基于cAMP/PKA-CREB-BDNF信号通路的七氟烷影响抑制剂及其应用

基于camp/pka-creb-bdnf信号通路的七氟烷影响抑制剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及老年痴呆以及七氟烷影响调控领域，特别涉及基于 camp/pka-creb-bdnf信号通路的七氟烷影响抑制剂及其应用。


背景技术：

2.手术期神经认知功能障碍(perioperative neurocognitivedisorders,pnd)，其特征是术前无精神异常的患者在麻醉手术后数周或数月出现记忆力、精神集中及定向力等多方面的可逆性智力障碍，具体表现为认知能力异常、记忆受损、焦虑、人格改变、精神错乱等。如不及时改善和干预，可能会进一步发展为不可逆的认知改变，甚至发展为老年痴呆。大量流行病学研究结果显示：pnd在年龄分布上主要集中于65岁以上的老年患者，其发生率高于诸如心肌梗死和呼吸衰竭等严重术后并发症，而在某些特定患者(如心脏手术)pnd 的发生率可达50％，这不仅使患者住院时间延长，医疗费用增加，甚至使老年患者术后自理能力和生活质量下降、并发症和死亡率增加，同时pnd也使个人经济负担和社会医疗投入增加，据统计1999年美国用于pnd的医疗费用约20-40亿美元，到2006年此数字增长为约 60亿美元。随着老年患者需要接受手术治疗比例的逐年增加，老龄患者术后出现pnd将更为常见，因此解决pnd这一难题对改善公众健康和社会经济均有重大意义。然而目前，pnd的确切病因及发病机制尚不清楚，而我国直到近十来年才受到重视。而且现有的研究尚不能对pnd的发病机制与疾病进展做出完整而合理的解释，临床上也缺少有效的治疗方法，因此，关于pnd的研究仍是麻醉学领域的一个热点和难点。
3.目前研究认为老龄和麻醉药是引起pnd的主要危险因素，尤其是吸入麻醉药比静脉麻醉药更易引发pnd。
4.七氟烷是临床上常用的吸入麻醉药之一，其对中枢神经系统的影响尚未有定论。有实验表明七氟烷能导致大鼠的认知障碍，近年来也有实验表明亚麻醉浓度[大鼠七氟烷的最小肺泡浓度(minimumalveolar concentration,mac)约为2.4％,0.65mac是较常用的亚麻醉剂量，约为1.3％]的七氟烷吸入能改善大鼠的学习记忆功能，而七氟烷对认知功能影响的机制尚不明确，从目前的临床研究及动物实验中大致归结以下几种主要机制：1)影响神经递质和受体，前期研究中，我们在七氟烷麻醉后的大鼠海马组织中成功检测出5-ht1a、 5-ht3受体表达上调。2)抑制长时程增强(long-term potentiation, ltp)。3)促进神经细胞凋亡。4)其他机制：如七氟烷可通过改变前体淀粉样蛋白的产生，提高β淀粉样蛋白的水平，导致神经毒性或外周淋巴细胞内h
202
的生成增多从而损伤线粒体膜，介导七氟烷对细胞的毒性作用等。虽然既研究中已发现大量受体、分子与七氟烷的全麻效应可能相关，但却很难将这些分散的结果有机地联系起来，目前研究认为单一的膜脂溶性、离子通道、受体及基因等学说无法完全解释全麻(尤其是吸入麻醉药)的复杂效应，全麻药物对中枢神经系统的作用应该是多方位、多靶点的，细胞内信号转导系统具有变化迅速，能将大量信号有机的串联和整合起来，是未来药物作用机理研究的主要方向。而观察吸入麻醉过程对脑内
信号转导分子活化的影响，也是从一个新的视角来探索全麻机制。
[0005]
环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(campresponseelementbindingprotein,creb)是一种重要的调节中枢神经功能系统的核转录因子，它通过自身磷酸化来实现调节转录的功能。在多项研究中均证实大鼠吸入七氟烷后海马creb水平显著下降，并认为creb活化长期受到抑制可能是全麻后认知与学习记忆障碍的分子机制之一，但七氟烷如何作用creb从而引起认知改变尚无定论。creb受多种信号转导通路的调控，其中环腺苷酸(cyclicamp,camp)/蛋白激酶a(proteinkinasea,pka)-creb信号通路，受神经递质和受体作用而激活，被广泛地应用在长时程记忆的研究，此外，对哺乳动物学习记忆以及血管内皮生长因子的研究等都发现该信号系统的参与；ca
2+-钙调素依赖性蛋白激酶(calmodulindependentproteinkinase,camk)-creb信号通路，主要用于抑制长时程记忆形成的研究，近年来脑神经营养因子对神经系统的发育和功能的调节研究中也发现此通路的参与；pi3/akt信号通路已经被证明参与调节许多细胞过程，包括生存、凋亡、增殖和新陈代谢；
[0006]
脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,bdnf)，它是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，可被磷酸化的creb激活，具有促进中枢神经元生存和分化的功能，在改善认知功能障碍方面起着重要作用；此外，bdnf能调节突触传递和突触可塑性，促进和维持突触前和突触后突触传递的ltp，对学习记忆功能的形成和维持起至关重要的作用；研究证实其水平下降可引起神经元退行性变。在动物实验中，药理学实验(通过给予药物减少bdnf的水平如反义寡核苷酸和bdnf的抗体)和基因剔除bdnf可以导致动物出现学习和记忆功能障碍，bdnf的这些生理功能正好能总结目前七氟烷对认知功能影响的机制，然而目前七氟烷能否引起bdnf的改变尚无研究证实。


技术实现要素：

[0007]
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供基于camp/pka-creb-bdnf信号通路的七氟烷影响抑制剂及其应用。
[0008]
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0009]
基于camp/pka-creb-bdnf信号通路的七氟烷影响抑制剂；针对由使用七氟烷而导致的pnd，所述抑制剂为camp、pka、bdnf、creb中的一种或多种的组合。
[0010]
进一步的，针对由使用七氟烷而导致的pnd，所述抑制剂为bdnfmrna、crebmrna中的一种或多种的组合。
[0011]
进一步的，所述七氟烷浓度不小于3％。
[0012]
该抑制剂效果验证过程中，采用的qpcr检测引物为：
[0013][0014]
该该抑制剂效果验证过程中，pcr反应设置具体为：
[0015]
预变性cycle 1:(1x)
[0016]
step 1:95.0℃ for 05:00.
[0017]
pcr循环cycle 2:(40x)
[0018]
step 1:95.0℃ for 00:10.
[0019]
step 2:60℃ for 00:30.
[0020]
data collection and real-time analysis enabled.
[0021]
溶解曲线cycle 3:(71x)
[0022]
step 1:60.0℃-95.0℃ for 00:30.
[0023]
increase set point temperature after cycle 2by 0.5℃
[0024]
melt curve data collection and analysis enabled.
[0025][0026]
进一步的，所述camp、pka、bdnf、creb中的一种或多种的组合作为七氟烷引起的pnd治疗药物的应用。
[0027]
进一步的，bdnfmrna、crebmrna中的一种或多种的组合，作为七氟烷引起的pnd治疗药物的应用。
[0028]
进一步的，所述七氟烷浓度不小于3％。
[0029]
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0030]
本发明基于camp/pka-creb-bdnf信号通路的七氟烷影响抑制剂及其应用；验证了不同浓度七氟烷对老年大鼠认知功能是否具有浓度相关的双重影响；在动物模型的基础上，采用western-blot方法检测海马组织内camp、pka、creb、bdnf表达变化，采用rt-pcr 检测creb和bdnfmrna表达变化，探讨七氟烷对认知功能影响的相关机制，为临床七氟烷的使用剂量提供指导意义，也为进一步探讨七氟烷对认知功能影响机制奠定研究基础。对于阐明七氟烷致pnd发生过程中的作用机制以及对pnd的防治具有重要的临床意义；通过上调组织内camp、pka、bdnf、creb表达，以及bdnfmrna、crebmrna表达能有效抑制机体由于使用七氟烷而导致的pnd。改善老年人术后恢复情况。减少pnd发生风险，具有很好的临床应用前景。
附图说明
[0031]
图1为不同组别的bdnf的表达灰度图；
[0032]
图2为不同组别的bdnf的表达灰度图；注：与c组相比**p《0.05；
[0033]
图3为不同组别的creb的表达灰度图；
[0034]
图4为不同组别的creb的表达灰度分析图；
[0035]
注：与c组相比**p《0.05；
[0036]
图5为不同组别的pka的表达灰度图；
[0037]
图6为本发明的技术路线图。
[0038]
图7为目的基因creb,bdnf,trkb,camkiv的表达分析柱状图。
具体实施方式
[0039]
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
[0040]
试验例：如图1-7所示，基于camp/pka-creb-bdnf信号通路的七氟烷影响抑制剂及其应用
[0041]
(1)建立七氟烷麻醉后pnd的大鼠模型，观察不同浓度的七氟烷对老龄大鼠认知功能的影响
[0042]
选取老龄(18-20月龄)wister大鼠作为研究对象，用不同浓度的七氟烷进行麻醉处理，采用morris水迷宫测试大鼠的行为学能力，对大鼠海马组织进行病理学观察，以明确不同浓度的七氟烷对认知功能的影响是否具有浓度相关的双重效应。
[0043]
(2)在动物模型的基础上，研究七氟烷对camp/pka-creb-bdnf信号通路的影响。
[0044]
用westen-blot法检测海马组织中camp、pka、creb、bdnf蛋白表达变化，通过pcr检测creb和bdnfmrna的表达，探讨七氟烷对认知功能影响的分子机制。
[0045]
研究发现
[0046]
(1)验证不同浓度七氟烷对老年大鼠认知功能是否具有浓度相关的双重影响；
[0047]
(2)探讨七氟烷对认知功能影响的相关机制，为临床七氟烷的使用剂量提供指导意义，也为进一步探讨七氟烷对认知功能影响机制奠定研究基础。
[0048]
(3)明确不同浓度的七氟烷对术后认知功能的影响。
[0049]
(4)明确camp/pka-creb-bdnf信号通路在七氟烷致pnd发生发展过程中的表达变化，探讨七氟烷对认知功能影响的相关机制
[0050]
建立七氟烷麻醉后pnd的动物模型，并鉴定模型是否成功。
[0051]
(1)实验分组：将wister大鼠按照随机数字表法随机分为5组 (n＝15)，分别为空自对照组(c组),1％七氟醚组((s1组),2％七氟醚组 (s2组),3％七氟醚组(s3,组),4％七氟醚组(s4组)。
[0052]
(2)方法
[0053]
1)大鼠七氟烷吸入模型的建立
[0054]
实验时将大鼠置于一自制透明麻醉盒内(用透明玻璃制成50cm
×
40 cm
×
40cm大小，箱底铺有钠石灰)，麻醉箱一侧孔接drager fabius 型麻醉机(drager公司，德国)，一侧孔接solar8000m型多功能监测仪(ge公司，美国)监测麻醉气体的浓度。分别吸((1％,2％,3％,4％)不同浓度的七氟醚与氧气(2l/min)的混合气体6h，c组在相同的环境下吸入2l/min氧气6h。然后放置回恒温动物房，自由取食。吸入后 24h每组各取8只在冰上断头取海马，剩余部分进行水迷宫测试。
[0055]
2)morris水迷宫测试
[0056]
morris水迷宫是直径120cm，水深50cm的圆形铁皮水池。池壁上有东、南、酉、北4个入水点，其南北、东酉的连线将水池划分为 4个象限，分别称第1象限(se)、第2象限(ne)、第3象限(n w)、第4象限(sw)，在第4象限正中离池壁24cm处放与水池背景同色的平台，平台低于水面3cm。放染色剂入水并保持水迷宫外参照物不变，水温控制在(24+1)℃左右。训练前1d将大鼠放入无站台的池中自由游泳，以适应环境和剔除漂浮且停留的大鼠。(1)定位航行实验测试：将大鼠面向池壁放入水中，从入水到找到隐蔽平台的时间记为潜伏期，若找不到平台则引导大鼠至平台停留数秒并记潜伏期为60 s，每天分别从4个象限将大鼠放入水中训练并记录，历时5d。每天训练取当天平均潜伏期作为成绩，游泳的轨迹为总路程，取平均值作为成绩。(2)空间探索实验:第6天游泳训练需撤去平台，记录大鼠在60s内穿过平台位置的次数以及平台所在象限的活动时间。
[0057]
对大鼠海马组织进行病理学观察及camp/pka-creb-bdnf信号转导通路上主要元件进行检测。
[0058]
(1)组织的取材及处理：
[0059]
腹腔注射10％水合氯醛0.3ml/100g麻醉后，立即取脑，在冰上分离双侧海马，将标木称重后放入冻存管在液氮中保存备用。
[0060]
(2)海马组织的病理观察：
[0061]
将海马组织常规石蜡切片，切片厚度为5μm，按常规方法进行尼氏染色，使用电镜进行病理学观察。
[0062]
(3)采用免疫印迹(western blot)检测camp、pka、creb、 bdnf水平：取海马组织，低温状态下加入裂解液(1mg:4ul)进行组织裂解，匀浆，离心等操作后提取上清液，此即为全蛋白提取物，bca 法进行蛋白定量。将全蛋白提取物进行电泳，转膜，封闭后，置于相应的抗一稀释液4℃缓慢摇动孵育过夜。洗膜，置于相应的二抗稀释液中，室温孵育1h。洗膜，孵育底物，化学发光显色。
[0063]
(4)rt-pcr检测crebmrna、bdnfmrna表达：第一步：总rna 提取采用异硫氰酸呱法提取总rna，将组织在lml trizol试剂中匀浆，经离心后与异丙酮混合，室温孵育10min。于4
°
с离心15min，弃上清液，沉淀块用70％乙醇冲洗后，以20ul depc水溶解。经纯化后将rna沉淀溶解于depc处理的水中，用分光光度计测量rna浓度，存于-80℃保存备用。
[0064]
第二步：反转录合成cdna：在50ul的反应体积中加入5ug总rna， 5x反应缓冲液10ul，10mmol/l dntps 5ul，rnasin(promega,40u/ml) 0.5ul，oligo(dt)
12-18
(invitrogen)0.25ug，反转录酶(m-mlv, invitrogen,200u/ml)2ml，0.1mol/l二硫苏糖醇0.5ml，置37 ℃孵育1h，然后在65℃加热5min，储存于-20℃。
[0065]
第三步：聚合酶链反应扩增：在25ul的反应体积中加入合成的 cdna 0.1ug，10
×
聚合酶链反应缓冲液2.5ul，dntps(2mmol/l) 2.5ul，氯化镁(25mmol/l)2.5ul各引物(20pmol/ml)1μl，taqdna聚合酶(takara,5u/μl)0.5ul。使用ptc-100聚合酶链反应仪 (mjresearch)进行热循环。
[0066]
引物序列：bdnf(f)5-gct gct gga tga gga cca ga-3
[0067]
(r)5-cca aag gca ctt gac tgc tg-3
[0068]
creb(f)5-cca ctc agc cgg gta cta cc-3
[0069]
(r)5-cac cag agg cag ctt gaa ca-3
[0070]
主要的实验结果
[0071]
(1)动物行为学检测结果：
[0072]
统计morris水迷宫实验中不同组别大鼠逃避潜伏期，结果显示，在训练第5天，各组别大鼠逃避潜伏期时间差异无统计学意义 (p》0.05)，造模后，与c组相比s1、s2组较训练第5d逃避潜伏期无统计学差异(p》0.05)，s3、s4组较训练第5d逃避潜伏期均延长 (p《0.05)，具体统计结果见表1。
[0073]
表1两组老龄大鼠逃避潜伏期的比较(`x
±
s)
[0074][0075]
注：与c组比较，*p《0.05
[0076]
统计morris水迷宫实验中不同组别大鼠原平台象限穿越次数，结果显示，在训练第5天，各组别大鼠原平台象限穿越次数差异无统计学意义(p》0.05)，造模后，与c组相比s1、s2组较较训练第5d 原平台象限穿越次数无统计学差异(p》0.05)，s3、s4各组别大鼠原平台象限穿越次数均减少(p《0.05)，具体统计结果见表2。
[0077]
表2各组老龄大鼠第ⅳ平台象限穿越次数的比较(`x
±
s)
[0078][0079]
注：与c组比较，*p《0.05
[0080]
统计morris水迷宫实验中不同组别大鼠第ⅳ平台象限停留时间，结果显示，在训练第5天，各组别大鼠原平台象限停留时间差异无统计学意义(p》0.05)，造模后，与c组相比s1、s2组差异无统计学差异(p》0.05)，s3、s4各组别大鼠原平台象限停留时间较训练第5d均缩短(p《0.05)，具体统计结果见表1-3。
[0081]
表3各组老龄大鼠第ⅳ平台象限停留时间的比较(`x
±
s)
[0082][0083]
注：与c组比较，*p《0.05
[0084]
(2)western-blot检测结果
[0085]
大鼠海马区bdnf、creb及p-creb表达变化结果
[0086]
采用western blot技术检测各组别大鼠海马组织蛋白表达含量变化。检测结果显示，与对照组c相比，s1、s2的bdnf蛋白表达量无统计学差异(p》0.05)，s3、s4的bndf蛋白表达量均下降，且随着七氟烷浓度的升高，bdnf的表达有下降的趋势，差异有统计学意义 (p《
0.05)。统计结果见图1和图2。
[0087]
大鼠海马区creb及p-creb表达变化结果
[0088]
检测大鼠海马组织中creb及磷酸化creb(p-creb)的表达情况，结果显示，与对照组c相比，s1、s2的creb及p-creb蛋白表达量无统计学差异(p》0.05)，s3、s4的creb及p-creb蛋白表达量均下降，且随着七氟烷浓度的升高，creb磷酸化的表达有下降的趋势，差异有统计学意义(p《0.05)。统计结果见图3和图4。
[0089]
大鼠海马区pka表达变化结果
[0090]
采用western blot检测大鼠海马组织pka，与c组相比，s1、s2组麻醉后海马神经元pka表达逐渐下调，差异无统计学意义(p》0.05)，s3、 s4组pka表达逐渐下调，差异有统计学意义(p《0.05)，见图5。
[0091]
大鼠海马区camp表达变化结果
[0092]
采用elisa法检测海马组织camp，结果显示，与c组相比，s1、s2 组camp表达变化无统计学差异，s3、s4组camp表达下调明显(p《0.05)，差异有统计学意义，见表4。
[0093]
表4五组大鼠海马组织camp表达的比较(n＝15，x
±
s)
[0094][0095][0096]
注：与c组相比，
*
p《0.05
[0097]
结果证实吸入高浓度的七氟烷会导致pnd的发生，且随吸入浓度的增加对术后认知的影响加重，为临床使用七氟烷提供剂量指导；此外在研究中观察到七氟烷可导致海马神经元内camp/pka-creb-bdnf通路内各反应元件的表达下调，因此认为camp/pka-creb-bdnf信号通路参与 pnd的发生。
[0098]
试验例2：
[0099]
一.实验目的
[0100]
抽提15例海马组织的rna，反转录成cdna后qpcr检测 creb,bdnf,trkb,camkiv基因的本底表达。
[0101]
二.实验材料
[0102]
实验器材
[0103]
表5实验中涉及的主要器材
[0104][0105]
主要实验试剂
[0106]
表6实验中涉及的主要试剂
[0107][0108][0109]
检测样本：15例海马组织
[0110]
k1左k2左侧k3左侧1-21-41-62-22-42-63-23-43-64-24-44-6
[0111]
三.实验步骤
[0112]
1.从组织中抽提总rna
[0113]
1)取适量组织样加入1ml trizol，匀浆器匀浆，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
[0114]
2)每管加入250μl氯仿，用手上下颠倒ep管15s，室温静置3min， 4℃，12000rpm，离心15min。
[0115]
3)吸取上清移至新的1.5ml ep管，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀30min。
[0116]
4)4℃，12000rpm离心10min后，去上清，加入1ml 4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀，4℃，10000rpm离心5min，弃上清，室温干燥。
[0117]
5)加入20μl rnase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提rna 的浓度。
[0118]
2.rna反转录成cdna
[0119]
根据操作说明书进行反转录，体系如下：
[0120]
在rnase-free的pcr管中加入(总体系20ul)
[0121]
rna1μgdepc
·
h 2o补足至11.0ul
[0122]
混匀，65℃孵育5min，立刻-20℃冰浴3min，然后加入
[0123]5×
reaction buffer4.1μlrevertaid reverse transcriptase(100u/μl)0.6μldntp mix(10mm)2.1μlribolock rnaes inhibtor(40u/μl)1.1μloligo(dt)primer(0.2μg/μl)1.1μl
[0124]
42℃孵育60min，72℃，10min；cdna冻存于-20℃或即刻pcr。
[0125]
3.qpcr引物设计
[0126]
根据目的基因序列信息设计并合成qpcr检测引物，序列见表7；
[0127]
表7rt-pcr检测引物信息
[0128][0129]
4.rt-pcr预实验
[0130]
以反转录的cdna为模板，用目的基因特异性引物和内参引物扩增待检测的目的基因片段和看家基因，摸索适合qpcr上机的最佳引物退火温度和模板量，若有杂带应重新调整pcr过程中的退火温度，直至杂带消失。
[0131]
5.qpcr正式实验
[0132]
1)在rt-pcr预实验摸索出最佳的引物退火温度和模板量的前提下，使用2
×
sybr green mix配制pcr mix，根据需要上机的样品数和重复数，计算并配制pcr mix，体系如下：
[0133]
成分体积2*sybr green mix10ul引物mix(2mm)1μl模板(稀释25倍的cdna)5μl超纯水4μl总体积20ul
[0134]
2)分装至axygen pcr8连管，微型离心机瞬时离心混匀pcr体系。
[0135]
3)将上述样品放入iq5荧光定量pcr仪，sybr green法荧光定量pcr以分析各基因的表达，pcr程序设置如下：
[0136]
pcr反应可设成2步法：(退火温度结合引物的tm值及rt-pcr 预实验的结果自行设定，融解曲线可设60-95℃)
[0137]
预变性cycle 1:(1x)
[0138]
step 1:95.0℃ for 05:00.
[0139]
pcr循环cycle 2:(40x)
[0140]
step 1:95.0℃ for 00:10.
[0141]
step 2:60℃ for 00:30.
[0142]
data collection and real-time analysis enabled.
[0143]
溶解曲线cycle 3:(71x)
[0144]
step 1:60.0℃-95.0℃ for 00:30.
[0145]
increase set point temperature after cycle 2by 0.5℃
[0146]
melt curve data collection and analysis enabled.
[0147]
6.数据分析：用
△△
ct法进行各基因表达的相对定量。
[0148]
四.实验结果
[0149]
1.qpcr数据分析
[0150]
a.目的基因及内参基因的扩增曲线
[0151]
b.目的基因及内参基因的熔解曲线
[0152]
c.qpcr定量结果分析
[0153]
数据分析如图7
[0154]
本发明(1)建立七氟烷麻醉后pnd的大鼠模型，观察不同浓度的七氟烷对老龄大鼠认知功能的影响
[0155]
选取老龄(18-20月龄)wister大鼠作为研究对象，用不同浓度(1％、 2％、3％、4％)的七氟烷进行麻醉处理，采用morris水迷宫测试大鼠的行为学能力，记录老年大鼠逃避潜伏期、游泳距离、原平台穿越次数和第ⅱ平台象限停留时间，以明确不同浓度的七氟烷对认知功能的影响是否具有浓度相关的双重效应。
[0156]
(2)在动物模型的基础上，研究七氟烷对camp/pka-creb-bdnf信号通路的影响。
[0157]
造模结束后每组于1d、3d、7d随机选取5只大鼠处死，取海马组织，用westen-blot法检测海马组织中camp、pka、creb、bdnf蛋白表达变化，通过rt-pcr检测creb和bdnfmrna的表达，探讨七氟烷对认知功能影响的分子机制。
[0158]
本发明基于camp/pka-creb-bdnf信号通路的七氟烷影响抑制剂及其应用，在动物模型的基础上，通过rt-pcr、western-blot 检测大鼠海马组织中camp、pka、creb及bdnf的蛋白和mrna表达变化，从细胞信号转导通路来阐明七氟烷致pnd发生的作用及机理。研究结果：水迷宫检测，与c组比较，s1组和s2组大鼠逃逸潜伏期和穿越平台象限的次数差异无统计学意义，s3组和s4组大鼠逃逸潜伏期延长，穿越平台象限的次数减少(p《0.05)；western-blot检测结果，与c组比较，s3组和s4组大鼠海马组织内camp、pka、bdnf、 creb表达下调(p《0.05)，s1组和s2组与c组间无统计学差异。rt-pcr 检测结果，与c组比较，s3组和s4组大鼠海马组织内bdnfmrna、 crebmrna表达下调(p《0.05)，s1组和s2组与c组间无统计学差异。结
果说明吸入高浓度(大于3％)的七氟烷会导致老年大鼠pnd的发生，其发生机制与camp/pka-creb-bdnf通路上各元件的变化相关。通过上调组织内camp、pka、bdnf、creb表达，以及bdnfmrna、crebmrna 表达能有效抑制机体由于使用七氟烷而导致的pnd。改善老年人术后恢复情况。减少pnd发生风险，具有很好的临床应用前景。
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以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。