包含黄藤素的药物组合物及其制备方法与用途与流程

1.本发明属于眼用药物领域，具体涉及包含黄藤素的药物组合物及其制备方法与用途。


背景技术：

2.角膜，是眼睛抵抗外界微生物细菌的重要屏障。由于角膜直接暴露于外界，容易受到机械、感染、化学制品、烧伤等多种因素的损害。角膜的健康，影响着眼球的健康状态，及时有效修复受损角膜，可以阻止病情的深入。
3.黄藤素，别名：掌叶防已碱、巴马汀等，是一种异喹啉生物碱，具有多种药理作用，例如：抗菌、抗病毒、调节血脂等。
4.甘草酸二钾(dg)，为白色或类白色粉末，具有抗炎、抗过敏、保湿等功效，在医药行业主要用于镇咳祛痰、胃溃疡、急慢性胃炎、湿疹、皮肤瘙痒，以及用于治疗癌症和防治艾滋病等。
5.截止到目前为止，未检索到有将黄藤素或其与甘草酸二钾组合用于预防和/或治疗角膜损伤、糖尿病患者角膜损伤(或者，用于降低hmgb1和/或rage的表达水平)的相关文献报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题和/或不足，本发明的目的在于提供一种包含黄藤素的药物组合物及其制备方法与用途。该药物组合物用作眼用制剂(如：滴眼液等)，能够加快角膜损伤的修复速度，修复改善角膜敏感度和角膜神经，降低角膜、三叉神经节中的炎症因子含量，有效抑制hmgb1、rage的表达。
7.本发明提供了一种药物组合物，其包括：黄藤素和药学上可接受的甘草酸盐；其中，黄藤素与甘草酸盐的质量比为1:2～50(例如，1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:16、1:18、1:20、1:22、1:25、1:30、1:35或1:45)。
8.进一步的，
9.在上述任一技术方案(药物组合物)中，黄藤素与甘草酸盐的质量比为1:5～20(例如，1:6、1:9、1:12、1:15或1:18)；优选地，黄藤素与甘草酸盐的质量比为1:15～18。
10.进一步的，
11.在上述任一技术方案(药物组合物)中，黄藤素的包封率至少为80％(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)；优选地，黄藤素的包封率≥90％或≥95％。
12.进一步的，
13.在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；优选地，所述的甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠。
14.进一步的，
15.在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的药物组合物是由包括以下步骤的方法制成：将黄藤素和甘草酸盐一起分散或溶解于溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，即得；
16.优选地，所述的溶剂为醇类溶剂，更优选为甲醇或乙醇；
17.优选地，每克黄藤素对应所述溶剂的用量为100～800ml(例如，100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml等)，更优选为300～500ml。
18.进一步的，
19.在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的药物组合物为固体制剂或液体制剂；
20.优选地，所述的药物组合物为液体制剂，其溶剂选自药学上可接受的水、pbs缓冲液、羧甲基纤维素钠水溶液或羟丙基甲基纤维素水溶液；
21.更优选地，所述液体制剂的ph值为6～8，更优选为6.8～7.4。
22.进一步的，
23.在上述任一技术方案(药物组合物)中，当所述液体制剂中的黄藤素浓度为5mg/ml时，所述的液体制剂满足下述条件
①
～
③
中的一个或两个以上：
24.①
、所述液体制剂的胶束平均直径为1～80nm；优选10～30nm；
25.②
、所述液体制剂的多分散指数为≤0.5；优选≤0.3；
26.③
、所述液体制剂的zeta电位为-20～0mv；优选-5～0mv；
27.优选地，所述的溶剂制剂同时满足条件
①
～
③
。
28.进一步的，
29.在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述的药物组合物中还包括药学上可接受的辅料。
30.进一步的，
31.在上述任一技术方案(药物组合物)中，所述药物组合物中的黄藤素为治疗有效量的，和/或，所述的药物组合物为眼用制剂；
32.优选地，所述的眼用制剂为滴眼液，进一步优选为纳米胶束滴眼液；
33.更优选地，
34.所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防角膜损伤的眼用制剂；
35.或者，
36.所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防糖尿病患者角膜损伤的眼用制剂；
37.或者，
38.所述的眼用制剂是用于修复角膜神经的眼用制剂；
39.或者，
40.所述的眼用制剂是用于抑制角膜和/或三叉神经节中的炎症因子表达、hmgb1表达或者rage表达的眼用制剂；进一步优选地，所述的炎症因子为il-1β或il-6。
41.本发明还提供了上述任意一项所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
42.将黄藤素和甘草酸盐一起分散或溶解于溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，得到固体产物；之后可选择地包括：将所述的固体产物溶解或分散在所述液体制剂
的溶剂中，调节所述液体制剂的ph值为6～8，过滤灭菌，即可；
43.优选地，所述的溶剂为醇类溶剂，更优选为甲醇或乙醇；
44.优选地，每克黄藤素对应所述溶剂的用量为100～800ml(例如，100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml等)，更优选为300～500ml；
45.优选地，调节所述液体制剂的ph值为6.8～7.4；
46.优选地，调节所述液体制剂的ph值所使用的是氢氧化钠和/或氢氧化钾。
47.本发明的另一目的还在于提供上述药物组合物的药物用途。
48.具体的，
49.本发明还提供了一种上述药物组合物在制备眼用制剂中的用途。
50.本发明提供的包含黄藤素的药物组合物，抗氧化能力强，安全、无刺激，而且黄藤素和甘草酸盐组合，可以起到协同增效的作用，使得黄藤素药物在角膜的吸收得到显著增强，用作眼用制剂(如：滴眼液等)能够加快角膜损伤的修复速度，修复改善角膜敏感度和角膜神经，降低角膜、三叉神经节中的炎症因子含量，有效抑制hmgb1、rage的表达。
附图说明
51.图1是palm与dg不同质量比的包封率。
52.图2是兔眼刺激性观察图。
53.图3是兔眼组织病理学观察图。
54.图4是给药palm-nar后的角膜荧光强度图。
55.图5是不同浓度下的抗氧化活性(abts法)。
56.图6是不同时间的抗氧化活性(abts法)。
57.图7是正常小鼠不同给药组的角膜荧光素钠染色图像。
58.图8是正常小鼠不同给药组的角膜上皮缺损率。
59.图9是正常小鼠不同给药组的角膜敏感度。
60.图10是正常小鼠不同给药组的组织病理学观察图。
61.图11是正常小鼠不同给药组角膜神经修复荧光图。
62.图12是正常小鼠不同给药组角膜荧光神经占整个角膜的百分比(percent area occupied by subbasal nerves)。
63.图13是正常小鼠不同给药组的角膜il-1β水平。
64.图14是正常小鼠不同给药组的角膜il-6水平。
65.图15是正常小鼠不同给药组的三叉神经节il-1β水平。
66.图16是正常小鼠不同给药组的三叉神经节il-6水平。
67.图17是正常小鼠不同给药组的角膜蛋白质印迹法检测结果。
68.图18是正常小鼠不同给药组的角膜hmgb1水平。
69.图19是正常小鼠不同给药组的角膜rage水平。
70.图20是正常小鼠不同给药组的三叉神经节蛋白质印迹法检测结果。
71.图21是正常小鼠不同给药组的三叉神经节hmgb1水平。
72.图22是正常小鼠不同给药组的三叉神经节rage水平。
73.图23是糖尿病小鼠不同给药组的角膜荧光素钠染色图像。
74.图24是糖尿病小鼠不同给药组的角膜上皮缺损率。
75.图25是糖尿病小鼠不同给药组的角膜敏感度。
76.图26是糖尿病小鼠不同给药组的组织病理学观察图。
77.图27是糖尿病小鼠不同给药组角膜神经修复荧光图。
78.图28是糖尿病小鼠不同给药组角膜荧光神经占整个角膜的百分比。
79.图29是糖尿病小鼠不同给药组的角膜il-1β水平。
80.图30是糖尿病小鼠不同给药组的角膜il-6水平。
81.图31是糖尿病小鼠不同给药组的三叉神经节il-1β水平。
82.图32是糖尿病小鼠不同给药组的三叉神经节il-6水平。
83.图33是糖尿病小鼠不同给药组的角膜hmgb1水平。
84.图34是糖尿病小鼠不同给药组的角膜rage水平。
85.图35是糖尿病小鼠不同给药组的三叉神经节hmgb1水平。
86.图36是糖尿病小鼠不同给药组的三叉神经节rage水平。
具体实施方式
87.以下实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所作的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。
88.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
89.本发明中，未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
90.例如：
91.黄藤素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
92.甘草酸二钾：陕西富捷药业有限公司；
93.pbs缓冲液(ph＝7.2～7.4)：磷酸盐缓冲液，青岛云山生物科技有限公司；
94.tbs缓冲液(ph＝7.2～7.4)：盐酸盐缓冲液，武汉赛维尔生物科技有限公司；
95.新西兰兔：成年，spf级，山东齐辉特种养殖有限公司；
96.c57bl/6j小鼠：雄性，6～8周龄，spf级，体重18～23g，南京金莱畅生物科技有限公司。
97.关于本发明中使用术语的定义，除非另有说明，本文中术语提供的初始定义适用于全文中的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应当根据公开内容和/或上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
98.实施例1
99.将25mg黄藤素(palm)与甘草酸二钾(dg)(质量比分别为1:6、1:9、1:12、1:15、1:18)加入到茄型瓶中，超声，使黄藤素和甘草酸二钾溶解或均匀分散在甲醇(10ml)中。随后，将茄型瓶置于旋转蒸发仪，在40℃、减压条件下将甲醇挥干，直到茄型瓶的瓶壁上形成一层薄膜(palm-dg)。取下茄型瓶，加入pbs缓冲液将瓶壁上的薄膜(palm-dg)溶解，用氢氧化钠调节ph至6.8～7.4并定容(5ml)，灭菌针式过滤器(0.22μm滤膜)过滤，得到palm-dg滴眼液
(其palm的浓度为5mg/ml)。
100.1.1包封率测定
101.将制备的palm-dg滴眼液过0.22μm滤膜，过滤分离未包封的palm。用适当溶剂(例如：甲醇)稀释palm-dg过滤前和过滤后的溶液，以破坏胶束。用酶标仪(瑞士帝肯酶标仪，型号：infinite m plex)在326nm测定溶液中黄藤素(palm)浓度。包封率，为过滤后检测到的palm浓度与过滤前检测到的palm浓度之比。测定结果见图1。
102.结果显示，palm与dg的质量比为1:6时，包封率为79.23％；palm与dg的质量比为1:12或更高(例如，1:12、1:15等)时，包封率＞90％；palm与dg的质量比为1:15或1:18时，包封率接近100％。
103.1.2胶束尺寸、多分散指数(pdi)和zeta电位
104.使用纳米粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)进行测定；结果显示，palm-dg滴眼液(palm与dg的质量比为1:15，其palm的浓度为5mg/ml)的平均直径为16.54
±
5.01nm，多分散指数(polydispersity index)为0.227
±
0.044，zeta电位为-(3.71
±
0.65)mv。
105.1.3眼部安全性考察
106.将新西兰白兔分为如下五组：
107.(1)palm-dg滴眼液组(palm与dg的质量比为1:15，其palm的浓度为5mg/ml)；
108.(2)palm悬液组(5mg/ml，溶剂为pbs缓冲液)；
109.(3)dg溶液(75mg/ml，溶剂为pbs缓冲液)；
110.(4)pbs缓冲液；
111.(5)sds溶液组(浓度0.5％，溶剂为pbs缓冲液)。
112.分别对各组白兔左眼进行滴眼，右眼不做处理。每隔30min滴眼一次，每次5μl，共滴眼13次。最后一次滴眼完成并间隔24h后，对各组白兔进行拍照，麻醉处死白兔，摘取其眼球，甲醛进行固定，然后经过脱水、透化、包埋、切片、烤片处理后，进行he染色和pas染色，显微镜下观察得到病理结果评测palm-dg纳米胶束滴眼液安全性。
113.观察和检测的结果见图2和图3，结果显示：
114.(1)sds组(阳性刺激对照组)可以看到结膜充血十分严重，眼部释放出粘性分泌物，并因闭合眼睑严重而导致无法睁开眼睛；而palm-dg组、palm组、dg组、pbs组，均没有出现明显的眼部症状，显示出良好的眼耐受性(见图2)；
115.(2)sds组的角膜上皮变薄且不平滑，水肿严重，结膜组织中观察到许多炎性细胞，杯状细胞数量减少并散落；而palm-dg组的兔眼睛具有正常的组织学结构，没有组织损伤，也没有水肿、发炎等症状，palm组、dg组、pbs组的角膜和结膜也没有观察到明显的异常(见图3)。
116.以上结果表明，palm-dg对眼睛没有明显的刺激性，是安全的。
117.1.4眼部吸收特性考察
118.用香豆素6(cou-6)分别对palm-dg(palm与dg的质量比为1:15，其palm的浓度为5mg/ml)、palm(5mg/ml，溶剂为pbs缓冲液)进行标记(香豆素6的浓度5μg/ml)，将小鼠随机分为两组(另设空白对照)，一组眼表滴香豆素6标记的palm-dg纳米胶束滴眼液；另一组滴香豆素6标记的palm悬液，5μl/眼，每10分钟一次，共4次；
119.最后一次点眼结束后30、60和90分钟处死小鼠，用生理盐水冲洗眼球以去除滴眼
液残留，摘取眼球并分离出角膜。将小鼠角膜剪瓣平铺玻片上，使用荧光显微镜观察，结果见图4。
120.结果显示，同一时间点(30分钟)，与香豆素6标记的palm悬液相比，香豆素6标记的palm-dg纳米胶束滴眼液组显示出强得多的荧光强度，这表明角膜对palm-dg中palm的吸收利用明显优于单独的palm。而且，荧光强度随时间的增加而逐渐变弱。
121.1.5抗氧化能力评估
122.采用abts法检测palm-dg滴眼液组(palm与dg的质量比为1:15，其palm的浓度为5mg/ml)的抗氧化能力，结果见图5和图6。
123.结果显示，同等条件下palm-dg的抗氧化能力优于palm和dg。
124.实施例2、palm-dg促进正常小鼠角膜上皮损伤修复
125.小鼠角膜上皮刮除术：
126.对健康雄性c57bl/6j小鼠实施角膜上皮刮除术，刮除面积均为同等大小，手术后眼睛涂抹红霉素眼膏，待小鼠麻醉苏醒之后，随机分为如下5组给药：
127.(1)pbs缓冲液组；
128.(2)palm悬液组(5mg/ml，溶剂为pbs缓冲液，0.5wt％hpmc助悬)；
129.(3)dg溶液组(75mg/ml，溶剂为pbs缓冲液)；
130.(4)palm&dg物理混合物悬液组(palm：5mg/ml，dg：75mg/ml，溶剂为pbs缓冲液)；
131.(5)palm-dg滴眼液组(palm与dg的质量比为1:15，其palm的浓度为5mg/ml)。
132.分别对前述各组小鼠进行滴眼，每天滴眼4次，每次5μl/眼，连续给药3天。
133.2.1荧光素钠染色与拍照
134.对于给药0h(未给药)、24h(滴眼给药4次)、36h(滴眼给药6次)、48h(滴眼给药8次)、60h(滴眼给药10次)、72h(滴眼给药12次)的每个分组小鼠，在小鼠眼部给予浓度为1％的荧光素钠溶液染色，冲去多余荧光素钠溶液，暴露眼球，在裂隙灯(钴蓝光)前观察，拍照记录。用图像分析软件image j分析照片荧光面积，进而评估小鼠角膜上皮修复情况，结果见图7和图8(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；&：表示与dg组相比，p＜0.05；％：表示与palm&dg组相比，p＜0.05)。
135.结果显示，palm-dg能够加快角膜损伤的修复速度，给药36h的角膜上皮面积缺损率已小于5％，而此时其他组的角膜上皮面积缺损率仍在20％以上；palm-dg给药48h已实现角膜损伤的完全修复。
136.2.2角膜敏感度修复测试
137.使用cochet-bonnet角膜知觉仪(型号：wo-7760)检测：抓取给药组小鼠(另取正常健康的小鼠作为对照)，使其眼球暴露，用触针轻触角膜，最开始将仪器触针长度调整为最大刻度，然后依次递减0.5，在某一刻度触针纤维端垂直触碰小鼠角膜正中央时小鼠出现频繁眨眼反应，此刻度即为测量值，重复三次，取三次平均值进行记录，结果见图9(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05)。
138.结果显示，与其他组相比，palm-dg能够更好、更快地修复角膜敏感度。
139.2.3角膜上皮损伤修复后角膜病理检查
140.给药3天(72h)后，处死小鼠，摘下眼球，甲醛固定，然后经过脱水、透化、包埋、切片、烤片处理后，染色，显微镜下拍片得到病理结果，结果见图10。
141.结果显示，pbs组：角膜上皮明显缺失变薄，角膜整体水肿，角膜组织中观察到许多炎性细胞；palm组、dg组、palm&dg组：角膜上皮恢复一定厚度，但外观缺乏平滑度；palm-dg组：角膜上皮较厚，排列致密，外观平滑；进一步表明，palm-dg有利于角膜损伤的修复。
142.2.4角膜神经修复情况
143.角膜神经的修复是考察角膜修复的重要指标，正常小鼠角膜实施刮除术并给药3天(72h)后，取各组小鼠角膜进行角膜神经检测。
144.给药3天(72h)后，处死小鼠，摘下眼球，剪下角膜，置于zamboni's固定液(北京索莱宝科技有限公司)中固定，pbs冲洗3次，将洗好的角膜放置于96孔板中，每孔加入200μl混合溶液(1ml混合溶液配方：580μl的pbs,20μl的10％triton-100,200μl的10％goat serum(山羊血清)和200μl的5％bsa(牛血清白蛋白))，室温下浸泡120～180min；
145.弃去96孔板内液体，每孔加入200μl混合溶液(1ml混合溶液配方：580μl的tbs,20μl的10％triton-100,200μl的10％goat serum和200μl的5％bsa)和1μl抗体，4℃条件下避光过夜；
146.第二天取出角膜，放置于48孔板中，每孔加入400μl混合溶液(1ml混合溶液配方：580μl的tbs,20μl的10％triton-100,200μl的10％goat serum和200μl的5％bsa)，摇床上摇动冲洗6次，每次冲洗每孔更换新的混合溶液400μl，每次持续10min；
147.将洗好的角膜放置在滴加抗荧光淬灭剂的载玻片下，使用荧光显微镜观察各组角膜神经修复情况并进行拍照，使用软件image j对所得照片上神经密度进行分析。
148.结果见图11和图12(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；&：表示与dg组相比，p＜0.05；％：表示与palm&dg组相比，p＜0.05)。
149.结果显示，palm-dg组的小鼠角膜中心位置神经密度高，分支多，角膜神经修复情况明显好于其他各组，这表明palm-dg相对于其他各组能够显著提高角膜神经的修复。
150.2.5 elisa试剂盒检测小鼠角膜及三叉神经节中炎症因子表达
151.(1)给药3天(72h)后，处死小鼠，摘下眼球，取角膜剪碎，加入200μl含有pmsf(北京索莱宝科技有限公司)的pbs，用超声破碎仪在冰上进行破碎；4℃离心上述样品，上清液转移至新的离心管中，将角膜蛋白样品稀释后，加入到96孔板中，按bca试剂盒(碧云天生物科技有限公司)说明书操作并计算待测样品的蛋白浓度，并根据il-1β试剂盒、il-6试剂盒的说明书检测il-1β和il-6。
152.角膜中的il-1β和il-6水平，检测结果见图13和图14(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；&：表示与dg组相比，p＜0.05)。
153.结果显示，pbs组、palm组、dg组、palm&dg组和palm-dg组的il-1β的含量分别为47.00
±
6.88、44.50
±
3.79、32.18
±
0.90、36.17
±
0.67、21.67
±
4.09，pbs组、palm组、dg组，palm&dg组和palm-dg组的il-6含量分别为：46.58
±
1.82、42.57
±
1.3、30.21
±
4.88、30.09
±
0.96、19.52
±
0.31。与其他给药组相比，palm-dg滴眼液在抑制角膜中的il-1β、il-6等炎症因子表达方面显示出更好的效果。
154.(2)给药3天(72h)后，处死小鼠，摘取并分离出三叉神经节，剪碎，加入600μl含有pmsf的pbs，用超声破碎仪在冰上进行破碎；4℃离心上述样品，上清液转移至新的离心管中，稀释后，加入到96孔板中，按bca试剂盒说明书操作并计算待测样品的蛋白浓度，并根据il-1β试剂盒、il-6试剂盒的说明书检测il-1β和il-6。
155.三叉神经中的il-1β和il-6水平，检测结果见图15和图16(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；&：表示与dg组相比，p＜0.05；％：表示与palm&dg组相比，p＜0.05)。
156.结果显示，与其他给药组相比，palm-dg滴眼液在抑制三叉神经中的il-1β、il-6等炎症因子表达方面显示出更好的效果。
157.2.6 western blot法检测小鼠角膜及三叉神经节中目的蛋白表达
158.(1)蛋白浓度测定和提取
159.给药3天(72h)后，处死小鼠，摘下眼球，取角膜剪碎，加入1200μl含有pmsf(北京索莱宝科技有限公司)的ripa裂解液(北京索莱宝科技有限公司)，用超声破碎仪在冰上进行破碎；4℃离心上述样品，上清液转移至新的离心管中，将角膜蛋白样品稀释后，加入到96孔板中，按bca试剂盒(碧云天生物科技有限公司)说明书操作并计算待测样品的蛋白浓度；充分混合蛋白样品与上样缓冲液后，金属浴95℃加热5分钟，冷却后放于-80℃冰箱冻存。
160.给药3天(72h)后，处死小鼠，摘取并分离出三叉神经节，剪碎，加入1800μl含有pmsf的ripa裂解液，用超声破碎仪在冰上进行破碎；4℃离心上述样品，上清液转移至新的离心管中，稀释后，加入到96孔板中，按bca试剂盒说明书操作并计算待测样品的蛋白浓度；充分混合蛋白样品与上样缓冲液后，金属浴95℃加热5分钟，冷却后放于-80℃冰箱冻存。
161.(2)制备聚丙烯酰胺凝胶
162.①
配制10％分离胶，按表1的配方比例配制10％分离胶，按顺序依次快速加入，充分混合。混匀后均匀加入到两个制胶玻璃板中间的空隙中，缓慢加入至指定位置；
163.表1、sds-page分离胶配方
[0164][0165]
②
用移液枪沿玻璃板壁缓慢均匀的加入双蒸水将水平面压平，加满后在水平桌面静置30min左右至其完全凝固，弃去双蒸水，擦干；
[0166]
③
配制5％浓缩胶，按表2的配方比例配制5％浓缩胶，按顺序依次快速加入，充分混合，将其均匀加入在分离胶顶部至空隙填满即可，迅速平整插入15孔齿梳，在水平桌面静置40min左右至其完全凝固，观察平整无气泡，即可备后续实验使用。
[0167]
表2、sds-page浓缩胶配方
[0168]
[0169]
(3)电泳
[0170]
取出制备好的胶板，将梳子轻轻平行拔出。将胶装在电泳槽上，加入电泳缓冲液(ph＝8.4～8.6，武汉赛维尔生物科技有限公司)，缓冲液要没过上下电阻丝。用加样枪头按预定顺序加入待测样品，及预染marker。电泳槽放在冰水中，80v电压用于浓缩胶电泳20-30分钟，120v电压用于分离胶电泳，溴酚蓝跑到底部边缘，结束电泳。
[0171]
(4)转膜
[0172]
将pvdf膜(0.45μm)先在甲醇中浸泡1分钟，将滤纸、pvdf膜和海绵放在转膜缓冲液(表3配方)中浸泡。电泳结束后，小心拆下凝胶，置于转膜缓冲液。打开转膜夹子，按照规定顺序将滤纸、海绵、胶、pvdf膜放好，排气泡。接通电源，在冰浴条件下进行，时间90分钟。
[0173]
表3、转膜液配方
[0174][0175]
(5)免疫反应与化学发光
[0176]
加入脱脂奶粉(溶剂：tbst水溶液，ph＝7.2～7.4，武汉赛维尔生物科技有限公司)封闭，室温孵育；加入一抗(抗体稀释比例为hmgb1(1:1000)稀释、rage(1:2500)稀释、gapdh(1:5000)稀释)，摇床孵育120min(也可以摇床孵育60min后置于4℃保存过夜)；吸出一抗孵育液，用tbst漂洗；加入二抗液(天津三箭生物技术股份有限公司：hrp标记羊抗兔二抗，1:5000稀释)，摇床孵育60分钟；弃去二抗，不回收，以tbst漂洗；将pvdf膜蛋白样品侧朝上至于保鲜膜上，取等量的化学发光剂和增强剂混合，滴在pvdf膜，显影。用image j软件分析各蛋白具体表达情况。
[0177]
正常小鼠角膜刮除术给药后的角膜蛋白表达结果见图17～图19(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；&：表示与dg组相比，p＜0.05)。结果显示，palm-dg能够有效抑制角膜hmgb1、rage的表达。
[0178]
正常小鼠角膜刮除术给药后的三叉神经蛋白表达结果见图20～图22(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；&：表示与dg组相比，p＜0.05)。结果显示，palm-dg能够有效抑制三叉神经hmgb1、rage的表达。
[0179]
实施例3、palm-dg促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复
[0180]
3.1建立糖尿病小鼠模型
[0181]
使用c57bl/6j小鼠构建糖尿病模型(i型)，链脲佐菌素(stz)诱导(按照50mg/kg的注射剂量避光注射，整个造模过程持续5天)，造模结束后，尾部取血对小鼠血糖浓度进行测量，糖尿病模型小鼠评测指标应大于16.7mmol/l，整个过程应仔细监测小鼠血糖与体重等生命体征等待实验备用。
[0182]
3.2糖尿病小鼠角膜上皮刮除术
[0183]
对造模成功的糖尿病小鼠实施角膜上皮刮除术，刮除面积均为同等大小，手术后眼睛涂抹红霉素眼膏，待小鼠麻醉苏醒之后，随机分为如下5组给药：
[0184]
(1)pbs缓冲液；
[0185]
(2)palm悬液组(5mg/ml，溶剂为pbs缓冲液，0.5wt％hpmc助悬)；
[0186]
(3)dg溶液(75mg/ml，溶剂为pbs缓冲液)；
[0187]
(4)palm&dg物理混合物悬液组(palm：5mg/ml，dg：75mg/ml，溶剂为pbs缓冲液)；
[0188]
(5)palm-dg滴眼液组(palm与dg的质量比为1:15，其palm的浓度为5mg/ml)。
[0189]
分别对前述各组小鼠进行滴眼，每天滴眼4次，每次5μl/眼，连续给药3天。
[0190]
3.3荧光素钠染色与拍照
[0191]
参照实施例2进行，对糖尿病小鼠进行角膜上皮刮除术后，在对各组糖尿病小鼠滴眼治疗0h、24h、36h、48h、60h、72h采用荧光素钠溶液对角膜进行染色，结果见图23和图24(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；&：表示与dg组相比，p＜0.05；％：表示与palm&dg组相比，p＜0.05)。
[0192]
结果表明，palm-dg能够加快糖尿病小鼠角膜损伤的修复速度，给药48h的角膜上皮已接近完全修复，与其他组存在显著性差异。
[0193]
3.4角膜敏感度修复测试
[0194]
参照实施例2进行，结果见图25(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；&：表示与dg组相比，p＜0.05；％：表示与palm&dg组相比，p＜0.05)。
[0195]
结果显示，与其他组相比，palm-dg能够更好、更快地修复糖尿病小鼠的角膜敏感度。
[0196]
3.5角膜上皮损伤修复后角膜病理检测
[0197]
参照实施例2进行，结果见图26。
[0198]
结果显示，pbs组：角膜上皮明显缺失，角膜组织中观察到许多炎性细胞；palm组、dg组、palm&dg组：角膜上皮恢复一定厚度，角膜组织中观察到少许炎性细胞；palm-dg组：角膜上皮较厚，排列致密，炎症细胞较少，表明palm-dg有利于糖尿病小鼠角膜损伤的修复。
[0199]
3.6角膜神经修复情况
[0200]
参照实施例2进行，结果见图27和图28(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；&：表示与dg组相比，p＜0.05；％：表示与palm&dg组相比，p＜0.05)。
[0201]
结果显示，palm-dg组的糖尿病小鼠角膜粗神经明显，细神经分支较多，角膜神经修复情况明显好于其他各组，这表明palm-dg相对于其他各组显著提高糖尿病小鼠角膜神经的修复。
[0202]
3.7 elisa试剂盒检测糖尿病小鼠角膜及三叉神经节中炎症因子表达
[0203]
参照实施例2进行，各组糖尿病小鼠角膜中炎症因子il-1β、il-6的检测结果，见图29和图30(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；&：表示与dg组相比，p＜0.05；％：表示与palm&dg组相比，p＜0.05)。结果显示，pbs组、palm组、dg组，palm&dg组、palm-dg组糖尿病小鼠角膜中的il-1β含量分别为49.84
±
5.65、49.59
±
5.40、38.07
±
3.73、39.70
±
1.34、25.68
±
1.69；pbs组、palm组、dg组，palm&dg组、palm-dg组糖尿病小鼠角膜中的il-6含量分别为：54.34
±
3.86、52.77
±
5.55、35.02
±
6.40、35.52
±
5.50、26.97
±
0.47。
[0204]
各组糖尿病小鼠三叉神经节中炎症因子il-1β、il-6的检测结果，见图31和图32(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；％：表示与palm&dg组相比，p＜0.05)。结果显示，pbs组、palm组、dg组，palm&dg组、palm-dg组糖尿病小鼠三叉神经节中
的il-1β含量分别为41.34
±
1.03、31.20
±
2.17、21.69
±
1.13、22.57
±
1.16、17.35
±
0.52；pbs组、palm组、dg组，palm&dg组、palm-dg组糖尿病小鼠三叉神经节中的il-6含量分别为：36.86
±
7.21、32.19
±
0.18、18.85
±
4.42、19.30
±
2.03、13.70
±
2.12。
[0205]
上述结果表明，palm-dg能够降低糖尿病小鼠角膜、三叉神经节中的炎症因子含量，对其具有抑制作用。
[0206]
3.8 western blot法检测糖尿病小鼠角膜及三叉神经节中目的蛋白表达
[0207]
参照实施例2进行，糖尿病小鼠角膜刮除术给药后的角膜蛋白表达结果，见图33和图34(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；％：表示与palm&dg组相比，p＜0.05)。结果显示，palm-dg能够有效抑制糖尿病小鼠角膜hmgb1、rage的表达。
[0208]
糖尿病小鼠角膜刮除术给药后的三叉神经蛋白表达结果，见图35和图36(*：表示与pbs组相比，p＜0.05；#：表示与palm组相比，p＜0.05；％：表示与palm&dg组相比，p＜0.05)。结果显示，palm-dg能够有效抑制糖尿病小鼠三叉神经hmgb1、rage的表达。