抗非洲猪瘟病毒感染的疫苗的制作方法

本发明涉及减毒的非洲猪瘟病毒。减毒病毒保护猪免受随后的强毒病毒攻击。本发明还涉及这种减毒病毒用于治疗和/或预防非洲猪瘟的用途。本发明还涉及包含特定氨基酸取代的非洲猪瘟病毒的ep402r蛋白，以及编码此类蛋白质的多核苷酸和包含此类蛋白质的非洲猪瘟病毒。

背景技术：

1、非洲猪瘟(asf)

2、非洲猪瘟是由双链dna病毒非洲猪瘟病毒(asfv)引起的毁灭性家猪出血性疾病。asfv是非洲猪瘟病毒科(asfarviridae)的唯一成员，主要在细胞的细胞质中复制。asfv的强毒株可在感染后约5-14天内杀死家猪，死亡率接近100％。

3、asfv可以在疣猪(phacochoerus sp.)、丛林猪(potamocherus sp.)和饨缘蜱属(ornithodoros)的软蜱(其被认为是载体)中感染和复制，但在这些物种中几乎没有观察到任何临床症状(如果有的话)并且几乎不能确定长期的持续感染。asfv是在欧洲定居者将猪带入asfv流行地区后首次描述的，因此是“新发感染”的实例。该病目前在许多撒哈拉以南的国家和欧洲撒丁岛流行。自2007年在跨高加索地区传入格鲁吉亚后，asfv已在包括俄罗斯联邦在内的邻国广泛传播。2012年乌克兰报道首次爆发疫情，2013年白俄罗斯首次爆发疫情。2014年，在乌克兰的猪中报道了进一步的爆发并且在立陶宛和波兰的山猪中也检测到病毒。2018年，asfv传播到中国，此后在中国和许多其他亚洲国家(蒙古、越南、柬埔寨、缅甸、韩国、朝鲜、印度尼西亚、菲律宾、巴布亚新几内亚和东帝汶)广泛传播。

4、目前没有asf的治疗方法。非洲以外的国家已经尝试在国家层面上通过限制进口猪和猪肉产品、在饲喂猪前强制煮沸获得许可的废弃动物产品以及在诊断出疾病时实施屠宰政策等方式进行预防。非洲的预防基于使疣猪和被疣猪污染的材料远离猪群的措施。

5、因此，需要改进措施来控制asfv感染并防止疾病传播。

6、非洲猪瘟病毒(asfv)

7、已经比较了asfv分离株贝宁97/1(来自西非的高致病性病毒，第1组)、分离株ourt88/3(来自葡萄牙的非致病性减毒病毒，第1组)和分离株ba71v(vero细胞组织培养适应非致病性病毒，第1组)的全基因组序列(chapman等人2008j.gen.virol.89:397-408)。还已对基因型ii分离株格鲁吉亚2007/1的全基因组进行了测序(chapman等人2011emerginfect dis 17(4):599-605)。

8、在ourt88/3基因组中，多基因家族(mgf)360 18r(dp148r)基因、ep153r基因和ep402r基因均被移码突变中断。此外，ourt88/3基因组中不存在以下mgf基因：mgf 110 3l、6l、7l、8l、10l、11l和12l，mgf 300 3l，mgf 360 5l、6l、7l、10l、11l、12l、13l、14l、20r、21r和22r，以及mgf 505 1r、2r和6r。mgf 505 3r基因也被截短。

9、还比较了高毒力lisboa60毒株和低毒力nh/p68毒株的序列(portugal等人2015j.gen.virol.96:408-419)。

10、在nh/p68基因组中，mgf 360 18r(dp148r)基因、ep153r基因和ep402r基因均被提前终止密码子中断。此外，nh/p68基因组中不存在以下mgf基因：mgf 110 3l、6l、7l、8l、10l、11l和12l，mgf 360 5l、6l、7l、10l、11l、12l、13l、14l、20r、21r和22r，以及mgf 5051r、2r和6r。mgf 360 9l和mgf 505 3r基因也被截短。

11、还比较了高毒力ba71毒株和低毒力ba71v毒株的序列(rodríguez等人2015plosone 10(11):e0142889)。

12、强毒贝宁97/1分离株中dp148r基因的缺失会降低毒力并诱导对亲本病毒的攻击的保护(reis等人2017 j.virol.91,24:e01428-17)。

13、区分感染和免疫动物(diva)疫苗

14、diva疫苗(也称为标记疫苗)允许区分已经感染野生型病原体的动物与已经用疫苗免疫接种的动物。diva疫苗缺少至少一种存在于野生型病原体中的免疫原性抗原(diva标记物)。感染野生型病原体的动物会产生针对diva标记物的抗体，而接种疫苗的动物则不会。可以使用血清学测定来检测针对diva标记物的抗体。尽管两组动物都具有针对病原体的其他免疫原的抗体，但感染的动物(具有针对diva标记物的抗体)可以与接种疫苗的动物(不具有针对diva标记物的抗体)区分开来。

15、diva标记物应当具有免疫原性，但基因的缺失不应影响疫苗的保护能力。

技术实现思路

0、发明概述

1、通常，本发明涉及减毒的非洲猪瘟病毒，其中基因ep153r和ep402r的表达和/或活性被破坏，而特定mgf基因的表达和/或活性未被破坏。

2、本发明还涉及确定ep153r和ep402r基因的表达和/或活性的破坏与区分感染和免疫动物(differentiation of infected from vaccinated animal，diva)突变组合可以使非洲猪瘟病毒减毒。本发明尤其涉及k145r基因中的diva突变。

3、本发明还涉及确定非洲猪瘟病毒的ep402r蛋白中破坏血细胞吸附的特定氨基酸改变。因此，本发明包括包含此类氨基酸改变的ep402r蛋白、编码此类蛋白的多核苷酸和包含此类ep402r蛋白和多核苷酸的非洲猪瘟病毒。

4、此外，本发明涉及前述的组合，因为ep402r中的氨基酸改变可以与ep153r基因的活性和/或表达的破坏和/或diva突变组合以使非洲猪瘟病毒减毒。

5、本发明的减毒非洲猪瘟病毒特别有益，因为当它们用于疫苗时，它们提供针对野生型非洲猪瘟病毒株感染的保护，如本文实施例中所证明的。

6、在一个方面，本发明提供了减毒的非洲猪瘟(asf)病毒，其中基因ep153r和ep402r的表达和/或活性被破坏；并且该减毒的asf病毒包含一个或多个以下基因的功能形式：

7、多基因家族(mgf)110 3l、6l、7l、8l、10l、11l和12l，

8、mgf 360 5l、6l、7l、10l、11l、12l、13l、14l、20r、21r和22r，以及

9、mgf 505 1r、2r和6r。

10、本发明还提供了减毒的asf病毒，其中基因ep153r和ep402r的表达和/或活性被破坏；

11、并且该减毒的asf病毒包含一个或多个以下基因的功能形式：

12、多基因家族(mgf)110 5l、6l、8l和12l，

13、mgf 360 6l、10l、11l、12l、13l、14l和21r，以及

14、mgf 505 1r和2r。

15、本发明还提供了减毒的asf病毒，其中基因ep153r和ep402r的表达和/或活性被破坏；

16、并且该减毒的asf病毒包含一个或多个以下基因的功能形式：

17、多基因家族(mgf)110 11l和12l，

18、mgf 360 6l、10l、11l、12l、13l和14l，以及

19、mgf 505 1r和2r。

20、在另一方面，本发明提供了减毒的asf病毒，其中基因ep153r和ep402r的表达和/或活性被破坏，并且该减毒的asf病毒包含diva突变。在一些实施方案中，diva突变破坏k145r基因的表达。

21、在另一方面，本发明提供了在配体结合结构域中包含一个或多个氨基酸改变的ep402r蛋白，其中该氨基酸改变破坏ep402r蛋白的配体结合。

22、在另一方面，本发明提供了在对应于格鲁吉亚2007/1 ep402r蛋白(seq idno.24)的q96和/或w99的位置处包含氨基酸改变的ep402r蛋白。

23、本发明还提供了编码本发明的ep402r蛋白的多核苷酸。

24、本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。

25、在另一方面，本发明提供了包含本发明的ep402r蛋白的asf病毒。本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的asf病毒。

26、本发明还提供了用于治疗和/或预防受试者的疾病的本发明的asf病毒，以及本发明的asf病毒在制备用于治疗和/或预防受试者的疾病的药物中的用途。

27、本发明还提供了包含本发明的asf病毒的药物组合物，以及用于治疗和/或预防受试者的疾病的这种药物组合物。

28、本发明还提供了包含本发明的asf病毒的疫苗，以及用于治疗和/或预防受试者的非洲猪瘟的这种疫苗。

29、本发明还提供治疗和/或预防受试者的非洲猪瘟的方法，该方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的药物组合物或根据本发明的疫苗的步骤。

30、在另一方面，本发明提供了产生本发明的asf病毒的方法，该方法包括改变ep402r蛋白的配体结合结构域中的一个或多个氨基酸，其中该氨基酸改变破坏ep402r蛋白的配体结合。

31、在另一方面，本发明提供了产生本发明的asf病毒的方法，该方法包括改变ep402r蛋白中对应于格鲁吉亚2007/1 ep402r蛋白(seq id no.24)的q96和/或w99的位置处的一个或多个氨基酸。

32、在另一方面，本发明提供了降低asf病毒诱导血细胞吸附的能力的方法，该方法包括改变ep402r蛋白的配体结合结构域中的一个或多个氨基酸，其中该氨基酸改变破坏ep402r蛋白的配体结合。

33、在另一方面，本发明提供了降低asf病毒诱导血细胞吸附的能力的方法，该方法包括改变ep402r蛋白中对应于格鲁吉亚2007/1 ep402r蛋白(seq id no.24)的q96和/或w99的位置处的一个或多个氨基酸。

34、在另一方面，本发明提供了使asf病毒减毒的方法，该方法包括破坏ep153r和ep402r基因的表达和/或活性。