一种应用于生物组织修复的干细胞组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体属于一种应用于生物组织修复的干细胞组合物及其制备方法。


背景技术：

2.随着近代科技的发展，干细胞在生物组织中的应用越来越深入，已经有临床试验表明，干细胞可以用于修复生物体的创伤，为生物体组织修复，特别是一些难以愈合的伤口的修复带来了希望。
3.然而，目前的干细胞应用于生物体组织的修复，通常都需要采取自体干细胞进行培养，这样一来对自体造成一定伤害，还很费功夫和时间，对生物体本身不够友善，也不够便捷。
4.另外，目前在造血干细胞成熟，神经细胞上的定向诱导已经相对成熟，但是利用其它的干细胞特别是脂肪干细胞进行诱导组织修复则研究相对不够成熟，而且定向诱导干细胞进行生物体组织修复也存在一定的难度和缺陷。主要问题，一是，难以准确的进行定向诱导，快速修复组织；二是，诱导过程中需要添加一些有毒，或者对组织刺激性较大的物质，如2-丙基戊酸、β-巯基乙醇等，容易在组织修复过程中造成刺激，产生一定的毒副作用，不够安全；三是，目前利用干细胞进行组织修时，虽然有些技术能够使难以愈合的创伤愈合，但是却留下了明显的疤痕；四是，成分复杂，制备过程不够精简，容易产生致敏性，也增加了制造成本。


技术实现要素：

5.针对背景技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种应用于生物组织修复的干细胞组合物及其制备方法，通过该干细胞组合物可以不需要自体的干细胞即可进行生物组织修复，且成分精简，修复后不会出现明显疤痕，并且经过严格设计的该制备方法能够保持干细胞活性的同时，保障干细胞后续分化的平稳进行，快速进行组织修复。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
7.一种应用于生物组织修复的干细胞组合物，包括脂肪干细胞、脂肪干细胞外泌体、表皮干细胞外泌体，以及蝾螈素和胶原短肽。
8.进一步所采取的措施是：蝾螈素与胶原短肽之间的添加质量比例为1：(30-100)。
9.进一步所采取的措施是：所述胶原短肽包括ⅰ型胶原蛋白。
10.进一步所采取的措施是：所述胶原短肽为ⅰ型胶原蛋白与海洋胶原蛋白短肽的混合物。
11.进一步所采取的措施是：胶原短肽为ⅰ型胶原蛋白与海洋胶原蛋白短肽以(2-4)：1的质量比进行混合。
12.进一步所采取的措施是：所述胶原短肽的分子量为小于300道尔顿。
13.进一步所采取的措施是：还包括对乙酰氨基酚和基因细胞生长肽。
14.进一步所采取的措施是：还包括组织修复载体。(为生物支架所述的生物支架的材料为壳聚糖-聚丙交酯。所述组织修复载体的结构为多孔单层或者多层立体结构)。
15.一种应用于生物组织修复的干细胞组合物的其制备方法，包括以下步骤：
16.(1)制备脂肪干细胞：获取动物的脂肪组织，并将脂肪组织通过筛网过滤，得到脂肪干细胞；
17.(2)获取脂肪干细胞外泌体：将步骤(1)得到的脂肪干细胞悬液进行超低温冷冻后，取出快速融化，然后快速混匀，再将脂肪干细胞用细胞破碎机进行破碎裂解，最后离心处理，取出上层离心液，获得脂肪干细胞外泌体液；
18.(3)获取表皮干细胞外泌体：将表皮干细胞制备成悬液，然后快速冷冻，取出后快速融化，然后快速混匀，再将表皮干细胞利用细胞破碎机进行破碎裂解，最后离心处理，取出上层离心液，获得表皮干细胞外泌体液；
19.(4)充分混合；上述步骤制备得到的脂肪干细胞悬液加入适量的蝾螈素，然后再加入上述步骤制备得到的脂肪干细胞外泌体液以及表皮干细胞外泌体液，放于低温环境下高速混匀，再加入胶原短肽，进行充分混合，得到成品。
20.进一步所采取的措施是：所述步骤(2)中，在电动混匀器上快速混匀，混匀的时间为8-10分钟；所述步骤(3)中，进行快速冷冻后低温保存10-15分钟，并在电动混匀器上混匀，混匀时间为8-10分钟。
21.本发明团队经过长期研究和无数的试验验证，从安全、精简、准确诱导进行生物组织修复的角度出发，并避免修复过程中留下疤痕，发现可以不需要自体的干细胞，利用其它生物体的脂肪干细胞，同时通过脂肪干细胞外泌体、表皮干细胞外泌体，以及添加蝾螈素能够定向诱导进行生物体组织的修复，并且修复过程不会留下疤痕，精准、安全，配合胶原短肽，实现组织完美修复。蝾螈素是从蝾螈体内提取的富含诱导编程指令的活化细胞和活化细胞分解物组成，但是一直未被应用于生物组织的定向修复，也未能发现其能够诱导脂肪干细胞进行准确诱导分化，并且修复过程中不留疤痕。通过脂肪干细胞的定向分化，同时脂肪干细胞外泌体、表皮干细胞外泌体和蝾螈素的相互作用，激化脂肪干细胞的分化，并补充修复过程所需的因子，能够准确保持定向诱导分化，且修复过程不留疤痕，还有就是同步添加蝾螈素和胶原短肽，保障修复过程的平稳，也不会对皮肤产生刺激，这也是本研究团队的一大发现，为实现以后成熟的无疤痕修复各种组织及器官奠定了坚实的技术基础。
22.本发明团队通过进一步深入研究还发现，蝾螈素与胶原短肽之间的添加质量比例为1：(30-100)，胶原短肽采用ⅰ型胶原蛋白与海洋胶原蛋白短肽的混合物，并以(2-4)：1的质量比进行混合时，能够更高效、快速的进行诱导脂肪干细胞分化进行组织修复，保障修复过程的平稳进行；而胶原短肽的分子量为小于300道尔顿，更有利于肌肤组织的吸收和利用。还有通过添加对乙酰氨基酚和基因细胞生长肽还能够促进组织修复的速度，加快生物组织修复，缩短疗程。组织修复过程中使用的组织修复载体的结构优选为多孔单层或者多层立体结构，可使用壳聚糖-聚丙交酯作为修复载体材料。
23.此外，本发明干细胞组合物的其制备方法精简、高效，特别是最后混合过程中加入蝾螈素再进行混合后，保证了脂肪干细胞悬液脂肪干细胞外泌体液以及表皮干细胞外泌体液的充分混合反应，形成初步激活状态，再加入胶原短肽，形成稳定的干细胞组合物体系，这样再施用于伤口处愈合时能够随时快速调动脂肪干细胞进行分化，修复受伤的组织，还
有电动混匀器上快速混匀，混匀时间的控制，也是为了混合的额恰到好处，达到初步激活并保持整体稳定的状态，从而可以在使用时发挥出最佳的组织修复功效。
24.通过上述技术方案，本发明与现有技术相比，所具有的有益效果如下：
25.1、本发明获得的干细胞组合物成分精简、安全、能够准确诱导进行生物组织修复，使得难愈合的创伤也能够进行高效修复，并且不需要自体的干细胞，避免对自体造成二次伤害，更具应用价值。
26.2、本发明获得的干细胞组合物在进行组织修复后，不会留下明显的疤痕，使得组织修复更完善，更美观，这也是组织修复的一大技术进步。
27.3、本发明制备方法精简高效，特别是最后混合过程中加入蝾螈素再进行混合后，保证了脂肪干细胞悬液脂肪干细胞外泌体液以及表皮干细胞外泌体液的充分混合反应，形成初步激活状态，再加入胶原短肽，形成稳定的干细胞组合物体系，从而可以在使用时发挥出最佳的组织修复功效。
附图说明
28.图1为本发明各组小鼠创伤愈合后出现疤痕和未出现疤痕的小鼠数量情况结果的柱状统计图。
具体实施方式
29.为了更清楚的了解本发明所采用的技术方案，下面对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
30.实施例1：一种应用于生物组织修复的干细胞组合物，包括脂肪干细胞、脂肪干细胞外泌体、表皮干细胞外泌体、蝾螈素和胶原短肽，以及组织修复载体。
31.其中，蝾螈素与胶原短肽之间的添加质量比例为1：100；所述胶原短肽为ⅰ型胶原蛋白与海洋胶原蛋白短肽的混合物，并以4：1的质量比进行混合。
32.实施例2：一种应用于生物组织修复的干细胞组合物，包括脂肪干细胞、脂肪干细胞外泌体、表皮干细胞外泌体、蝾螈素和胶原短肽，以及对乙酰氨基酚和基因细胞生长肽；还包括组织修复载体。
33.其中，蝾螈素与胶原短肽之间的添加质量比例为1：30；所述胶原短肽为ⅰ型胶原蛋白与海洋胶原蛋白短肽的混合物，并以2：1的质量比进行混合。
34.实施例3：一种应用于生物组织修复的干细胞组合物，包括脂肪干细胞、脂肪干细胞外泌体、表皮干细胞外泌体、蝾螈素和胶原短肽，以及对乙酰氨基酚和基因细胞生长肽；还包括组织修复载体。
35.其中，蝾螈素与胶原短肽之间的添加质量比例为1：80；所述胶原短肽为ⅰ型胶原蛋白与海洋胶原蛋白短肽的混合物，并以3：1的质量比进行混合；所述胶原短肽的分子量为小于300道尔顿。
36.上述实施例1-3，均通过以下制备方法制得，包括以下步骤：
37.(1)制备脂肪干细胞：获取动物的脂肪组织，并将脂肪组织通过筛网过滤，得到脂肪干细胞；
38.(2)获取脂肪干细胞外泌体：将步骤(1)得到的脂肪干细胞悬液进行超低温冷冻
后，取出快速融化，然后快速混匀，再将脂肪干细胞用细胞破碎机进行破碎裂解，最后离心处理，取出上层离心液，获得脂肪干细胞外泌体液；
39.(3)获取表皮干细胞外泌体：将表皮干细胞制备成悬液，然后快速冷冻，取出后快速融化，然后快速混匀，再将表皮干细胞利用细胞破碎机进行破碎裂解，最后离心处理，取出上层离心液，获得表皮干细胞外泌体液；
40.(4)充分混合；上述步骤制备得到的脂肪干细胞悬液加入适量的蝾螈素，然后再加入上述步骤制备得到的脂肪干细胞外泌体液以及表皮干细胞外泌体液，放于低温环境下高速混匀，再加入胶原短肽，进行充分混合，得到成品。
41.其中，所述步骤(2)中，在电动混匀器上快速混匀，混匀的时间为8-10分钟；所述步骤(3)中，进行快速冷冻后低温保存10-15分钟，并在电动混匀器上混匀，混匀时间为8-10分钟。
42.上述脂肪干细胞可以取自健康小鼠或者家兔的脂肪干细胞，表皮干细胞可以取自健康小鼠或者家兔的表皮干细胞，并采用缓冲液pbs制备成相应的干细胞悬液。
43.本发明还进行了对比例试验，其中比较有具有代表性的对比例试验如下：
44.对比例1：不添加蝾螈素，其他成分、比例及制备步骤等均与实施例3相同，制备得到对比例1的成品。
45.对比例2：不添加脂肪干细胞外泌体，其他成分、比例及制备步骤等均与实施例3相同，制备得到对比例2的成品。
46.对比例3：不添加表皮干细胞外泌体，其他成分、比例及制备步骤等均与实施例3相同，制备得到对比例3的成品。
47.对比例4：不添加胶原短肽，其他成分、比例及制备步骤等均与实施例3相同，制备得到对比例4的成品。
48.对比例5：蝾螈素与胶原短肽之间的添加质量比例为1:25，其他成分、比例及制备步骤等均与实施例3相同，制备得到对比例5的成品。
49.将以上实施例1-3以及对比例1-5制备得到的成品进行了以下效果试验。
50.1.建立糖尿病小鼠模型：选取同一批次，大小相当的小鼠超过100只，在同一环境下饲养，并且每只小鼠均给予高糖、高脂饮食维持30天，并采用链佐霉素单独小剂量进行多次腹腔注射，然后用四氧嘧啶半量腹腔注射一次，最后测定各小鼠的血糖含量，挑选符合糖尿病模型的小鼠80只。
51.2.进行组织修复试验：对符合糖尿病模型的这80只小鼠进行剃毛处理后，在其背部切开一个3cm*5cm的矩形全层皮肤创口，然后随机分成8组，每组10只；这8组小鼠分别使用实施例1-3、对比例1-5制备得到的干细胞组合物进行伤口修复，并保持各组小鼠均在相同条件下喂养相同的纯净水及普通饲料，然后，每天观察伤口的愈合情况以及小鼠的状态，并在饲养至第7天后，每组随机处死一半即5只小鼠，一共处死40只小鼠，并取各组小鼠的标本进行伤口愈合程度的检查分析；剩下的40只小鼠继续饲养至第28天，然后将余下的小鼠全部处死，并取各组小鼠的标本进行伤口愈合后的疤痕评价。
52.3.对饲养至第7天后处死的各组小鼠的伤口愈合程度进行检查，并与原始伤口的情况进行对比，记录下组内伤口最高愈合率、伤口最低愈合率，并计算出组内平均伤口愈合率，结果如下表1所示。
53.表1：伤口愈合率统计结果
[0054][0055][0056]
由上表结果可以明显看出，本实施例1-3获得的干细胞组合物能够准确诱导生物组织进行修复，且修复速度快，修复程度高，在7天内可以达到伤口平均愈合率90.3％以上，甚至最高愈合率可达到96.3％，实现优异的组织修复程度，并且该干细胞不需要取自自体，避免自体造成二次伤害，加重自体的负担。
[0057]
另外，从对比例1-5的修复率结果也可以看出，脂肪干细胞外泌体、表皮干细胞外泌体，以及添加蝾螈素的组合，相互协同，相互促进，才能够达到高程度的修复率，三者缺一不可；并且蝾螈素与胶原短肽之间的添加质量比例也需要严格控制在适当的比例，这样才能够保障修复过程的稳定进行，避免产生刺激等其他影响，不然也会导致修复进程较慢，修复率不高。
[0058]
4.对饲养至第28天后处死的各组小鼠的伤口愈合情况进行疤痕检查，统计各组小鼠创伤愈合后未出现疤痕的小鼠数量，以及出现疤痕的小鼠数量，如附图1所示；及疤痕的严重情况，并用疤痕严重程度从小至大的轻微、较明显、明显、严重表示，结果如下表2所示。
[0059]
表2：疤痕严重程度统计结果
[0060][0061]
由图1和上表2的试验结果可以知道，本实施例1-3获得的干细胞组合物不仅能够准确诱导生物组织进行修复，而且修复后的伤口基本不留疤痕，及时出现疤痕也是轻微的，也不明显，可见本发明干细胞组合物在修复难以愈合的伤口的同时，还能实现不留下明显疤痕，是的组织修复更完善，更美观。
[0062]
而从对比例1-5的修复率结果也可以看出，脂肪干细胞外泌体、表皮干细胞外泌体，以及添加蝾螈素的相互作用，才能够实现真正的组织修复不留疤痕，还有添加蝾螈素的同同时再添加胶原短肽，能够保障修复过程的更加平稳，疤痕修复更完好，缺少胶原短肽也会对疤痕修复有一定影响。
[0063]
综上，可以看出，本发明干细胞组合物不需要使用自体干细胞就能够对生物组织进行高效修复，并且修复后不会出现明显疤痕，这是本领域的一大技术进步，极具应用价值。
[0064]
以上所述仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通人员对本发明的技术方案所做的均等修饰与变化，只要不脱离本发明创造整体构思的情况下，均仍属于本发明创造涵盖的范围之中。