一种黄芩苷-海藻酸钙温敏纳米凝胶、制备方法及其应用

一种黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶、制备方法及其应用
技术领域
1.本技术涉及中医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗脑卒中的黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶制备方法及其应用。


背景技术：

2.2019年柳叶刀杂志发表的2017年中国疾病负担研究结果显示脑卒中已经成为我国人群死亡的第一病因。《中国脑卒中防治报告(2018)》也指出，目前我国40岁及以上居民脑卒中现患人数1242万，每年196万人因脑卒中死亡。其高发病率、高死亡率和高致残率给社会和家庭带来沉重的负担。我国脑卒中防治仍面临巨大挑战，防治体系亟待进一步加强。
3.组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tpa)是美国fda批准的治疗急性缺血性脑卒中唯一的药物，由于其治疗时间窗短、脑出血转化风险高等副作用限制了其在临床广泛应用，临床使用中实际受益人群极少，仅有3％
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5％的缺血性脑卒中患者可以得到tpa静脉溶栓治疗。如何更好的发挥药物对于急性期脑卒中救治的功效，对于挽救急性期脑卒中患者具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶、制备方法及其应用。本发明构建的载黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶，常温状态为液体，采用经鼻腔给药方式，鼻腔温度使常温状态的液体变为凝胶状粘附在鼻腔表面，使黄芩苷经鼻腔粘膜吸收后绕过血脑屏障快速到达脑部，快速发挥治疗急性脑卒中的作用。与传统用于治疗脑卒中的口服和静脉制剂相比，本发明具有起效快、用量少、使用方便等优势。
5.本发明采用的技术方案具体如下：
6.第一方面，一种黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶的制备方法，所述黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶由原料药黄芩苷加入药学上有效的辅料制得，具体包括以下步骤：
7.(1)黄芩苷
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海藻酸钙纳米凝胶的制备
8.按照500
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200：5
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1.5：1的重量比例分别加入液体石蜡、span 80和tween 80，于40
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60℃水浴，500rpm条件下充分分散作为油相。将搅拌转速调至1000rpm，将60
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300份包含黄芩苷的海藻酸钠溶液滴入油相中，控制流速为0.75ml/min，滴加完毕后持续搅拌，使水相与油相充分混匀，再加入20
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100份固化剂，控制流速为0.25ml/min，搅拌转速1000rpm，滴加完毕后继续搅拌1h，将得到的纳米凝胶于3000rpm条件下离心15min，分离水相得到黄芩苷
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海藻酸钙纳米凝胶悬液，液氮速冻并冷冻干燥。其中，所述包含黄芩苷的海藻酸钠溶液中，海藻酸钠浓度为1
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10mg/ml，黄芩苷浓度为0.1
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20mg/ml，所述固化剂为0.5
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5mg/ml氯化钙的70％乙醇溶液。
9.(2)黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶的制备
10.取6重量份步骤1制得的黄芩苷
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海藻酸钙纳米凝胶，加入生理盐水，分散均匀后在冰浴下再加入1重量份泊洛沙姆188(p 188)和7重量份泊洛沙姆407(p 407)混合，直至全部
溶解均匀。制得黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶。
11.进一步地，所述黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶在温度为30
±
2℃时为凝胶状。
12.进一步地，所述液体石蜡、span 80和tween 80的重量比例为333.33重量份：2.33重量份：1重量份；包含黄芩苷的海藻酸钠溶液的重量份为100重量份，固化剂的重量份为33.33重量份。
13.第二方面，一种根据第一方面所述的制备方法获得的黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶。
14.第三方面，一种第二方面所述的黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶在制备治疗脑卒中药物的用途，所述药物采用经鼻腔给药方式。
15.在一些实施例中，所述脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中。
16.第四方面，一种脑卒中治疗药物，包括有效量的第一方面所述的黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶。
17.本发明的有益效果是：本发明的黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶具有治疗急性脑卒中作用，疗效确切、安全性高、质量可控；本发明构建的温敏纳米凝胶，常温状态为液体，采用经鼻腔给药方式，鼻腔温度使常温状态的液体变为凝胶状粘附在鼻腔表面，使黄芩苷经鼻腔粘膜吸收后绕过血脑屏障快速到达脑部，快速发挥治疗急性脑卒中的作用。与传统用于治疗脑卒中的口服和静脉制剂相比，本发明具有起效快、用量少、使用方便等优势。并且制备方法简单，工艺条件温和，制造成本低廉，对于脑卒中治疗具有药物经济学优势，适宜临床应用和市场推广。
附图说明
18.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
19.图1为模型组、黄芩苷(静脉)和黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶组大鼠脑组织ttc图片。
20.图2为模型组、黄芩苷(静脉)和黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶组大鼠脑梗死体积统计结果，*p<0.05。
具体实施方式
21.本发明提供了一种用于治疗脑卒中的黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶，主料为黄芩苷，海藻酸钙温敏纳米凝胶体系包括海藻酸钠、氯化钙、泊洛沙姆188和泊洛沙姆407。
22.本发明的制备方法，包括如下步骤：
23.(1)黄芩苷
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海藻酸钙纳米凝胶的制备
24.按照500
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200：5
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1.5：1的重量比例分别加入液体石蜡、span 80和tween 80，于40
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60℃水浴，500rpm条件下充分分散作为油相。将搅拌转速调至1000rpm，将60
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300份包含黄芩苷的海藻酸钠溶液滴入油相中，控制流速为0.75ml/min，滴加完毕后持续搅拌，使水相与油相充分混匀，再加入20
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100份固化剂，控制流速为0.25ml/min，搅拌转速1000rpm，滴加完毕后继续搅拌1h，将得到的纳米凝胶于3000rpm条件下离心15min，分离水相得到黄芩苷
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海藻酸钙纳米凝胶悬液，液氮速冻并冷冻干燥。其中，所述包含黄芩苷的海藻酸钠溶液中，海藻酸钠浓度为1
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10mg/ml，黄芩苷浓度为0.1
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20mg/ml，所述固化剂为0.5
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5mg/ml氯化钙的
70％乙醇溶液。
25.(2)黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶的制备
26.取步骤1制得的黄芩苷
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海藻酸钙纳米凝胶6重量份，置于合适西林瓶中，并将纳米凝胶铺在瓶底，加入少量生理盐水，电磁搅拌直至纳米凝胶分散均匀。在大烧杯中加入适量碎冰，将西林瓶放在中间预冷，调整转速和西林瓶位置使得转子搅拌均匀。再按处方量将1重量份泊洛沙姆188(p 188)和7重量份泊洛沙姆407(p 407)混合，一点一点加入直至全部溶解均匀。将制备好的黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶储存在4℃冰箱。
27.其中，海藻酸钙纳米凝胶为常规制备方法，在上述比例下均能制备获得，下面以液体石蜡、span 80和tween 80的重量比例为333.33重量份：2.33重量份：1重量份；包含黄芩苷的海藻酸钠溶液的重量份为100重量份，固化剂的重量份为33.33重量份为例详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。
28.实施例1：
29.1.黄芩苷
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海藻酸钙凝胶的制备
30.于500ml三颈瓶中分别加入150ml液体石蜡，1.05ml span 80和0.45ml tween 80，于40℃水浴，500rpm条件下充分分散30min作为油相。将搅拌转速调至1000rpm，使用蠕动泵将45ml浓度为5mg/ml海藻酸钠溶液(含有黄芩苷27mg，提前超声助溶至澄清溶液，制备成包含浓度为0.6mg/ml黄芩苷的5mg/ml海藻酸钠溶液)缓慢滴入油相中，控制流速0.75ml/min，滴加完毕后持续搅拌1h，使水相与油相充分混匀。使用蠕动泵加入固化剂(1mg/ml)氯化钙的70％乙醇溶液15ml，控制流速0.25ml/min，搅拌转速1000rpm，滴加完毕后继续搅拌1h，将得到的纳米凝胶倒入50ml离心管中称重，于3000rpm条件下离心15min，分离水相得到黄芩苷
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海藻酸钙凝胶悬液，液氮速冻并冷冻干燥保存，备用。
31.2.黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶的制备
32.用消毒后的小刀将黄芩苷
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海藻酸钙纳米凝胶切碎，准确称量黄芩苷
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海藻酸钙纳米凝胶360mg置于西林瓶(2.7cm
×
4.7cm)中，并将纳米凝胶铺在瓶底(注意不要挂壁)，加入生理盐水2.16ml，加入转子，电磁搅拌直至纳米凝胶分散均匀(约30min)。在500ml烧杯加入适量碎冰，将西林瓶放在中间预冷，注意冰不要没过瓶盖，调整转速和西林瓶位置使得转子搅拌均匀(可用玻璃培养皿倒扣在搅拌器上，然后将烧杯放在上面，这样转子可以比较稳定转动)。再按处方量将60mg泊洛沙姆188(p 188)和420mg泊洛沙姆407(p 407)混合，用称量纸一点一点加入(分15次加入)直至全部溶解均匀，约1小时，注意不要加到瓶壁上。将制备好的温敏纳米凝胶分装到200ul离心管中，用锡箔纸包装储存在4℃冰箱。
33.通过试管倾斜法模拟凝胶在鼻腔中胶凝情况和粘度计测定本发明的黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶可以在30
±
2℃范围内试管倒立时液面不流动。此粘度范围的凝胶可以达到鼻腔给药后延缓药物从鼻腔内流出的效果，同时保证药物能够迅速从介质中释放，通过鼻腔快速进入脑内治疗疾病。
34.实施例2：
35.用本发明的黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶经鼻腔给药对脑缺血再灌注损伤药效学评价实验
36.1.实验动物
37.健康wistar大鼠，雄性，体重260
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280g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提
供，实验前禁食12h，但可以自由饮水。
38.2.实验方法
39.2.1大鼠脑缺血模型制备与评价
40.采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(mcao)模型，激光多普勒血流监测仪(laser doppler flowmetry，ldf)监测皮层脑血流以评价造模是否成功，具体为：大鼠以异氟烷气体麻醉后，于前囟后2mm、中线右侧旁开5mm处颅骨钻一薄孔，将ldf光纤探头于此处固定，连续监测大脑皮层局部脑血流(cerebral blood flow，cbf)。于造模前监测获取基线值，并连续监测至术后血流值稳定为止。大鼠仰卧位，常规消毒、备皮、剥离肌肉筋膜，依次分离暴露右侧颈总动脉(cca)、颈外动脉(eca)、颈内动脉(ica)，离断eca的分支，双线结扎eca，夹闭cca、ica近心端，于eca近心端斜剪一“v”形切口，快速插入根据大鼠体重选好的线栓，并将预先放置于eca根部的丝线打一单结。于双结之间离断eca，移去ica上的动脉夹，轻拉eca使之与ica成近似直线，将线栓缓慢地向ica入颅方向插入，至感觉有少许阻力为止，以阻断该侧大脑中动脉(mca)的血流。此时ldf显示mca支配皮层局部血流下降为血流基值的25％以下视为造模成功。阻塞2h后缓慢将线栓抽出，并将eca断端结扎，松开cca动脉夹，缝合皮肤。小动物加热板维持大鼠术中肛温37℃，术后30℃保温，并予5ml生理盐水腹腔注射以防止脱水，大鼠苏醒后放回笼中，自由进食进水。
41.2.2实验分组与给药
42.实验动物随机共分为3组，每组10只大鼠，具体分组如下：
43.(1)模型组：脑缺血10min后，两侧经鼻分别给予150μl/kg生理盐水。
44.(2)黄芩苷静脉给药组：脑缺血10min后尾静脉注射黄芩苷溶液(15mg/kg)。
45.(3)黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶组：脑缺血10min后每次双鼻给予黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶(0.4mg/kg按照黄芩苷计算167.7μl/kg)，为了避免两侧同时给药造成大鼠窒息，梗塞侧鼻腔给药10min后再给正常侧鼻腔药物。两个鼻孔给药后继续麻醉10min使凝胶凝固在鼻腔内。
46.共计给药3次，分别于脑缺血10分钟、24h和48h后给药。脑缺血72h后处死大鼠，取脑。
47.2.3脑梗死体积评价
48.于脑缺血72小时，大鼠以异氟烷气体麻醉，经心脏生理盐水灌流后，取脑，置于脑切片模具中(去除嗅球、小脑)依次从前至后行2mm厚冠状切片，2％ttc溶液中染色15min(ttc是脂溶性光敏感复合物，是线粒体呼吸链质子受体，正常脑组织中的脱氢酶与ttc反应而呈红色，缺血脑组织因细胞膜线粒体脱氢酶活性下降而不能与ttc反应，呈白色拒染区域)，用image j图像分析软件进行分析。具体公式如下：
49.脑梗死体积(％)＝(正常侧半球体积－缺血侧半球正常部分体积)
÷
正常侧半球体积
×
100％。
50.3.实验结果
51.3.1黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶对大鼠脑缺血急性期脑梗死体积的影响
52.大鼠脑组织经ttc染色后，正常脑组织均匀红染，模型组缺血半球脑组织纹状体、海马、皮层等区域可见白色拒染区域(梗死灶)，说明模型制作成功；与模型组比较，黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶经鼻给药(0.4mg/kg)和黄芩苷静脉给药(15mg/kg)均能降低脑中风
后脑梗死体积，黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶经鼻腔给药(0.4mg/kg)剂量仅为静脉注射黄芩苷剂量(15mg/kg)的1/37.5(图1、图2)。
53.表明黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶经鼻腔给药对急性脑中风损伤具有明显的保护作用。黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶经鼻腔给药(0.4mg/kg)剂量仅为静脉注射黄芩苷剂量(15mg/kg)的1/37.5，给药量小、疗效更好。
54.本发明构建载黄芩苷
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海藻酸钙温敏纳米凝胶，常温状态为液体，采用经鼻腔给药方式，鼻腔温度使常温状态的液体变为凝胶状粘附在鼻腔表面，使黄芩苷经鼻腔粘膜吸收后绕过血脑屏障快速到达脑部，快速发挥治疗急性脑卒中的作用，并且减少药物用量的同时，也降低相应副作用的产生。与传统用于治疗脑卒中的口服和静脉制剂相比，本发明具有起效快、用量少、使用方便等优势。
55.以上实施例用来解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。