SARS-COV-2mRNA结构域疫苗的制作方法

sars-cov-2 mrna结构域疫苗
1.相关申请
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2020年2月7日提交的美国临时申请号62/971,825、于2020年4月27日提交的美国临时申请号63/016,175、于2020年6月25日提交的美国临时申请号63/044,330和于2020年8月7日提交的美国临时申请号63/063,137的权益，每个申请都通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.人类冠状病毒是冠状病毒科(coronaviridae family)的高度接触传染性包膜正单链rna病毒。已知冠状病毒科的两个亚科会引起人类疾病。最重要的是β-冠状病毒(betacoronavirus)。β-冠状病毒是轻度至中度上呼吸道感染的常见病原体。然而，新型冠状病毒感染(例如由最初于2019年12月从中国武汉市鉴定的冠状病毒引起的感染)的爆发与高死亡率死亡人数相关。这种最近鉴定的冠状病毒(称为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)，以前称为“2019新型冠状病毒”或“2019-ncov”)已迅速感染数十万人。sars-cov-2病毒引起的大流行病已由世界卫生组织(world health organization，who)命名为covid-19(冠状病毒疾病(coronavirus disease)2019)。sars-cov-2分离株(wuhan-hu-1)的第一个基因组序列由位于北京的中国cdc的研究人员于2020年1月10日在virological发表，所述virological是用于分析和解释病毒分子进化和流行病学的基于uk的讨论论坛。然后将所述序列于2020年1月12日保藏于genbank，genbank登录号为mn908947.1。
4.目前，尚无针对covid-19的特异性治疗或针对sars-cov-2感染的疫苗。与冠状病毒感染、特别是sars-cov-2大流行相关的持续的健康问题和死亡率在国际上受到极大关注。由sars-cov-2引起的公共健康危机强调了快速开发针对这些病毒的有效且安全的疫苗候选者的重要性。


技术实现要素：

5.在一些实施方案中，本文提供了包含一种或多种信使核糖核酸(mrna)分子的组合物(例如疫苗)，所述信使核糖核酸(mrna)分子编码能够引发针对sars-cov-2抗原的强效中和抗体反应的高免疫原性抗原。本文所述的mrna分子用于表达sars-cov-2冠状病毒刺突(s)蛋白的关键中和结构域，当个别地或组合用作免疫原性组合物或疫苗时，其有效诱导保护性免疫，以保护人免于天然病毒感染和/或在感染时减轻症状。
6.已知β冠状病毒的包膜s蛋白决定病毒宿主向性和进入宿主细胞，并且对于sars-cov-2感染是至关重要的。s蛋白的组织在β冠状病毒(例如sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hku1-cov、mhv-cov和nl63-cov(包括两个亚基s1和s2，其分别介导附着和膜融合))中相似。s1亚基包括n末端结构域(ntd)和受体结合结构域(rbd)。
7.亚基抗原的表达将免疫反应集中于特定亚基，对与其他相关病毒共有的抗原的其他结构域具有特异性的记忆b和t细胞的刺激最小。本文提供的数据表明，施用编码膜结合或可溶性sars-cov-2 s1亚基抗原的mrna产生针对sars-cov-2 rbd抗原、ntd抗原、野生型
全长s蛋白和具有双脯氨酸突变以稳定融合前构象的s蛋白中的每一者的抗体滴度。如本文所示，在所有测试的剂量下，两剂量方案(即，包括加强剂量)有效诱导可识别并结合至sars-cov-2 wt s蛋白的抗体。令人惊讶的是，即使在s1亚基中未发现双脯氨酸突变(双脯氨酸突变发生在s2中，而在测试的免疫原中不存在s2)，当针对双脯氨酸稳定化形式的s蛋白测量时，诱导的滴度最高。
8.另外，已知ntd和rbd两者都是结合中和病毒活性的抗体的位点。在sars-cov-2的情形下，rbd是刺突蛋白的受体结合位点，其结合血管收缩肽转化酶2(ace2)。ntd的功能尚未完全了解，其似乎在结合糖部分和促进刺突蛋白从融合前构象向融合后构象的构象转变中起作用。无论如何，ntd和rbd结构域都诱导如本文所示的高结合抗体和中和抗体滴度。
9.例如，相当令人惊讶的是，本文一些实施方案中提供的数据显示，尽管来自施用编码膜结合rbd抗原(rbd-tm)或膜结合ntd抗原(ntd-tm)的mrna的血清显示对sars-cov-2 s1/s2刺突蛋白具有免疫原性，但两种mrna(并且因此两种抗原)的50∶50组合产生对sars-cov-2 s1/s2刺突蛋白出乎意料高的协同中和抗体滴度。
10.因此，本公开的一些方面提供了包含编码sars-cov-2 s蛋白的功能结构域的mrna的组合物，所述功能结构域能够诱导针对sars-cov-2的免疫反应，例如中和抗体反应。在一些实施方案中，所述mrna配制在脂质纳米颗粒中。
11.在一些方面，提供了包含编码sars-cov-2刺突蛋白的至少两个结构域并且小于全长刺突蛋白的开放阅读框(orf)的mrna。小于全长刺突蛋白的刺突蛋白是具有比全长刺突蛋白少至少一个氨基酸的刺突蛋白的一个或多个结构域和/或亚基，或具有以非天然顺序或序列连接在一起的一个或多个结构域的融合蛋白。在一些实施方案中，两个结构域之一是sars-cov-2刺突蛋白的n末端结构域(ntd)。在一些实施方案中，两个结构域之一是sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)。在一些实施方案中，所述orf编码与所述ntd和/或rbd连接的跨膜结构域(td)。在一些实施方案中，所述td是流感血凝素跨膜结构域。在一些实施方案中，所述orf包含ntd-rbd-tm。在一些实施方案中，所述至少两个结构域经由可切割或不可切割的接头连接。在一些实施方案中，所述不可切割的接头是甘氨酸-丝氨酸(gs)接头。在一些实施方案中，所述gs接头包含4-15个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头是泛hla dr结合表位(padre)。在一些实施方案中，所述orf编码信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽与所述ntd连接。在一些实施方案中，所述信号肽与所述rbd连接。在一些实施方案中，所述信号肽与sars-cov-2异源。在一些实施方案中，所述至少两个结构域是可溶的。在一些实施方案中，所述orf编码运输信号结构域。在一些实施方案中，所述运输信号结构域是巨噬细胞标志物。在一些实施方案中，所述巨噬细胞标志物是cd86和/或cd11b。在一些实施方案中，所述运输信号结构域是vsv-g胞质尾(vsvgct)。在一些实施方案中，所述两个结构域之一是sars-cov-2刺突蛋白的第一重复七肽：hpphcpc(hr1)。在一些实施方案中，所述两个结构域之一是sars-cov-2刺突蛋白的第二重复七肽：hpphcpc(hr2)。在一些实施方案中，所述orf编码与hr1和/或hr2连接的跨膜结构域(td)。在一些实施方案中，所述td是流感血凝素跨膜结构域。在一些实施方案中，所述orf编码融合肽(fp)。在一些实施方案中，所述orf编码ct尾。
12.在一些方面，提供了包含编码sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)的开放阅读框(orf)的mrna。在一些实施方案中，所述rbd是可溶的。在一些实施方案中，所述rbd
与跨膜结构域、任选地流感血凝素跨膜结构域连接。
13.本发明的一个或多个实施方案的细节在以下描述中阐述。本发明的其他特征或优点将从以下附图和若干实施方案的详细描述以及所附权利要求中显而易见。
附图说明
14.图1由本发明的mrna编码的野生型和2p刺突蛋白抗原的示意图；信号肽(sp)，无填充；n末端结构域(ntd)，有点的；受体结合结构域(rbd)，向下对角条带；子结构域1(sd1)，水平条带；子结构域2(sd2)，波形；融合肽(fp)，向上对角条带；七肽重复区1(hr1)，编织形；七肽重复区2(hr2)，对角砖形；(tm)，垂直条带；和胞质尾区(ct)，砖形。
15.图2显示了由实施例1-3中所述的mrna编码的抗原的示例性线性设计。
16.图3显示了图2中绘示的抗原的序列比对。
17.图4显示了由实施例4-6中所述的mrna编码的抗原的示例性线性设计。
18.图5显示了本文所述的各种s1亚基抗原的序列比对。
19.图6显示了由实施例7和8中所述的mrna编码的抗原的示例性线性设计。
20.图7显示了中和与elisa滴度的相关性。
21.图8a-图8c显示了用lnp中的编码ntd-rbd-tm的mrna对小鼠进行第1天初免和第21天加强剂量后第36天的血清igg1滴度和igg2a滴度。
具体实施方式
22.严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)是新近出现的高发病率和死亡率的呼吸道病毒。与2002年出现的sars-cov和2012年出现的中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)相比，sars-cov-2已经迅速在全世界传播。世界卫生组织(who)报告，截至2020年7月6日，covid-19的当前爆发在世界范围内具有几乎1150万确诊病例，其中有超过530,000例死亡。covid-19感染的新病例呈上升趋势，并且仍然在迅速增加。因此，开发了各种安全且有效的疫苗和药物来预防和治疗covid-19并且减少covid-19在全世界所具有的严重影响是至关重要的。使用多种方式制得的疫苗和药物以及具有改进的安全性和功效的疫苗是必要的。仍然需要加速针对冠状病毒疾病2019(covid-19)的疫苗和治疗药物的先进设计和开发。
23.在2020年1月7日，将严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)鉴定为于2019年12月出现在中国湖北省武汉市的新型肺炎的病原体(lu h等人，(2020)j med virol.4月；92(4)：401-402。)。不久以后，所述病毒在中国引起爆发并传播至世界各地。根据sars-cov-2的基因组结构的分析，其属于β-冠状病毒(cov)(chan等人，2020 emerg microbes infect.；9(1)：221-236)。
24.冠状病毒表面上的关键蛋白是刺突蛋白。已设计大量mrna构建体并在本文中公开。当在适当递送媒介物中配制时，编码刺突抗原、其亚基和结构域的mrna能够诱导针对sars-cov-2的强烈免疫反应，从而产生有效且强效的mrna疫苗。施用编码各种刺突蛋白抗原、特别是刺突蛋白亚基和结构域抗原的mrna导致mrna递送至免疫系统的免疫组织和细胞，在那里其快速翻译成蛋白抗原。其他免疫细胞(例如b细胞和t细胞)然后能够识别和启动，并且免疫反应发展出针对编码蛋白的免疫反应，并最终产生针对冠状病毒的持久保护
性反应。经由使用本文公开的编码刺突蛋白、其亚基和结构域的高效mrna疫苗避免了低免疫原性(由于对免疫系统的呈递差或抗原的不正确折叠而导致的蛋白疫苗开发的缺点)。
25.本公开提供了引发针对冠状病毒抗原的强效中和抗体的组合物(例如，mrna疫苗)。在一些实施方案中，组合物包括编码至少一种(例如，一种、两种或更多种)冠状病毒抗原(例如sars-cov-2抗原)的mrna。在一些实施方案中，所述mrna编码刺突蛋白结构域，例如受体结合结构域(rbd)、n末端结构域(ntd)或rbd和ntd的组合。
26.本公开的一些方面提供了包含编码融合蛋白的开放阅读框的信使核糖核酸(mrna)，所述融合蛋白包含sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)和蛋白质跨膜结构域，例如天然存在的或异源的跨膜结构域。
27.在一些实施方案中，所述蛋白质跨膜结构域是流感血凝素跨膜结构域。
28.在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
29.在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
30.在一些实施方案中，所述融合蛋白包含seq id no：77的氨基酸序列。
31.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：76的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
32.在一些实施方案中，其中所述开放阅读框包含与seq id no：76的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
33.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含seq id no：76的核苷酸序列。
34.本公开的其他方面提供了包含编码融合蛋白的开放阅读框的信使核糖核酸(mrna)，所述融合蛋白包含sars-cov-2刺突蛋白的氨基(n)末端结构域和跨膜结构域。
35.在一些实施方案中，所述跨膜结构域是流感血凝素跨膜结构域。
36.在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与seq id no：47的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
37.在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与seq id no：47的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
38.在一些实施方案中，所述融合蛋白包含seq id no：47的氨基酸序列。
39.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：46的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
40.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：46的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
41.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含seq id no：46的核苷酸序列。
42.本公开的其他方面提供了包含编码融合蛋白的开放阅读框的信使核糖核酸(mrna)，所述融合蛋白包含任选地经由接头与sars-cov-2刺突蛋白的氨基(n)末端结构域
连接的sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域。
43.在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含跨膜结构域。
44.在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与seq id no：92的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
45.在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与seq id no：92的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
46.在一些实施方案中，所述融合蛋白包含seq id no：92的氨基酸序列。
47.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：91的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
48.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：91的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
49.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含seq id no：91的核苷酸序列。
50.在一些实施方案中，所述mrna还包含5
′
非翻译区(utr)，所述5
′
非翻译区任选地包含seq id no：131或2的核苷酸序列。
51.在一些实施方案中，所述mrna还包含3
′
非翻译区(utr)，所述3
′
非翻译区任选地包含seq id no：132或4的核苷酸序列。
52.在一些实施方案中，所述mrna还包含5
′
帽，任选地7mg(5
′
)ppp(5
′
)nlmpnp。
53.在一些实施方案中，所述mrna还包含多聚a尾，所述多聚a尾任选地具有约100个核苷酸的长度。
54.在一些实施方案中，所述mrna包含化学修饰，任选地1-甲基假尿苷。
55.本公开的一些方面提供了包含前述段落中任一者的mrna的组合物。
56.本公开的其他方面提供了包含前述段落中任一者的至少两种mrna的组合物。
57.本公开的其他方面提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包含编码融合蛋白的开放阅读框的信使核糖核酸(mrna)，所述融合蛋白包含sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)和蛋白质跨膜结构域；和(b)包含编码融合蛋白的开放阅读框的mrna，所述融合蛋白包含sars-cov-2刺突蛋白的氨基(n)末端结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，(a)的mrna对(b)的mrna的比率为约1∶1，例如1∶2、1∶3、2∶1或3∶1。在一些实施方案中，组合物的至少50％的mrna为(a)的mrna。例如，组合物的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的mrna为(a)的mrna。在一些实施方案中，组合物的至少50％的mrna为(b)的mrna。例如，组合物的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的mrna为(b)的mrna。
58.在一些实施方案中，所述蛋白质跨膜结构域是流感血凝素跨膜结构域。
59.在一些实施方案中，(a)的融合蛋白包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
60.在一些实施方案中，(a)的融合蛋白包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
61.在一些实施方案中，(a)的融合蛋白包含seq id no：77的氨基酸序列。
62.在一些实施方案中，(a)的开放阅读框包含与seq id no：76的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
63.在一些实施方案中，(a)的开放阅读框包含与seq id no：76的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
64.在一些实施方案中，(a)的开放阅读框包含seq id no：76的核苷酸序列。
65.在一些实施方案中，(b)的融合蛋白包含与seq id no：47的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
66.在一些实施方案中，(b)的融合蛋白包含与seq id no：47的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
67.在一些实施方案中，(b)的融合蛋白包含seq id no：47的氨基酸序列。
68.在一些实施方案中，(b)的开放阅读框包含与seq id no：46的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
69.在一些实施方案中，(b)的开放阅读框包含与seq id no：46的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
70.在一些实施方案中，(b)的开放阅读框包含seq id no：46的核苷酸序列。
71.在一些实施方案中，所述mrna配制在脂质纳米颗粒中。
72.在一些实施方案中，所述组合物还包含脂质纳米颗粒。
73.在一些实施方案中，(a)的mrna配制在脂质纳米颗粒中，并且(b)的mrna配制在脂质纳米颗粒中。
74.在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质。
75.在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒还包含中性脂质。
76.在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒还包含固醇。
77.在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒还包含聚乙二醇(peg)修饰的脂质。
78.在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含可电离的阳离子脂质、中性脂质、固醇和peg修饰的脂质。
79.在一些实施方案中，所述可电离的阳离子脂质是8((2羟基乙基)(6氧代6-(十一烷基氧基)己基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(化合物1)。
80.在一些实施方案中，所述中性脂质是1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)。
81.在一些实施方案中，所述固醇是胆固醇。
82.在一些实施方案中，所述peg修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(peg2000 dmg)。
83.在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离的阳离子脂质、5-25mol％中性脂质、25-55mol％固醇和0.5-15mol％peg修饰的脂质。
84.在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含：47mol％可电离的阳离子脂质；
11.5mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和3.0mol％peg修饰的脂质；48mol％可电离的阳离子脂质；11mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和2.5mol％peg修饰的脂质；49mol％可电离的阳离子脂质；10.5mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和2.0mol％peg修饰的脂质；50mol％可电离的阳离子脂质；10mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和1.5mol％peg修饰的脂质；或51mol％可电离的阳离子脂质；9.5mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和1.0mol％peg修饰的脂质。
85.在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含47mol％化合物1；11.5mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和3.0mol％peg2000 dmg；48mol％化合物1；11mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和2.5mol％peg2000 dmg；49mol％化合物1；10.5mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和2.0mol％peg2000 dmg；50mol％化合物1；10mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和1.5mol％peg2000 dmg；或51mol％化合物1；9.5mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和1.0mol％peg2000 dmg。
86.本公开的其他方面提供了一种方法，所述方法包括向受试者施用在所述受试者中有效诱导针对sars-cov-2的中和抗体反应的量的前述权利要求中任一项所述的mrna或组合物。
87.本公开的其他方面提供了一种方法，所述方法包括向受试者施用在所述受试者中有效诱导针对sars-cov-2的t细胞免疫反应的量的前述权利要求中任一项所述的mrna或组合物。
88.本公开的一些方面提供了包含开放阅读框(orf)的信使核糖核酸(mrna)，所述开放阅读框编码能够诱导针对sars-cov-2的免疫反应(例如中和抗体反应)的冠状病毒抗原，其中所述抗原包含sars-cov-2的蛋白质片段或功能性蛋白质结构域，任选地其中所述rna配制在脂质纳米颗粒中。
89.在一些实施方案中，所述抗原是功能性蛋白质结构域。
90.在一些实施方案中，所述蛋白质结构域是sars-cov-2刺突蛋白的n末端结构域(ntd)。
91.在一些实施方案中，所述ntd与跨膜结构域、任选地流感血凝素跨膜结构域连接。
92.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：47的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：47的氨基酸序列。
93.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：46的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：46的核苷酸序列。
94.在一些实施方案中，所述蛋白质结构域是sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)。
95.在一些实施方案中，所述rbd是可溶的。
96.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：62的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：62的氨基酸序列。
97.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：61的核苷酸序列具有至少
70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：61的核苷酸序列。
98.在一些实施方案中，所述rbd与跨膜结构域、任选地流感血凝素跨膜结构域连接。
99.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：77的氨基酸序列。
100.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：76的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：76的核苷酸序列。
101.在一些实施方案中，所述ntd与sars-cov-2刺突蛋白的rbd连接以形成ntd-rbd融合蛋白。
102.在一些实施方案中，所述ntd-rbd融合体与跨膜结构域(tm)、任选地流感血凝素跨膜结构域连接，以形成ntd-rbd-tm蛋白。
103.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：92的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：92的氨基酸序列。
104.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：91的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：91的核苷酸序列。
105.在一些实施方案中，所述ntd-rbd融合体包含c末端截短。
106.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：107的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：107的氨基酸序列。
107.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：106的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：106的核苷酸序列。
108.在一些实施方案中，所述ntd和/或rbd包括延伸区。
109.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：59、86、89、116、119或122中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：59、86、89、116、119或122中的任一者的氨基酸序列。
110.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：58、85、88、115、118或121中的任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：58、85、88、115、118或121中的任一者的核苷酸序列。
111.在一些实施方案中，所述蛋白质结构域是sars-cov-2刺突蛋白的s1亚基结构域。
112.在一些实施方案中，所述s1亚基是可溶的。
113.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：5的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序
列，任选地其中所述抗原包含seq id no：5的氨基酸序列。
114.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：3的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：3的核苷酸序列。
115.在一些实施方案中，所述s1亚基与跨膜结构域、任选地流感血凝素跨膜结构域连接。
116.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：17的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：17的氨基酸序列。
117.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：16的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：16的核苷酸序列。
118.在一些实施方案中，所述s1亚基经修饰以去除s蛋白的rbd或rbd的一部分。
119.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：20、23、26、29、32或35中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：20、23、26、29、32或35中的任一者的氨基酸序列。
120.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：19、22、25、28、41或34中的任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：19、22、25、28、31或34中的任一者的核苷酸序列。
121.在一些实施方案中，所述s1亚基与s蛋白的s2亚基连接。
122.在一些实施方案中，所述s2亚基来自sars-cov-2 s蛋白。
123.在一些实施方案中，所述s1亚基来自hku1 s蛋白。
124.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：38的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：38的氨基酸序列。
125.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：37的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：37的核苷酸序列。
126.在一些实施方案中，所述s1亚基来自oc43s蛋白。
127.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：41的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：41的氨基酸序列。
128.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：40的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：40的核苷酸序列。
129.在一些实施方案中，所述抗原还包含支架结构域，任选地选自铁蛋白、2，4-二氧四氢蝶啶(lumazine)合成酶和折叠子。
130.在一些实施方案中，所述支架结构域是铁蛋白。
131.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：8或65的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：8或65的氨基酸序列。
132.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：7或64的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：7或64的核苷酸序列。
133.在一些实施方案中，所述支架结构域是2，4-二氧四氢蝶啶合成酶。
134.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：11、14、68或71中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：11、14、68或71中的任一者的氨基酸序列。
135.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：10、13、67或70中的任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：10、13、67或70中的任一者的核苷酸序列。
136.在一些实施方案中，所述支架结构域是折叠子。
137.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：44、50、74、80、83、101、104或113中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：44、50、74、80、83、101、104或113中的任一者的氨基酸序列。
138.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：43、49、73、79、82、100、103或112中的任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：43、49、73、79、82、100、103或112中的任一者的核苷酸序列。
139.在一些实施方案中，所述抗原还包含运输信号，任选地选自巨噬细胞标志物，任选地cd86、cd11b和/或vsvgct。
140.在一些实施方案中，所述抗原包含与seq id no：95、98或110中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：95、98或110中的任一者的氨基酸序列。
141.在一些实施方案中，所述开放阅读框包含与seq id no：94、97或109中的任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：94、97或109中的任一者的核苷酸序列。
142.在一些实施方案中，所述mrna配制在脂质纳米颗粒中。
143.在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质(任选地可电离的阳离子脂质)、中性脂质、固醇和/或聚乙二醇(peg)修饰的脂质。可电离的阳离子脂质在本文中可
viruses；11(1)：第59页)。大部分抗原性肽位于结构蛋白中(cui等人，2019 nat.rev.microbiol.；17(3)：181-192)。刺突表面糖蛋白(s)、小包膜蛋白(e)、基质蛋白(m)和核衣壳蛋白(n)是四种主要的结构蛋白。由于s-蛋白有助于细胞向性，其能够诱导中和抗体(nab)和保护性免疫，因此可将其视为所有其他结构蛋白中冠状病毒疫苗开发中最重要的靶标之一。此外，氨基酸序列分析显示s-蛋白含有冠状病毒中的保守区，其可为通用疫苗开发的基础。
151.抗原
152.本发明的组合物(例如疫苗组合物)的特征在于设计用于编码目标抗原(例如，源自β冠状病毒结构蛋白的抗原，特别是源自sars-cov-2刺突蛋白的抗原)的核酸，特别是mrna。本发明的组合物(例如疫苗组合物)不包含抗原本身，而是包含一旦递送至细胞、组织或受试者即编码抗原或抗原性序列的核酸，特别是mrna。核酸分子(特别是mrna)的递送是通过将所述核酸分子配制在适当载体或递送媒介物(例如，脂质纳米颗粒)中来实现，使得在施用至细胞、组织或受试者后，核酸由细胞摄取，所述细胞进而表达由核酸(例如mrna)编码的蛋白质。如本文所用的术语“抗原”是指例如蛋白质(例如糖蛋白)、多肽、肽等的物质，其引发免疫反应，例如当存在于受试者中时(例如，当存在于人类或哺乳动物受试者中时)引发免疫反应。本发明至少部分基于以下理解：当mrna编码的抗原从施用至细胞或受试者的mrna表达时，可引起免疫系统产生针对表达的抗原的免疫反应，例如可触发针对表达抗原的抗体(例如结合和/或中和抗体)的产生，可触发对表达的抗原具特异性的b细胞和或t细胞反应，并且最终可引起针对随后遇到抗原或与抗原相关的病原体的保护性或预防性反应。优选的mrna编码的抗原是“病毒抗原”。如本文所用的术语“病毒抗原”是指源自病毒、例如源自致病病毒的抗原。如本文所用的术语抗原可指全长蛋白，例如全长病毒蛋白，或者可指蛋白的片段(例如多肽或肽片段)、亚基或结构域，例如病毒蛋白亚基或结构域。
153.许多蛋白质具有四级或三维结构，其由一个以上多肽或若干缔合成寡聚分子的多肽链组成。如本文所用的术语“亚基”是指单一蛋白质分子，例如，由加工新生蛋白质分子产生的多肽或多肽链，所述亚基与其他蛋白质分子(例如亚基或链)组装(或“共组装”)形成蛋白质复合体。蛋白质可具有相对小数目的亚基，并且因此阐述为“寡聚的”，或者可由大数目的亚基组成并且因此阐述为“多聚的”。寡聚或多聚蛋白质的亚基可为相同的、同源的或完全不相似的，并且专用于不同的任务。
154.蛋白质或蛋白质亚基还可包含结构域。如本文所用的术语“结构域”是指蛋白质内不同的功能和/或结构单元。通常，“结构域”负责特定功能或相互作用，从而有助于蛋白质的总体作用。结构域可存在于各种生物环境中。相似结构域(即，共享结构、功能和/或序列同源性的结构域)可存在于单一蛋白质内或者可存在于具有相似或不同功能的不同蛋白质内。蛋白质结构域通常是给定蛋白质三级结构或序列的保守部分，其可独立于蛋白质或其亚基的其余部分起作用和存在。
155.在结构和分子生物学中，相同、同源或相似的亚基或结构域可帮助对新近鉴定或新颖蛋白质进行分类，正如在sars-cov-2病毒基因组序列公开后立即进行的那样。
156.如本文所用的术语抗原不同于术语“表位”，所述表位是抗原的亚结构，例如多肽或碳水化合物结构，其可由抗原结合位点识别，但不足以诱导免疫反应。本领域阐述了以分离形式递送至受试者或免疫细胞的蛋白抗原，例如分离的蛋白质、多肽或肽抗原，然而，蛋
白抗原的设计、测试、验证和产生可为昂贵且耗时的，尤其是当大规模产生蛋白时。相反，mrna技术可用于快速设计和测试编码各种抗原的mrna构建体。此外，结合配制在适当递送媒介物(例如，脂质纳米颗粒)中的mrna的快速产生可快速进行并且可快速大规模产生mrna疫苗。潜在益处还来自于以下事实：由本发明的mrna编码的抗原由受试者的细胞表达，例如由人体表达，并且因此，受试者(例如人体)用作“工厂”以产生抗原，其进而引发期望免疫反应。
157.在优选方面，抗原是能够诱导免疫反应(例如，引起免疫系统产生针对抗原的抗体)的蛋白质。在本文中，除非另有说明，否则术语“抗原”的使用涵盖免疫原性蛋白以及衍生自免疫原性蛋白的多肽或肽，例如免疫原性片段(诱导(或能够诱导)对抗原的免疫反应的免疫原性片段)。应理解，术语“蛋白质”涵盖多肽和肽，并且术语“抗原”涵盖抗原性片段。其他分子可为抗原性的，例如细菌多糖或蛋白和多糖结构的组合，但对于本文包括的病毒疫苗，源自β冠状病毒sars-cov-2的病毒蛋白、病毒蛋白片段和设计和或突变的蛋白是本文特征性的抗原。
158.核酸/mrna
159.本文所述的疫苗技术的特征在于设计用于编码目标抗原(例如β冠状病毒刺突蛋白抗原、其亚基、结构域或片段(例如抗原性片段))的核酸，特别是信使rna(mrna)。本发明的核酸(例如mrna)优选配制在适当载体或递送媒介物(例如，脂质纳米颗粒)中，使得核酸(例如mrna)适于体内使用。核酸(例如mrna)当经适当配制时能够递送至受试者(例如人类受试者)内的细胞和/或组织，以完成由这些核酸编码的蛋白质的翻译。
160.核酸分子是由携带遗传信息的连接核苷酸构成的大分子，并且通过指导蛋白质合成过程，指导大部分(如果并非全部)细胞功能。核酸包含核苷酸(核苷酸单体)的聚合物。因此，核酸也称为多核苷酸(也称为多核苷酸链)。核酸的两个主要类别是脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。dna构成所有自由生活的生物体和大部分病毒中的遗传物质。rna是某些病毒的遗传物质，但也在所有活细胞中发现，在所述活细胞中，rna在细胞过程中、最显著的是在蛋白质的制备中起重要作用。
161.核苷是核酸(例如dna和rna)的结构亚基。核苷由共价附接至五碳碳水化合物核糖或“糖”(其为核糖或脱氧核糖)的含氮碱基(核碱基)、通常为嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)或嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)构成。核苷酸由含氮碱基、糖(核糖或脱氧核糖)和一个至三个磷酸基团组成。本质上，核苷酸仅仅是具有一个或多个额外磷酸基团的核苷。
162.核酸分子(dna和rna)由在一个核苷酸的糖碱基与相邻核苷酸的磷酸基团之间通过化学键(称为酯键)在链中彼此连接的核苷酸构成。糖在每个核苷酸的3
′
端，并且磷酸在每个核苷酸的5
′
端。附接至一个核苷酸上的糖的5
′
碳的磷酸基团与下一个核苷酸的3
′
碳上的游离羟基形成酯键。这些键称为磷酸二酯键，并且当合成分子时，糖-磷酸主链阐述为在5
′
至3
′
方向上延伸或生长。
163.核酸的核碱基部分的特征在于嘌呤碱基：腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)；和嘧啶碱基：胞嘧啶(c)、dna中的胸腺嘧啶(t)和rna中的尿嘧啶(u)。核酸的糖部分的特征在于dna中的脱氧核糖、rna中的核糖。五个核苷通常分别缩写为其单字母代码a、g、c、t和u。然而，胸苷更通常地写为“dt”(“d”代表“脱氧”)，因为其含有2
′‑
脱氧呋喃核糖部分而非尿苷中发现的呋喃核糖环。这是由于胸苷在脱氧核糖核酸(dna)而非核糖核酸(rna)中发现。相反，尿苷在rna
中而非dna中发现。其余三个核苷可在rna和dna二者中发现。在rna中，其将表示为a、c和g，而在dna中，其将表示为da、dc和dg。
164.本领域技术人员应理解，除非另有说明，否则本技术中所阐释的核酸序列可在代表性dna序列中列举“t”，但在序列表示mrna的情况下，“t”将被取代为“u”。因此，所公开和由本文特定序列识别号鉴定的任何dna还公开了与dna互补的相应mrna序列，其中dna序列的每个“t”被“u”取代。
165.核酸可为或可包括例如脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)(例如mrna)、苏糖核酸(tna)、二醇核酸(gna)、肽核酸(pna)、锁核酸(lna，包括具有β-d-核糖构型的lna、具有α-l-核糖构型的α-lna(lna的非对映异构体)、具有2
′‑
氨基官能化的2
′‑
氨基-lna和具有2
′‑
氨基官能化的2
′‑
氨基-α-lna)、乙烯核酸(ena)、环己烯基核酸(cena)和/或其嵌合体和/或组合。
166.本发明的特征在于信使rna(mrna)，特别是设计用于编码目标抗原(例如β冠状病毒刺突蛋白抗原、其亚基、结构域或片段(例如抗原性片段))的mrna。信使rna(mrna)(一种rna亚型)是对应于基因的遗传序列的单链rna分子。在转录过程中产生mrna，其中单链dna通过rna聚合酶解码，并且合成、即转录mrna。mrna在合成蛋白质、即翻译的过程中由核糖体读取。因此，信使rna(mrna)是编码(至少一种)蛋白质(天然存在的、非天然存在的或经修饰的氨基酸聚合物)的rna，并且可经翻译以在体外、体内、原位或离体产生编码的蛋白质。
167.本公开的组合物包含(至少一种)具有编码冠状病毒抗原的开放阅读框(orf)的mrna。在一些实施方案中，mrna还包含5
′
utr、3
′
utr、多聚(a)尾和/或5
′
帽或帽类似物。开放阅读框(orf)是一段连续的dna或rna，以起始密码子(例如，甲硫氨酸(atg或aug))开始并以终止密码子(例如taa、tag或tga，或uaa、uag或uga)结束。orf通常编码蛋白质。应理解，本文公开的序列还可包含额外元件，例如5
′
和3
′
utr，但与orf不同，那些元件不一定存在于本公开的mrna中。还应理解，本发明的mrna(例如本公开的β冠状病毒疫苗中特征性的mrna)可包括任何5
′
非翻译区(utr)和/或任何3
′
utr。示例性utr序列提供于序列表中(例如，seq id no：2、4、131和132)；然而，其他utr序列可使用或替换本文所述的任何utr序列。还可从本文提供的mrna省略utr。
168.在一些实施方案中，组合物包含mrna，所述mrna包含与seq id no：45、75或90中的任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包含mrna，所述mrna包含与表1至表15中的序列中的任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
169.在一些实施方案中，组合物包含mrna，所述mrna包含与seq id no：46、76或91中的任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的orf。在一些实施方案中，组合物包含mrna，所述mrna包含与表1至表15中的序列中的任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的orf。
170.表1至表15中提供了本公开的组合物的冠状病毒抗原和编码所述冠状病毒抗原的
mrna的示例性序列。
171.应理解，本文所述mrna编码的任何一种抗原可包含或不包含信号序列。
172.编码的冠状病毒刺突(s)蛋白抗原
173.已知的β冠状病毒的包膜刺突(s)蛋白决定病毒宿主向性和进入宿主细胞。冠状病毒刺突(s)蛋白是疫苗设计的选择抗原，因为其可诱导中和抗体和保护性免疫。s蛋白对于sars-cov-2感染至关重要。s蛋白的组织在β冠状病毒(例如sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hku1-cov、mhv-cov和nl63-cov)中是相似的。
174.如本文所用的术语“刺突蛋白”是指形成从病毒(包括β冠状病毒)的包膜(病毒表面)突出的同三聚体的糖蛋白。三聚化刺突蛋白通过与宿主细胞表面上的受体结合、接着融合病毒和宿主细胞膜而促进病毒粒子进入宿主细胞。s蛋白是高度糖基化的大的i型跨膜融合蛋白，其由1,160至1,400个氨基酸组成，这取决于病毒的类型。β冠状病毒刺突蛋白包含约1100至1500个氨基酸，并且包含如图1所阐释的结构(即，结构域组成和组织)。sars-cov-2刺突(s)蛋白是疫苗设计的选择抗原，因为其可诱导中和抗体和保护性免疫。本发明的mrna经设计用于产生sars-cov-2刺突蛋白(即，编码刺突蛋白，使得当mrna递送至细胞或组织(例如受试者的细胞或组织)时刺突蛋白表达)，以及其抗原性变体。本领域技术人员将理解，尽管基本上全长或完整刺突蛋白对于病毒(例如β冠状病毒)实施其促进病毒进入宿主细胞的预期功能可为必需的，但当主要寻求引发针对刺突蛋白的免疫反应时，可耐受刺突蛋白结构和/或序列的一定量的变化。例如，可耐受例如从编码的刺突蛋白(例如编码的刺突蛋白抗原)的n末端或c末端的一个至几个、可能至多5个或至多10个氨基酸的少量截短，而不改变蛋白质的抗原性质。同样，可耐受编码的刺突蛋白(例如编码的刺突蛋白抗原)的一个至几个、可能至多5个或至多10个氨基酸(或更多)的变化(例如保守取代)，而不改变蛋白质的抗原性质。在示例性实施方案中，刺突蛋白(例如编码的刺突蛋白抗原)具有表1-15的序列中的任一者中所阐释的氨基酸序列(例如，源自如seq id no：125所阐释的氨基酸序列)。在其他实施方案中，与具有表1-15的序列中的任一者中所阐释的氨基酸序列(例如，源自如seq id no：125所阐释的氨基酸序列)的刺突蛋白相比(当与其比对时)，刺突蛋白(例如编码的刺突蛋白抗原)具有不大于100、不大于90、不大于80、不大于70、不大于60、不大于50、不大于40、不大于30、不大于20、不大于10或不大于5个氨基酸取代和/或缺失。在编码的刺突蛋白序列中发生微小变化的情况下，变体优选具有与参考刺突蛋白序列相同的活性和/或具有与参考刺突蛋白相同的免疫特异性，如例如在免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(elisa测定))中所确定。
175.冠状病毒的s蛋白可分为两个重要的功能亚基，其中包括n末端s1亚基，其形成s蛋白的球状头部；和c末端s2区，其形成蛋白的茎并直接嵌入病毒包膜中。在与潜在宿主细胞相互作用时，s1亚基将识别并结合至宿主细胞上的受体，特别是血管收缩肽转化酶2(ace2)受体，而作为s蛋白的最保守组分的s2亚基将负责将病毒的包膜与宿主细胞膜融合。(参见例如shang等人，plos pathog.2020年3月；16(3)：e1008392。)。三聚化s蛋白三聚体的每个单体含有两个亚基s1和s2，分别介导附着和膜融合。参见例如图1。作为体内感染过程的一部分，两个亚基通过酶切割过程彼此分离。s蛋白首先通过弗林蛋白酶(furin)介导的切割在感染细胞中在s1/s2位点进行切割，在体内，随后在s1内的s2
′
位点发生丝氨酸蛋白酶介导的切割事件。在sars-cov2中，s1/s2切割位点在氨基酸676-tqtnsprrar/sva-688(参考
225个氨基酸长度，与具有如seq id no：125所阐释的氨基酸序列的刺突蛋白的s1亚基的氨基酸316-517具有同一性。如本文所用的术语“受体结合基序”是指rbd中直接接触ace2受体的部分。预测表达的rbd特异性结合至血管收缩肽转化酶2(ace2)作为其受体和/或与rbd结合和/或中和抗体(例如cr3022)特异性反应。
179.本文提供的组合物包括mrna，其可编码任何一个或多个全长或部分(截短或其他序列缺失)s蛋白亚基(例如，s1或s2亚基)、s蛋白亚基的一个或多个结构域或结构域的组合(例如，ntd、rbd或ntd-rbd融合体，有或无sd1和/或sd2)或全长或部分s1和s2蛋白亚基的嵌合体。本文考虑其他s蛋白亚基和/或结构域配置。
180.图2和图6绘示源自sars-cov-2刺突蛋白的示例性结构域和亚基抗原。图2a和图2b分别绘示可溶性和跨膜rbd抗原。跨膜ntd抗原示于图2c中。图2d-图2f和图2i中所示的结构域抗原表示ntd和rbd的示例性融合蛋白，每种具有sp和tm结构域。构建体中的两者还具有末端运输结构域(cd86和/或cd11b)。所述结构域经由接头、特别是gs接头或padre接头(图2i)连接。具有在ntd结构域的n末端的rbd结构域的结构域构建体绘示于图2g和图2h中。每个构建体还可包括sp和/或tm结构域。
181.编码的亚基抗原
182.本公开的一些方面提供了包含编码sars-cov-2 s蛋白的(至少一个)亚基的mrna的组合物。在一些实施方案中，mrna编码s1亚基(例如全长或部分)。在其他实施方案中，mrna编码s2亚基(例如全长或部分)。在其他实施方案中，mrna编码嵌合s1-s2蛋白，其中一个亚基来自sars-cov-2 s蛋白，而另一个亚基来自另一生物体，例如病毒，如流感病毒。由本公开的mrna编码的sars-cov-2亚基(s1和/或s2)可为可溶的或膜结合的(例如，与跨膜结构域连接)。基于s2的示例性抗原设计示于图6中。图6a绘示全长s2，包括fp、hr1、hr2、tm和ct结构域。由亚基之间的接头构成的一种形式的s2示于图6b中。无ct结构域的结构域抗原示于图6c和图6d中。
183.可溶性亚基抗原
184.可溶性蛋白存在于细胞的细胞质中或从细胞分泌(例如，不结合膜)。细胞分泌的可溶性抗原可由补体调理，并且由淋巴结中的滤泡树突细胞捕获，在这里它们可由对表达的蛋白质上存在的表位特异性的b细胞识别。亚基抗原的表达进一步允许将免疫反应集中于特定亚基，并且对与其他相关病毒共有的抗原的其他结构域具有特异性的记忆b和t细胞的刺激最小。不受限于理论，据认为sars-cov-2 s1亚基(包括ntd、rbd和在一些情况下sars-cov-2 s1亚基的插入多肽)以可溶形式的呈递，产生s1亚基特异性免疫反应。因此，在一些实施方案中，本文提供的mrna编码可溶性sars-cov-2 s1亚基抗原和/或可溶性sars-cov-2 s2亚基抗原。可溶性sars-cov-2 s1亚基抗原和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表1a和表1b中。本文提供了可溶性sars-cov-2亚基抗原的其他实例。
185.表1a.可溶性亚基抗原
[0186][0187]
表1b.可溶性亚基抗原
[0188]
[0189]
[0190][0191]
膜结合的亚基抗原
[0192]
膜结合蛋白锚定在细胞膜中(不可溶的)。不受限于理论，据认为抗原呈递细胞将嵌入的抗原携带至引流淋巴结以产生强烈免疫反应。引流淋巴结中出现的生发中心反应涉及cd4
+
t
fh
细胞与b细胞之间的延长接触，允许共刺激和局部细胞因子信号，例如il-4和il-21，其有利于对所呈递抗原具特异性的b细胞的复制和类别转换至igg1的产生，其各自可促进长寿命的浆细胞和记忆b细胞的产生。因此，在一些实施方案中，mrna编码膜结合的sars-cov-2 s1亚基抗原和/或膜结合的sars-cov-2 s2亚基抗原。在一些实施方案中，膜结合抗原(例如，s1亚基、s2亚基、ntd、rbd或其任何组合)与跨膜结构域(例如天然存在的跨膜结构域或异源跨膜结构域(源自异源蛋白质)，其负责将蛋白质锚定在细胞膜中)连接。膜结合的sars-cov-2 s1亚基抗原和sars-cov-2 s2亚基抗原和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表2a和表2b中。本文考虑其他膜结合的sars-cov-2 s1亚基抗原。
[0193]
表2a.膜结合的亚基抗原
[0194][0195]
表2b.膜结合的亚基抗原
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201][0202]
亚基抗原截短和rbd缺失
[0203]
在一些实施方案中，组合物包含编码已经修饰以去除rbd或rbd的一部分的s1亚基的mrna。s1亚基的截短为免疫系统提供较少的表位来识别，从而使免疫反应偏向于其余表位，这可选择针对对于病毒中和重要的特定表位的抗体。rbd的截短或部分缺失可防止表达的蛋白质或携带其的细胞与受体ace2相互作用，使其更可能到达淋巴结并刺激所需免疫反应。此外，去除rbd可防止以前针对相关病毒产生的交叉反应性抗体造成的表位掩蔽，并因此将引发的免疫反应特异性地集中于所需抗原。另外，去除rbd可改变所表达的亚基的构象，允许对这些替代构象表位具特异性的b细胞摄取线性肽并且将线性肽呈递给t细胞，从而间接增强cd4
+
t细胞对仍以天然构象存在的那些表位的反应。
[0204]
在一些实施方案中，组合物包含编码s1亚基的mrna，所述s1亚基已被修饰以去除rbd或rbd的一部分，其中s2亚基含有聚糖。聚糖通过经由天冬酰胺残基的n-连接糖基化或丝氨酸或苏氨酸残基上的o-连接糖基化与蛋白质附接。在蛋白质的一些组分上存在聚糖屏蔽物可掩蔽肽表位，从而将抗体反应集中于其他暴露的肽表位。此外，糖基化蛋白还引发识别包被聚糖的抗体。识别聚糖表位的b细胞将摄取线性肽表位并将其呈递给cd4
+
t细胞，从而加强cd4
+
t细胞对整个蛋白中发现的线性表位的反应。
[0205]
截短的sars-cov-2 s1亚基抗原和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表3a和表3b中。
[0206]
具有rbd缺失的sars-cov-2 s1亚基和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文
表4a和表4b中。
[0207]
表3a.亚基抗原截短
[0208][0209]
表3b.亚基抗原截短
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222][0223]
表4a.亚基抗原rbd缺失
[0224][0225]
表4b.亚基抗原rbd缺失
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232][0233]
嵌合s1-s2亚基抗原
[0234]
在一些实施方案中，组合物包含编码嵌合蛋白(例如具有来自一种病毒的s蛋白的s1亚基和来自另一种不同病毒的s蛋白的s2亚基的嵌合s1-s2蛋白)的mrna。例如，s2亚基可来自sars-cov-2，而s1亚基可来自hku1。作为另一实例，s2亚基可来自sars-cov-2，而s1亚基可来自oc43。这些嵌合蛋白可能由通过先前暴露而产生的对hku1或oc43的s1亚基具特异性的循环抗体调理，促进巨噬细胞和树突细胞有效地摄取sars-cov-2 s2亚基肽并将其交叉呈递给cd4
+
t细胞。通过循环抗体的调理作用还促进由滤泡树突细胞的捕获，用于呈递给具有对sars-cov-2 s2亚基表位具特异性的受体的b细胞。嵌合s1/s2亚基构建体和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表5a和表5b中。
[0235]
表5a.嵌合s1亚基-s2亚基抗原
[0236][0237]
表5b.嵌合s1亚基-s2亚基抗原
[0238]
[0239]
[0240]
[0241]
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248][0249]
编码的结构域抗原
[0250]
本公开的其他方面提供了包含编码s蛋白的sars-cov-2 s1亚基的(至少一个)子结构域的mrna的组合物。所述子结构域可为n末端结构域(ntd)或受体结合结构域(rbd)(有或无sd1和/或sd2)。在一些实施方案中，mrna编码ntd和rbd(有或无sd1和/或sd2)的组合(例如，非天然组合)。在一些实施方案中，所述ntd和/或rbd与跨膜结构域(有或无sd1和/或sd2)连接。在一些实施方案中，所述mrna编码s蛋白的sars-cov-2 s1亚基的两个子结构域(ntd和rbd)，其经突变以包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，此类突变导致二硫键的形成。举例来说，mrna可编码包含f43c突变的ntd和包含q563c突变的rbd，最终产生经由二硫键与rbd连接的ntd。
[0251]
n末端结构域(ntd)构建体
[0252]
在一些实施方案中，本文提供的mrna编码sars-cov-2 s蛋白的s1亚基的ntd。某些β冠状病毒的ntd会引发保护性水平的抗体。对其他β冠状病毒(例如mers)的ntd具特异性的抗体通过防止膜融合和病毒进入起作用(zhou h等人，nat commun.2019；3068)，提供不同于防止病毒附着至ace2的第二种中和机制。由本公开的mrna编码的sars-cov-2 ntd可为可溶的或膜结合的。膜结合的sars-cov-2 ntd抗原和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表6a和表6b中。
[0253]
表6a.膜结合的ntd抗原
[0254][0255]
表6b.膜结合的ntd抗原
[0256]
[0257][0258]
受体结合结构域(rbd)构建体
[0259]
在其他实施方案中，本文提供的mrna编码sars-cov-2 s蛋白的s1亚基的rbd。rbd结合宿主细胞上的ace2受体，这介导病毒附着至细胞。附着对于病毒进入细胞和复制是必需的。因此，阻断病毒附着至细胞中的rbd靶向抗体反应有效地中和细胞外病毒颗粒，从而防止增殖并促进对中和的病毒颗粒的其他组分的进一步免疫反应。由本公开的mrna编码的sars-cov-2 rbd可为可溶的或膜结合的(例如，与跨膜结构域连接)。
[0260]
可溶性rbd抗原
[0261]
在一些实施方案中，mrna编码可溶性sars-cov-2 rbd。树突细胞通过胞饮作用对可溶性蛋白进行取样，并且在迁移至引流淋巴结时，将包含取样的蛋白质的线性肽呈递至cd4
+
t细胞。这些cd4
+
t细胞向已经识别、摄取和呈递来自rbd的表位的b细胞提供增殖信号，因此施用特异性rbd而没有sars-cov-2刺突蛋白的其他组分预计将免疫反应集中于rbd中存在的表位。可溶性sars-cov-2 rbd和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表7a和表7b中。
[0262]
表7a.可溶性rbd抗原
[0263][0264]
表7b.可溶性rbd抗原
[0265]
[0266][0267]
膜结合的rbd抗原
[0268]
在一些实施方案中，mrna编码膜结合的sars-cov-2 rbd。预计表达膜结合的rbd的细胞将这些膜结合的抗原携带至引流淋巴结，并促进rbd特异性b细胞对表位的有效识别。
由于b细胞表面含有许多表面结合的抗体并且表达细胞含有许多膜结合的rbd的拷贝，因此预计b细胞初始识别抗原后会发生b细胞受体的交联，从而经由亲合效应刺激强烈反应。膜结合的sars-cov-2 rbd和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表8a和表8b中。
[0269]
表8a.膜结合的rbd抗原
[0270][0271]
表8b.膜结合的rbd抗原
[0272]
[0273][0274]
结构域融合抗原
[0275]
在其他实施方案中，本文提供的mrna编码sars-cov-2 ntd-rbd融合蛋白。例如，s蛋白的sars-cov-2 s1亚基的ntd和rbd可经由接头(例如短氨基酸(例如，甘氨酸-丝氨酸)接头)彼此连接，以允许结构域之间的柔性/铰接和空间。在另一个实施方案中，可使用包含抗原性表位(例如ii类通用t细胞表位，例如padre)的接头。在一些实施方案中，跨膜区例如经由另一短氨基酸(例如，甘氨酸-丝氨酸或padre)接头与ntd-rbd融合体连接以获得柔性并允许膜与抗原之间存在合理距离。不受限于理论，据认为这种膜结合的串联配置在一个开放阅读框中呈递大部分(如果并非全部)已知中和表位和保护性表位。施用这种融合蛋白然后应将免疫反应集中于已知保护性表位，并减少对非保护性表位特异的抗体和t细胞的
不必要产生。此外，针对不同结构域的抗体可经由不同机制、例如通过阻断与宿主细胞的附着或防止结合的病毒经历膜融合并进入宿主细胞来中和病毒颗粒。因此，由包含不同结构域的融合蛋白引发的广泛反应在进化上可能更稳固，需要多个不同突变来逃避疫苗诱导的免疫。sars-cov-2 ntd-rbd融合蛋白和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表9a和表9b中。
[0276]
接头
[0277]
根据本公开可使用多种接头。如本文提供的接头仅仅是将两个其他氨基酸序列人工连接在一起的氨基酸序列。本文所用的接头可为可切割的或不可切割的。可切割的接头允许将mrna翻译成多肽，之后接头的切割允许独立地释放每个个别组分。不可切割的接头保持连接一个或多个蛋白质亚基，允许整个蛋白质实施需要组分亚基紧密接近的功能。此类接头的非限制性实例包括甘氨酸-丝氨酸(gs)接头(不可切割的)；以及f2a接头、p2a接头、t2a接头和e2a接头(可切割的)。本文可使用其他连接。
[0278]
在一些实施方案中，所述接头是gs接头。gs接头是包括甘氨酸和丝氨酸氨基酸重复的多肽接头。其包含柔性和亲水性残基，并且可用于实施蛋白质亚基的融合，而不干扰蛋白质结构域的折叠和功能，并且不形成二级结构。在一些实施方案中，mrna编码包含3至20个氨基酸长的gs接头的融合蛋白。例如，所述gs接头可具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度(或具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度)。在一些实施方案中，gs接头是(或至少是)15个氨基酸长(例如，ggsggsggsggsggg(seq id no：133))。在一些实施方案中，gs接头是(或至少是)8个氨基酸长(例如，gggsgggs(seq id no：134))。在一些实施方案中，gs接头是(或至少是)7个氨基酸长(例如，gggsggg(seq id no：135))。在一些实施方案中，gs接头是(或至少是)4个氨基酸长(例如，gggs(seq id no：136))。在一些实施方案中，gs接头包含(gggs)n(seq id no：136)，其中n为1-5的任何整数。在一些实施方案中，gs接头是(或至少是)4个氨基酸长(例如，gsgg(seq id no：152))。在一些实施方案中，所述gs接头包含(gsgg)n(seq id no：152)，其中n为1-5的任何整数。
[0279]
在一些实施方案中，接头是甘氨酸接头，例如具有3个氨基酸的长度(或至少3个氨基酸的长度)(例如，ggg)。
[0280]
在一些实施方案中，由mrna疫苗编码的蛋白质包括一个以上接头，其可彼此相同或不同(例如，在同一s蛋白构建体中的gggsggg(seq id no：135)和gggs(seq id no：136))。
[0281]
在一些实施方案中，接头包含编码泛hla dr结合表位(padre)的mrna(例如，akfvaawtlkaaa(seq id no：148))。padre是免疫显性辅助cd4t细胞表位和强效免疫原(参见，例如alexander j.等人，j of immuno.164(3)：1625-33，通过引用并入本文)。
[0282]
表9a.结构域融合抗原
[0283][0284][0285]
表9b.结构域融合抗原
[0286]
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]
[0291]
[0292][0293]
运输信号
[0294]
在一些实施方案中，mrna编码与高尔基体(golgi)运输信号连接的sars-cov-2 s蛋白结构域(例如，ntd、rbd或ntd-rbd融合体)。此类信号的非限制性实例包括巨噬细胞标志物，例如cd86和/或cd11b，其是高度表达的，并且细胞内区可控制从高尔基体至细胞表面的有效输出。本文可使用其他细胞运输信号(序列)，例如vsv-g胞质尾(vsvgct)。预计将编码的蛋白质更有效地运输至细胞表面会增加b细胞识别的抗原可用性，并因此促进产生针对编码的sars-cov-2 s蛋白结构域的抗体。与运输信号连接的sars-cov-2抗原和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表10a和表10b中。
[0295]
表10a.与运输信号连接的结构域融合抗原
[0296][0297]
表10b.与运输信号连接的结构域融合抗原
[0298]
[0299]
[0300]
[0301]
[0302]
[0303][0304]
结构域融合c末端截短
[0305]
在其他实施方案中，本文提供的mrna编码sars-cov-2 ntd-rbd融合蛋白，其中c末端结构域的某一部分已经截短/缺失。在一个实施方案中，ntd-rbd融合蛋白的c末端结构域缺失13个(或至少13个)氨基酸。预计这些氨基酸的缺失会增加表位于抗体中的暴露，从而刺激对ntd和rbd结构域上存在的保护性表位的更稳固的免疫反应。
[0306]
具有c末端截短的sars-cov-2结构域融合抗原和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表11a和表11b中。
[0307]
表11a.结构域融合c末端截短
[0308]
[0309]
表11b.结构域融合c末端截短
[0310]
[0311]
[0312][0313]
结构域延伸
[0314]
在一些实施方案中，sars-cov-2 s蛋白结构域抗原包括“延伸”区，其包括与本领域理解的ntd结构域或rbd结构域相邻和/或侧接的序列。rbd_ext系列涵盖sd1(子结构域1)。ntd_ext系列涵盖ntd中的c末端螺旋。一些b细胞和抗体识别仅在正确折叠而非变性形式的sars-cov-2 s蛋白ntd和rbd中发现的构象表位。包括与ntd和rbd结构域相邻和/或侧接的序列不仅可为抗原提供额外b细胞表位，并且可潜在地导致那些结构域的更优化折叠，并用对可在任一结构域边缘上发现的表位具特异性的抗体刺激b细胞。此外，包括这些延伸序列可因此增加ntd或rbd与表达细胞膜之间的距离，从而增加两个结构域于抗体中的暴露，如果表达的蛋白质太靠近细胞表面，则抗体结合效率较低。最后，包括延伸序列会增加肽的集合，所述肽可潜在地由识别ntd或rbd表位的b细胞呈递给cd4
+
t细胞，然后加工完整蛋白用于抗原呈递，从而增加ntd或rbd特异性b细胞接受足够t细胞辅助的机会。sars-cov-2结构域延伸和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表12a和表12b中。
[0315]
表12.结构域延伸
[0316][0317]
表12b.结构域延伸
[0318]
[0319]
[0320]
[0321]
[0322]
[0323]
[0324]
[0325]
[0326]
[0327]
[0328]
[0329]
[0330]
[0331]
[0332]
[0333][0334]
结构域混合物
[0335]
在一些方面，本公开提供了包含编码sars-cov-2 s蛋白子结构域的mrna的混合物的组合物。在一个实例中，组合物包含编码ntd(有或无sd1、sd2和/或跨膜结构域)的mrna和编码rbd(有或无sd1、sd2和/或跨膜结构域)的mrna的混合物。在一些实施方案中，组合物包
含编码与跨膜结构域连接的ntd(例如seq id no：47)的mrna(例如seq id no：45或46)和编码与跨膜结构域连接的rbd(例如seq id no：77)的mrna(例如seq id no：75或76)。
[0336]
组合物中一种mrna对另一种mrna的浓度的比率可为1∶1(50∶50)、1∶2、1∶3、1∶4或1∶5。在一些实施方案中，所述比率为1∶1。例如，组合物可包含1∶1比率的编码与跨膜结构域连接的ntd(例如seq id no：47)的mrna(例如seq id no：45或46)对编码与跨膜结构域连接的rbd(例如seq id no：77)的mrna(例如seq id no：75或76)。在一些实施方案中，所述比率为1∶2。例如，组合物可包含1∶2比率的编码与跨膜结构域连接的ntd(例如seq id no：47)的mrna(例如seq id no：45或46)对编码与跨膜结构域连接的rbd(例如seq id no：77)的mrna(例如seq id no：75或76)。另一个实例，组合物可包含1∶2比率的编码与跨膜结构域连接的rbd(例如，seq id no：77)的mrna(例如seq id no：75或76)对编码与跨膜结构域连接的ntd(例如，seq id no：47)的mrna(例如，seq id no：45或46)。编码不同抗原的不同mrna可刺激不同强度的免疫反应(magini d等人，plos one.2016；11：e0161193)，并且施用等摩尔比率的编码两种不同抗原的两种mrna可引起对一者而非另一者的免疫反应(john s等人，vaccine.2018；36：1689-1699)。对共递送的mrna的比率的操纵可用于引发以相等效力靶向期望抗原的广泛免疫反应。
[0337]
编码的纳米颗粒抗原
[0338]
在一些实施方案中，本文提供的mrna疫苗编码包含与支架结构域连接的冠状病毒抗原的融合蛋白。在一些实施方案中，支架结构域赋予由本公开的mrna编码的抗原期望的性质。例如，支架结构域可例如通过改变抗原的结构、改变抗原的摄取和加工和/或使抗原结合至另一分子来改善抗原的免疫原性。在一些实施方案中，与抗原连接的支架结构域促进抗原自组装成病毒纳米颗粒或更大的蛋白质折叠免疫原。可如本文提供使用的支架结构域的非限制性实例包括铁蛋白结构域、2，4-二氧四氢蝶啶合成酶结构域、折叠子结构域和包封蛋白(encapsulin)结构域。可使用其他支架结构域。
[0339]
铁蛋白
[0340]
在一些实施方案中，铁蛋白结构域用作支架结构域。铁蛋白是主要功能为在细胞内储存铁的蛋白质。铁蛋白由二十四(24)个亚基组成，每个亚基由自组装成具有八面体对称性的四级结构的四α螺旋束构成(cho k.j.等人，j mol biol.2009；390：83-98；granier t.等人，j biol inorg chem.2003；8：105-111；和lawson d.m.等人，nature.1991；349：541-544)。铁蛋白自组装成具有稳固的热稳定性和化学稳定性的纳米颗粒。预计以这种方式将抗原包封在铁蛋白纳米颗粒内既会延迟抗原的降解还会聚集个别抗原，其中每个纳米颗粒含有二十四(24)个抗原亚基。相同抗原的多个拷贝的聚集增强了由树突细胞的抗原摄取和迁移，以及更稳固的cd4
+
和cd8
+
t细胞反应(kastenm
ü
ller k等人，j clin invest.2011；121(5)：1782-96)。因此，铁蛋白纳米颗粒是非常适合抗原呈递和疫苗开发的平台。
[0341]
在一些实施方案中，本文提供的mrna编码例如经由甘氨酸(例如，ggg)接头结构域与铁蛋白结构域连接的rbd。可使用其他接头。
[0342]
在其他实施方案中，本文提供的mrna编码例如经由甘氨酸(例如，ggg)接头与铁蛋白结构域连接的s蛋白的s1结构域。如本文中别处指示，可使用其他接头。
[0343]
与铁蛋白结构域连接的sars-cov-2抗原和编码其的mrna的非限制性实例提供于
下文表13a和表13b中。
[0344]
表13a.与铁蛋白结构域连接的抗原
[0345][0346]
表13b.与铁蛋白结构域连接的抗原
[0347]
[0348]
[0349]
[0350]
[0351]
[0352][0353]
2，4-二氧四氢蝶啶合成酶
[0354]
在一些实施方案中，2，4-二氧四氢蝶啶合成酶结构域用作支架结构域。2，4-二氧四氢蝶啶合成酶是一种在多种生物体(包括古细菌、细菌、真菌、植物和真细菌)中负责核黄素生物合成的倒数第二个催化步骤的酶。2，4-二氧四氢蝶啶合成酶由同寡聚体构成，所述同寡聚体根据其来源的种类而大小和亚基数不同，包括五聚体、十聚体和二十面六十聚体(icosahedral sixty-mer)。2，4-二氧四氢蝶啶合成酶单体长度为150个氨基酸，并且包括具有侧翼串联α-螺旋的β-折叠。已报导2，4-二氧四氢蝶啶合成酶的不同四级结构，阐释其形态多样性：从同五聚体至形成直径的衣壳的十二(12)个五聚体的对称装配。在2，4-二氧四氢蝶啶合成酶表面的抗原呈递导致以有序阵列展示的抗原的高局部浓度。此类重复结构使得b细胞受体能够交联，并经由亲合效应导致强烈免疫反应。
[0355]
在一些实施方案中，本文提供的mrna编码例如经由甘氨酸-丝氨酸(例如，ggs)与2，4-二氧四氢蝶啶合成酶结构域连接的rbd。可使用其他接头。
[0356]
在其他实施方案中，本文提供的mrna编码例如经由甘氨酸-丝氨酸(例如，ggs)接头与2，4-二氧四氢蝶啶合成酶结构域连接的s蛋白的s1结构域。如本文中别处指示，可使用其他接头。
[0357]
与折叠子结构域连接的sars-cov-2抗原和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表14a和表14b中。
[0358]
表14a.与2，4-二氧四氢蝶啶合成酶结构域连接的抗原
[0359][0360]
表14b.与2，4-二氧四氢蝶啶合成酶结构域连接的抗原
[0361]
[0362]
[0363]
[0364]
[0365]
[0366]
[0367]
[0368]
[0369]
[0370]
[0371]
[0372][0373]
折叠子
[0374]
在一些实施方案中，折叠子结构域用作支架结构域。t4次要纤维蛋白(fibritin)的c末端结构域(折叠子)对于形成次要纤维蛋白三聚体结构是必需的，并且可用作人工三聚化结构域(参见例如meier s.等人，journal of molecular biology 2004年12月3日；344(4)：1051-1069；tao y等人，structure 1997年6月15日；5(6)：789-98)。当与s蛋白胞外结构域融合时，折叠子结构域促进s蛋白的正确三聚化，从而避免蛋白质的错误折叠。导致s蛋白融合前构象产生的这种过程导致表达、构象均质性增加，并引发强效中和抗体反应。
[0375]
不受限于理论，认为此构型将导致折叠子在蛋白质的细胞内区上在很大程度上免疫原性沉默。与折叠子结构域连接的sars-cov-2抗原和编码其的mrna的非限制性实例提供于下文表15a和表15b中。
[0376]
表15a.与折叠子结构域连接的抗原
[0377]
[0378][0379]
表15b.与折叠子结构域连接的抗原
[0380]
[0381]
[0382]
[0383]
[0384]
[0385]
[0386]
[0387]
[0388]
[0389]
[0390]
[0391]
[0392]
[0393]
[0394][0395]
包封蛋白
[0396]
在一些实施方案中，包封蛋白结构域用作支架结构域。包封蛋白是从嗜热生物海栖热袍菌(thermotoga maritima)分离的蛋白质笼形纳米颗粒。包封蛋白由相同31kda单体的60个拷贝组装而成，所述单体具有薄的二十面体t＝1对称的笼形结构，其内径和外径分别为20nm和24nm(sutter m.等人，nat struct mol biol.2008；15：939-947)。尽管包封蛋白在海栖热袍菌中的确切功能尚未清楚地为人们所了解，但最近其晶体结构已得以解决，并且其功能假定为包封例如dyp(染料脱色过氧化物酶)和flp(铁蛋白样蛋白)的蛋白质的细胞区室，所述蛋白质参与氧化应激反应30(rahmanpour r.等人，febs j.2013；280：2097-2104)。使用包封蛋白进行纳米颗粒构建使得蛋白质抗原能够在纳米颗粒表面上展示，并且能够将例如mrna的货物包封在纳米颗粒本身内。以前的基于包封蛋白纳米颗粒的疫苗已引发对表面展示抗原和货物蛋白本身的强烈免疫反应(lagoutte p.等人，vaccine.2018；36(25)：3622-3628)。
[0397]
在一些实施方案中，本文提供的mrna编码与包封蛋白结构域连接的s蛋白结构域(例如，s1、s2、rbd和/或ntd)。
[0398]
融合蛋白
[0399]
在一些实施方案中，本公开的组合物包括编码抗原性融合蛋白的mrna。因此，编码的一种或多种抗原可包括接合在一起的两种或更多种蛋白质(例如，蛋白质和/或蛋白质片段)。或者，与蛋白抗原融合的蛋白质不促进对其自身的强烈免疫反应，而是促进对冠状病毒抗原的强烈免疫反应。在一些实施方案中，抗原性融合蛋白保留来自每个原始蛋白质的功能性质。
[0400]
在一些实施方案中，融合蛋白包含来自sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域。
[0401]
在一些实施方案中，融合蛋白包含来自sars-cov-2刺突蛋白的n末端结构域。
[0402]
在一些实施方案中，融合蛋白包含跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域可来自不为sars-cov-2的病毒。例如，所述跨膜结构域可来自流感血凝素跨膜结构域，其
search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.”j.mol.biol.48：443-453)。最近，已开发出一种快速最佳全局序列比对算法(fogsaa)，据称其比其他最佳全局比对方法(包括needleman-wunsch算法)更快地产生核苷酸和蛋白质序列的全局比对。
[0408]
因此，编码相对于参照序列、特别是本文公开的多肽(例如抗原)序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包括在本公开的范围内。例如，序列标签或氨基酸(例如一个或多个赖氨酸)可添加至肽序列中(例如，在n末端或c末端)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽的溶解度或允许生物素化。或者，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区的氨基酸残基可任选地缺失，以提供截短的序列。根据序列的用途，例如作为可溶或连接至固体载体的更大序列的一部分的序列的表达，某些氨基酸(例如，c末端或n末端残基)可替代地缺失。在一些实施方案中，信号序列、终止序列、跨膜结构域、接头、多聚化结构域(例如，折叠子区)等(或编码其)的序列可用实现相同或相似功能的替代序列取代。在一些实施方案中，可例如通过引入更大的氨基酸填充蛋白质核心中的空腔以改善稳定性。在其他实施方案中，可用疏水性残基置换包埋的氢键网络以改进稳定性。在其他实施方案中，可去除糖基化位点并用适当残基置换。本领域技术人员可容易地鉴定此类序列。还应理解，本文提供的一些序列含有可在例如用于制备mrna疫苗之前缺失的序列标签或末端肽序列(例如，在n末端或c末端)。
[0409]
如由本领域技术人员认识到，也将蛋白质片段、功能蛋白质结构域和同源蛋白质视为在目标冠状病毒抗原的范围内。例如，本文提供了参照蛋白质的任何蛋白质片段(意指比参照抗原序列短至少一个氨基酸残基、但在其他方面相同的多肽序列)，条件是所述片段是免疫原性的并赋予针对冠状病毒的保护性免疫反应。除了与参照蛋白质相同但截短的变体之外，在一些实施方案中，如本文提供或参考的任何序列中所示，抗原包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变。抗原/抗原性多肽的长度范围可为约4、6或8个氨基酸至全长蛋白质。
[0410]
稳定化元件
[0411]
天然存在的真核mrna分子除了例如5
′‑
帽结构或3
′‑
多聚(a)尾的其他结构特征之外，还可含有稳定化元件，包括但不限于在其5
′
端(5
′
utr)和/或在其3
′
端(3
′
utr)的非翻译区(utr)。5
′
utr和3
′
utr二者都通常是从基因组dna转录并且是成熟前mrna的元件。通常在mrna加工期间向转录的(成熟前)mrna中添加成熟mrna的特征性结构特征(例如5
′‑
帽和3
′‑
多聚(a)尾)。
[0412]
在一些实施方案中，组合物包括具有编码至少一种具有至少一个修饰的抗原性多肽的开放阅读框、至少一个5
′
末端帽的mrna，并且配制在脂质纳米颗粒内。多核苷酸的5
′‑
加帽可根据制造商的方案在体外转录反应期间使用以下化学rna帽类似物同时完成，以产生5
′‑
鸟苷帽结构：3
′‑
o-me-m7g(5
′
)ppp(5
′
)g[arca帽]；g(5
′
)ppp(5
′
)a；g(5
′
)ppp(5
′
)g；m7g(5
′
)ppp(5
′
)a；m7g(5
′
)ppp(5
′
)g(new england biolabs，ipswich，ma)。经修饰的rna的5
′‑
加帽可在转录后使用牛痘病毒加帽酶完成，以产生“帽0”结构：m7g(5
′
)ppp(5
′
)g(new england biolabs，ipswich，ma)。帽1结构可使用牛痘病毒加帽酶和2
′‑
o甲基转移酶产生，以产生：m7g(5
′
)ppp(5
′
)g-2
′‑
o-甲基。帽2结构可从帽1结构、接着使用2
′‑
o甲基转移酶对5
′‑
倒数第三个核苷酸进行2
′‑
o-甲基化来产生。帽3结构可从帽2结构、接着使用2
′‑
o甲基转移酶对5
′‑
倒数第四个核苷酸进行2
′‑
o-甲基化来产生。酶可源自重组来源。
[0413]3′‑
多聚(a)尾通常是添加至转录的mrna的3
′
端的一段腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，其可包含高达约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3
′‑
多聚(a)尾的长度对于个别mrna的稳定性可为必需的要素。
[0414]
在一些实施方案中，组合物包括稳定化元件。稳定化元件可包括例如组蛋白茎环。已鉴定茎环结合蛋白(slbp)，一种32kda的蛋白质。其与细胞核和细胞质二者中组蛋白信使3
′
端的组蛋白茎环结合。其表达水平受细胞周期的调控；其在s期达到峰值，此时组蛋白mrna水平也升高。已显示所述蛋白质对于u7 snrnp对组蛋白前mrna的有效3
′
端加工是至关重要的。slbp在加工后继续与茎环结合，然后刺激成熟组蛋白mrna在细胞质中翻译成组蛋白。slbp的rna结合结构域在后生动物和原生动物中是保守的；其与组蛋白茎环的结合取决于环的结构。最小结合位点包括相对于茎环的5
′
的至少三个核苷酸和3
′
的两个核苷酸。
[0415]
在一些实施方案中，mrna包括编码区、至少一个组蛋白茎环和任选地多聚(a)序列或多聚腺苷酸化信号。所述多聚(a)序列或多聚腺苷酸化信号通常应增强编码的蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，所述编码的蛋白质不为组蛋白、报告基因蛋白(例如荧光素酶、gfp、egfp、β-半乳糖苷酶、egfp)或标志物或选择蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt))。
[0416]
在一些实施方案中，mrna包括多聚(a)序列或多聚腺苷酸化信号与至少一个组蛋白茎环的组合，即使两者在性质上代表替代机制，但协同地作用以增加蛋白质表达超过用任一个别元件观察到的水平。多聚(a)和至少一种组蛋白茎环的组合的协同效应不依赖于元件的顺序或多聚(a)序列的长度。
[0417]
在一些实施方案中，mrna不包括组蛋白下游元件(hde)。“组蛋白下游元件”(hde)包括在天然存在的茎环的3
′
的大约15至20个核苷酸的富含嘌呤的多核苷酸段，其代表u7 snrna的结合位点，所述u7 snrna参与组蛋白前mrna加工成成熟组蛋白mrna。在一些实施方案中，核酸不包括内含子。
[0418]
mrna可含有或可不含有增强子和/或启动子序列，其可经修饰或未经修饰，或者其可经活化或未经活化。在一些实施方案中，组蛋白茎环通常源自组蛋白基因，并且包括由间隔体分开的两个相邻的部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对，所述间隔体由形成结构的环的短序列组成。未配对的环区通常不能与茎环元件中的任一者碱基配对。其由于是许多rna二级结构的关键组分而更经常地出现于rna中，但也可存在于单链dna中。茎环结构的稳定性通常取决于长度、错配或膨出部的数目和配对区的碱基组成。在一些实施方案中，可产生摆动碱基配对(非沃森-克里克碱基配对(non-watson-crick base pairing))。在一些实施方案中，至少一种组蛋白茎环序列包含15至45个核苷酸的长度。
[0419]
在一些实施方案中，mrna已去除一个或多个富含au的序列。这些序列有时称为aures，其是在3
′
utr中发现的去稳定化序列。aures可从rna疫苗去除。或者，aures可保留在rna疫苗中。
[0420]
信号肽
[0421]
在一些实施方案中，组合物包含具有orf的mrna，所述orf编码与冠状病毒抗原融合的信号肽。包含蛋白质n末端15-60个氨基酸的信号肽通常是分泌途径上跨膜易位所需要的，并且因此，普遍控制真核生物和原核生物中大部分蛋白质进入分泌途径。在真核生物中，新生前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体引导至粗内质网(er)膜，并且起始生长的肽
链穿过其转运以进行加工。er加工产生成熟蛋白质，其中信号肽通常通过宿主细胞的er驻留信号肽酶从前体蛋白切割，或者其保持未切割并作为膜锚起作用。信号肽也可促进蛋白质靶向细胞膜。
[0422]
信号肽的长度可为15-60个氨基酸。例如，信号肽的长度可为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸。在一些实施方案中，信号肽的长度为20-60、25-60、30-60、35-60、40-60、45-60、50-60、55-60、15-55、20-55、25-55、30-55、35-55、40-55、45-55、50-55、15-50、20-50、25-50、30-50、35-50、40-50、45-50、15-45、20-45、25-45、30-45、35-45、40-45、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40、15-35、20-35、25-35、30-35、15-30、20-30、25-30、15-25、20-25或15-20个氨基酸。
[0423]
来自异源基因的信号肽(其调控自然界中除冠状病毒抗原外的基因的表达)是本领域中已知的，并且可测试其期望性质，然后并入本公开的核酸中。
[0424]
序列优化
[0425]
在一些实施方案中，对编码本公开的抗原的orf进行密码子优化。密码子优化方法是本领域中已知的。例如，本文提供的任何一个或多个序列的orf可为密码子优化的。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；偏向gc含量以增加mrna稳定性或减少二级结构；最小化可损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基操作；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；在编码的蛋白质中去除/添加翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白结构域；插入或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mrna降解位点；调整翻译率以允许蛋白质的各种结构域正确折叠；或者减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域中已知的-非限制性实例包括来自geneart(life technologies)、dna2.0(menlo park ca)和/或专有方法的服务。在一些实施方案中，使用优化算法优化开放阅读框(orf)序列。
[0426]
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列orf(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共享小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共享小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共享小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共享小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共享小于75％的序列同一性。
[0427]
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共享介于65％与85％之间(例如，介于约67％与约85％之间或介于约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共享介于65％与75％或约80％之间的序列同一性。
[0428]
在一些实施方案中，密码子优化的序列编码的抗原与由非密码子优化的序列编码
的冠状病毒抗原的免疫原性一样，或比其免疫原性更高(例如，高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)。
[0429]
经修饰的mrna在转染至哺乳动物宿主细胞中时具有12-18小时之间或大于18小时、例如24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或大于72小时的稳定性，并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。
[0430]
在一些实施方案中，密码子优化的rna可为其中g/c的水平增加的rna。核酸分子(例如mrna)的g/c含量可影响rna的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(g)和/或胞嘧啶(c)残基的rna可在功能上比含有大量腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)核苷酸的mrna更稳定。举例来说，wo02/098443公开了一种药物组合物，其含有通过翻译区中的序列修饰而稳定化的mrna。由于遗传密码的简并性，修饰通过用促进更大rna稳定性而不改变所得氨基酸的那些密码子取代现有密码子来起作用。所述方法限于rna的编码区。
[0431]
化学上未经修饰的核苷酸
[0432]
在一些实施方案中，mrna未经化学修饰，并且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，例如存在于转录的rna中的那些核苷残基(例如a、g、c或u)。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准脱氧核糖核苷，例如存在于dna中的那些脱氧核糖核苷(例如da、dg、dc或dt)。
[0433]
化学修饰
[0434]
在一些实施方案中，本公开的组合物包含具有编码冠状病毒抗原的开放阅读框的mrna，其中核酸包含可为标准的(未经修饰的)或如本领域中已知修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含经修饰的核苷酸或核苷。此类经修饰的核苷酸和核苷可为天然存在的经修饰的核苷酸和核苷或非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷。此类修饰可包括如本领域中公认的在核苷酸和/或核苷的糖、主链或核碱基部分的那些修饰。
[0435]
在一些实施方案中，本公开的天然存在的经修饰的核苷酸或核苷是本领域中通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类天然存在的经修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于广泛公认的modomics数据库中。
[0436]
在一些实施方案中，本公开的非天然存在的经修饰的核苷酸或核苷是本领域中通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于公开的美国申请号pct/us2012/058519；pct/us2013/075177；pct/us2014/058897；pct/us2014/058891；pct/us2014/070413；pct/us2015/36773；pct/us2015/36759；pct/us2015/36771；或pct/ib2017/051367，所述申请都通过引用并入本文。
[0437]
因此，本公开的核酸(例如，dna核酸和rna核酸，例如mrna核酸)可包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或其任何组合。
[0438]
在一些实施方案中，本公开的核酸(例如，dna核酸和rna核酸，例如mrna核酸)包含多种(一种以上)不同类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。在一些实施方案中，核酸的特定区含有一种、两种或更多种(任选地不同)类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。
[0439]
在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入细胞或生物体的经修饰的rna核酸(例如，经修饰的mrna核酸)分别在细胞或生物体中展现降低
的降解。
[0440]
在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入细胞或生物体中的经修饰的rna核酸(例如，经修饰的mrna核酸)可分别在细胞或生物体中展现降低的免疫原性(例如，降低的先天反应)。
[0441]
在一些实施方案中，核酸(例如rna核酸，例如mrna核酸)包含非天然修饰的核苷酸，其在核酸的合成期间或合成后引入以实现期望功能或性质。修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可用化学合成或用聚合酶在链的末端或链中的任何其他地方引入。核酸的任何区可经化学修饰。
[0442]
本公开提供了核酸(例如rna核酸，例如mrna核酸)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)组合的化合物。“核苷酸”是指包括磷酸基团的核苷。经修饰的核苷酸可通过任何有用的方法，例如化学、酶促或重组方法合成，以包括一个或多个经修饰的或非天然的核苷。核酸可包含连接的核苷的一个或多个区。此类区可具有可变的主链键联。键联可为标准磷酸二酯键联，在这种情形下，核酸将包含核苷酸的区。
[0443]
经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且还包括在核苷酸和/或包含非标准或经修饰的碱基的经修饰的核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许在非标准碱基与标准碱基之间或在两个互补非标准碱基结构之间、例如在具有至少一个化学修饰的那些核酸中的氢键。此类非标准碱基配对的一个实例是经修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可并入本公开的核酸中。
[0444]
在一些实施方案中，核酸(例如rna核酸，例如mrna核酸)中经修饰的核碱基包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-甲基-胞苷(m5c)和/或假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，核酸(例如rna核酸，例如mrna核酸)中的经修饰的核碱基包含5-甲氧基甲基尿苷、5-甲硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括至少两种(例如，2、3、4种或更多种)任何上文所提及的经修饰的核碱基的组合，包括但不限于化学修饰。
[0445]
在一些实施方案中，本公开的mrna包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代。
[0446]
在一些实施方案中，本公开的mrna包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置的5-甲基胞苷取代。
[0447]
在一些实施方案中，本公开的mrna包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的假尿苷(ψ)取代。
[0448]
在一些实施方案中，本公开的mrna包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的假尿苷(ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置的5-甲基胞苷取代。
[0449]
在一些实施方案中，本公开的mrna包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的尿苷。
[0450]
在一些实施方案中，对于特定修饰，对mrna进行均匀修饰(例如，完全修饰、贯穿整个序列中修饰)。例如，核酸可用1-甲基-假尿苷均匀修饰，这意味着mrna序列中的所有尿苷残基都用1-甲基-假尿苷置换。类似地，通过用经修饰的残基(例如上文所阐释的那些残基)
置换，可针对序列中存在的任何类型的核苷残基对核酸进行均匀修饰。
[0451]
本公开的核酸可沿着分子的整个长度经部分或完全修饰。例如，在本公开的核酸中，或在其预定序列区中(例如，在包括或不包括多聚(a)尾的mrna中)，可均匀地修饰一种或多种或所有或给定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或任何一种或多种或所有a、g、u、c)。在一些实施方案中，本公开的核酸中(或其序列区中)的所有核苷酸x都是经修饰的核苷酸，其中x可为核苷酸a、g、u、c中的任一者，或组合a+g、a+u、a+c、g+u、g+c、u+c、a+g+u、a+g+c、g+u+c或a+g+c中的任一者。
[0452]
所述核酸可含有约1％至约100％的经修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即a、g、u或c中的任何一者或多者)或任何居间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。应理解，未经修饰的a、g、u或c的存在占任何其余百分数。
[0453]
mrna可含有最少1％并且最多100％的经修饰的核苷酸或任何居间百分数，例如至少5％的经修饰的核苷酸、至少10％的经修饰的核苷酸、至少25％的经修饰的核苷酸、至少50％的经修饰的核苷酸、至少80％的经修饰的核苷酸或至少90％的经修饰的核苷酸。例如，所述核酸可含有经修饰的嘧啶，例如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，所述核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶由经修饰的尿嘧啶(例如5-取代的尿嘧啶)置换。经修饰的尿嘧啶可由具有单一独特结构的化合物置换，或者可由具有不同结构(例如，2、3、4种或更多种独特结构)的多种化合物置换。在一些实施方案中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶由经修饰的胞嘧啶(例如5-取代的胞嘧啶)置换。经修饰的胞嘧啶可由具有单一独特结构的化合物置换，或者可由具有不同结构(例如，2、3、4种或更多种独特结构)的多种化合物置换。
[0454]
非翻译区(utr)
[0455]
本公开的mrna可包含一个或多个充当或用作非翻译区的区或部分。当mrna被设计为编码至少一种目标抗原时，核酸可包含这些非翻译区(utr)中的一者或多者。核酸的野生型非翻译区经转录，而非经翻译。在mrna中，5
′
utr在转录起始位点开始，并继续至起始密码子，但不包括起始密码子；而3
′
utr在终止密码子之后立即开始，并继续至转录终止信号。越来越多的证据表明utr在核酸分子的稳定性和翻译方面所起的调控作用。utr的调控特征可并入本公开的多核苷酸中，以尤其增强分子的稳定性。还可并入特定特征以确保在转录物被错误导向不期望器官部位的情形下转录物的受控下调。多种5
′
utr和3
′
utr序列是本领域中已知和可获得的。
[0456]5′
utr是mrna的在起始密码子(核糖体翻译的mrna转录物的第一个密码子)正上游(5
′
)的区。5
′
utr不编码蛋白质(是非编码的)。天然5
′
utr具有在翻译起始中起作用的特征。它们带有印记如kozak序列，通常已知所述kozak序列参与核糖体起始许多基因翻译的过
程。kozak序列具有共有ccr(a/g)ccaugg(seq id no：128)，其中r是起始密码子(aug)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，起始密码子(aug)后接另一个
‘
g’。还已知5
′
utr形成参与延伸因子结合的二级结构。
[0457]
在本公开的一些实施方案中，5
′
utr是异源utr，即，是在自然界中发现的与不同orf相关的utr。在另一个实施方案中，5
′
utr是合成utr，即，在自然界中不出现。合成的utr包括已经突变以改善其性质的utr，例如，增加基因表达的utr，以及完全合成的utr。示例性5
′
utr包括非洲爪蟾属(xenopus)或人类源a-球蛋白或b-球蛋白(8278063；9012219)、人类细胞色素b-245a多肽和羟基类固醇(17b)脱氢酶和烟草蚀纹病毒(us8278063、9012219)。还可使用cmv立即早期1(ie1)基因(us20140206753、wo2013/185069)、序列gggauccuacc(seq id no：129)(wo2014144196)。在另一个实施方案中，top基因的5
′
utr是缺乏5
′
top基序(寡嘧啶束)的top基因的5
′
utr(例如，wo/2015101414、wo2015101415、wo/2015/062738、wo2015024667、wo2015024667)；可使用源自核糖体蛋白大32(l32)基因的5
′
utr元件(wo/2015101414、wo2015101415、wo/2015/062738)、源自羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(hsd17b4)的5
′
utr的5
′
utr元件(wo2015024667)或源自atp5a1的5
′
utr的5
′
utr元件(wo2015024667)。在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(ires)代替5
′
utr。
[0458]
在一些实施方案中，本公开的5
′
utr包含选自seq id no：131和seq id no：2的序列。
[0459]3′
utr是mrna的在终止密码子(mrna转录物的发出翻译终止信号的密码子)正下游(3
′
)的区。3
′
utr不编码蛋白质(是非编码的)。已知天然或野生型3
′
utr具有嵌入其中的腺苷和尿苷的段。这些富au的印记在具有高周转率的基因中特别普遍。富au的元件(are)基于其序列特征和功能特性可分成三类(chen等人，1995)：i类are在富u区内含有auuua基序的若干分散的拷贝。c-myc和myod含有i类are。ii类are具有两个或更多个重叠uuauuua(u/a)(u/a)(seq id no：130)九聚体。含有这种类型的are的分子包括gm-csf和tnf-a。iii类are定义不太明确。这些富u区不含auuua基序。c-jun和肌细胞生成素是这种类别的两个充分研究的实例。已知大多数结合至are的蛋白质使信使不稳定，而据记载elav家族的成员(最著名的是hur)增加mrna的稳定性。hur结合至所有三个类别的are。将hur特异性结合位点工程化至核酸分子的3
′
utr中将导致hur结合，并因此导致体内信使的稳定化。
[0460]3′
utr富au元件(are)的引入、去除或修饰可用于调节本公开的核酸(例如rna)的稳定性。当工程化特定核酸时，可引入are的一个或多个拷贝以使本公开的核酸更不稳定，从而缩减翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，可鉴定和去除或突变are以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产生。可在相关细胞系中使用本公开的核酸执行转染实验，并且可在转染后的不同时间点测定蛋白质产生。例如，可用不同are工程化分子，并且通过对相关蛋白质使用elisa试剂盒并测定在转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质，来转染细胞。
[0461]3′
utr可为异源的或合成的。关于3
′
utr，球蛋白utr(包括非洲爪蟾属β-球蛋白utr和人类β-球蛋白utr)是本领域中已知的(8278063、9012219、us20110086907)。通过首尾相连地克隆两个连续的人类β-球蛋白3
′
utr，已开发在一些细胞类型中具有增强的稳定性的经修饰的β-球蛋白构建体，并且其是本领域中众所周知的(us2012/0195936、wo2014/071963)。另外，a2-球蛋白、a1-球蛋白、utr和其突变体也是本领域中已知的
(wo2015101415、wo2015024667)。在非专利文献中mrna构建体中阐述的其他3
′
utr包括cyba(ferizi等人，2015)和白蛋白(thess等人，2015)。其他示例性3
′
utr包括牛或人类生长激素(野生型或经修饰的)(wo2013/185069、us20140206753、wo2014152774)、兔β球蛋白和乙型肝炎病毒(hbv)的3
′
utr，α-球蛋白3
′
utr和病毒veev 3
′
utr序列也是本领域中已知的。在一些实施方案中，使用序列uuugaauu(wo2014144196)。在一些实施方案中，使用人类和小鼠核糖体蛋白的3
′
utr。其他实例包括rps93
′
utr(wo2015101414)、fig4(wo2015101415)和人类白蛋白7(wo2015101415)。
[0462]
在一些实施方案中，本公开的3
′
utr包含选自seq id no：132和seq id no：4的序列。
[0463]
本领域的普通技术人员将理解，异源或合成的5
′
utr可与任何期望的3
′
utr序列一起使用。例如，异源5
′
utr可与合成3
′
utr或异源3
′
utr一起使用。
[0464]
非utr序列也可用作核酸内的区或亚区。例如，内含子或内含子序列的部分可并入本公开的核酸的区中。内含子序列的并入可增加蛋白质产生以及核酸水平。
[0465]
特征的组合可包括在侧翼区中并且可包含在其他特征内。例如，orf的侧翼可为5
′
utr，其可含有强kozak翻译起始信号；和/或3
′
utr，其可包括用于以模板添加多聚a尾的寡(dt)序列。5
′
utr可包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，例如美国专利申请公开号20100293625和pct/us2014/069155中所述的5
′
utr，所述公开通过引用整体并入本文。
[0466]
应理解，来自任何基因的任何utr可并入核酸的区中。此外，可利用任何已知基因的多个野生型utr。提供不为野生型区的变体的人工utr也在本公开的范围内。这些utr或其部分可以与其所选自的转录物中相同的方向放置，或者可在方向或位置上改变。因此，5
′
或3
′
utr可倒置、缩短、延长，与一个或多个其他5
′
utr或3
′
utr一起制备。如本文所用的术语“改变的”当关于utr序列时，意指相对于参考序列，utr已经以某种方式改变。例如，3
′
utr或5
′
utr可通过如上文教导的方向或位置的改变而相对于野生型或天然utr改变，或者可通过包括额外核苷酸、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座而改变。产生“改变的”utr(无论3
′
或5
′
)的这些改变中的任一者包含变体utr。
[0467]
在一些实施方案中，可使用双重、三重或四重utr，例如5
′
utr或3
′
utr。如本文所用的“双重”utr是其中串联或基本上串联编码相同utr的两个拷贝的utr。例如，可使用双重β-球蛋白3
′
utr，如美国专利公开20100129877中所述，所述专利公开的内容通过引用整体并入本文。
[0468]
具有模式化utr也在本公开的范围内。如本文所用的“模式化utr”是反映重复或交替模式的那些utr，例如重复一次、两次或超过3次的ababab或aabbaabbaabb或abcabcabc或其变体。在这些模式中，每个字母a、b或c代表核苷酸水平的不同utr。
[0469]
在一些实施方案中，侧翼区选自其蛋白质共享共同功能、结构、特征或性质的转录物家族。例如，目标多肽可属于在特定细胞、组织中或在发育期间的某个时间表达的蛋白质家族。来自这些基因中的任一者的utr可交换为相同或不同蛋白质家族的任何其他utr，以产生新的多核苷酸。如本文所用的“蛋白质家族”以最广泛的意义使用，指共享至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式的一组两种或更多种目标多肽。
[0470]
非翻译区还可包括翻译增强子元件(tee)。作为一个非限制性实例，tee可包括美
国申请号20090226470中阐述的那些tee和本领域中已知的那些tee，所述申请通过引用整体并入本文。
[0471]
rna的体外转录
[0472]
编码本文所述的多核苷酸的cdna可使用体外转录(ivt)系统转录。rna的体外转录是本领域中已知的，并且阐述于国际公开wo 2014/152027中，所述公开通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本公开的rna是根据wo 2018/053209和wo 2019/036682中阐述的任何一种或多种方法制备，所述文献各自通过引用并入本文。
[0473]
在一些实施方案中，所述rna转录物是使用非扩增的线性化dna模板在体外转录反应中产生，以产生rna转录物。在一些实施方案中，所述模板dna是分离的dna。在一些实施方案中，所述模板dna是cdna。在一些实施方案中，所述cdna通过mrna(例如但不限于冠状病毒mrna)的逆转录形成。在一些实施方案中，用质粒dna模板转染细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌，例如dh-1细胞。在一些实施方案中，培养转染的细胞以复制质粒dna，然后分离和纯化所述质粒dna。在一些实施方案中，所述dna模板包括rna聚合酶启动子，例如位于目标基因5
′
并与其可操作连接的t7启动子。
[0474]
在一些实施方案中，体外转录模板编码5
′
非翻译(utr)区，含有开放阅读框，并编码3
′
utr和多聚(a)尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于模板编码的mrna。
[0475]“5
′
非翻译区”(utr)是指不编码多肽的mrna的位于起始密码子(即，核糖体翻译的mrna转录物的第一个密码子)正上游(即，5
′
)的区。当产生rna转录物时，5
′
utr可包含启动子序列。此类启动子序列是本领域中已知的。应理解，此类启动子序列将不存在于本公开的疫苗中。
[0476]“3
′
非翻译区”(utr)是指不编码多肽的mrna的位于终止密码子(即，发出翻译终止信号的mrna转录物的密码子)正下游(即，3
′
)的区。
[0477]“开放阅读框”是以起始密码子(例如，甲硫氨酸(atg))开始并以终止密码子(例如，taa、tag或tga)结束的dna的连续段，并且编码多肽。
[0478]“多聚(a)尾”是mrna的位于含有多个连续单磷酸腺苷的3
′
utr的下游、例如正下游(即，3
′
)的区。多聚(a)尾可含有10至300个单磷酸腺苷。例如，多聚(a)尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，多聚(a)尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关生物学环境中(例如，在细胞中，在体内)，多聚(a)尾用于保护mrna免于例如在细胞质中的酶促降解，并帮助转录终止，和/或mrna从细胞核输出和翻译。
[0479]
在一些实施方案中，核酸包括200至3,000个核苷酸。例如，核酸可包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000个核苷酸。
[0480]
体外转录系统通常包含转录缓冲液、核苷酸三磷酸(ntp)、rna酶抑制剂和聚合酶。
[0481]
所述ntp可在内部制造，可选自供应商，或者可如本文所述合成。所述ntp可选自但不限于本文所述的那些ntp，包括天然和非天然(经修饰的)ntp。
[0482]
任何数量的rna聚合酶或变体可用于本公开的方法中。所述聚合酶可选自但不限于噬菌体rna聚合酶，例如t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶和/或突变型聚合
酶，例如但不限于能够并入经修饰的核酸和/或经修饰的核苷酸(包括化学修饰的核酸和/或核苷酸)的聚合酶。一些实施方案排除使用dna酶。
[0483]
在一些实施方案中，rna转录物通过酶促加帽来加帽。在一些实施方案中，rna包含5
′
末端帽，例如7mg(5
′
)ppp(5
′
)nlmpnp。
[0484]
化学合成
[0485]
固相化学合成。本公开的核酸可使用固相技术全部或部分地制造。核酸的固相化学合成是一种自动化方法，其中分子固定于固体载体上，并且在反应物溶液中逐步合成。固相合成可用于在核酸序列中位点特异性引入化学修饰。
[0486]
液相化学合成。通过顺序添加单体结构单元来合成本公开的核酸可在液相中实施。
[0487]
合成方法的组合。上文论述的合成方法各自具有其自身的优点和限制。已尝试组合这些方法以克服所述限制。此类方法的组合在本公开的范围内。固相或液相化学合成与酶促连接的组合使用提供了产生不能通过单独化学合成获得的长链核酸的有效方式。
[0488]
核酸区或亚区的连接
[0489]
还可使用通过连接酶装配核酸。dna或rna连接酶经由磷酸二酯键的形成促进多核苷酸链的5
′
端和3
′
端的分子间连接。核酸(例如嵌合多核苷酸和/或环状核酸)可通过一个或多个区或亚区的连接来制备。dna片段可通过连接酶催化的反应连接，以产生具有不同功能的重组dna。两个寡脱氧核苷酸(一个具有5
′
磷酰基，并且另一个具有游离的3
′
羟基)用作dna连接酶的底物。
[0490]
纯化
[0491]
本文所述的核酸的纯化可包括但不限于核酸净化、质量保证和质量控制。净化可通过本领域中已知的方法实施，所述方法例如但不限于珠粒(beckman coulter genomics，danvers，ma)、聚-t珠粒、lnatm寡-t捕获探针(公司，vedbaek，denmark)或基于hplc的纯化方法，例如但不限于强阴离子交换hplc、弱阴离子交换hplc、反相hplc(rp-hplc)和疏水相互作用hplc(hic-hplc)。术语“纯化的”当关于核酸使用时，例如“纯化的核酸”，是指与至少一种污染物分离的核酸。“污染物”是使另一种物质不适合、不纯或劣质的任何物质。因此，纯化的核酸(例如，dna和rna)以不同于其在自然界中发现的形式或环境存在，或以不同于其在进行处理或纯化方法之前存在的形式或环境存在。
[0492]
质量保证和/或质量控制检查可使用例如但不限于凝胶电泳、uv吸光度或分析型hplc的方法执行。
[0493]
在一些实施方案中，核酸可通过包括但不限于逆转录酶-pcr的方法测序。
[0494]
定量
[0495]
在一些实施方案中，本公开的核酸可在外泌体中或当衍生自一种或多种体液时定量。体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液(csf)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper
′
s fluid)或预射精液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊肿液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔液和脐带血。或者，外泌体可从选自由以下组成的组的器官中取得：肺、心
50mol％、30-40mol％、40-60mol％、40-50mol％或50-60mol％可电离的阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含20mol％、30mol％、40mol％、50mol％或60mol％可电离的阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、39mol％、40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％、50mol％、51mol％、52mol％、53mol％、54mol％或55mol％可电离的阳离子脂质。
[0507]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含5-25mol％非阳离子脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含5-20mol％、5-15mol％、5-10mol％、10-25mol％、10-20mol％、10-25mol％、15-25mol％、15-20mol％或20-25mol％非阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含5mol％、10mol％、15mol％、20mol％或25mol％非阳离子脂质。
[0508]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含25-55mol％固醇。例如，所述脂质纳米颗粒可包含25-50mol％、25-45mol％、25-40mol％、25-35mol％、25-30mol％、30-55mol％、30-50mol％、30-45mol％、30-40mol％、30-35mol％、35-55mol％、35-50mol％、35-45mol％、35-40mol％、40-55mol％、40-50mol％、40-45mol％、45-55mol％、45-50mol％或50-55mol％固醇。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％或55mol％固醇。
[0509]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含0.5-15mol％peg修饰的脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含0.5-10mol％、0.5-5mol％、1-15mol％、1-10mol％、1-5mol％、2-15mol％、2-10mol％、2-5mol％、5-15mol％、5-10mol％或10-15mol％。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含0.5mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％peg修饰的脂质。
[0510]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离的阳离子脂质、5-25mol％非阳离子脂质、25-55mol％固醇和0.5-15mol％peg修饰的脂质。
[0511]
在一些实施方案中，本公开的可电离的阳离子脂质包含式(i)化合物：
[0512][0513]
或其盐或异构体，其中：
[0514]
r1选自由c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r
″m′r′
组成的组；
[0515]
r2和r3独立地选自由h、c
1-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r*or
″
组成的组，或者r2和r3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
[0516]
r4选自由c
3-6
碳环、-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr、-cq(r)2和未被取代的c
1-6
烷基组成的组，其中q选自碳环、杂环、-or、-o(ch2)nn(r)2、-c(o)or、-oc(o)r、-cx3、-cx2h、-cxh2、-cn-、n(r)2、-c(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)c(o)n(r)2、-n(r)c(s)n(r)2、-n(r)r8、-o(ch2)nor、-n(r)c(＝nr9)n(r)2、-n(r)c(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、-n(or)c(o)r、-n(or)s(o)2r、-n(or)c(o)or、-n(or)c(o)n(r)2、-n(or)c(s)n(r)2、-n(or)c(＝
nr9)n(r)2、-n(or)c(＝chr9)n(r)2、-c(＝nr9)n(r)2、-c(＝nr9)r、-c(o)n(r)or和-c(r)n(r)2c(o)or，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
[0517]
每个r5独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0518]
每个r6独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0519]
m和m
′
独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r
′
)-、-n(r
′
)c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or
′
)o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0520]
r7选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0521]
r8选自由c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0522]
r9选自由h、cn、no2、c
1-6
烷基、-or、-s(o)2r、-s(o)2n(r)2、c
2-6
烯基、c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0523]
每个r独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0524]
每个r
′
独立地选自由c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和h组成的组；
[0525]
每个r
″
独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0526]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
2-12
烯基组成的组；
[0527]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0528]
每个x独立地选自由f、cl、br和i组成的组；并且
[0529]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
[0530]
在一些实施方案中，式(i)化合物的子集包括以下的那些化合物：其中当r4是-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr或-cq(r)2时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，q不为-n(r)2，或(ii)当n为1或2时，q不为5元、6元或7元杂环烷基。
[0531]
在-些实施方案中，式(i)化合物的另一个子集包括以下的那些化合物：其中
[0532]
r1选自由c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r
″m′r′
组成的组；
[0533]
r2和r3独立地选自由h、c
1-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r*or
″
组成的组，或者r2和r3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
[0534]
r4选自由c
3-6
碳环、-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr、-cq(r)2和未被取代的c
1-6
烷基组成的组，其中q选自c
3-6
碳环、具有一个或多个选自n、o和s的杂原子的5至14元杂芳基、-or、-o(ch2)nn(r)2、-c(o)or、-oc(o)r、-cx3、-cx2h、-cxh2、-cn、-c(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)c(o)n(r)2、-n(r)c(s)n(r)2、-crn(r)2c(o)or、-n(r)r8、-o(ch2)nor、-n(r)c(＝nr9)n(r)2、-n(r)c(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、-n(or)c(o)r、-n(or)s(o)2r、-n(or)c(o)or、-n(or)c(o)n(r)2、-n(or)c(s)n(r)2、-n(or)c(＝nr9)n(r)2、-n(or)c(＝chr9)n(r)2、-c(＝nr9)n(r)2、-c(＝nr9)r、-c(o)n(r)or和具有一个或多个选自n、o和s的杂原子的5至14元杂环烷基，其被一个或多个选自以下的取代基取代：氧代基(＝o)、oh、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基和c
1-3
烷基，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
[0535]
每个r5独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0536]
每个r6独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0537]
m和m
′
独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r
′
)-、-n(r
′
)c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or
′
)o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0538]
r7选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0539]
r8选自由c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0540]
r9选自由h、cn、no2、c
1-6
烷基、-or、-s(o)2r、-s(o)2n(r)2、c
2-6
烯基、c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0541]
每个r独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0542]
每个r
′
独立地选自由c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和h组成的组；
[0543]
每个r
″
独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0544]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
2-12
烯基组成的组；
[0545]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0546]
每个x独立地选自由f、cl、br和i组成的组；并且
[0547]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
[0548]
或其盐或异构体。
[0549]
在一些实施方案中，式(i)化合物的另一个子集包括以下的那些化合物：其中
[0550]
r1选自由c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r
″m′r′
组成的组；
[0551]
r2和r3独立地选自由h、c
1-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r*or
″
组成的组，或者r2和r3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
[0552]
r4选自由c
3-6
碳环、-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr、-cq(r)2和未被取代的c
1-6
烷基组成的组，其中q选自c
3-6
碳环、具有一个或多个选自n、o和s的杂原子的5至14元杂环、-or、-o(ch2)nn(r)2、-c(o)or、-oc(o)r、-cx3、-cx2h、-cxh2、-cn、-c(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)c(o)n(r)2、-n(r)c(s)n(r)2、-crn(r)2c(o)or、-n(r)r8、-o(ch2)nor、-n(r)c(＝nr9)n(r)2、-n(r)c(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、-n(or)c(o)r、-n(or)s(o)2r、-n(or)c(o)or、-n(or)c(o)n(r)2、-n(or)c(s)n(r)2、-n(or)c(＝nr9)n(r)2、-n(or)c(＝chr9)n(r)2、-c(＝nr9)r、-c(o)n(r)or和-c(＝nr9)n(r)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当q是5至14元杂环并且(i)r4是-(ch2)nq，其中n为1或2，或(ii)r4是-(ch2)nchqr，其中n为1，或(iii)r4是-chqr和-cq(r)2时，则q是5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基；
[0553]
每个r5独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0554]
每个r6独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0555]
m和m
′
独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r
′
)-、-n(r
′
)c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or
′
)o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0556]
r7选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0557]
r8选自由c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0558]
r9选自由h、cn、no2、c
1-6
烷基、-or、-s(o)2r、-s(o)2n(r)2、c
2-6
烯基、c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0559]
每个r独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0560]
每个r
′
独立地选自由c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和h组成的组；
[0561]
每个r
″
独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0562]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
2-12
烯基组成的组；
[0563]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0564]
每个x独立地选自由f、cl、br和i组成的组；并且
[0565]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
[0566]
或其盐或异构体。
[0567]
在一些实施方案中，式(i)化合物的另一个子集包括以下的那些化合物：其中
[0568]
r1选自由c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r
″m′r′
组成的组；
[0569]
r2和r3独立地选自由h、c
1-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r*or
″
组成的组，或者r2和r3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
[0570]
r4选自由c
3-6
碳环、-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr、-cq(r)2和未被取代的c
1-6
烷基组成的组，其中q选自c
3-6
碳环、具有一个或多个选自n、o和s的杂原子的5至14元杂芳基、-or、-o(ch2)nn(r)2、-c(o)or、-oc(o)r、-cx3、-cx2h、-cxh2、-cn、-c(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)c(o)n(r)2、-n(r)c(s)n(r)2、-crn(r)2c(o)or、-n(r)r8、-o(ch2)nor、-n(r)c(＝nr9)n(r)2、-n(r)c(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、-n(or)c(o)r、-n(or)s(o)2r、-n(or)c(o)or、-n(or)c(o)n(r)2、-n(or)c(s)n(r)2、-n(or)c(＝nr9)n(r)2、-n(or)c(＝chr9)n(r)2、-c(＝nr9)r、-c(o)n(r)or和-c(＝nr9)n(r)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
[0571]
每个r5独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0572]
每个r6独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0573]
m和m
′
独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r
′
)-、-n(r
′
)c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or
′
)o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0574]
r7选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0575]
r8选自由c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0576]
r9选自由h、cn、no2、c
1-6
烷基、-or、-s(o)2r、-s(o)2n(r)2、c
2-6
烯基、c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0577]
每个r独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0578]
每个r
′
独立地选自由c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和h组成的组；
[0579]
每个r
″
独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0580]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
2-12
烯基组成的组；
[0581]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0582]
每个x独立地选自由f、cl、br和i组成的组；并且
[0583]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
[0584]
或其盐或异构体。
[0585]
在一些实施方案中，式(i)化合物的另一个子集包括以下的那些化合物：其中
[0586]
r1选自由c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r
″m′r′
组成的组；
[0587]
r2和r3独立地选自由h、c
2-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r*or
″
组成的组，或者r2和r3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
[0588]
r4是-(ch2)nq或-(ch2)nchqr，其中q是-n(r)2，并且n选自3、4和5；
[0589]
每个r5独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0590]
每个r6独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0591]
m和m
′
独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r
′
)-、-n(r
′
)c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or
′
)o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0592]
r7选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0593]
每个r独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0594]
每个r
′
独立地选自由c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和h组成的组；
[0595]
每个r
″
独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0596]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
1-12
烯基组成的组；
[0597]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0598]
每个x独立地选自由f、cl、br和i组成的组；并且
[0599]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
[0600]
或其盐或异构体。
[0601]
在一些实施方案中，式(i)化合物的另一个子集包括以下的那些化合物：其中
[0602]
r1选自由c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r
″m′r′
组成的组；
[0603]
r2和r3独立地选自由c
1-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和-r*or
″
组成的组，或者r2和r3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
[0604]
r4选自由-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr和-cq(r)2组成的组，其中q是-n(r)2，并且n选自1、2、3、4和5；
[0605]
每个r5独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0606]
每个r6独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0607]
m和m
′
独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r
′
)-、-n(r
′
)c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or
′
)o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0608]
r7选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0609]
每个r独立地选自由c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h组成的组；
[0610]
每个r
′
独立地选自由c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr
″
、-yr
″
和h组成的组；
[0611]
每个r
″
独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0612]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
1-12
烯基组成的组；
[0613]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0614]
每个x独立地选自由f、cl、br和i组成的组；并且
[0615]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
[0616]
或其盐或异构体。
[0617]
在一些实施方案中，式(i)化合物的子集包括式(ia)化合物：
[0618][0619]
或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；m1是键或m
′
；r4是未被取代的c
1-3
烷基，或-(ch2)nq，其中q是oh、-nhc(s)n(r)2、-nhc(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)r8、-nhc(＝nr9)n(r)2、-nhc(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、杂芳基或杂环烷基；m和m
′
独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r
′
)-、-p(o)(or
′
)o-、-s-s-、芳基和杂芳基；并且r2和r3独立地选自由h、c
1-14
烷基和c
2-14
烯基组成的组。
[0620]
在一些实施方案中，式(i)化合物的子集包括式(ii)化合物：
[0621]
或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m1是键或m
′
；r4是未被取代的c
1-3
烷基，或-(ch2)nq，其中n为2、3或4，并且q为oh、-nhc(s)n(r)2、-nhc(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)r8、-nhc(＝nr9)n(r)2、-nhc(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、杂芳基或杂环烷基；m和m
′
独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r
′
)-、-p(o)(or
′
)o-、-s-s-、芳基和杂芳基；并且r2和r3独立地选自由h、c
1-14
烷基和c
2-14
烯基组成的组。
[0622]
在一些实施方案中，式(i)化合物的子集包括式(iia)、(iib)、(iic)或(iie)的化合物：
[0623][0624]
或其盐或异构体，其中r4如本文所述。
[0625]
在一些实施方案中，式(i)化合物的子集包括式(iid)化合物：
[0626][0627]
或其盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、r
′
、r
″
和r2至r6如本文所述。例如，r2和r3可各自独立地选自由c
5-14
烷基和c
5-14
烯基组成的组。
[0628]
在一些实施方案中，本公开的可电离的阳离子脂质包含具有以下结构的化合物：
[0629][0630]
在一些实施方案中，本公开的可电离的阳离子脂质包含具有以下结构的化合物：
[0631][0632]
在一些实施方案中，本公开的非阳离子脂质包含1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dlpc)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dmpc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1，2-二-十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dupc)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1，2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚pc)、1-油酰基-2胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16 lyso pc)、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(me 16.0 pe)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(dopg)、鞘磷脂和其混合物。
[0633]
在一些实施方案中，本公开的peg修饰的脂质包含peg修饰的磷脂酰乙醇胺、peg修饰的磷脂酸、peg修饰的神经酰胺、peg修饰的二烷基胺、peg修饰的二酰基甘油、peg修饰的二烷基甘油和其混合物。在一些实施方案中，peg修饰的脂质是dmg-peg、peg-c-domg(也称为peg-domg)、peg-dsg和/或peg-dpg。
[0634]
在一些实施方案中，本公开的固醇包含胆固醇、粪生固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、芸苔固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚和其混合物。
[0635]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含化合物1的可电离的阳离子脂质，其中非阳离子脂质是dspc，结构脂质是胆固醇，并且peg脂质是dmg-peg。
[0636]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含45-55摩尔百分比(mol％)的可电离的阳离子脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含45mol％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％、50mol％、51mol％、52mol％、53mol％、54mol％或55mol％可电离的阳离子脂质。
[0637]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含5-15mol％、5-10mol％或10-15mol％dspc。例如，所述脂质纳米颗粒可包含5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％dspc。
[0638]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含35-40mol％胆固醇。例如，所述脂质纳米颗粒可包含35mol％、35.5mol％、36mol％、36.5mol％、37mol％、37.5mol％、38mol％、38.5mol％、39mol％、39.5mol％或40mol％胆固醇。
[0639]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含1-2mol％、1-3mol％、1-4mol％或1-5mol％dmg-peg。例如，所述脂质纳米颗粒可包含1mol％、1.5mol％、2mol％、2.5mol％、3mol％或3.5mol％dmg-peg。
[0640]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含50mol％可电离的阳离子脂质、10mol％dspc、38.5mol％胆固醇和1.5mol％dmg-peg。
[0641]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含49mol％可电离的阳离子脂质、10mol％dspc、38.5mol％胆固醇和2.5mol％dmg-peg。
[0642]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含49mol％可电离的阳离子脂质、11mol％dspc、38.5mol％胆固醇和1.5mol％dmg-peg。
[0643]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含48mol％可电离的阳离子脂质、11mol％dspc、38.5mol％胆固醇和2.5mol％dmg-peg。
[0644]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约2∶1至约30∶1的n∶p比。
[0645]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约6∶1的n∶p比。
[0646]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约3∶1的n∶p比。
[0647]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约10∶1至约100∶1的可电离的阳离子脂质组分对rna的重量/重量比。
[0648]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约20∶1的可电离的阳离子脂质组分对rna的重量/重量比。
[0649]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约10∶1的可电离的阳离子脂质组分对rna的重量/重量比。
[0650]
在一些实施方案中，本公开的lnp具有约50nm至约150nm的平均直径。
[0651]
在一些实施方案中，本公开的lnp具有约70nm至约120nm的平均直径。
[0652]
多价疫苗
[0653]
如本文提供的组合物可包括编码相同或不同种类的两种或更多种抗原的rna或多种rna。在一些实施方案中，组合物包括编码两种或更多种冠状病毒抗原的mrna或多种mrna。在一些实施方案中，所述rna可编码1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或更多种冠状病毒抗原。
[0654]
在一些实施方案中，可将两种或更多种不同的编码抗原的mrna配制在相同脂质纳
米颗粒中。在其他实施方案中，可将两种或更多种不同的编码抗原的rna配制在单独脂质纳米颗粒中(每个rna配制在单一脂质纳米颗粒中)。然后，可将脂质纳米颗粒组合并作为单一疫苗组合物(例如，包含编码多种抗原的多种rna)施用，或者可单独施用。
[0655]
组合疫苗
[0656]
如本文提供的组合物可包括编码相同或不同病毒株的两种或更多种抗原的mrna或多种rna。本文还提供了包含编码一种或多种冠状病毒和不同生物体的一种或多种抗原的rna的组合疫苗。因此，本公开的疫苗可为靶向相同株/种类的一种或多种抗原或不同株/种类的一种或多种抗原的组合疫苗，例如诱导对在冠状病毒感染风险高的相同地理区域发现的生物体或个体在暴露于冠状病毒时有可能暴露于其的生物体的免疫性的抗原。
[0657]
药物制剂
[0658]
本文提供了用于预防或治疗例如人类和其他哺乳动物的冠状病毒的组合物(例如药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。本文提供的组合物可用作治疗剂或预防剂。其可用于药物中以预防和/或治疗冠状病毒感染。
[0659]
在一些实施方案中，可将含有如本文所述的rna的冠状病毒疫苗施用给受试者(例如哺乳动物受试者，例如人类受试者)，并且mrna在体内翻译以产生抗原性多肽(抗原)。
[0660]
组合物(例如，包含rna)的“有效量”至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、rna的物理特征(例如，长度、核苷酸组成和/或修饰的核苷的程度)、疫苗的其他组分和其他决定因素，例如受试者的年龄、体重、身高、性别和一般健康状况。通常，有效量的组合物提供诱导或加强的免疫反应，其随受试者细胞中的抗原产生而变化。在一些实施方案中，有效量的含有具有至少一个化学修饰的mrna的组合物比含有编码相同抗原或肽抗原的相应未经修饰的多核苷酸的组合物更有效。抗原产生增加可通过细胞转染(用rna疫苗转染的细胞的百分数)增加、从多核苷酸的蛋白质翻译和/或表达增加、核酸降解减少(例如，如通过从经修饰的多核苷酸的蛋白质翻译的持续时间增加)或宿主细胞的抗原特异性免疫反应的改变来证明。
[0661]
术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物尤其适于体内或离体诊断或治疗用途。“药学上可接受的载体”在施用给受试者后或在施用给受试者时不会引起不期望的生理效应。药物组合物中的载体在其与活性成分相容并且能够稳定活性成分的意义上必须也是“可接受的”。一种或多种增溶剂可用作递送活性剂的药物载体。药学上可接受的载体的实例包括(但不限于)生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以实现可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶态氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和月桂基硫酸钠。额外适宜药物载体和稀释剂以及使用其的药物必需品阐述于remington
′
s pharmaceutical sciences中。
[0662]
在一些实施方案中，根据本公开的组合物(包含多核苷酸和其编码的多肽)可用于治疗或预防冠状病毒感染。组合物可作为主动免疫方案的一部分预防性或治疗性地施用给健康个体或在潜伏期(incubation phase)期间或在症状发作后的活动性感染期间的感染早期施用。在一些实施方案中，提供给细胞、组织或受试者的rna的量可为有效用于免疫预防的量。
[0663]
组合物可与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为一个非限制性实例，预防性或治疗性化合物可为佐剂或加强剂。如本文所用，当提及预防性组合物(例如疫苗)时，术
语“加强剂”是指额外施用预防性(疫苗)组合物。加强剂(或加强疫苗)可在较早施用预防性组合物之后给予。初始施用预防性组合物与加强剂之间的施用时间可为(但不限于)1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超过99年。在示例性实施方案中，初始施用预防性组合物与加强剂之间的施用时间可为(但不限于)1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。
[0664]
在一些实施方案中，组合物可经肌内、鼻内或真皮内施用，类似于本领域中已知的灭活疫苗的施用。
[0665]
根据感染的盛行率或未满足的医疗需要的程度或水平，组合物可用于各种环境。作为一个非限制性实例，rna疫苗可用于治疗和/或预防多种传染病。rna疫苗具有优越的性质，这是因为它们比市售疫苗产生大得多的抗体滴度、更好的中和免疫性、产生更耐久的免疫反应和/或更早产生反应。
[0666]
本文提供了药物组合物，其包括rna和/或复合体，任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
[0667]
所述rna可单独配制或施用，或与一种或多种其他组分联合配制或施用。例如，组合物可包含其他组分，包括但不限于佐剂。
[0668]
在一些实施方案中，组合物不包含佐剂(其不含佐剂)。
[0669]
rna可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少一种额外活性物质，例如治疗活性物质、预防活性物质或两者的组合。疫苗组合物可为无菌的、无热原的，或无菌和无热原的。在医药剂(例如疫苗组合物)的配制和/或制造中的一般考虑因素可见于例如remington：the science and practice of pharmacy，第21版，lippincott williams&wilkins，2005(其通过引用整体并入本文)。
[0670]
在一些实施方案中，将组合物施用给人类、人类患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指rna疫苗或其中所含的多核苷酸，例如编码抗原的mrna。
[0671]
本文所述的疫苗组合物的制剂可通过药理学领域中已知或以后开发的任何方法来制备。一般来说，此类制备方法包括使活性成分(例如mrna)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合并且然后在必要时和/或需要时将产品分割、成型和/或包装成期望的单剂量或多剂量单元的步骤。
[0672]
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、体型和/或状况并且进一步根据组合物待施用的途径而变化。举例来说，所述组合物可包含介于0.1％与100％之间、例如介于0.5％与50％之间、介于1％与30％之间、介于5％与80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
[0673]
在一些实施方案中，使用一种或多种赋形剂配制mrna以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，来自储积制剂)；(4)改变生物分布(例如，靶向特
定组织或细胞类型)；(5)增加编码的蛋白质在体内的翻译；和/或(6)改变编码的蛋白质(抗原)在体内的释放曲线。除了传统赋形剂(例如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂)之外，赋形剂还可包括(但不限于)类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合体、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用rna转染的细胞(例如，用于移植至受试者中)、玻尿酸酶、纳米颗粒模拟物和其组合。
[0674]
给药/施用
[0675]
本文提供了用于预防和/或治疗人类和其他哺乳动物的冠状病毒感染的组合物(例如，rna疫苗)、方法、试剂盒和试剂。免疫组合物可用作治疗剂或预防剂。在一些实施方案中，组合物用于提供对冠状病毒感染的预防性保护。在一些实施方案中，组合物用于治疗冠状病毒感染。在一些实施方案中，组合物用于引发免疫效应细胞，例如离体激活外周血单核细胞(pbmc)，然后将其输注(再输注)至受试者中。
[0676]
受试者可为任何哺乳动物，包括非人类灵长类动物和人类受试者。通常，受试者是人类受试者。
[0677]
在一些实施方案中，将组合物(例如，rna疫苗)以有效诱导抗原特异性免疫反应的量施用给受试者(例如，哺乳动物受试者，例如人类受试者)。编码冠状病毒抗原的rna在体内表达和翻译以产生抗原，其然后刺激受试者的免疫反应。
[0678]
在施用本公开的组合物之后，可实现对冠状病毒的预防性保护。免疫组合物可施用一次、两次、三次、四次或更多次，但有可能施用一次疫苗即为足够的(任选地接着进行单次加强)。尽管不太期望，但可将组合物施用给受感染个体以实现治疗反应。可能需要相应地调整给药。
[0679]
在本公开的方面中，提供了在受试者中引发针对冠状病毒抗原(或多种抗原)的免疫反应的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者施用包含具有编码冠状病毒抗原的开放阅读框的mrna的组合物，从而在受试者中诱导对冠状病毒抗原特异性的免疫反应，其中相对于用预防有效剂量的针对所述抗原的传统疫苗接种的受试者中的抗抗原抗体滴度，疫苗接种后受试者中的抗抗原抗体滴度增加。“抗抗原抗体”是特异性结合至抗原的血清抗体。
[0680]
预防有效剂量是在临床上可接受的水平上预防病毒感染的有效剂量。在一些实施方案中，有效剂量是疫苗的包装插页中列出的剂量。如本文所用，传统疫苗是指除本公开的mrna疫苗之外的疫苗。例如，传统疫苗包括(但不限于)活微生物疫苗、杀灭的微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白质抗原疫苗、dna疫苗、病毒样颗粒(vlp)疫苗等。在示例性实施方案中，传统疫苗是已经获得监管部门批准和/或在国家药物监管机构(例如美国食品药品管理局(fda)或欧洲药物管理局(ema))注册的疫苗。
[0681]
在一些实施方案中，相对于用预防有效剂量的针对冠状病毒的传统疫苗接种的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度，疫苗接种后的受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log至10log。在一些实施方案中，相对于用预防有效剂量的针对冠状病毒的传统疫苗接种的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度，疫苗接种后的受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log、2log、3log、4log、5log或10log。
[0682]
在本公开的其他方面，提供了在受试者中引发针对冠状病毒的免疫反应的方法。
所述方法包括向受试者施用包含含有编码冠状病毒抗原的开放阅读框的mrna的组合物，从而在受试者中诱导对冠状病毒特异性的免疫反应，其中受试者中的免疫反应等同于以相对于组合物2倍至100倍剂量水平用针对冠状病毒的传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。
[0683]
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的组合物两倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的组合物三倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的组合物4倍、5倍、10倍、50倍或100倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的组合物10倍至1000倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的组合物100倍至1000倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。
[0684]
在其他实施方案中，通过测定受试者中的[蛋白]抗体滴度来评价免疫反应。在其他实施方案中，测试来自经免疫受试者的血清或抗体中和病毒摄取或减少人类b淋巴细胞的冠状病毒转化的能力。在其他实施方案中，使用本领域中公认的技术来测量促进稳固t细胞反应的能力。
[0685]
本公开的其他方面提供了通过向受试者施用包含具有编码冠状病毒抗原的开放阅读框的mrna的组合物，从而在受试者中诱导对冠状病毒抗原特异性的免疫反应，而在受试者中引发针对冠状病毒的免疫反应的方法，其中相对于在用预防有效剂量的针对冠状病毒的传统疫苗接种的受试者中诱导的免疫反应，所述受试者中诱导的免疫反应早2天至10周。在一些实施方案中，在以相对于本公开的组合物2倍至100倍的剂量水平用预防有效剂量的传统疫苗接种的受试者中，诱导所述受试者中的免疫反应。
[0686]
在一些实施方案中，相对于在用预防有效剂量的传统疫苗接种的受试者中诱导的免疫反应，所述受试者中诱导的免疫反应早2天、3天、1周、2周、3周、5周或10周。
[0687]
本文还提供了通过向受试者施用具有编码第一抗原的开放阅读框的mrna而在受试者中引发针对冠状病毒的免疫反应的方法，其中rna不包括稳定化元件，并且其中佐剂不与疫苗共配制或共施用。
[0688]
组合物可通过任何产生治疗有效结果的途径施用。这些途径包括(但不限于)真皮内、肌内、鼻内和/或皮下施用。本公开提供了包括向有需要的受试者施用rna疫苗的方法。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式等。rna通常配制成剂量单位形式以便于施用和剂量的均匀性。然而，应理解，rna的总日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。
[0689]
如本文提供的rna的有效量可低至20μg，例如以单一剂量或两个10μg剂量施用。在一些实施方案中，有效量为20μg-300μg或25μg-300μg的总剂量。例如，有效量可为20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μ
g、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、250μg或300μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为20μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为25μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为50μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为75μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为100μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为150μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为200μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为250μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为300μg的总剂量。
[0690]
本文所述的rna可配制成本文所述的剂型，例如鼻内、气管内或可注射(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、真皮内、心内、腹膜内和皮下)。
[0691]
疫苗功效
[0692]
本公开的一些方面提供了组合物(例如，rna疫苗)的制剂，其中以有效量配制rna以在受试者中产生抗原特异性免疫反应(例如，产生对冠状病毒抗原特异性的抗体)。“有效量”是有效产生抗原特异性免疫反应的rna的剂量。本文还提供了在受试者中诱导抗原特异性免疫反应的方法。
[0693]
如本文所用，对本公开的疫苗或lnp的免疫反应是在受试者中产生对疫苗中存在的(一种或多种)冠状病毒蛋白的体液和/或细胞免疫反应。出于本公开的目的，“体液”免疫反应是指由抗体分子(包括例如分泌性(iga)或igg分子)介导的免疫反应，而“细胞”免疫反应是由t淋巴细胞(例如，cd4+辅助细胞和/或cd8+ t细胞(例如ctl))和/或其他白细胞介导的免疫反应。细胞免疫的一个重要方面包括由细胞溶解性t细胞(ctl)引起的抗原特异性反应。ctl对与主要组织相容性复合体(mhc)编码的蛋白质缔合呈递并在细胞表面上表达的肽抗原具有特异性。ctl帮助诱导和促进细胞内微生物的破坏或感染此类微生物的细胞的溶解。细胞免疫的另一个方面包括由辅助t细胞引起的抗原特异性反应。辅助t细胞用于帮助刺激功能并且使非特异性效应细胞的活性集中于在表面上展示与mhc分子缔合的肽抗原的细胞。细胞免疫反应还导致产生细胞因子、趋化因子和由活化t细胞和/或其他白细胞产生的其他此类分子(包括源自cd4+和cd8+ t细胞的那些)。
[0694]
在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应通过测量在施用如本文提供的组合物的受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度来表征。抗体滴度是受试者内抗体(例如，对特定抗原或抗原的表位特异性的抗体)的量的测量结果。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(elisa)是用于测定抗体滴度的常见测定。
[0695]
可使用多种血清学测试来测量针对编码的目标抗原的抗体，例如sar-cov-2病毒或sar-cov-2病毒抗原，例如sar-cov-2刺突或s蛋白，或其结构域。这些测试包括血球凝集抑制测试、补体结合测试、荧光抗体测试、酶联免疫吸附测定(elisa)和噬斑减少中和测试(prnt)。这些测试中的每一者测量不同抗体活性。在示例性实施方案中，噬斑减少中和测试或prnt(例如prnt50或prnt90)用作保护的血清学相关物。prnt测量体外病毒中和的生物学参数，并且是某些类别的病毒中最具血清学病毒特异性的测试，与病毒感染的保护的血清水平充分相关。
[0696]
prnt的基本设计允许在试管或微量滴定板中发生病毒-抗体相互作用，并且然后通过将混合物平铺在病毒易感性细胞、优选哺乳动物来源的细胞上来测量抗体对病毒感染性的效应。用限制后代病毒传播的半固体培养基覆盖细胞。引发生产性感染的每个病毒产生局部感染区域(噬斑)，其可以多种方式检测。对噬斑计数并与病毒的起始浓度进行比较
以确定总病毒感染性的降低百分比。在prnt中，通常在与标准量的病毒混合之前，将所测试的血清样品进行连续稀释。病毒的浓度保持恒定，使得当添加至易感细胞中并用半固体培养基覆盖时，可辨别个别噬斑并计数。以这种方式，可在任何选择的病毒活性降低百分比下计算每个血清样品的prnt终点滴度。
[0697]
在旨在评价疫苗免疫原性的功能测定中，用于抗体滴定的血清样品稀释系列理想地应在低于“血清保护性”阈值滴度下开始。关于sars-cov-2中和抗体，“血清保护性”阈值滴度仍然未知；但在某些实施方案中，1∶10的血清阳性阈值可被认为是血清保护阈值。
[0698]
prnt终点滴度表示为显示所需的噬斑计数减少百分比的最后血清稀释度的倒数。prnt滴度可基于50％或更大的噬斑计数减少来计算(prnt50)。对于疫苗血清，prnt50滴度优于使用较高截止值(例如，prnt90)的滴度，从滴定曲线的线性部分提供更准确的结果。
[0699]
存在用以计算prnt滴度的若干方式。计算滴度的最简单和最广泛使用的方式是对噬斑计数，并且将滴度报告为基于输入噬斑的反滴定，显示输入噬斑计数减少＞50％的最后血清稀释度的倒数。使用来自若干血清稀释的曲线拟合方法可允许计算更精确的结果。存在多种计算机分析程序可用于此目的(例如，spss或graphpad prism)。
[0700]
在一些实施方案中，抗体滴度用于评价受试者是否已经感染或确定是否需要免疫。在一些实施方案中，抗体滴度用于确定自身免疫反应的强度，确定是否需要加强免疫，确定先前的疫苗是否有效，以及鉴定任何最近或先前的感染。根据本公开，抗体滴度可用于确定由组合物(例如，rna疫苗)在受试者中诱导的免疫反应的强度。
[0701]
在一些实施方案中，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加至少1.5、至少2、至少2.5或至少3log。在一些实施方案中，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加1、1.5、2、2.5或3log。在一些实施方案中，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加1-3log。例如，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加1-1.5、1-2、1-2.5、1-3、1.5-2、1.5-2.5、1.5-3、2-2.5、2-3或2.5-3log。
[0702]
在一些实施方案中，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度可相对于对照增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加2-10倍。例如，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10倍。
[0703]
在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应测量为冠状病毒血清中和抗体滴度的几何平均滴度(gmt)的比率，称为几何平均比率(gmr)。几何平均滴度(gmt)是通过将所有值相乘并且取所述数的n次方根来计算的一组受试者的平均抗体滴度，其中n是具有可用数据的受试者的数目。
[0704]
在一些实施方案中，对照是在未施用组合物(例如rna疫苗)的受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度。在一些实施方案中，对照是在施用重组或纯化的蛋白疫苗的受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度。重组蛋白疫苗通常包括在异源表达系统(例如细菌
或酵母)中产生或从大量病原生物体中纯化的蛋白抗原。
[0705]
在一些实施方案中，在鼠类模型中测量组合物(例如rna疫苗)有效的能力。例如，可将组合物施用给鼠类模型，并且分析所述鼠类模型的中和抗体滴度的诱导。病毒攻击研究还可用于评价本公开的疫苗的功效。例如，可将组合物施用给鼠类模型，用病毒攻击鼠类模型，并测定鼠类模型的存活和/或免疫反应(例如中和抗体反应、t细胞反应(例如细胞因子反应))。
[0706]
在一些实施方案中，组合物(例如，rna疫苗)的有效量是与重组蛋白疫苗的标准护理剂量相比减少的剂量。如本文所提供的“照护标准”是指医学或心理学治疗指南，并且可为一般性的或特异性的。“照护标准”基于科学证据和参与给定疾患的治疗的医学专业人士之间的合作来指定适当治疗。其是医师/临床医师对于某种类型的患者、疾病或临床情况应遵循的诊断和治疗过程。如本文所提供的“照护标准剂量”是指医师/临床医师或其他医学专业人士在遵循用于治疗或预防冠状病毒感染或相关疾患的照护标准指南的同时，将施用给受试者以治疗或预防冠状病毒感染或相关疾患的重组或纯化蛋白疫苗、或活的减毒或灭活疫苗、或vlp疫苗的剂量。
[0707]
在一些实施方案中，在施用有效量的组合物的受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度等同于在施用照护标准剂量的重组或纯化蛋白疫苗、或活的减毒或灭活疫苗、或vlp疫苗的对照受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度。
[0708]
疫苗功效可使用标准分析来评价(例如，参见weinberg等人，j infect dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。例如，疫苗功效可通过双盲、随机化、临床对照试验来测量。疫苗功效可表示为未接种疫苗(aru)和接种疫苗(arv)的研究同类群组之间疾病罹患率(ar)的成比例降低，并且可使用下式从接种疫苗组中疾病的相对风险(rr)计算：
[0709]
功效＝(aru-arv)/aru
×
100；并且
[0710]
功效＝(1-rr)
×
100。
[0711]
同样，疫苗有效性可使用标准分析来评估(例如，参见weinberg等人，j infect dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。疫苗有效性是评价疫苗(其可能已经证明具有高疫苗功效)如何减少群体中的疾病。此量度可评价在自然现场条件下而非在受控临床试验中，疫苗接种程序而不仅仅疫苗本身的益处和不利效应的净平衡。疫苗有效性与疫苗功效(效力)成正比，但也受群体中的目标组的免疫程度以及影响住院治疗、流动就诊或费用的“真实世界”结果的其他非疫苗相关因素影响。例如，可使用回溯性病例对照分析，其中比较一组感染病例和适当对照之间的疫苗接种率。疫苗有效性可表示为比率差异，其中使用针对疫苗接种后仍发生感染的优势比(or)：
[0712]
有效性＝(1-or)
×
100。
[0713]
在一些实施方案中，相对于未接种疫苗的对照受试者，组合物(例如，rna疫苗)的功效为至少60％。例如，相对于未接种疫苗的对照受试者，组合物的功效可为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少98％或100％。
[0714]
消除性免疫性。消除性免疫性是指防止病原体有效感染至宿主中的独特免疫状态。在一些实施方案中，有效量的本公开的组合物足以在受试者中提供消除性免疫性至少1年。例如，有效量的本公开的组合物足以在受试者中提供消除性免疫性至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。在一些实施方案中，有效量的本公开的组合物足以在受试者中以相对
于对照低至少5倍的剂量提供消除性免疫性。例如，有效量可足以在受试者中以相对于对照低至少10倍、15倍或20倍的剂量提供消除性免疫性。
[0715]
可检测抗原。在一些实施方案中，有效量的本公开的组合物足以产生可检测水平的冠状病毒抗原，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。
[0716]
滴度。抗体滴度是受试者内抗体(例如，对特定抗原(例如，抗冠状病毒抗原)特异性的抗体)的数量的量度。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(elisa)是用于测定抗体滴度的常见测定。
[0717]
在一些实施方案中，有效量的本公开的组合物足以产生由针对冠状病毒抗原的中和抗体产生的1,000-10,000中和抗体滴度，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。在一些实施方案中，有效量足以产生由针对冠状病毒抗原的中和抗体产生的1,000-5,000中和抗体滴度，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。在一些实施方案中，有效量足以产生由针对冠状病毒抗原的中和抗体产生的5,000-10,000中和抗体滴度，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。
[0718]
在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少100nt
50
。例如，所述中和抗体滴度可为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000nt
50
。在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少10,000nt
50
。
[0719]
在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少100个中和单位/毫升(nu/ml)。例如，所述中和抗体滴度可为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000nu/ml。在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少10,000nu/ml。
[0720]
在一些实施方案中，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加至少2、3、4、5、6、7、8、9或10log。
[0721]
在一些实施方案中，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少3、4、5、6、7、8、9或10倍。
[0722]
在一些实施方案中，几何平均值，即n个数的乘积的n次方根，通常用于阐述成比例生长。在一些实施方案中，几何平均值用于表征受试者中产生的抗体滴度。
[0723]
对照可为例如未接种疫苗的受试者，或施用活的减毒病毒疫苗、灭活病毒疫苗或蛋白质亚单位疫苗的受试者。
[0724]
额外实施方案
[0725]
以下编号的段落涵盖本公开的额外实施方案：
[0726]
1.一种信使核糖核酸(mrna)，所述信使核糖核酸(mrna)包含编码融合蛋白的开放阅读框，所述融合蛋白包含sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)和蛋白质跨膜结构域。
[0727]
2.如段落1所述的mrna，其中所述蛋白质跨膜结构域是流感血凝素跨膜结构域。
[0728]
3.如段落2所述的mrna，其中所述融合蛋白包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0729]
4.如段落3所述的mrna，其中所述融合蛋白包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基
酸序列。
[0730]
5.如段落4所述的mrna，其中所述融合蛋白包含seq id no：77的氨基酸序列。
[0731]
6.如前述段落中任一项所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：76的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
[0732]
7.如段落6所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：76的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
[0733]
8.如段落7所述的mrna，其中所述开放阅读框包含seq id no：76的核苷酸序列。
[0734]
9.一种信使核糖核酸(mrna)，所述信使核糖核酸(mrna)包含编码融合蛋白的开放阅读框，所述融合蛋白包含sars-cov-2刺突蛋白的氨基(n)末端结构域(ntd)和跨膜结构域。
[0735]
10.如段落9所述的mrna，其中所述跨膜结构域是流感血凝素跨膜结构域。
[0736]
11.如段落10所述的mrna，其中所述融合蛋白包含与seq id no：47的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0737]
12.如段落11所述的mrna，其中所述融合蛋白包含与seq id no：47的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
[0738]
13.如段落12所述的mrna，其中所述融合蛋白包含seq id no：47的氨基酸序列。
[0739]
14.如前述段落中任一项所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：46的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
[0740]
15.如段落14所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：46的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
[0741]
16.如段落15所述的mrna，其中所述开放阅读框包含seq id no：46的核苷酸序列。
[0742]
17.一种信使核糖核酸(mrna)，所述信使核糖核酸(mrna)包含编码融合蛋白的开放阅读框，所述融合蛋白包含与sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域连接的sars-cov-2刺突蛋白的氨基(n)末端结构域。
[0743]
18.如段落17所述的mrna，其中所述融合蛋白还包含跨膜结构域。
[0744]
19.如段落18所述的mrna，其中所述融合蛋白包含与seq id no：92的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0745]
20.如段落18所述的mrna，其中所述融合蛋白包含与seq id no：92的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
[0746]
21.如段落20所述的mrna，其中所述融合蛋白包含seq id no：92的氨基酸序列。
[0747]
22.如前述段落中任一项所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：91的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
[0748]
23.如段落22所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：91的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
[0749]
24.如段落23所述的mrna，其中所述开放阅读框包含seq id no：91的核苷酸序列。
[0750]
25.如前述段落中任一项所述的mrna，所述mrna还包含5
′
非翻译区(utr)，所述5
′
非翻译区任选地包含seq id no：131或2的核苷酸序列。
[0751]
26.如前述段落中任一项所述的mrna，所述mrna还包含3
′
非翻译区(utr)，所述3
′
非翻译区任选地包含seq id no：132或4的核苷酸序列。
[0752]
27.如前述段落中任一项所述的mrna，所述mrna还包含5
′
帽，任选地7mg(5
′
)ppp(5
′
)nlmpnp。
[0753]
28.如前述段落中任一项所述的mrna，所述mrna还包含多聚a尾，任选地具有约100个核苷酸的长度。
[0754]
29.如前述段落中任一项所述的mrna，其中所述mrna包含化学修饰，任选地1-甲基假尿苷。
[0755]
30.一种组合物，所述组合物包含段落1-29中任一项所述的mrna。
[0756]
31.一种组合物，所述组合物包含段落1-8中任一项所述的mrna和段落9-16中任一项所述的mrna。
[0757]
32.一种组合物，所述组合物包含段落17-29中任一项所述的mrna。
[0758]
33.一种组合物，所述组合物包含：
[0759]
(a)信使核糖核酸(mrna)，其包含编码融合蛋白的开放阅读框，所述融合蛋白包含sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)和蛋白质跨膜结构域；和
[0760]
(b)mrna，其包含编码融合蛋白的开放阅读框，所述融合蛋白包含sars-cov-2刺突蛋白的氨基(n)末端结构域和跨膜结构域。
[0761]
34.如段落33所述的组合物，其中所述蛋白质跨膜结构域是流感血凝素跨膜结构域。
[0762]
35.如段落34所述的组合物，其中(a)的所述融合蛋白包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0763]
36.如段落35所述的组合物，其中(a)的所述融合蛋白包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
[0764]
37.如段落36所述的组合物，其中(a)的所述融合蛋白包含seq id no：77的氨基酸序列。
[0765]
38.如段落34-37中任一项所述的组合物，其中(a)的所述开放阅读框包含与seq id no：76的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
[0766]
39.如段落38所述的组合物，其中(a)的所述开放阅读框包含与seq id no：76的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
[0767]
40.如段落39所述的组合物，其中(a)的所述开放阅读框包含seq id no：76的核苷酸序列。
[0768]
41.如段落34-40中任一项所述的组合物，其中(b)的所述融合蛋白包含与seq id no：47的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0769]
42.如段落41所述的组合物，其中(b)的所述融合蛋白包含与seq id no：47的氨基
酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
[0770]
43.如段落42所述的组合物，其中(b)的所述融合蛋白包含seq id no：47的氨基酸序列。
[0771]
44.如段落34-43中任一项所述的组合物，其中(b)的所述开放阅读框包含与seq id no：46的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。
[0772]
45.如段落44所述的组合物，其中(b)的所述开放阅读框包含与seq id no：46的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
[0773]
46.如段落45所述的组合物，其中(b)的所述开放阅读框包含seq id no：46的核苷酸序列。
[0774]
47.如段落33-46中任一项所述的组合物，其中(a)的所述mrna与(b)的所述mrna的比率为约1∶1。
[0775]
48.如段落1-29中任一项所述的mrna，所述mrna配制在脂质纳米颗粒中。
[0776]
49.如段落30-47中任一项所述的组合物，所述组合物还包含脂质纳米颗粒。
[0777]
50.如段落49所述的组合物，其中所述mrna配制在所述脂质纳米颗粒中。
[0778]
51.如段落33-47中任一项所述的组合物，其中(a)的所述mrna配制在脂质纳米颗粒中并且(b)的所述mrna配制在脂质纳米颗粒中。
[0779]
52.如段落51所述的组合物，其中(a)和(b)的所述mrna在相同脂质纳米颗粒中，或者其中(a)和(b)的所述mrna相对于彼此各自配制在单独纳米颗粒中。
[0780]
53.如段落48所述的mrna或如段落49-52中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质。
[0781]
54.如段落53所述的mrna或组合物，其中所述脂质纳米颗粒还包含中性脂质。
[0782]
55.如段落53或54所述的mrna或组合物，其中所述脂质纳米颗粒还包含固醇。
[0783]
56.如段落53-55中任一项所述的mrna或组合物，其中所述脂质纳米颗粒还包含聚乙二醇(peg)修饰的脂质。
[0784]
57.如段落53-56中任一项所述的mrna或组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含可电离的阳离子脂质、中性脂质、固醇和peg修饰的脂质。
[0785]
58.如段落57所述的mrna或组合物，其中所述可电离的阳离子脂质是8((2羟基乙基)(6氧代6-(十一烷基氧基)己基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(化合物1)。
[0786]
59.如段落57或58所述的mrna或组合物，其中所述中性脂质是1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)。
[0787]
60.如段落57-59中任一项所述的mrna或组合物，其中所述固醇是胆固醇。
[0788]
61.如段落57-60中任一项所述的mrna或组合物，其中所述peg修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(peg2000 dmg)。
[0789]
62.如段落57-61中任一项所述的mrna或组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离的阳离子脂质、5-25mol％中性脂质、25-55mol％固醇和0.5-15mol％peg修饰的脂质。
[0790]
63.如段落62所述的mrna或组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含：
[0791]
47mol％可电离的阳离子脂质；11.5mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和3.0mol％peg修饰的脂质；
[0792]
48mol％可电离的阳离子脂质；11mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和2.5mol％peg修饰的脂质；
[0793]
49mol％可电离的阳离子脂质；10.5mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和2.0mol％peg修饰的脂质；
[0794]
50mol％可电离的阳离子脂质；10mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和1.5mol％peg修饰的脂质；或
[0795]
51mol％可电离的阳离子脂质；9.5mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和1.0mol％peg修饰的脂质。
[0796]
64.如段落63所述的mrna或组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含：
[0797]
47mol％化合物1；11.5mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和3.0mol％peg2000 dmg；
[0798]
48mol％化合物1；11mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和2.5mol％peg2000 dmg；
[0799]
49mol％化合物1；10.5mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和2.0mol％peg2000 dmg；
[0800]
50mol％化合物1；10mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和1.5mol％peg2000 dmg；或
[0801]
51mol％化合物1；9.5mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和1.0mol％peg2000 dmg。
[0802]
65.一种方法，所述方法包括向受试者施用有效地在所述受试者中诱导针对sars-cov-2的中和抗体反应的量的前述段落中任一项所述的mrna或组合物。
[0803]
66.一种方法，所述方法包括向受试者施用有效地在所述受试者中诱导针对sars-cov-2的t细胞免疫反应的量的前述段落中任一项所述的mrna或组合物。
[0804]
67.一种信使核糖核酸(mrna)，所述信使核糖核酸(mrna)包含编码冠状病毒抗原的开放阅读框(orf)，所述冠状病毒抗原能够诱导针对sars-cov-2的免疫反应，例如中和抗体反应，其中所述抗原包含sars-cov-2的蛋白质片段或功能性蛋白质结构域，任选地其中所述rna配制在脂质纳米颗粒中。
[0805]
68.如段落67所述的mrna，其中所述抗原是功能性蛋白质结构域。
[0806]
69.如段落68所述的mrna，其中所述蛋白质结构域是sars-cov-2刺突蛋白的n末端结构域(ntd)。
[0807]
70.如段落69所述的mrna，其中所述ntd与跨膜结构域、任选地流感血凝素跨膜结构域连接。
[0808]
71.如段落70所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：47的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：47的氨基酸序列。
[0809]
72.如段落70或71所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：46的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：46的核苷酸序列。
[0810]
73.如段落68所述的mrna，其中所述蛋白质结构域是sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)。
[0811]
74.如段落73所述的mrna，其中所述rbd是可溶的。
[0812]
75.如段落74所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：62的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：62的氨基酸序列。
[0813]
76.如段落74或75所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：61的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：61的核苷酸序列。
[0814]
77.如段落73所述的mrna，其中所述rbd连接至跨膜结构域，任选地流感血凝素跨膜结构域。
[0815]
78.如段落77所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：77的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：77的氨基酸序列。
[0816]
79.如段落77或78所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：76的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：76的核苷酸序列。
[0817]
80.如段落69所述的mrna，其中所述ntd与sars-cov-2刺突蛋白的rbd连接以形成ntd-rbd融合蛋白。
[0818]
81.如段落80所述的mrna，其中所述ntd-rbd融合体与跨膜结构域(tm)、任选地流感血凝素跨膜结构域连接，以形成ntd-rbd-tm蛋白。
[0819]
82.如段落81所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：92的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：92的氨基酸序列。
[0820]
83.如段落81或82所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：91的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：91的核苷酸序列。
[0821]
84.如段落80所述的mrna，其中所述ntd-rbd融合体包含c末端截短。
[0822]
85.如段落84所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：107的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：107的氨基酸序列。
[0823]
86.如段落84或85所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：106的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：106的核苷酸序列。
[0824]
87.如前述段落中任一项所述的mrna，其中所述ntd和/或rbd包括延伸区。
[0825]
88.如段落87所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：59、86、89、116、119或122中任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：59、
86、89、116、119或122中任一者的氨基酸序列。
[0826]
89.如段落87或88所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：58、85、88、115、118或121中任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：58、85、88、115、118或121中任一者的核苷酸序列。
[0827]
90.如段落68所述的mrna，其中所述蛋白质结构域是sars-cov-2刺突蛋白的s1亚基结构域。
[0828]
91.如段落90所述的mrna，其中所述s1亚基是可溶的。
[0829]
92.如段落91所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：5的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：5的氨基酸序列。
[0830]
93.如段落91或92所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：3的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：3的核苷酸序列。
[0831]
94.如段落90所述的mrna，其中所述s1亚基连接至跨膜结构域、任选地与流感血凝素跨膜结构域。
[0832]
95.如段落94所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：17的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：17的氨基酸序列。
[0833]
96.如段落94或95所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：16的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：16的核苷酸序列。
[0834]
97.如段落90所述的mrna，其中所述s1亚基已被修饰以去除s蛋白的rbd或rbd的一部分。
[0835]
98.如段落97所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：20、23、26、29、32或35中任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：20、23、26、29、32或35中任一者的氨基酸序列。
[0836]
99.如段落97或98所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：19、22、25、28、41或34中任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：19、22、25、28、31或34中任一者的核苷酸序列。
[0837]
100.如段落90所述的mrna，其中所述s1亚基与s蛋白的s2亚基连接。
[0838]
101.如段落100所述的mrna，其中所述s2亚基来自sars-cov-2 s蛋白，并且在一些实施方案中，其中所述s2亚基包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与seq id no：145的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：145
的核苷酸序列。
[0839]
102.如段落101所述的mrna，其中所述s1亚基来自hku1 s蛋白。
[0840]
103.如段落102所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：38的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：38的氨基酸序列。
[0841]
104.如段落102或103所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：37的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：37的核苷酸序列。
[0842]
105.如段落101所述的mrna，其中所述s1亚基来自oc43 s蛋白。
[0843]
106.如段落105所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：41的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：41的氨基酸序列。
[0844]
107.如段落105或106所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：40的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：40的核苷酸序列。
[0845]
108.如前述段落中任一项所述的mrna，其中所述抗原还包含支架结构域，任选地选自铁蛋白、2，4-二氧四氢蝶啶合成酶和折叠子。
[0846]
109.如段落108所述的mrna，其中所述支架结构域是铁蛋白。
[0847]
110.如段落109所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：8或65的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：8或65的氨基酸序列。
[0848]
111.如段落109或110所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：7或64的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：7或64的核苷酸序列。
[0849]
112.如段落108所述的mrna，其中所述支架结构域是2，4-二氧四氢蝶啶合成酶。
[0850]
113.如段落112所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：11、14、68或71中任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：11、14、68或71中任一者的氨基酸序列。
[0851]
114.如段落112或113所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：10、13、67或70中任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：10、13、67或70中任一者的核苷酸序列。
[0852]
115.如段落108所述的mrna，其中所述支架结构域是折叠子。
[0853]
116.如段落115所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：44、50、74、80、83、101、104或113中任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：44、50、74、80、83、101、104或113中任一者的氨基酸序列。
[0854]
117.如段落115或116所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：43、49、73、79、82、100、103或112中任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：43、49、73、79、82、100、103或112中任一者的核苷酸序列。
[0855]
118.如前述段落中任一项所述的mrna，其中所述抗原还包含运输信号，任选地选自巨噬细胞标志物，任选地cd86、cd11b和/或vsvgct。
[0856]
119.如段落118所述的mrna，其中所述抗原包含与seq id no：95、98或110中任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述抗原包含seq id no：95、98或110中任一者的氨基酸序列。
[0857]
120.如段落118或119所述的mrna，其中所述开放阅读框包含与seq id no：94、97或109中任一者的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，任选地其中所述开放阅读框包含seq id no：94、97或109中任一者的核苷酸序列。
[0858]
121.如段落67-120中任一项所述的mrna，所述mrna配制在脂质纳米颗粒中。
[0859]
122.如段落121所述的mrna，其中所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、任选地可电离的阳离子脂质、中性脂质、固醇和/或聚乙二醇(peg)修饰的脂质。
[0860]
123.如段落108所述的mrna或组合物，其中所述可电离的阳离子脂质是8((2羟基乙基)(6氧代6-(十一烷基氧基)己基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(化合物1)，所述中性脂质是1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)，所述固醇是胆固醇，和/或所述peg修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(peg2000 dmg)。
[0861]
124.如段落121-123中任一项所述的mrna或组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离的阳离子脂质、5-25mol％中性脂质、25-55mol％固醇和0.5-15mol％peg修饰的脂质。
[0862]
125.如段落124所述的mrna或组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含：
[0863]
47mol％可电离的阳离子脂质；11.5mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和3.0mol％peg修饰的脂质；
[0864]
48mol％可电离的阳离子脂质；11mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和2.5mol％peg修饰的脂质；
[0865]
49mol％可电离的阳离子脂质；10.5mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和2.0mol％peg修饰的脂质；
[0866]
50mol％可电离的阳离子脂质；10mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和1.5mol％peg修饰的脂质；或
[0867]
51mol％可电离的阳离子脂质；9.5mol％中性脂质；38.5mol％固醇；和1.0mol％peg修饰的脂质。
[0868]
126.如段落125所述的mrna或组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含：
[0869]
47mol％化合物1；11.5mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和3.0mol％peg2000 dmg；
[0870]
48mol％化合物1；11mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和2.5mol％peg2000 dmg；
[0871]
49mol％化合物1；10.5mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和2.0mol％peg2000 dmg；
[0872]
50mol％化合物1；10mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和1.5mol％peg2000 dmg；或
[0873]
51mol％化合物1；9.5mol％dspc；38.5mol％胆固醇；和1.0mol％peg2000 dmg。
[0874]
127.一种方法，所述方法包括向受试者施用有效地在所述受试者中诱导针对sars-cov-2的中和抗体反应的量的段落67-126中任一项所述的mrna。
[0875]
128.一种方法，所述方法包括向受试者施用有效地在所述受试者中诱导针对sars-cov-2的t细胞免疫反应的量的段落67-126中任一项所述的mrna。
[0876]
实施例
[0877]
实施例1.表达数据
[0878]
本研究中使用的mrna用于表达sars-cov-2冠状病毒刺突(s)蛋白的关键中和结构域，并且评价这些中和蛋白结构域在个别地或组合用作免疫原性组合物或疫苗以保护人免受活的和传播的天然病毒感染时是否可更有效地诱导保护性免疫性。由mrna编码的蛋白质的线性设计如图2中所示。蛋白质还都含有源自流感的血凝素(ha)的羧基(c)末端跨膜结构域(tm)。
[0879]
已知ntd和rbd两者都是结合表现中和病毒活性的抗体的位点。在sars-cov-2的情形下，rbd是刺突蛋白的受体结合位点，并且结合血管收缩肽转化酶2(ace2)。氨基(n)末端结构域ntd的功能尚未完全了解，似乎在结合糖部分和促进刺突蛋白从融合前构象向融合后构象的构象转变中起作用。参见zhou h，chen y，zhang s等人，nat commun.2019；10(1)：3068。无论如何，ntd和rbd结构域两者都诱导如下文论述的高结合抗体和中和抗体滴度。
[0880]
使用对sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)(mab1)和sars-cov-2刺突蛋白的n末端结构域(ntd)(ab2)特异性的抗体，在表16和表17中显示mrna rbd-tm疫苗(“sars-cov-2rbd-tm”；seq id no：75-77)、mrna ntd-tm疫苗(“sars-cov-2 ntd-tm”；seq id no：45-47)和mrna ntd-rbd-tm(“sars-cov-1ntd-rbd-tm”；seq id no：90-92)疫苗的表达数据。表16显示在24小时(hr)、48hr和72hr时，与wt sars-cov-2刺突蛋白mrna相比，mfi*freq的平均倍数差异(在稀释范围内)(表16)。
[0881]
表16.与s2p蛋白相比的总抗原表达(mfi*freq)的倍数变化
[0882][0883]
rbd＝受体结合结构域
[0884]
ntd＝n末端结构域
[0885]
tm＝跨膜结构域
[0886]
实施例2.单一剂量后第21天的免疫原性数据和中和数据
[0887]
以下列剂量向小鼠施用mrna ntd-tm和mrna rbd-tm(阐述于实施例1中)：0.001μg、0.01μg、0.1μg或1μg(n＝8)。以下列剂量向小鼠施用mrna ntd-rbd-tm(阐述于实施例1中)：0.1μg或1μg(n＝8)。向小鼠施用mrna ntd-tm和mrna rbd-tm的50∶50混合物，其含有0.1μg每个mrna，总共0.2μg mrna，或1μg每个mrna，总共2μg mrna(n＝8)。然后在疫苗接种后第21天通过elisa测量sars-cov-2刺突蛋白特异性igg滴度(表17)、sars-cov-2 rbd特异性igg滴度(表18)和sars-cov-2 ntd特异性igg滴度(表19)。数据提供于表17-19中。0.1μg剂量的mrna ntd-rbd-tm和0.2μg剂量的mrna ntd-tm和mrna rbd-tm组合物的50∶50混合物引发可观察到的ntd特异性和rbd特异性igg滴度，并且0.1μg剂量的rbd-tm和ntd-tm分别引发可测量的针对rbd和ntd抗原的igg滴度。
[0888]
表17.sars-cov-2 s1/s2刺突蛋白特异性igg滴度-平均值
[0889][0890]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0891]
表18.rbd结构域特异性igg滴度-平均值
[0892][0893]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0894]
表19.ntd结构域特异性igg滴度-平均值
[0895][0896][0897]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0898]
测量来自用1μg剂量的rbd-tm和ntd-rbd-tm组合物和2μg剂量的ntd-tm和rbd-tm组合物的50∶50混合物接种的小鼠的血清的中和滴度，并且分析elisa滴度与中和滴度之间
的相关性(图7)。
[0899]
由1μg剂量的ntd-rbd-tm组合物或2μg的ntd-tm和rbd-tm组合物的50∶50混合物引起的滴度大于由1μg剂量的rbd-tm组合物引起的那些滴度(表20)。在刺突特异性igg、rbd特异性igg和ntd特异性igg的中和滴度和elisa滴度之间存在显著的相关性(图7)。
[0900]
表20.中和滴度-平均值
[0901][0902]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0903]
基于重组vsvδg的sars-cov-2假病毒中和测定
[0904]
将密码子优化的野生型或d614g刺突基因(wuhan-hu-1株；nc_045512.2)克隆至pcaggs载体中。为了产生基于vsvδg的sars-cov-2假病毒，如先前所述(whitt，2010)，用刺突表达质粒和感染的vsvδg-萤火虫-荧光素酶转染bhk-21/wi-2细胞。使用a549-hace2-tmprss2细胞作为基于vsvδg的sars-cov-2假病毒中和测定的靶细胞。制备编码hace2-p2a-tmprss2的慢病毒，以产生a549-hace2-tmprss2细胞，将其维持在补充有10％胎牛血清和1μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的dmem中。在37℃下用假病毒感染a549-hace2-tmprss2细胞1小时。感染后除去接种病毒或病毒-抗体混合物。18小时后，将等体积的one-glo试剂(promega；e6120)添加至培养基中，使用bmg pherastar-fs读板器进行读数。中和程序和数据分析与上文在基于慢病毒的假病毒中和测定中所述相同。参见whitt，m.a.(2010).journal of virological methods 169，365-374。
[0905]
实施例3.两个剂量后第36天的免疫原性数据
[0906]
接种疫苗第一剂量后第22天，再次将相同剂量的实施例2中所述的mrna疫苗作为加强剂量施用给小鼠。从第36天血清通过elisa测量在加强剂量后产生的针对rbd抗原、ntd抗原、野生型(wt)刺突(s)蛋白和s2p蛋白(具有双脯氨酸突变以稳定融合前构象的s蛋白)中的每一者的抗体的滴度，并显示如下。将由lnp中的mrna编码的rbd-tm和ntd-tm的两种免疫原性组合物的50∶50混合物在第22天以2μg或0.2μg总mrna作为加强剂量施用给小鼠，并且在第36天测定滴度。参见表21。
[0907]
表21中显示的用由lnp中的mrna编码的rbd-tm、ntd-tm或ntd-rbd-tm免疫的小鼠的wt s蛋白滴度指示，在诱导可识别并结合至sars-cov-2 wt s蛋白的抗体方面，两个剂量在所有测试的剂量下都是优异的。
[0908]
表21.sars-cov-2 wt s特异性igg滴度-几何平均值
[0909][0910]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0911]
进一步分析来自用两个剂量的由lnp中的mrna编码的rbd-tm、ntd-tm或ntd-rbd-tm免疫的小鼠的血清的抗体识别和结合sars-cov-2 s2p蛋白的能力。通过elisa使用s2p作为板上的抗原测定sars-cov-2 s2p蛋白的滴度，并且其示于下表22中。当s2p为抗原时，这些免疫原中的每一者诱导比当wt s蛋白为elisa抗原时高得多的抗体滴度。比较表21和表22。
[0912]
表22.sars-cov-2 s2p特异性igg滴度-几何平均值
[0913][0914]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0915]
在表23中，免疫原是由lnp中的mrna编码的rbd-tm和ntd-tm的50∶50混合物，并且在一个剂量(第21天)和两个剂量(第36天)后测定对wt s、rbd、ntd和s2p的滴度。这些结果显示，当免疫原是rbd-tm和ntd-tm以50∶50混合的组合时，与相同剂量的个别抗原诱导的抗体滴度相比，滴度显著增加。50∶50混合物诱导对免疫抗原的良好滴度，但令人惊讶的是，对wt s蛋白的滴度甚至更佳并且对s2p蛋白的滴度极高。参见表23。
[0916]
表23.sars-cov-2抗原特异性igg滴度-几何平均值
[0917]
[0918][0919]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0920]
表24显示用rbd-tm和ntd-tm中的每一者作为编码那些抗原的mrna进行免疫的结果。使用由mrna免疫原编码的蛋白质作为elisa板上的抗原，测量每组8只小鼠的几何平均滴度。同样，当抗原作为配制在lnp中的mrna施用时，两种免疫原性组合物都诱导对免疫抗原的高滴度。在这种情形中，两个剂量在所有浓度下都产生优异的抗体反应。然而，以每微克(μg)计，这些抗原的50∶50混合物诱导的抗体反应是单独施用抗原时的约10倍。比较表23和表24。
[0921]
表24.sars-cov-2 rbd和ntd结构域特异性igg滴度-几何平均值
[0922][0923]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0924]
在第1天和第21天，以0.1和1μg剂量将包含与rbd连接并由lnp中的mrna编码的ntd的融合蛋白作为免疫原性组合物施用给8只小鼠的组。参见下表25。甚至编码ntd-rbd-tm的融合蛋白形式的mrna对个别结构域也诱导非常好的滴度，所述滴度高于当单一结构域为免疫抗原时的滴度。对s2p蛋白的滴度是对wt s蛋白的滴度的约8倍。参见表25。
[0925]
表25.sars-cov-2 ntd-rbd-tm结构域特异性igg滴度-几何平均值
[0926][0927]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0928]
中和数据示于表26中。由mrna编码的s1-666-tm是使用s1子结构域的抗原，特别是sars-cov-2刺突蛋白的附接至跨膜结构域的残基1-666。
[0929]
表26.第1天和第22天两次免疫后第36天的平均中和滴度。
[0930][0931][0932]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0933]
实施例4.s1-666-tm的免疫原性
[0934]
将由lnp中的mrna编码的s1-666-tm(或刺突蛋白s的s1残基1-666)在第1天作为初免免疫施用给小鼠，并且在第22天作为加强剂量施用0.01μg和0.1μg(n＝8)组。从第21天(加强前)和第36天(加强后)血清通过elisa测量加强剂量后产生的针对mrna rbd、mrna ntd和mrna野生型(wt)刺突(s)蛋白(图1)中每一者的抗体滴度，并且示于下表27中。
[0935]
表27中显示的用由lnp中的mrna编码的s1-666-tm免疫的小鼠的wt s蛋白滴度指示，在诱导可识别并结合至sars-cov-2 wt s蛋白的抗体方面，两个剂量在所有测试的剂量下都是优异的。令人惊讶的是，即使在s1中未发现2p突变(这是因为2p突变发生在s2中，而免疫原中不存在s2)，当针对刺突蛋白的s2p形式测量时，诱导的滴度也最高。与其他构建体相似，ntd滴度需要第二剂量以变高。
[0936]
表27.sars-cov-2抗原特异性igg滴度-几何平均值
[0937][0938]
n＝8的平均值；仅pbs＝1.1
[0939]
实施例5.rbd-tm、ntd-tm、ntd-rbd-tm和ntd-tm/rbd-tm组合物的50∶50混合物在两个剂量后在第36天的免疫原性
[0940]
在这种重复实验中，在接种第一剂量后第22天，再次向小鼠施用上述实施例中所述相同剂量的mrna疫苗作为加强剂量。然后在接种第一剂量后第36天通过elisa测量sars-cov-2刺突蛋白特异性igg滴度、sars-cov-2 s2p蛋白特异性igg滴度、sars-cov-2 rbd特异性igg滴度和sars-cov-2 ntd特异性igg滴度。
[0941]
结果显示1μg和0.1μg剂量的mrna rbd-tm、mrna ntd-tm、mrna ntd-rbd-tm组合物和含有1μg或0.1μg mrna rbd-tm和mrna ntd-tm组合物中的每一者的50∶50混合物引发针对sars-cov-2刺突或sars-cov-2 s2p蛋白的高elisa滴度。
[0942]
实施例6.免疫原性研究
[0943]
将mrna ntd-tm和mrna rbd-tm的50∶50混合物的免疫原性以下列剂量施用给小鼠：0.2μg或2μg总mrna(0.1μg或1μg每个mrna)(n＝8)。在第1天施用初免剂量，并且在第22天施用加强剂量。在第36天，使用elisa来评价抗体与sars-cov-2稳定化的融合前刺突蛋白(sars-cov-2 pre-s)的结合。将包括mrna ntd-rbd-tm、mrna rbd-tm和mrna ntd-tm的下列疫苗组合物以下列剂量施用给小鼠：0.1μg和0.01μg(n＝8)。测定gmt数据并示于下表28中。
[0944]
表28.s蛋白结构域融合和组合诱导的sars-cov-2刺突滴度
[0945]
[0946][0947]
实施例7.ntd-rbd-tm的igg2a和igg1的比率的测定
[0948]
将ntd-rbd-tm、mrna ntd-rbd-tm的组合物以下列剂量施用给小鼠：0.1μg和1μg。在第1天施用初免剂量，并且在第22天施用加强剂量。在第36天，评价s2p特异性igg1和igg2a的滴度。参见图7a-7c。截至第36天，在两个剂量水平下，igg2a的滴度都高于igg1的量。参见图7a。为了确定t细胞反应是否偏向th1或th2型反应，我们绘制了在第36天时间点的igg2a/igg1的比率。如图7b中所示，ntd-rbd-tm组合物诱导抗体免疫反应，所述抗体免疫反应明确地在th1型反应中。th2型反应在疫苗开发中是不利的，这是因为其与驱动疾病增强有关。
[0949]
实施例8.免疫原性研究
[0950]
将表29中列出的mrna以下列剂量施用给小鼠：0.1μg和1μg(n＝8)。在第1天施用初免剂量，并且在第22天施用加强剂量。第21天和第36天在s2p包被的板上测定血清igg滴度。结果示于表29中。
[0951]
表29.
[0952]
[0953][0954]
额外序列
[0955]
应理解，本文所述的任何mrna序列可包括5
′
utr和/或3
′
utr。所述utr序列可选自以下序列，或者可使用其他已知utr序列。还应理解，本文所述的任何mrna构建体还可包含多聚(a)尾和/或帽(例如，7mg(5
′
)ppp(5
′
)nlmpnp)。此外，尽管本文所述的许多mrna和编码的抗原序列包括信号肽和/或肽标签(例如，c末端his标签)，但应理解，所指示的信号肽和/或肽标签可用不同信号肽和/或肽标签取代，或者可省略信号肽和/或肽标签。
[0956]5′
utr：gggaaauaagagagaaaagaagaguaagaagaaauauaagagccacc(seq id no：131)
[0957]5′
utr：gggaaauaagagagaaaagaagaguaagaagaaauauaagaccccggcgccgccacc(seq id no：2)
[0958]3′
utr：ugauaauaggcuggagccucgguggccaugcuucuugccccuugggccuccccccagccccuccuccccuuccugcacccguacccccguggucuuugaauaaagucugagugggcggc(seq id no：132)
[0959]3′
utr：ugauaauaggcuggagccucgguggccuagcuucuugccccuugggccuccccccagccccuccuccccuuccugcacccguacccccguggucuuugaauaaagucugagugggcggc(seq id no：4)
[0960]
[0961]
[0962]
[0963]
[0964]
[0965][0966]
还应理解，本文所述的开放阅读框和/或相应氨基酸序列中的任一者可包括或排除信号序列。
[0967]
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请都关于其各自所列举的主题通过引用并入，其在一些情形下可涵盖整个文件。
[0968]
除非明确指示相反情形，否则如本文在说明书和在权利要求书中所用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为意指“至少一个/种”。还应理解，除非明确指示相反情形，否则在本文所要求的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定受限于列举所述方法的步骤或动作的顺序。
[0969]
在权利要求书中以及在上文说明书中，所有过渡性短语(例如“包含”、“包括”、“携载”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......构成”等)应理解为是开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册(united states patent office manual of patent examining procedures)第2111.03节所述，仅过渡性短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别为封闭式或半封闭式过渡性短语。
[0970]
数值前的术语“约”和“基本上”意指所列举的数值的
±
10％。
[0971]
在提供值的范围的情况下，本文具体考虑并阐述所述范围的上端和下端之间的每个值。
[0972]
国际申请号pct/us2015/02740、pct/us2016/043348、pct/us2016/043332、pct/us2016/058327、pct/us2016/058324、pct/us2016/058314、pct/us2016/058310、pct/us2016/058321、pct/us2016/058297、pct/us2016/058319和pct/us2016/058314的整个内容通过引用并入本文。