.1.1.5相关规定，试验菌种为白色葡萄球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，水浴控制作用温度19～21℃，试验重复3次：
135.第1组：吸取消毒剂5.0ml于无菌小平皿内，将其置20℃
±
1℃水浴中5min后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中；待白色葡萄球菌作用0.5min、金黄色葡萄球菌作用5min后，立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0ml稀释液试管中，作用10min；用电动混合器混合20s，吸取该最终样液1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
136.第2组：吸取消毒剂5.0ml于无菌小平皿内，将其置20℃
±
1℃水浴中5min后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中；待白色葡萄球菌作用0.5min、金黄色葡萄球菌作用5min后，立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0ml中和剂试管中；用电动混合器混合20s，作用10min，选适宜稀释度悬液，吸取1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
137.第3组：吸取中和剂5.0ml于无菌小平皿中，将其置20℃
±
1℃水浴中5min后，用无
菌镊子夹入1菌片，并使浸透于中和剂内，作用10min；立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0ml中和剂试管中，用电动混合器混合20s，混匀；吸取该最终样液0.5ml，用中和剂做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
138.第4组：吸取中和产物溶液(以一片浸有消毒剂的载体置5.0ml中和剂内，作用10min)5.0ml于无菌小平皿内，将其置20℃
±
1℃水浴中5min后，用无菌镊子夹入1菌片，并使浸透于中和产物溶液中；作用10min，用无菌镊子取出菌片，移入含5.0ml中和产物溶液的试管中，用电动混合器混合20s，混匀；吸取该最终样液0.5ml，用中和产物溶液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
139.第5组：吸取稀释液5.0ml于无菌小平皿内，将其置20℃
±
1℃水浴中5min后，用无菌镊子夹入1菌片，并使浸透于稀释液中；作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0ml稀释液的试管中，用电动混合器混合20s，混匀；吸取该最终样液0.5ml，用稀释液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
140.第6组：分别吸取稀释液与中和剂各1.0ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15ml～20ml，培养观察。如出现细菌生长，提示试验材料或操作过程中可能有污染，应重新进行试验。
141.表1为中和剂鉴定数据。依据表1，第1组生长平均菌落数为1.67
×
106cfu/片；第2组生长平均菌落数为4.10
×
106cfu/片，较第1组多且高于第一组生长平均菌落数的1.5倍；第3组生长平均菌落数为4.35
×
106cfu/片，第4组生长平均菌落数为4.12
×
106cfu/片，第5组生长平均菌落数为4.52
×
106cfu/片，均高于第2组的菌落生长；第3组、第4组、第5组间菌落误差率分别为1.57％、4.15％、4.49％，均不超过15％；第6组均无菌生长；符合《消毒技术规范》(2002年版)2.1.1.5.7评价规定的相关要求，为合格的中和剂。
142.表1本发明所使用的中和剂鉴定数据
[0143][0144]
杀菌试验：
[0145]
对本发明实施例1的中药组合物原液采用《消毒技术规范》(2002年版)2.1.1.7的规定进行细菌定量杀灭试验方法进行杀灭大肠杆菌作用时间5min、10min、15min，杀灭金黄色葡萄球菌作用时间15min、30min、45min，试验重复3次，水浴控制试验温度为19℃～21℃：
[0146]
取无菌小平皿，按每片5.0ml的量，吸取该原液并注入平皿中；将盛有消毒剂平皿置20℃
±
1℃水浴箱内5min后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片3片，并使之浸透于消毒液中；大肠杆菌作用至5min、10min、15min，金黄色葡萄球菌作用至15min、30min、45min时，用无菌镊子将菌片取出分别移入含5.0ml中和剂试管中；用电动混合器混合20s，使菌片
上的细菌被洗脱进入中和液中，中和作用10min后，吸取1.0ml直接接种平皿，每管接种2个平皿，测定存活菌数；另取一平皿，注入10.0ml稀释液代替消毒液，放入2片菌片，作为阳性对照组；其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同；所有试验样本均在37℃温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h，观察最终结果。
[0147]
(1)为对大肠杆菌的杀灭效果：
[0148]
各次试验的阴性对照组均无菌生长。
[0149]
表2为本发明实施例1的中药组合物对大肠杆菌的杀灭试验结果。依据表2，大肠杆菌作用5min、10min、15min后，阳性对照值的平均活菌数的对数值为6.36，本发明实施例1的中药组合物对载体中大肠杆菌的杀灭对数值均大于3.00，平均杀灭率均大于99.9％，符合《消毒技术规范》(2002年版)2.1.1.7.7定量灭菌实验的评价规定的灭菌合格。
[0150]
表2本发明实施例1的中药组合物对大肠杆菌的杀灭试验结果
[0151][0152]
其中，杀灭率为按公式：杀灭率(％)＝(阳性对照组平均菌落数(cfu/片)
‑
试验组菌落数(cfu/片))
÷
阳性对照组平均菌落数(cfu/片)
×
100％计算所得。
[0153]
(2)对金黄色葡萄球菌的杀灭效果：
[0154]
各次试验的阴性对照组均无菌生长。
[0155]
表3本发明实施例1的中药组合物对金黄色葡萄球菌的杀灭试验结果
[0156][0157]
表3为本发明实施例1的中药组合物对金黄色葡萄球菌的杀灭试验结果。依据表3，金黄色葡萄球菌作用10min、30min、45min后，阳性对照组平均活菌数的对数值为6.38，对载体中金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>3.00，符合《消毒技术规范》(2002年版)2.1.1.7.7定量灭菌实验的评价规定的灭菌合格。
[0158]
空气消毒实验
[0159]
对本发明实施例1的中药组合物按照《消毒技术规范》(2002年版)2.1.3空气消毒
效果鉴定试验的相关规定，进行空气消毒效果模拟现场试验：开启高效过滤器净化，同时调节两个舱温度为20～25℃，湿度为50～70％rh；开启微生物气溶胶发生器进行喷雾染菌，完毕后，风扇继续搅拌5min，然后静置5min；同时对试验组和对照组分别用液体撞击式采样器采样，采样器置于试验舱正中央，采样流量为12.5l/min；试验组用本发明中药组合物原液按照10ml/m3的用量向1m3舱中喷雾10ml样品，消毒作用60min后采样，对照组不雾化消毒剂同时在相应时间段采样。
[0160]
对本发明实施例1的中药组合物按照《消毒技术规范》(2002年版)2.1.3空气消毒效果鉴定试验的相关规定，进行空气消毒效果现场试验：将实验用器材一次性分别放入试验空间内，关闭门窗，在0min采样，作为试验前样本(阳性对照)；用本发明中药组合物原液按照10ml/m3的用量向20m3密闭空间中喷雾200ml样品，消毒作用60min后采样，作为试验后的试验样本；采样器置于室内中央1.0m高处，采样流量为28.3l/min；取未用的同批培养基2份，与试验采样的样本同时进行培养，作为阴性对照；试验期间环境温度介于25～30℃，环境湿度介于50～70％rh，试验重复3次，计算出每次的消亡率。
[0161]
(3)对白色葡萄球菌的杀灭效果
[0162]
各次试验的阴性对照组均无菌生长；
[0163]
表4本发明实施例1的中药组合物对白色葡萄球菌的杀灭试验结果
[0164][0165]
表4为本发明实施例1的中药组合物对白色葡萄球菌的杀灭试验结果。依据表4，3次实验结果均大于99.90％，符合《消毒技术规范》(2002年版)2.1.3.4消毒合格的要求。
[0166]
(4)对空气中自然菌的消毒效果
[0167]
各次试验的阴性对照组均无菌生长。
[0168]
表5为本发明实施例1的中药组合物对空气中自然菌的消毒测试结果。依据表5，空气中自然菌的消亡率均大于90％，符合《消毒技术规范》(2002年版)2.1.3.5现场试验规定的消毒合格。
[0169]
因此，以上结果表明本发明实施例1的中药组合物具有抗菌作用。
[0170]
表5本发明实施例1的中药组合物对空气中自然菌的消毒测试结果
[0171][0172]
4、对实施例1的中药组合物进行安全性实验。
[0173]
试验动物：km小鼠(spf级)、nih小鼠(spf级)，由广东省医学实验动物中心提供；普通级新西兰兔，由广州市白云区龙归兴科动物养殖场提供。
[0174]
试验方法和结果：
[0175]
(1)对本发明实施例1的中药组合物按《消毒技术规范》(2002年版)2.3.1进行km小鼠的急性经口毒性试验。实验结果为：km小鼠的经口ld
50
大于5000mg/kg体重者，符合《消毒技术规范》(2002年版)2.3.1.6评价规定的实际无毒；
[0176]
(2)对本发明实施例1的中药组合物按《消毒技术规范》(2002年版)2.3.8.4进行小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：在500mg/kg体重、2000mg/kg体重、5000mg/kg体重三个给药剂量下，小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验的嗜多染红细胞微核率与不给药的阴性对照组相比均无显著差异，符合《消毒技术规范》(2002年版)2.3.8.4.6评价规定的不具有染色体损伤作用；
[0177]
(3)对本发明实施例1的中药组合物按《消毒技术规范》(2002年版)2.3.3进行皮肤刺激实验：对新西兰兔进行一次完整皮肤刺激试验。实验结果为各观察时间点的最高积分均值为0，符合《消毒技术规范》(2002年版)2.3.3.4.1评价规定的对皮肤无刺激性。
[0178]
(4)对本发明实施例1的中药组合物按《消毒技术规范》(2002年版)2.3.2进行急性吸入毒性试验检测，实验结果为对nih小鼠的急性吸入毒性半数致死浓度lc
50
2h大于10000mg/m3，符合《消毒技术规范》(2002年版)2.3.2.4评价规定的实际无毒。
[0179]
因此，本发明实施例1的中药组合物是无毒安全。
[0180]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方法，都包含在本发明的保护范围之内。