含有羟基脲的抑制炎症反应的药物组合物的制作方法

1.本发明涉及羟基脲的药物用途，羟基脲调节如中性粒细胞等免疫细胞，从而发挥抑制炎症反应的作用，如全身炎症反应综合征或脓毒症。


背景技术：

2.全身炎症反应综合征(sirs)是指全身发生严重炎症反应的一种疾病。临床上，观察到以下两种或两种以上症状的病例被定义为全身炎症反应综合征：体温≥38℃的高热或体温≤36℃的低热，每分钟超过24次的增加的呼吸频率(呼吸急促)，每分钟超过90次的心率(心动过速)，血液检测中白细胞计数过度升高或降低。全身性炎症反应可由脓毒症、创伤、撕裂伤、胰腺炎等引起。特别是在由微生物感染引起的全身炎症反应综合征的情况下，称为脓毒症。
3.脓毒症是指由于组织或器官损伤引起的全身免疫反应引起的症状，这种免疫反应的强度足以威胁生命。脓毒症是由对抗感染的炎症免疫反应引起的。一般来说，这种感染是由细菌引起的，然而，脓毒症也可能由孢子、病毒等感染引起的。脓毒症是通过肺部、大脑、尿道、皮肤和腹部等器官发生的原发性感染引起的。年龄太小或太大的人，以及因癌症或糖尿病而免疫力下降的人，可能容易患脓毒症。脓毒症可引起全身的炎症反应，从而对机体造成不可逆转的损伤。脓毒症的死亡率为30％，全世界每年有3000万的脓毒症患者。
4.这种脓毒症的治疗主要通过输液和使用抗生素。一般情况下，最好尽早使用抗生素。在液体供应不足以维持血压的情况下，可以使用能够提高血压的药物。此外，各种抗炎物质和免疫调节剂已被尝试作为治疗药物，以抑制脓毒症的高炎症反应。具体而言，已经尝试使用免疫调节剂治疗脓毒症，如皮质类固醇、抗内毒素抗体、tnf拮抗剂和il-1受体拮抗剂。然而，目前尚未获得脓毒症改善的结果。


技术实现要素：

5.技术问题
6.已经开展了治疗脓毒症的研究，但是，目前开发的药物治疗效果不佳或存在副作用。因此，需要开发一种安全有效的脓毒症治疗剂。因此，本发明的目的是提供一种药物组合物，用于以抑制全身炎症反应的方式预防、减轻或治疗全身炎症反应综合征或脓毒症。
7.解决方案
8.为了解决上述问题，在本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，用于预防、减轻或治疗全身免疫反应综合征或脓毒症，所述药物组合物包括羟基脲作为活性成分。
9.本发明的有利效果：
10.羟基脲是本发明药物组合物的活性成分，可以调节中性粒细胞(参与个体炎症机制的免疫细胞)的活性，因此可以保护个体免受暴露于如细菌或病毒等微生物引起的全身炎症反应所引起的副作用或病理状况。因此，在将本发明的药物组合物施用于患有全身免疫反应的个体的情况下，有可能预防、减轻或治疗该个体的全身免疫反应综合征或脓毒症，
从而最终显著提高该个体的生存率。此外，根据本发明的组合物可以有效地预防、减轻或治疗暴露于细菌或病毒等微生物时可能发生的中性粒细胞增多症，其中所述病毒包括用于治疗目的的病毒，如溶瘤病毒，以及致病性病毒，如流感病毒或冠状病毒。
11.附图简要说明
12.图1显示了在细菌诱导的脓毒症模型中确定羟基脲(hu)效应的实验时间表。其中，“hu”表示一组每天接受一次hu，“hu
””
表示一组每天接受两次hu。这也适用于其余的附图。
13.图2显示了在细菌脂多糖(lps)诱导的脓毒症小鼠中，hu治疗后测定的生存率结果。
14.图3显示了在细菌lps诱导的脓毒症小鼠中，hu治疗后测定的生存率结果。
15.图4显示了在由牛痘病毒西部储备株(wr病毒，1
×
105pfu)诱导的脓毒症小鼠中，hu治疗后测定的生存率结果。
16.图5显示了用牛痘病毒西部储备株诱导小鼠脓毒症，用hu治疗小鼠，然后测定血液中病毒颗粒数所得到的结果。
17.图6显示了在由牛痘病毒西部储备株(1
×
105pfu和1
×
107pfu)诱导的脓毒症小鼠中，hu治疗后测定的生存率结果。
18.图7显示了给牛痘病毒西部储备株诱导的脓毒症小鼠注射hu或g-csf，然后对肝和肺组织进行染色后拍摄的照片。
19.图8显示了在流感病毒诱导的脓毒症模型中确定hu效应的实验时间表。
20.图9显示了在流感病毒诱导的脓毒症小鼠中，使用达菲(tamiflu)和/或hu治疗后，通过测定存活率获得的结果。
21.图10显示了在流感病毒诱导的脓毒症小鼠中，观察达菲和/或hu治疗后体重变化的结果。
22.图11显示了为确定hu是否具有抗病毒作用而进行实验得到的结果。其中，cc
50
表示大约50％的细胞表现出细胞毒性反应的浓度；ec
50
表示在该浓度下可以看到约50％的药物效应。
23.图12所示的照片显示了hu治疗后，患有由牛痘病毒西部储备株诱导的全身炎症综合征的猴子的皮疹和脓疱水平。
24.图13显示了在患有牛痘病毒西部储备株诱导的全身炎症综合征的猴子中，观察hu治疗后的体温和体重变化所得到的结果。
25.图14显示了对患有牛痘病毒西部储备株诱导的全身炎症综合征的猴子进行hu治疗，然后测量血液中病毒颗粒数的结果。
26.图15显示了在患有牛痘病毒西部储备株诱导的全身炎症综合征的猴子中，hu治疗后的绝对中性粒细胞计数(anc)、全血细胞计数(wbc)和绝对淋巴细胞计数(alc)的变化。
27.图16显示了在感染包括sars-cov-2在内的多种类型病毒的情况下，与“非致命”患者相比，“致命”患者的绝对中性粒细胞计数(anc)水平较高。
28.图17显示了溶瘤病毒感染后早期死亡患者血液样本的分析结果，结果表明早期死亡患者的anc迅速增加。
29.图18显示了使用牛痘病毒西部储备株诱导小鼠脓毒症，并对小鼠进行hu治疗，然后确定小鼠存活与anc、体重之间的相关性，以及anc与病毒颗粒数量之间的相关性的结果。
30.图19显示了给牛痘病毒西部储备株诱导的脓毒症小鼠注射hu或g-csf，然后对肺组织进行染色后拍摄的照片。
31.图20显示了在流感病毒诱导的脓毒症小鼠中，通过观察hu治疗后的体重变化和生存率获得的结果。
32.图21显示了通过观察流感病毒诱导的脓毒症小鼠的生存率和anc的变化得到的结果。
33.图22所示的照片显示了hu治疗后，患痘苗病毒vv
tk-诱导的全身炎症综合征的小鼠的皮疹和脓疱水平。
34.图23显示了在患有牛痘病毒西部储备株诱导的全身炎症综合征的小鼠中，用hu治疗后，通过测定绝对中性粒细胞计数(anc)和病毒颗粒数得到的结果。
35.实施本发明的最佳方式
36.以下将对本发明进行详细描述。
37.在本发明的一个方面，提供了一种用于预防、减轻或治疗全身免疫综合征(sirs)或脓毒症的药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的式1化合物(羟基脲)或其药学上可接受的盐。所述药物组合物可有效用于治疗脓毒症休克和脓毒症。
38.[式1]
[0039][0040]
所述羟基脲已知是一种抑制dna合成的抗癌剂，然而，其确切的机制尚未阐明。所述羟基脲可以以含有羟基脲的商品化药物的形式包含在所述药物组合物中。含有羟基脲的商业化药物的例子可以包括但不限于商业化药物的例子可以包括但不限于droxia
tm
、mylocel
tm
、羟基脲胶囊。
[0041]
此外，所述药物组合物可通过注射给药，并具有用于静脉给药的制剂，例如，液体制剂。
[0042]
其中，所述羟基脲可以以0.1mg/kg/天～90mg/kg/天的剂量给药。具体地，羟基脲可以以0.1mg/kg/天～90mg/kg/天、1mg/kg/天～80mg/kg/天、5mg/kg/天～70mg/kg/天、10mg/kg/天～60mg/kg/天、或20mg/kg/天～50mg/kg/天的剂量给药。
[0043]
具体地，在血液中所述羟基脲应持续保持在10～500um、50～400um、80～300um、100～200um或120～150um。其中，根据全身炎症反应综合征或脓毒症的严重程度和患者的反应率，可以适当地确定所述羟基脲的血浓度水平。
[0044]
如本文所用，术语“全身炎症反应综合征”是指全身发生严重炎症反应的情况。观察到以下两种或两种以上症状的病例被定义为全身炎症反应综合征：体温≥38℃的高热或体温≤36℃的低热，每分钟超过24次的增加的呼吸频率(呼吸急促)，每分钟超过90次的心率(心动过速)，血液检测中白细胞计数过度升高或降低。全身炎症反应综合征可能伴随着暴露于细菌或病毒时发生的炎症反应。此外，创伤或烧伤也可能诱发全身炎症反应。特别是在由微生物感染引起的全身炎症反应综合征的情况下，被称为脓毒症。
[0045]
所述全身炎症反应综合征可能伴随着暴露于病毒时的炎症反应，所述病毒可以是选自下组的至少一种：流感病毒、冠状病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、巨细胞病毒、杆状病毒、呼肠病毒、腺相关病毒、粘液瘤病毒、水泡性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、细小病毒、柯萨奇病毒、塞内卡病毒、牛痘病毒和痘病毒。
[0046]
所述病毒可以是野生型或突变型。所述病毒也可能是溶瘤病毒，例如，胸苷激酶(tk)基因缺失的重组牛痘病毒。溶瘤病毒可以是胸苷激酶基因缺失、突变的1型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因插入的重组牛痘病毒(ots-412)。溶瘤病毒可以是未插入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和β-半乳糖苷酶基因，并缺失胸苷激酶基因的重组痘苗病毒(vv
tk-)。另外，溶瘤病毒可以是缺失胸苷激酶(tk)基因且插入人gm-csf或人g-csf基因的重组牛痘病毒。
[0047]
如本文所用，术语“脓毒症”指的是一种全身发生重度炎症反应的疾病。脓毒症可伴有暴露于细菌或病毒时发生的炎症反应。具体地，脓毒症是由微生物感染引起的个体免疫系统紊乱，可能导致个体严重的器官损伤。根据对脓毒症病理生理学研究，在脓毒症中，微生物感染后免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞被激活。这些免疫细胞的激活导致炎性细胞因子如il-1、il-6、il-8和tnf-α的分泌增加，从而激活存在于细胞中的转录因子nf-κb，从而引起全身炎症反应。此外，由于脓毒性症状的恶化导致循环、细胞、代谢异常，死亡率较高的情况被称为脓毒性休克。如果脓毒症得不到及时、适当的治疗，就会导致休克或死亡。
[0048]
具体而言，脓毒症是指疑似或确诊感染患者的症状符合全身炎症反应综合征的诊断标准。例如，全身炎症反应综合征的定义是满足以下两项或两项以上：体温超过38℃或低于36℃，心率超过90次/分，呼吸频率超过20次/分或paco2低于32mmhg，白细胞计数超过12,000个/mm3或少于4,000个/mm3或未分化细胞比例超过10％。
[0049]
脓毒症可由微生物感染引起，而所述微生物可以是细菌、真菌或病毒。其中，能够引起脓毒症的微生物可以包括但不限于属于革兰氏阳性菌的链球菌和肠球菌。具体来说，引起脓毒症的微生物可以是肺炎葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。另外，能引起脓毒症的微生物可以包括但不限于克雷伯氏菌属、假单胞菌属和肠杆菌属，这些微生物均属革兰氏阴性菌。具体来说，引起脓毒症的微生物可能是大肠杆菌、创伤弧菌或流感嗜血杆菌。脓毒症可能是由微生物中的脂多糖引起的。
[0050]
此外，当暴露于病毒时，脓毒症可能伴有炎症反应，且所述病毒可以是选自下组的至少一种：流感病毒、冠状病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、巨细胞病毒、杆状病毒、呼肠病毒、腺相关病毒、粘液瘤病毒、水泡性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、细小病毒、柯萨奇病毒、塞内卡病毒、牛痘病毒和痘病毒。
[0051]
病毒可以是野生型或突变型。所述病毒也可以是溶瘤病毒，例如，胸苷激酶(tk)基因缺失的重组牛痘病毒。所述溶瘤病毒如上所述。
[0052]
如本文所用，除非另有说明，术语“活性成分”是指单独或与本身没有活性的佐剂(载体)一起显示活性的成分。
[0053]
所述药物组合物还可包括抗生素或抗病毒制剂。具体而言，所述药物组合物还可包括抗生素。所述抗生素可以是选自下组的至少一种：多力培南(doripenem)、头孢吡肟(cefepime)、亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢
洛林酯(ceftaroline fosamil)、头孢曲松(ceftriaxone)、万古霉素(vancomycin)、替考拉宁(teicoplanin)、头孢噻肟(cefotaxime)、甲硝唑(metronidazole)、氨基糖苷类抗生素及其组合。然而，本发明并不限于此。
[0054]
此外，所述药物组合物还可包括抗病毒制剂。所述抗病毒制剂可以是选自下组的至少一种：奥司他韦(oseltamivir)、扎那米韦(zanamivir)、帕拉米韦(peramivir)、阿昔洛韦(acyclovir)、伐那洛韦(valacyclovir)、法昔洛韦(famciclovir)、三氟尿苷(trifluridine)、拉米夫定(lamivudine)、替比夫定(telbivudine)、克夫定(clevudine)、恩替卡韦(entecavir)、阿德福韦(adefovir)、替诺福韦二吡呋嘧啶(tenofovir disoproxil)、替诺福韦阿拉法胺(tenofovir alafenamide)、贝西福韦(besifovir)、利巴韦林(ribavirin)、达沙布韦(dasabuvir)、索磷布韦(sofosbuvir)、达拉他韦(daclatasvir)、阿舒瑞韦(asunaprevir)、齐多夫定(zidovudine)、阿巴卡韦(abacavir)、依非韦伦(efavirenz)、依曲韦林(etravirine)、奈韦拉平(nevirapine)、利匹韦林(rilpivirine)、阿扎那韦(atazanavir)、达芦那韦(darunavir)、奈非那韦(nelifavir)、利托那韦(ritonavir)、依地那韦(indinavir)、多鲁特格雷韦(dolutegravir)、拉替格雷韦(raltegravil)、恩福替肽(enfuvertide)、马拉维若(maraviroc)及其组合。
[0055]
根据接受所述药物组合物的个人的体重，所述药物组合物中包括的抗生素或抗病毒制剂可以以每剂0.1mg/kg至200mg/kg的剂量给药。具体而言，所述药物组合物中包含的抗生素或抗病毒剂可以以0.1mg/kg～200mg/kg、1mg/kg～190mg/kg、5mg/kg～180mg/kg、10mg/kg～170mg/kg、20mg/kg～160mg/kg或40mg/kg～150mg/kg的剂量给药。
[0056]
所述药物组合物可以配制为注射剂。
[0057]
如本文所用，术语“注射剂”指的是药品的无菌制剂，所述制剂直接应用于皮肤内或通过皮肤和粘膜，其形式如溶剂、悬浮液或乳液，或使用时在溶剂中溶解或悬浮使用的任何形式。具体而言，所述注射剂可用作注射剂、注射粉、输液剂、冻干注射剂、移植液、长效注射剂、腹膜透析液、灌注液、透析液等。具体地说，所述注射剂可以通过推注或滴注、皮下注射或肌肉注射给药。
[0058]
所述注射剂中的化合物可以以溶于注射用水的形式存在。其中，所述的注射用水可以是生理盐水注射液、林格氏溶液或其他水溶液。此外，所述化合物可溶解于植物油等非水溶剂中使用。
[0059]
其中，所述化合物可能以0.1mg/ml～100mg/ml,1mg/ml～90mg/ml,10mg/ml～80mg/ml,20mg/ml～70mg/ml,30mg/ml～60mg/ml，或40mg/ml～50mg/ml的浓度包含在注射剂中。
[0060]
通过使用可用于注射的酸性水溶液或磷酸盐等缓冲液调节其ph值，可以将所述注射剂制备为物理和化学上非常稳定的注射剂，以确保可注射制剂分布期间的产品稳定性。具体而言，所述药物组合物可以包括注射用水。注射用水是指用来溶解固体注射剂或稀释水溶性注射剂的蒸馏水。
[0061]
所述药物组合物可以包括稳定剂或增溶剂。例如，稳定剂可以是焦亚硫酸钠或乙二胺四乙酸，增溶剂可以是盐酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钾。
[0062]
所述药物组合物还可包括通常用于注射的其他赋形剂。
[0063]
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防、减轻或治疗中性粒细胞增多症的药
物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的式1化合物(羟基脲)或其药学上可接受的盐。
[0064]
对于因感染sars-cov-2等致病性病毒而死亡或在重症监护病房(icu)接受治疗的患者，临床研究发现，与幸存者和非icu患者相比，这些患者的绝对中性粒细胞计数增加，淋巴细胞计数减少(图16)。此外，经鉴定，早期死于施用溶瘤病毒(jx-594)的患者的绝对中性粒细胞计数迅速增加(图17)。本发明人发现，在病毒感染引起脓毒症或全身炎症反应综合征的小鼠和猴子模型中也观察到被定义为绝对中性粒细胞计数增加的中性粒细胞增多症，对小鼠和猴子模型施用羟基脲可导致增加的绝对中性粒细胞计数下降(图15、18、21和23)。
[0065]
如本文所用，术语“中性粒细胞增多症”是指外周血中中性粒细胞高于正常水平的情况，这种中性粒细胞增多症可能由于急性感染、细菌感染、恶性肿瘤、炎症、组织坏死、骨髓增生性疾病等，甚至在肾上腺素或肾上腺皮质类固醇被施用的情况下发展。此外，急性感染或细菌感染可能导致嗜中性粒细胞增多症，例如当一个个体暴露于微生物，特别是病毒时引起的感染。具体而言，当出现全身炎症反应(如暴露于流感病毒或冠状病毒等致病性病毒引起的全身炎症综合征或脓毒症)时，也可能发生中性粒细胞增多症。中性粒细胞增多症可在暴露于细菌或病毒时发生。此外，中性粒细胞增多症可能是由于暴露于用于治疗目的的病毒，如溶瘤病毒而发生。
[0066]
中性粒细胞增多症发生在暴露于病毒时，所述病毒可以是流感病毒、冠状病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、巨细胞病毒、杆状病毒、呼肠病毒、腺相关病毒、粘液瘤病毒、水泡性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、细小病毒、柯萨奇病毒、塞内卡病毒、牛痘病毒和痘病毒中的任何一种。
[0067]
所述病毒可以是野生型或突变型。所述病毒也可以是溶瘤病毒，例如，胸苷激酶(tk)基因缺失的重组牛痘病毒。所述溶瘤病毒如上所述。
[0068]
根据本发明，用于减轻或治疗中性粒细胞增多症的药物组合物还可包括上述抗生素或抗病毒制剂。
[0069]
根据本发明，用于减轻中性粒细胞增多症的药物组合物也可以配制为注射剂。所述注射剂及所述化合物在注射中的形式和浓度如上所述。
[0070]
所述药物组合物可包括稳定剂或增溶剂。例如，稳定剂可以是焦亚硫酸钠或乙二胺四乙酸，增溶剂可以是盐酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钾。
[0071]
所述药物组合物还可包括通常用于注射的其他赋形剂。
[0072]
在本发明的另一方面，式1所示的化合物或其药学上可接受的盐可与第二活性成分(如抗生素或抗病毒制剂)一起使用。例如，提供了一种用于预防、减轻、治疗全身炎症反应综合征、脓毒症或中性粒细胞增多症的试剂盒，所述试剂盒包括第一组合物，所述第一组合物包括作为活性成分的式1所示的化合物及其药学上可接受的盐；和第二组合物，所述第二组合物包括作为活性成分的抗生素或抗病毒制剂。
[0073]
[式1]
[0074][0075]
所述第一组合物和所述第二组合物可以同时、依次或以相反顺序组合给药。具体而言，第一组合物和第二组合物可以同时给药。另外，可以首先给药第一组合物，然后给药第二组合物。另外，可以首先给药第二组合物，然后给药第一组合物。此外，可以首先给药第二组合物，然后给药第一组合物，然后再给药第二组合物。
[0076]
所述第一组合物和所述第二组合物可用于患有或疑似患有全身炎症反应综合征、脓毒症或中性粒细胞增多症的人或其他哺乳动物。此外，所述第一组合物和所述第二组合物可以采用注射的形式，可通过静脉、肌内或皮下注射给药。
[0077]
通过使用酸性水溶液或可用于注射剂的磷酸盐等缓冲液调节其ph值，可将所述第一组合物和所述第二组合物中的每一种制备为物理上和化学上非常稳定的注射剂，以确保可注射剂型分布期间的产品稳定性。具体而言，所述第一组合物和所述第二组合物的每一种可包括注射用水。所述注射用水指的是用来溶解固体注射剂或稀释水溶性注射剂的蒸馏水。
[0078]
所述第一组合物和所述第二组合物的每一种可以包括稳定剂或增溶剂。例如，例如，稳定剂可以是焦亚硫酸钠或乙二胺四乙酸，增溶剂可以是盐酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钾。所述组合物还可包括通常用于注射的其他赋形剂。
[0079]
在本发明的另一个方面，提供了一种预防、减轻或治疗全身炎症反应综合征、脓毒症或中性粒细胞增多症的方法，所述方法包括将上述所述的药物组合物给药于个体的步骤。其中，所述个体可能是哺乳动物，优选是人类。
[0080]
其中，所述给药可以通过静脉、肌内或皮内给药。这样，在将根据本发明的药物组合物施用于患有全身炎症反应综合征、脓毒症或中性粒细胞增多症的个体的情况下，所述药物组合物可调节免疫细胞，从而可用于全身炎症反应的缓解或治疗。
[0081]
其中，所述方法还可包括施用抗生素或抗病毒制剂的步骤。其中所使用的抗生素或给药方法如上所述。
[0082]
在本发明的另一个方面，提供了一种上述药物组合物的用途，用于治疗全身炎症综合征、脓毒症或中性粒细胞增多症。
[0083]
在本发明的另一个方面，提供了一种上述药物组合物的用途，用于制备用于治疗全身炎症综合征、脓毒症或中性粒细胞增多症的药物。
[0084]
本发明的方式
[0085]
以下给出了一些首选的实施例，以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例只是为了更容易理解本发明，本发明的范围不受以下实施例的限制。
[0086]
制备实施例1注射剂的制备
[0087]
制备例1.1含羟基脲的注射剂的制备
[0088]
制备含有羟基脲的注射剂，其组成如下。
[0089]
表1
[0090]
成分实施例1实施例2实施例3实施例4羟基脲1000mg1000mg1500mg2000mg维他命c-5mg10mg20mg生理盐水q.s.q.s.q.s.q.s.总量(100ml)100100100100
[0091]
制备例1.2含羟基脲和抗生素的注射剂的制备
[0092]
制备含有羟基脲和抗生素的注射剂，其组成如下。
[0093]
表2
[0094]
成分实施例5实施例6实施例7羟基脲1000mg1500mg2000mg维他命c5mg10mg20mg生理盐水q.s.q.s.q.s.万古霉素250mg500mg750mg总量(100ml)100100100
[0095]
制备例1.3含羟基脲和抗病毒制剂的注射剂的制备
[0096]
制备含有羟基脲和抗病毒制剂的注射剂，其组成如下。
[0097]
表3
[0098]
成分实施例8实施例9实施例10羟基脲1000mg1500mg2000mg维他命c5mg10mg20mg生理盐水q.s.q.s.q.s.奥司他韦20mg30mg50mg总量(100ml)100100100
[0099]
实验实施例1羟基脲在细菌性脓毒症模型中的疗效鉴定(i)
[0100]
为了确定羟基脲治疗是否可以通过免疫反应提高脂多糖(lps，来自大肠杆菌o55:b5l2880,西格玛)诱导的小鼠脓毒症模型的存活率，进行了动物实验。每组7只小鼠，第0天腹腔注射lps，剂量为10mg/kg。除对照组外的两组小鼠从lps治疗前1天开始以30mg/kg的剂量腹腔注射羟基脲，每天1次或每天2次，每周5天(图1)。
[0101]
结果显示，仅注射lps的对照组7只动物在第2天全部死亡；另一方面，每天注射羟基脲1次的组(g2-lps(10mg/kg)+hu)，其中的1只动物存活到第12天，存活率为17％；每天注射羟基脲2次的组(g2-lps(10mg/kg)+hu”)，其中的3只动物存活到第12天，存活率为43％(图2和3)。
[0102]
实验实施例2羟基脲在细菌性脓毒症模型中的疗效鉴定(i)
[0103]
实验实施例2.1羟基脲引起的存活率增加的鉴定
[0104]
牛痘病毒西部储备株(wr)被认为是一种烈性病毒，因为该病毒在同系小鼠模型中增殖良好，因此具有很高的致死率。为了确定羟基脲是否能抑制病毒感染引起的全身炎症反应并提高存活率，将wr株牛痘病毒(1
×
105pfu或1
×
107pfu)通过鼻腔黏膜施用于小鼠，从而导致感染引发脓毒症。然后，进行了动物实验。将小鼠分为对照组(wr)、接受g-csf组(wr+
g-csf(25μg/kg))和接受羟基脲组(wr+hu(50mg/kg))。接受g-csf组用于诱导中性粒细胞增多，从而与中性粒细胞减少的接受羟基脲组在免疫调节效果方面进行比较。本文中所使用的wr株牛痘病毒是缺失胸苷激酶(tk)基因的重组牛痘病毒。为制备所述重组牛痘病毒，野生型wyeth牛痘病毒株(纽约市卫生署)和wr株牛痘病毒均购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。为了重组，以含有萤火虫荧光素酶报告基因(p7.5启动子)或gfp基因的梭形质粒为载体，对野生型痘苗病毒tk区进行置换。
[0105]
对每组进行了21天的生存期测定。结果显示，直到第21天，接受羟基脲组的生存率为40％，与其他两组相比，生存率有显著差异(p＝0.01)。另一方面，在对照组和接受g-csf组中，所有小鼠在接种牛痘病毒wr株后14天内死亡(图4和5)。
[0106]
此外，为了检查接受羟基脲组的存活率差异是否由于病毒引起的毒性差异，采集了接受羟基脲组小鼠的血液，并测量了病毒颗粒的数量。
[0107]
结果显示，在接受羟基脲组中，观察到的病毒颗粒数量最多。从以上结果可以看出，尽管促进了病毒增殖，但由于在施用羟基脲后中性粒细胞计数减少，观察到的存活率最高，这表明存活率能够被提高是因为免疫调节，而不是病毒引起的毒性(图6)。
[0108]
实验实施例2.2羟基脲对免疫系统作用的鉴定
[0109]
对于小鼠生存率，通过组织学分析确定病毒增殖与中性粒细胞浸润之间的关系。将小鼠分为对照组(wr)、接受g-csf组(wr+g-csf(25μg/kg))和接受羟基脲组(wr+hu(50mg/kg))，方法与实验实施例2.1相同，除经鼻黏膜施用野生型牛痘病毒wr株(1
×
107pfu)外，其他条件相同。小鼠死亡时或临死前立即处死，收集肝、肺组织。还处死1只未接受病毒的正常小鼠作为阴性对照组。
[0110]
进行组织染色(h&e)。结果显示，除阴性对照组外，其余各组小鼠的肺泡均有少量漏出液和渗出液，肝组织3区均有缺血改变(图7)。具体而言，与阴性对照组相比，肺泡内观察到的漏出液和渗出液的严重程度和肝组织缺血改变程度依次为接受羟基尿素组、接受g-csf组以及对照组。
[0111]
这些结果表明，野生型牛痘病毒wr株引起的毒性更可能是由于血流动力学的改变，如血液中性粒细胞计数下降，而不是病毒增殖本身引起的细胞毒性，这也很好地解释了为什么hu诱导的全身炎症反应抑制对溶瘤病毒引起的急性免疫毒性很重要(图17)。
[0112]
实验实施例3羟基脲在流感病毒诱导的脓毒症模型中的疗效鉴定(i)
[0113]
实验实施例3.1羟基脲引起的存活率增加的鉴定
[0114]
将42只小鼠(雄性，balb/c)分为6组(n＝7/组)，除对照组外，其余各组鼻内施用a型h1n1流感病毒(猪流感，pr8株，3
×
mld50(50％小鼠致死剂量))进行感染。感染a型流感病毒的三组分别单独给药已知的代表性抗病毒药物达菲(奥司他韦)和羟基脲，或联合给药。达菲以0.1mg/kg或10mg/kg的浓度给药，羟基脲以50mg/kg的浓度给药(图8)。
[0115]
结果显示，仅用a型流感病毒处理组的小鼠在第11天全部死亡，而达菲处理的三组小鼠无论浓度如何都存活了下来。在仅用羟基脲处理的组(hd组)中，两只小鼠分别死于第9天和第10天，而其余5只小鼠均存活(图9)。
[0116]
此外，每天测量各组小鼠的体重，持续18天。结果显示，仅用a型流感病毒处理组小鼠体重下降约30％后死亡，其他组小鼠体重下降在10％以内，随后恢复到初始体重(图10)。
[0117]
实验实施例3.2羟基脲作用机理的鉴定
[0118]
为了确定在流感病毒诱导的脓毒症模型中，哪种机制导致羟基脲的生存增加效应，以及这种机制与抗病毒药物的机制有何不同，在体外用三种流感病毒(h1n1 pr8、h3n2(1968)、lee)感染细胞，然后用三种不同的抗病毒药物(利巴韦林、金刚烷胺(amt)和羧酸奥司他韦)和羟基脲处理细胞。然后，比较抗病毒效果。
[0119]
具体而言，mdck细胞在96孔板中孵育，分别以0.001pfu/细胞感染三种流感病毒(h1n1 pr8、h3n2(1968)、lee)，然后在33～35℃的无血清条件下孵育。1小时后，pbs洗涤，加入mem和tpck-trypsin(2μg/ml,西格玛)。72小时后，采用mtt法测定细胞对病毒的活性。
[0120]
结果显示，经测定，羟基脲的cc
50
为1561μg/ml。然而，羟基脲浓度为1561μg/ml时，对a型流感病毒(h1n1 pr8、h3n2(1968))和b型病毒(lee)均无抗病毒作用。另一方面，达菲(osv-c)对这三种病毒都有明显的抗病毒作用，其次是利巴韦林和amt。
[0121]
从这些结果可以看出，羟基脲在流感病毒诱导的脓毒症模型中生存增加效应并非由于抑制病毒感染，而且可以看出，这种作用是通过一种不同于达菲等抗病毒药物增加生存的机制来实现的。只使用羟基脲处理的小鼠在第9天前体重下降，与只使用病毒处理的小鼠类似。然而，随后所有迅速恢复并存活下来的小鼠在第18天恢复健康，与用达菲处理的小鼠和对照组小鼠相似。这表明，由于羟基脲的中性粒细胞调节作用，可以降低病毒感染引起的致死率(图11)。
[0122]
实验实施例4羟基脲在猴子模型中羟引起的抑制全身炎症反应的鉴定(i)
[0123]
用实施例2中的牛痘病毒wr株((1
×
108pfu)或牛痘病毒wr株和羟基脲(wr:1
×
108pfu,hu:80mg/kg/天和30mg/kg/天)对45～55月龄的雄性食蟹猴(n＝3)进行全身给药。然后，通过测量全身炎症和脓疱水平、体温、体重等评估毒性。
[0124]
与仅接受牛痘病毒wr株组相比，同时施用牛痘病毒wr株和羟基脲组的全身炎症反应明显减弱和，并显示出对脓疱等皮疹病变的抑制(图12)。只接受病毒的组体温升高，而同时施用组体温没有明显升高；两组间体重减轻无差异(图13)。
[0125]
此外，采集共给药组猴子的血液，测定病毒颗粒数、绝对中性粒细胞计数(anc)、全血细胞计数(wbc)和绝对淋巴细胞计数(alc)。
[0126]
结果显示，对于仅接受病毒组(ots-412)和共给药组(mots-412)，在施用病毒后第8天，两组血液中病毒颗粒数差异无统计学意义(图14)。此外，绝对中性粒细胞计数、白细胞计数和绝对淋巴细胞计数均平均下降，并保持稳定(图15)。
[0127]
参考实施例1病毒感染引起的中性粒细胞增多症的综述
[0128]
病毒感染引起的嗜中性粒细胞增多症的益处和弊处之间的相关性仍有争议。sars-cov-2感染患者的临床特征显示，与存活患者和非icu患者相比，非存活患者和icu患者的绝对中性粒细胞计数增加，淋巴细胞计数减少。使用其他病毒的感染研究也显示了类似的结果(图16)。
[0129]
参考实施例2施用溶瘤病毒后患者血浆变化的综述
[0130]
图17显示了通过分析施用溶瘤病毒(jx-594)后早期死亡患者的血液样本得到的结果。图中可以看到，早死的患者anc快速增加，表现出与中性粒细胞增多相关的病理状况。
[0131]
实验实施例5羟基脲在细菌性脓毒症模型中的疗效鉴定(ii)
[0132]
将72只balb/c小鼠(8周龄左右)分为2个主要组(n＝36/组)，第0天经鼻腔黏膜给予低剂量(1
×
105pfu)和高剂量(1
×
107pfu)的牛痘病毒wr株进行感染。每个主要组又分为3
个亚组(生理盐水、g-csf或hu；n＝12/组)。腹腔注射给药生理盐水、g-csf(25μg/kg/天，第0～5天)和羟基脲(50mg/kg/天，第0～14天)。其中，对三个亚组中每个亚组的三只小鼠进行了血液全血细胞计数试验、病毒复制试验和组织学试验。分别于第1、2、4天处死小鼠，取血液样品和肺组织。
[0133]
结果显示，施用羟基脲的低剂量或高剂量牛痘接种组存活率提高(图18:a,b)。特别是施用羟基脲的高剂量牛痘接种组，在存活率提高的同时，绝对中性粒细胞计数(anc)也下降。另一方面，低剂量或高剂量牛痘接种组，在给予促进中性粒细胞增殖的g-csf后，中性粒细胞绝对计数显著增加，存活率下降(图19:c,d)。另一方面，在低剂量或高剂量牛痘接种组中，anc和病毒颗粒(vp)数量之间没有显著相关性(图18:e,f)。
[0134]
同时，另将14只小鼠分为2组(7只/组)，即羟基脲处理后的组，经鼻黏膜施用牛痘病毒wr株(1
×
105pfu)进行感染。2天后，仅1组采用羟基脲处理(80mg/kg/天，第2～14天)。
[0135]
结果显示，即使在病毒感染后2天给药hu，也能观察到hu在病毒治疗中的保护作用(图18:g,h)。
[0136]
另外，组织学试验显示，在牛痘病毒wr株和g-csf处理组小鼠肺组织中观察到肺水肿，而未在仅wr株痘苗病毒处理组小鼠肺组织观察到。从这些结果可以确定，脓毒症休克的原因是其他因素，如促炎细胞因子等，而不是病原体诱导的细胞毒性。
[0137]
相反，与其他组相比，牛痘病毒wr株和羟基脲处理组小鼠的肺组织中发现了改善的方面(图19，右)。此外，用a56蛋白的免疫荧光染色检测了由于给药途径导致的感染情况。结果显示，感染多发生在支气管，三组间无显著性差异(图19，左)。
[0138]
实验实施例6羟基脲在流感病毒诱导的脓毒症模型中的疗效鉴定(ii)
[0139]
将28只balb/c小鼠分为4组(n＝7/组)。首先，将第1组设为阴性对照组，不感染病毒，第2～4组于第0天经鼻黏膜施用a型h1n1流感病毒(mapr8、3
×
mld50(小鼠半数致死量))。将第二组设为阳性对照组，不进行药物治疗。第三组和第四组分别给予磷酸奥司他韦(osv-p,0.1mg/kg，每日两次，第0～4天)和羟基脲(50mg/kg，每日一次，第2～14天)治疗。每隔5天测量体重和存活率，直到第20天。
[0140]
结果发现，注射羟基脲的第四组存活率提高。具体而言，第二组(阳性对照组)小鼠直到第10天全部死亡，同时显示出体重下降，而第四组小鼠在第10天前体重下降，第20天恢复到初始体重(第四组小鼠70％存活)(图20)。
[0141]
实验实施例7羟基脲在细菌性脓毒症模型中的疗效鉴定(ii)
[0142]
将21只balb/c小鼠(8周龄左右)分为3组(lps组、lps+hu_30组、lps+hu_60组；n＝7/组)。所有小鼠于第0天腹腔注射lps，剂量为10mg/kg。lps+hu_30组小鼠每日1次给予羟基脲(30mg/kg/天，第1天至第3天)，lps+hu_60组小鼠每日2次给予羟基脲(60mg/kg/d，第1天至第3天)。每隔3天测量各组小鼠的存活率直至第12天，并在第12天收集血样，检测血液中绝对中性粒细胞计数。
[0143]
结果显示，只注射lps的小鼠在24-48小时内全部死亡。另一方面，lps+hu_30和lps+hu_60组小鼠的存活率显著提高。此外，lps+hu_30和lps+hu_60组小鼠anc降低(图21)。
[0144]
实验实施例8羟基脲在猴子模型中引起的抑制全身炎症反应的鉴定(ii)
[0145]
45～55月龄雄性食蟹猴(n＝3)仅全身施用vv
tk-(1
×
108pfu)(诱导全身炎症反应)，或同时施用vv
tk-和羟基脲(vv
tk-:1
×
108pfu,hu:80mg/kg/天和30mg/kg/天)。然后，通
过测量全身炎症和脓疱水平、体温、体重等来评估毒性。
[0146]
与仅接受vv
tk-的组相比，同时施用牛痘病毒vv
tk-和羟基脲的组显示出明显减弱的全身炎症和对脓疱等皮疹病变的抑制(图22)。
[0147]
此外，仅接受病毒的一组体温显著升高，而同时施用组体温没有明显升高；两组在体重减轻方面没有区别。此外，还发现中性粒细胞的绝对计数和病毒颗粒的数量平均下降并保持稳定(图23)。