通过抑制肠道损伤性细菌毒素TcdA和TcdB预防来自艰难梭菌感染的组织损伤的活性剂的制作方法

通过抑制肠道损伤性细菌毒素tcda和tcdb预防来自艰难梭菌感染的组织损伤的活性剂
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年5月6日提交的美国临时专利申请no.63/020,789和于2020年6月24日提交的美国临时专利申请no.63/043,495的权益，其内容通过引用并入本文。
3.关于联邦政府资助的r&d的声明
4.本要求保护的发明使用政府的资助在由国立卫生研究院(national institute of health)授予的grant no.gm041916下完成。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
5.本文公开了治疗和预防与艰难梭菌(clostridium difficile)感染有关的疾病和病症的新方法。
6.背景
7.艰难梭菌(c.difficile)感染是由人结肠感染艰难梭菌引起的严重疾病。感染主要由以下原因引起：(i)广谱抗生素疗法破坏肠道微生物组；和(ii)不能在患者中产生中和抗毒素抗体。艰难梭菌细菌产生两种主要毒素(即毒素a和毒素b)，其使上皮细胞内的gtp酶葡萄糖基化，并导致发热、腹痛、腹泻和结肠炎症。
8.tcda和tcdb分别为308kda和270kda的共有49％序列同一性的多结构域蛋白毒素。tcda和tcdb通过c-末端受体结合结构域与靶细胞结合，通过网格蛋白介导的胞吞作用触发摄入。内涵体的酸化导致ph依赖性构象改变，导致跨膜孔的形成和随后将n-末端自动加工半胱氨酸蛋白酶结构域(cpd)和葡糖基转移酶结构域(gtd)递送入胞质溶胶中。cpd被胞内肌醇六磷酸以变构方式活化，从而催化gtd释放入胞质溶胶中。在那里，使用udp-葡萄糖作为葡糖基供体，gtd使rho gtp酶糖基化并失活，包括在开关i效应子区域中在thr35处的rac1和cdc42和在thr37处的rhoa。tcd毒素对rho gtp酶的失活导致肌动蛋白解聚，从而导致细胞结构完整性的丧失，并最终通过胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9依赖性途径导致细胞死亡。尽管两种毒素表现出相同的细胞毒性机制，但已经显示tcdb在其诱导细胞变圆和细胞死亡的能力方面比tcda更强效。用于研究艰难梭菌的tcda
+
tcdb-、tcda-tcdb
+
和tcda
+
tcdb
+
菌株的毒力的多项研究表明，tcda
+
tcdb-菌株的毒力低于tcda-tcdb
+
和tcda
+
tcdb
+
菌株。仓鼠模型中的研究表明，tcda
+
tcdb-菌株具有几乎与tcda
+
tcdb
+
和tcda-tcdb
+
菌株一样的毒力。尽管物种敏感性存在差异，但这些研究的总和表明tcda和tcdb均为艰难梭菌发病机理的主要决定因素。
9.与细菌感染有关的疾病的常规治疗集中于使用几种不同的抗生素。这些抗生素包括：(i)万古霉素(1986年fda批准)；(ii)甲硝唑(未经fda批准，但“标签外”使用)；和(iii)非达米星(fda于2011年批准)，即与万古霉素或甲硝唑相比更窄谱的抗生素。近来，有报道表明新的艰难梭菌菌株的出现，其表现出增加的毒素产生和抗生素抗性。治疗细菌感染的替代方法涉及使用抗毒素抗体。使用细菌毒素作为疫苗的主动免疫接种目前处于临床试验中。需要开发治疗或预防细菌相关疾病的新方法。
10.概述
11.本专利文献公开了亚胺糖对由细菌病原体例如艰难梭菌产生的毒力因子的抑制活性。基于该发现的用于治疗与细菌病原体相关的疾病的治疗方法是抗生素方案的有吸引力的选项，因为人类微生物群被保留，同时对宿主组织的损伤被最小化。
12.本文件的一个方面提供了一种治疗患有与艰难梭菌相关的疾病或病症的个体的方法，包括向个体施用治疗有效量的式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐，其包括例如异法戈明、诺欧霉素或其组合。
[0013][0014]
其中
[0015]
r1选自h、直链c
1-6
烷基、被羟基取代的c
2-6
直链烷基、苄基和苯基；
[0016]
r2为oh或h；
[0017]
代表键；并且r2所连接的碳具有r或s立体化学。
[0018]
在一些实施方式中，亚胺糖是异法戈明或其药学上可接受的盐，其中异法戈明或其药学上可接受的盐抑制艰难梭菌毒素干扰ras相关的gtp结合蛋白的活性。在一些实施方案中，gtp结合蛋白选自rho、rac和cdc42。
[0019]
在一些实施方案中，所述活性剂抑制从艰难梭菌释放的毒素的udp-葡萄糖水解和/或gtp-结合蛋白葡糖基转移酶活性。在一些实施方案中，毒素为tcda或tcdb。
[0020]
在一些实施方案中，所述疾病选自肠道炎症、腹泻、异常体重减轻、结肠炎和中毒性巨结肠。在一些实施方案中，所述个体为人。在一些实施方案中，该方法还包含另外向个体施用抗生素。
[0021]
在一些实施方案中，化合物为异法戈明，其可以是酒石酸盐的形式。在一些实施方案中，通过口服施用异法戈明。
[0022]
本文件的另一个方面提供了一种在个体中预防艰难梭菌诱导的疾病或病症的方法，包括向暴露于艰难梭菌的个体施用有效量的式i的亚胺糖，其包括例如异法戈明、诺欧霉素或其组合。在一些实施方案中，个体暴露于艰难梭菌或存在暴露于艰难梭菌的风险中，并且没有经历疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，该方法包括在疾病或病症的任何症状之前向个体施用式i的化合物或其药学上可接受的盐以预防胃肠损伤。
[0023]
在一些实施方案中，艰难梭菌为艰难梭菌的营养形式、艰难梭菌孢子或两者的混合物。
[0024]
在一些实施方案中，化合物为异法戈明或其药学上可接受的盐，其能够抑制从艰难梭菌释放的毒素的udp-葡萄糖水解和/或gtp-结合蛋白葡糖基转移酶活性。在一些实施方案中，所述毒素为tcda或tcdb。在一些实施方案中，所述个体为人。
[0025]
另一个方面提供了一种抑制细菌产生的毒素诱导的udp-葡萄糖水解和/或抑制gtp-结合蛋白质葡萄糖基转移酶活性的方法，包括使所述毒素接触有效量的式i的亚胺糖，其包括例如异法戈明、诺欧霉素或其组合。
[0026]
在一些实施方案中，所述细菌为艰难梭菌。在一些实施方案中，所述毒素为tcda或
tcdb。该方法还包括使细菌与抗生素药物接触。
[0027]
另一个方面提供了用于治疗与由细菌产生的毒素诱导的udp-葡萄糖水解和/或gtp-结合蛋白葡糖基转移酶活性相关的疾病或病症的药盒，包含：
[0028]
(a)治疗有效量的式i的化合物或其药学上可接受的盐，其包括异法戈明、诺欧霉素或其组合；以及
[0029]
(b)使用式i化合物或其药学上可接受的盐治疗疾病或病症的说明书。
[0030]
在一些实施方案中，所述细菌为艰难梭菌。在一些实施方案中，所述毒素为tcda或tcdb。在一些实施方案中，所述药盒还包含抗生素药物。
[0031]
附图简述
[0032]
图1显示异法戈明对tcdb和tcda的抑制，其中葡糖基转移酶与udp的反应处于2x ki值下。
[0033]
图2显示了示例性化合物在抑制试验中的结果。
[0034]
发明详述
[0035]
本专利文件的各种实施方案公开了治疗或预防细菌诱导的疾病的方法。所述方法基于亚胺糖例如异法戈明对从细菌释放的毒素的水解活性的抑制。与常规方法相比，本文公开的方法选择性地靶向与毒素相关的有害事件的特定步骤。因此，可以在对宿主个体中的有益肠道细菌的影响最小的情况下治疗或预防各种疾病。
[0036]
尽管下文可能参考或举例说明了与治疗或预防疾病有关的化合物、药盒或方法的具体实施方案，但并不旨在将化合物、药盒或方法的范围限于这些具体参比物或实例。鉴于实际和经济考虑，本领域技术人员可以进行各种变型，例如化合物的具体盐形式和用于治疗或预防疾病或病症的治疗性化合物的施用量或频率。
[0037]
除非另有说明，否则本文所用的冠词“一”和“一个”是指“一个或多个”或“至少一个”。也就是说，通过不定冠词“一”或“一个”涉及实施方案的任何要素或组分不排除存在多于一个要素或组分的可能性。
[0038]
术语c
1-6
烷基包括具有1、2、3、4、5或6个碳的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、丙基和丁基。
[0039]
术语“药物组合物”是指本文公开的化合物与其他化学成分例如稀释剂或其他载体的混合物。药物组合物有助于将化合物施用于生物体。本领域存在多种施用药物组合物的技术，包括但不限于口服、注射、气雾剂、肠胃外和局部施用。在一些实施方案中，提供了本文公开的化合物的药学上可接受的盐。
[0040]
术语
″
个体
″
包括任何动物，但优选哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、狗、猫、马、牛或啮齿动物。更优选地，所述个体为人。
[0041]
本文通常使用的“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合用于与人和动物的组织、器官和/或体液接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0042]
术语“药学上可接受的载体”是指促进化合物或治疗剂递送或掺入细胞或组织中的化学化合物。
[0043]
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，其是如上定义的药学上可接受的，并且具有期望的药理学活性。这类盐的非限制性实例包括与无机酸形成的酸加成盐，所
述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸；或与有机酸形成的酸加成盐，例如1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4，4
′‑
亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、乙酸、脂族一元羧酸和二元羧酸、脂族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、o-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸和三甲基乙酸。药学上可接受的盐还包括碱加成盐，其可以在酸性质子存在时能够与无机碱或有机碱反应时形成。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱的非限制性实例包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇和n-甲基葡糖胺。应当认识到，形成本发明的任何盐的组成部分的特定阴离子或阳离子并不关键，只要该盐作为整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐及其制备和使用方法的另外的实例呈现于handbook of pharmaceutical salts：properties，and use(p.h.stahl&c.g.wermuth eds.，verlag helvetica chimica acta，2002)中。
[0044]
术语“治疗有效量”或“有效量”是指化合物或组合物有效预防、减轻或改善疾病症状、延长所治疗个体的存活期或达到期望/可接受的医疗或保健状况的量。治疗有效量或有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
[0045]
在一些实施方案中，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”任何疾病或病症是指改善疾病或病症(即，阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在一些实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指改善个体可能无法辨别的至少一种身体参数。在一些实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在身体上(例如，可辨别症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)或两者上调节疾病或病症。在一些实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指延迟疾病或病症的发作，乃至预防疾病或病症的发作。
[0046]
术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指用于预防疾病进展或用于处于发展病症风险中的人的预防目的的预防性治疗。该术语包括在患者开始患有艰难梭菌感染或相关病症(例如但不限于肠或胃肠病症)之前发生的行为，其延迟艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病或症状的发作，和/或抑制或降低艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病或症状的严重程度。
[0047]
本专利文件的方法基于抑制由细菌产生的毒素的水解和/或gtp结合蛋白葡糖基转移酶活性。与通常不区分有害细菌与健康微生物组的常规抗生素治疗不同，本文公开的方法提供了更有针对性的方法来减少或预防由细菌毒素引起的损害。例如，如实施例中所示，异法戈明有效地抑制由艰难梭菌产生的tcda和tcdb的udp-葡萄糖水解和/或gtp结合蛋白葡糖基转移酶活性，并保护细胞在用任一毒素攻击后免于中毒。tcda和tcdb通过使用udp-葡萄糖作为葡糖基供体使rho、rac和cdc细胞骨架稳定gtp酶糖基化和失活而引起细胞毒性。在不存在gtp酶的情况下，毒素催化udp-葡萄糖的缓慢水解。研究表明，毒素的糖基水解酶反应牵涉形成晚期解离的葡糖阳离子样过渡态，其中在异头碳上产生正电荷。不受任何特定理论的束缚，推定式i的亚胺糖可以模拟葡糖阳离子过渡态和针对毒素的抑制活性。
[0048][0049]
r1选自h、苄基、苯基、直链或支链c
1-6
烷基和被羟基取代的c
2-6
直链或支链烷基；
[0050]
r2为oh或h。
[0051]
r1的苄基或苯基芳族环任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自直链或支链c
1-6
烷基、卤素(f、cl、br或i)、cf3、ocf3和n(ra)2，其中ra各自独立地为氢或c
1-6
烷基。
[0052]
在一些实施方案中，r1为在ω位置上被羟基取代的c
2-6
直链(烷基的末端位置远离环氮)。
[0053]
在一些实施方案中，r2为h。在一些实施方案中，r2为oh。在一些实施方案中，r2所连接的碳具有r或s构型。在一些实施方案中，化合物为非对映异构体的混合物(分别在r2所连接的碳上具有r和s构型的异构体混合物。
[0054]
在一些实施方案中，式i的化合物选自在一些实施方案中，式i的化合物选自
[0055]
在一些实施方案中，该化合物为具有(3r，4r，5r)-5-(羟甲基)-3，4-哌啶二醇化学名的异法戈明，其具有如下化学结构：
[0056][0057]
该化合物的合成描述于sierks等人的美国专利号no.5,844,102和lundgren等人的美国专利号no.5,863,903中。异法戈明或诺欧霉素可以与药学上可接受的盐组合，包括例如有机羧酸盐，例如乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、异硫氰酸、乳糖酸和琥珀酸的盐。在一些实施方案中，异法戈明以酒石酸盐的形式使用。酒石酸可以具有不同的立体异构形式；d-或l-酒石酸，或dl-或内消旋酒石酸。术语酒石酸旨在涵盖d和l异构体以及dl混合物和内消旋酒石酸，因此术语异法戈明酒石酸盐旨在包括单-或二-异法戈明-l-酒石酸盐、单-或二-异法戈明-d-酒石酸盐、单-或二-异法戈明-dl-酒石酸盐和/或单-或二-异法戈明-内消旋酒石酸盐。l-酒石酸为(2r，3r)-(+)-酒石酸，其对映异构体富集度为97％或更高，并且d-酒石酸为(2s，3s)-(-)-酒石酸，其对映异构体富集度为97％或更高。dl-酒石酸为d-和l-酒石酸的混合物，其对映体富集度小于97％。
[0058]
治疗方法
[0059]
与“艰难梭菌相关疾病”相关的疾病或病症包括牵涉不希望的生长、毒素产生、与
艰难梭菌细菌一起定殖、细胞毒性、胃肠损伤、胃肠道中的组织病理学变化、肠道炎症、腹泻、异常体重减轻、结肠炎(例如假膜性结肠炎)、中毒性巨结肠、腹痛、发热、食欲不振、细胞毒性巨结肠、艰难梭菌定殖、胃肠损伤、胃肠道中的组织病理学变化、艰难梭菌孢子的排泄物脱落和艰难梭菌相关的死亡率和艰难梭菌在肠中的组织侵入的任何疾病。艰难梭菌相关的疾病或病症是众所周知的，并且具体包括抗生素相关的腹泻(也称作艰难梭菌结肠炎)、假膜性结肠炎和艰难梭菌相关的中毒性巨结肠。艰难梭菌结肠炎通常是指与至少一种艰难梭菌毒素的存在相关的大量、水样腹泻疾病。假膜性结肠炎是指艰难梭菌结肠炎的严重形式，其进一步特征在于血性腹泻、发热和艰难梭菌侵入肠壁。结肠或直肠表面上的“假膜”的出现可以为该病症的诊断。假膜主要由炎性碎片和白细胞组成。艰难梭菌相关疾病或病症还包括在先前患有艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的个体中艰难梭菌感染的复发。
[0060]
艰难梭菌的“菌株”是在独特的情况下从感染的个体获取的艰难梭菌细菌的样品。常规方法可以用于区分不同的艰难梭菌菌株。菌株的非限制性实例包括ki、630、r20291、m7404、vpi10463、cd196、r20291、
‘
ca’、jgs6133、ai35、cd71、vpi10463、sp、cd37、cd84、cd39、m322832、jir8078、m322630、cd63、fw07/06和jir8078。
[0061]
本专利文件的一个方面公开了治疗患有由艰难梭菌诱导或与之相关的疾病或病症的个体的方法。该方法包括向个体施用治疗有效量的式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述化合物为异法戈明、诺欧霉素或其药学上可接受的盐。
[0062]
不同的疾病或病症可由细菌例如艰难梭菌(c.difficile)诱导。包括tcda和tcdb的毒素催化葡糖基化和随后的靶分子的不可逆失活。异法戈明破坏毒素催化的葡糖基化并有助于维持gtp结合蛋白(包括rho、rac和cdc42)的正常功能。更具体地，异法戈明与tcd-udp复合物结合并通过用作葡糖阳离子的模拟物来抑制udp-葡萄糖水解和/或gtp-结合蛋白葡糖基转移酶。
[0063]
可以用本文公开的方法治疗与细菌例如艰难梭菌相关的疾病或病症。非限制性实例包括腹泻、腹痛、痉挛、发热、结肠活检炎症、低白蛋白血症、全身水肿、异常体重减轻、白细胞增多、败血症和/或无症状携带者。在一些实施方案中，所述疾病为肠上皮炎症。在一些实施方案中，所述方法还包括将个体诊断为患有由艰难梭菌毒素诱导的疾病或病症。
[0064]
该方法适用于人或动物。式i的化合物或其药学上可接受的盐可以抑制艰难梭菌干扰选自rho、rac和cdc42的ras相关gtp结合蛋白的活性。所述化合物或其药学上可接受的盐还可以抑制从艰难梭菌释放的毒素的udp-葡萄糖水解活性和/或gtp结合蛋白葡糖基转移酶活性。在一些实施方案中，该方法用于治疗与艰难梭菌相关的入.体疾病。在一些实施方案中，所述毒素为tcda或tcdb。
[0065]
在本领域普通技术人员的指导下，可以采用各种施用方式。在一些实施方案中，将异法戈明或其药学上可接受的盐通过口服施用于个体。
[0066]
在本专利文件的任何方法的一些实施方案中，所述化合物为异法戈明或诺欧霉素。异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐可以配制成合适的形式，包括例如片剂、胶囊、悬浮液或溶液。在一些实施方案中，异法戈明以酒石酸盐的形式使用。
[0067]
在本专利文件的任何方法的一些实施方案中，所述方法还包括依次或同时向个体施用抗生素药物。在一些实施方案中，所述方法不包括施用另外的抗生素药物。
[0068]
在本专利文件的任何方法的一些实施方案中，包括施用尿苷二磷酸葡糖(udp)的
步骤。udp可以在施用式i化合物或其药学上可接受的盐之前、与之同时或之后施用。
[0069]
在本专利文件中还公开了治疗有效量的式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐在治疗由艰难梭菌诱导或与其相关的疾病或病症中的用途。疾病或病症、施用方式、剂型和制剂以及另外的活性剂如上所述。在一些实施方案中，所述化合物为异法戈明、诺欧霉素或其药学上可接受的盐。
[0070]
本专利文件还提供了治疗有效量的式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐，其用于治疗由艰难梭菌诱导或与其相关的疾病或病症。疾病或病症、施用方式、剂型和制剂以及另外的活性剂如上所述。
[0071]
预防方法
[0072]
式i的化合物及其药学上可接受的盐还可以用于在个体中预防与艰难梭菌相关的疾病或病症、由艰难梭菌诱导的疾病的复发或降低复发或再感染的频率。该方法包括向个体施用治疗有效量的式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述个体可能未显示艰难梭菌相关疾病或病症的任何症状，并且施用式i化合物及其药学上可接受的盐可以起到预防作用。当没有观察到艰难梭菌相关疾病或病症的症状时，个体没有被细菌感染或细菌没有对个体引起任何临床上可确定的影响。
[0073]
在一些实施方案中，所述化合物为异法戈明、诺欧霉素或其药学上可接受的盐。待预防的疾病、施用方法和活性成分的合适形式类似于上述方法，并且可以由本领域普通技术人员根据个体的具体状况的不同进行修改。
[0074]
在一些实施方案中，所述方法包括向暴露于艰难梭菌或处于暴露于艰难梭菌风险中的个体施用治疗有效量的式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐。暴露于艰难梭菌或处于暴露于艰难梭菌的风险中的个体可能已被感染或可能未被感染，并且如果被感染，则可能具有或可能不具有艰难梭菌相关疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，当向个体施用式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐时，疾病或病症的发作尚未发生。在一些实施方案中，所述化合物为异法戈明、诺欧霉素或其药学上可接受的盐。艰难梭菌可以是任何形式，包括例如艰难梭菌的营养型形式、艰难梭菌孢子或两者的混合物。如上所述，异法戈明抑制毒素例如tcda和tcdb的udp-葡萄糖水解和/或gtp-结合蛋白葡糖基转移酶活性。在一些实施方案中，所述个体为人。
[0075]
处于艰难梭菌相关疾病或病症的风险中的个体的实例包括处于计划使用抗微生物剂的风险中或正在计划使用抗微生物剂的个体；有戒除处方甲硝唑或万古霉素风险或正在戒除处方甲硝唑或万古霉素的个体；处于计划入住医疗保健设施(例如医院、长期护理设施等)的风险中或正在计划入住医疗保健设施的个体和医疗保健工作者；和/或处于计划用质子泵抑制剂、h2拮抗剂和/或甲氨蝶呤或其组合治疗的风险中或正在进行计划用质子泵抑制剂、h2拮抗剂和/或甲氨蝶呤或其组合治疗的个体；患有或正在经历胃肠疾病如炎性肠病的个体；已经或正在经历胃肠手术或胃肠手术操作的个体；和患有或正在患有艰难梭菌感染和/或cdad复发的个体，例如患有艰难梭菌感染和/或cdad一次或多于一次的患者；约65岁或以上的个体。这样的濒临风险的个体或患者目前可能显示或可能不显示艰难梭菌感染的症状。
[0076]
施用有效量的亚胺糖(例如异法戈明、诺欧霉素)或其药学上可接受的盐可以例如预防腹泻、腹痛、痉挛、发热、结肠活检炎症、低白蛋白血症、全身水肿、白细胞增多、败血症
和/或无症状携带等，降低这些疾病的风险、降低这些疾病的严重程度、减少这些疾病的发生和/或延迟这些疾病的发作。在一些实施方案中，在开始施用异法戈明或诺欧霉素之前确定感染的症状、体征和/或风险因素的存在。
[0077]
在示例性实施方案中，在获得艰难梭菌感染的风险增加之前，施用异法戈明或诺欧霉素、其溶剂化物或药学上可接受的盐至少3、4、5、6或7天。在一些实施方案中，所述化合物在入院或疗养院之前施用。在一些实施方案中，所述化合物在入院或疗养院后施用。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用抗生素药物。
[0078]
在本专利文件中还公开了治疗有效量的式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐在个体中预防与艰难梭菌相关的疾病或病症、与艰难梭菌相关或由艰难梭菌诱导的疾病或病症的复发、或降低复发或再感染的频率中的用途。疾病或病症、施用方式、剂型和制剂以及另外的活性剂如上所述。在一些实施方案中，所述化合物为异法戈明、诺欧霉素或其药学上可接受的盐。
[0079]
本专利文件还提供了治疗有效量的式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐，其用于预防由艰难梭菌诱导或与其相关的疾病或病症。疾病或病症、施用方式、剂型和制剂以及另外的活性剂如上所述。
[0080]
抑制方法
[0081]
本专利文件的另一个方面提供了抑制由细菌产生的毒素诱导的udp-葡萄糖水解和/或gtp-结合蛋白葡糖基转移酶活性的方法。该方法包括使毒素与治疗有效量的式i的化合物或其药学上可接受的盐接触。在一些实施方案中，所述化合物为异法戈明、诺欧霉素或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，接触在体内发生。在一些实施方案中，接触在人或动物中发生。在一些实施方案中，接触在体外条件下进行。在一些实施方案中，所述方法还包括使毒素或细菌与第二活性剂例如抗生素药物接触。
[0082]
在一些实施方案中，udp-葡萄糖水解活性与选自以下的疾病相关：肠道炎症、腹泻、体重减轻、结肠炎、中毒性巨结肠、腹痛、发热、食欲不振、细胞毒性巨结肠、艰难梭菌定植、胃肠道损伤、胃肠道中的组织病理学变化、艰难梭菌孢子的排泄物脱落和艰难梭菌相关死亡率。
[0083]
异法戈明或诺欧霉素可以以任何方式或在任何合适的条件下接触毒素以实现期望的抑制作用。例如，化合物在施用于个体后与tcd(a或b)和udp的复合物结合，因此直接或间接地接触毒素。在体外条件下，异法戈明可以通过与tcd-udp复合物结合而类似地与毒素发生相互作用。
[0084]
在一些实施方案中，所述细菌为艰难梭菌，其产生包括tcda或tcdb的毒素。通过抑制udp-葡萄糖水解活性，可以减少由毒素诱导的细胞凋亡。因此，可以治疗或预防与毒素调节的葡糖基化和随后的靶分子的不可逆失活相关的各种疾病。
[0085]
在本专利文件中还公开了治疗有效量的式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐用于抑制由细菌产生的毒素诱导的udp-葡萄糖水解和/或gtp-结合蛋白葡糖基转移酶活性的用途。毒素、细菌、疾病或病症、施用方式、剂型和制剂以及另外的活性剂如上所述。在一些实施方案中，所述化合物为异法戈明、诺欧霉素或其药学上可接受的盐。
[0086]
本专利文件还提供了治疗有效量的式i的亚胺糖或其药学上可接受的盐，其用于抑制由细菌产生的毒素诱导的udp-葡萄糖水解和/或gtp-结合蛋白葡糖基转移酶活性。毒
素、细菌、疾病或病症、施用方式、剂型和制剂以及另外的活性剂如上所述。在一些实施方案中，所述化合物为异法戈明、诺欧霉素或其药学上可接受的盐。
[0087]
药盒和药物组合物
[0088]
本专利文件的另一个方面提供了药盒，其包括式i化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物和用于治疗或预防与艰难梭菌相关的疾病或抑制毒素调节的葡糖基化的说明书。在一些实施方案中，所述化合物为异法戈明、诺欧霉素或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该药盒还包括抗生素药物。
[0089]
用于上述方法或药盒的式i的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物通常包括一种或多种药学上可接受的载体。载体的非限制性实例包括生理上可接受的表面活性剂、助流剂、增塑剂、稀释剂、赋形剂、舒缓剂、助悬剂、成膜物质和包衣助剂。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料、甜味剂、香料、矫味剂等。例如，可以加入苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸的酯作为防腐剂。此外，可以使用抗氧化剂和助悬剂。在不同的实施方案中，醇、酯、硫酸化脂族醇等可用作表面活性剂。合适的示例性粘合剂包括结晶纤维素、蔗糖、d-甘露糖醇、糊精、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。合适的示例性崩解剂包括淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠等。合适的示例性溶剂或分散介质包括水、醇(例如乙醇)、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇、芝麻油、玉米油等)及其生理上相容的合适混合物。合适的示例性增溶剂包括聚乙二醇、丙二醇、d-甘露糖醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。合适的示例性助悬剂包括表面活性剂，例如硬脂酰三乙醇胺、月桂基硫酸钠、月桂基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯、椰子油、橄榄油、芝麻油、花生油、豆油等；和亲水性聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等。合适的示例性等渗剂包括氯化钠、甘油、d-甘露糖等。合适的示例性缓冲剂包括盐的缓冲溶液，所述盐例如磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐和柠檬酸盐。合适的示例性舒缓剂包括苄醇等。合适的示例性杀菌物质包括对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。合适的示例性抗氧化剂包括亚硫酸盐、抗坏血酸等。合适的示例性密封剂包括但不限于hpmc(或羟丙甲纤维素)、hpc、peg及其组合。合适的示例性润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉、胶体二氧化硅、硬化油等。
[0090]
在用于固体制剂的另外的示例性实施方案中，载体或赋形剂包括稀释剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。在用于液体制剂的示例性实施方案中，载体包括溶剂、增溶剂、助悬剂、等渗制、缓冲剂、舒缓剂等。用于治疗用途或制备药物组合物的一般方法的可接受的另外的载体或稀释剂是制药领域众所周知的，并且描述在例如remington’s pharmaceutical sciences，第18版，mack publishing co.，easton，pa(1990)中，其通过引用整体并入本文。
[0091]
在本文公开的任何方法或药盒中，还可以包括施用另外的抗生素药物。另外的治疗剂以协同或累加方式起作用以增强异法戈明或诺欧霉素在治疗或预防个体中的艰难梭菌感染或由艰难梭菌诱导的疾病中的治疗功效。示例性的另外的治疗剂包括但不限于抗生素、针对艰难梭菌的抗体(例如，抗毒素(tcda或tcdb)或抗内生孢子)等。在一个实例中，另外的治疗剂为抗生素，例如万古霉素或甲硝唑。在另一个实例中，另外的治疗剂为抗体。
[0092]
另外的治疗剂包括用于治疗艰难梭菌的抗生素。这样的抗生素可以与异法戈明或诺欧霉素组合使用。用抗生素治疗艰难梭菌感染依赖于抗生素杀灭艰难梭菌细菌的能力。
目前，至少有三种抗生素常用于临床以治疗艰难梭菌感染；即甲硝唑、非达米星和万古霉素。甲硝唑以商标名销售，并且是轻度至中度艰难梭菌结肠炎首次发作的首选药物。几种随机对照试验已经证明口服甲硝唑和口服万古霉素在治疗艰难梭菌结肠炎方面的等效功效。(参见，例如zar，f.a.等人，“a comparison of vancomycin and metronidazole for the treatment of c.difficile-associated diarrhea”clinical infectious diseases 45(3)：302-307，2007)。非达米星具有商标名“或”(由cubist pharmaceuticals销售)，并且其在口服施用时选择性地根除致病性艰难梭菌，对构成正常、健康的肠道菌群的多种物种的破坏最小。万古霉素具有商品名并且在1954年首次销售，并且可作为通用药物获得。推荐经口腔的万古霉素作为严重艰难梭菌结肠炎的治疗手段。
[0093]
抗-艰难梭菌抗体可以涵盖嵌合和人源化抗体。这些抗体在施用于人体时提供较低的抗原性。嵌合抗体可以通过本领域已知的重组dna技术产生。例如，用限制酶消化编码鼠(或其他物种)单克隆抗体分子的fc恒定区的基因以除去编码鼠fc的区域，并取代编码人fc恒定区的基因的等效部分(参见例如美国专利号no.4,816,567)。嵌合抗体也可以通过重组dna技术产生，其中编码鼠v区的dna可以与编码人恒定区的dna连接。艰难梭菌抗体包括例如(i)结合艰难梭菌毒素a的抗体；(ii)结合艰难梭菌毒素b的抗体；(iii)结合艰难梭菌毒素a和毒素b两者的抗体；(iv)结合艰难梭菌营养型细胞抗原的抗体；和(v)结合艰难梭菌内生孢子抗原的抗体。示例性抗-艰难梭菌毒素a抗体包括例如美国专利号8,236,311和8,986,697、u.s.2013/0230531、wo 2014/144292和wo 2013/028810中公开的那些。示例性抗艰难梭菌毒素b抗体包括例如美国专利号no.8,236,311和8,986,697、u.s.2013/0230531、wo 2014/144292和wo2013/028810中公开的那些。示例性抗-艰难梭菌毒素a和毒素b抗体包括例如美国专利号no.8,236,311、u.s.2013/0230531和wo 2014/144292中公开的那些。示例性抗-艰难梭菌营养型细胞抗原或内生孢子抗体包括例如美国专利号no.8,697,374中公开的那些。
[0094]
施用方案
[0095]
用于本文所述方法或药盒的异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐或其药物组合物可以通过任意合适的方式施用于个体。施用方法的非限制性实例尤其包括(a)通过口服途径施用，所述施用包括以胶囊、片剂、颗粒、喷雾剂、糖浆或其他这类形式施用；(b)通过非口服途径施用，例如直肠、阴道、尿道内、眼内、鼻内或心房内施用，所述施用包括作为水性悬浮液、油性制剂等或作为滴剂、喷雾剂、栓剂、药膏、软膏等施用；(c)通过注射、皮下、腹膜内、静脉内、肌内、皮内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内等施用，包括输注泵递送；以及(d)局部施用；如本领域技术人员认为适合于使活性化合物与活组织接触。
[0096]
有利地，将用于上述施用的异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐的药物组合物制备成适于配合活性成分剂量的单位剂量的剂型。单位剂量的这类剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。
[0097]
在用于口服施用的异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐的药物组合物的示例性实施方案中，所述组合物可以为片剂、包衣片、胶囊、胶囊形片剂、扁囊剂、锭剂、凝胶
胶囊、硬明胶胶囊、软明胶胶囊、含片、糖锭剂、分散体、粉末、颗粒、丸剂、液体、水性或非水性液体悬浮液、液体包油型或水包油型乳液，包括本领域已知的缓释制剂。对于儿科和老年应用，悬浮液、糖浆和咀嚼片是特别合适的。
[0098]
作为剂量所需的异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐的治疗有效量将取决于施用途径、所治疗的个体(包括人)的类型和所考虑的特定个体的身体特征。可以定制剂量以实现期望的效果，但将取决于例如体重、膳食、同时用药这样的因素和医学领域技术人员将认识到的其他因素。更具体地，治疗有效量是指有效预防、减轻或改善疾病症状或延长所治疗的个体的存活期的化合物的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
[0099]
在非人的动物研究中，潜在产品的应用以较高的剂量水平开始，减少剂量直至不再达到期望的效果，不良副作用消失。剂量可以在宽范围内变化，这取决于期望的效果和治疗适应征。典型地，剂量可以在约10微克/kg-约100mg/kg体重，优选约100微克/kg-约10mg/kg体重。或者，如本领域技术人员所理解的，剂量可以基于患者的表面积并基于患者的表面积计算。
[0100]
药物组合物的确切制剂、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的状况来选择(参见，例如fingl等人1975，“the pharmacological basis of therapeutics”，其全部内容通过引用并入本文，具体参考第1章，第1页)。在一些实施方案中，施用于个体或患者的异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐的剂量范围可以约为0.5-约1000mg/kg患者体重。根据患者的需要，剂量可以是在一天或多天的过程中给予的单一剂量或一系列的两个或多个剂量。在已经针对至少一些病症确定化合物的人体剂量的情况下，可以使用那些相同的剂量，或为所确定的人体剂量的约0.1％-约500％，更优选约25％-约250％的剂量。
[0101]
应当注意，主治医师可以知晓如何以及何时由于毒性或器官功能障碍而终止、中断或调整施用。相反，如果临床反应不充分(排除毒性)，则主治医师也会知晓可以将治疗调整至更高水平。在关注的病症的管理中施用剂量的大小将随待治疗的病症的严重程度和施用途径的不同而变化。病症的严重程度可以例如部分地通过标准预后评估方法来评估。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和反应的不同而改变。可以在兽医学中使用与上面讨论的相当的程序。
[0102]
尽管精确的剂量将在逐个药物的基础上确定，但在大多数情况下，可以进行关于剂量的一些概括。成人患者的日剂量方案可以是例如约0.1mg-2000mg活性成分的口服剂量，优选约1mg-约500mg，例如5mg-200mg。在其他实施方案中，使用约0.01mg-约100mg，优选约0.1mg-约60mg，例如约1-约40mg的活性成分的静脉内、皮下或肌内剂量。在施用药学上可接受的盐的情况下，剂量可以以游离酸计算。在一些实施方案中，将所述组合物每天施用1至4次。或者异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐可以通过连续静脉内输注施用，优选以每天至多约1000mg的剂量施用。正如本领域技术人员可以理解的，在某些情况下，可能需要以超过乃至远超过上述优选剂量范围的量施用本文的异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐，以便有效地和积极地治疗特定的侵袭性疾病或感染。在一些实施方案中，将式i的化合物或其药学上可接受的盐(例如异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐)施用连续治疗的时间期限，例如一周或以上，或数月或数年。
[0103]
在一些实施方案中，将式i的化合物或其药学上可接受的盐配制成在施用后释放
1-12小时，典型地3-12小时，更典型地6-12小时期限的剂型。在一些实施方案中，本文所述的口服药物组合物可以以单剂量或分剂量施用，每天一至四次。口服剂型可以便利地以单位剂型存在，并通过制药领域众所周知的任何方法制备。
[0104]
可以使用已知方法评价式i的化合物或其药学上可接受的盐的功效和毒性。例如，化合物的毒理学可以通过测定对细胞系(例如哺乳动物细胞系，优选人细胞系)的体外毒性来建立。这类研究的结果通常预测动物(例如哺乳动物，或更具体地为人)中的毒性。或者，可以使用已知方法测定动物模型(例如小鼠、大鼠、家兔或猴子)中的毒性。特定化合物的功效可以使用几种公认的方法确定，例如体外方法、动物模型或人体临床试验。对于几乎每一类病症都存在公认的体外模型。类似地，可接受的动物模型可以用于确定化学物质治疗这类病症的功效。当选择模型来确定功效时，本领域技术人员可以在现有技术的指导下选择适当的模型、剂量和施用途径以及方案。当然，人体临床试验也可以用于测定异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐在人体中的功效。
[0105]
如果期望，则式i的化合物或其药学上可接受的盐可以存在于包装或分配器装置中，所述包装或分配器装置可以包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有施用说明书。包装或分配器还可以附有与容器相关的由管理药物的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通告，该通告反映了该机构批准用于人或兽医施用的药物形式。例如，这种通告可以是美国食品和药物监督管理局(u.s.food and drug administration)批准的处方药标签，或批准的产品插页。还可以制备包含在相容的药物载体中配制的异法戈明或诺欧霉素或其药学上可接受的盐的组合物，将其置于合适的容器中，并标记用于治疗指定的病症。
[0106]
式i化合物的合成
[0107]
式i化合物的合成可以容易地由异法戈明或诺欧霉素或其立体异构体完成。如图1所示，通过还原氨基化反应，含有nh的前体与合适的醛反应，得到式i。r
1a
与r1短一个碳，且还原后的醛碳成为与n的连接碳。用于该转化的示例性试剂为nabh3cn的meoh溶液。可以改变具体的反应条件和试剂的量而无需过度实验。根据前体的反应性和性质的不同，可以使用保护基团来防止副反应发生。用于官能团的还原氨基化和保护的另外的实例包括bioorg.med.chem.，2001，9，733-744；angew.chem.int.ed.，2005，44，7450-7453；j.med.chem.2007，50，94-100中的那些。
[0108]
图示1
[0109][0110]
本文引用的所有参考文献均全文引入本文作为参考。
实施例
[0111]
实施例1
[0112]
基于积累的kie证据，即tcdb的两种过渡态都是葡糖阳离子样的，分析了作为葡糖阳离子化学模拟物的几种亚胺糖阳离子(图2)。这些包括葡萄糖羟基的几何特征和通过杂
环阳离子氮提出的糖基化特征，如下所示。完全展开的糖基化在cl处是平面的(sp2)，其中在cl与环氧(o5)之间共享缺电子。葡糖酸内酯在cl处共享sp2几何结构，但在阳离子处不共享sp2几何结构，并且是不良抑制剂。其他亚胺糖具有与葡萄糖类似的羟基构型，但环氧或cl被亚氨基取代以在环氧或异头碳位置处赋予潜在的阳离子。异法戈明是tcd的最佳抑制剂，在对于udp存在2x ki的情况下，对于tcdb的动力学ki为290nm，对于tcda的动力学ki为15nm(图1)。这一结果和异法戈明与udp之间的非竞争性模式证实了抑制剂仅与tcd-udp复合物结合，如从化学考量中所预期的。异法戈明的化学稳定性由其c2-脱氧赋予。在pka值为8.4的情况下，在生理ph值下存在分数阳离子。脱氧野尻霉素的对比不良抑制支持cl处的阳离子电荷的重要性，cl是tcdb过渡态中电荷发展的位置。异法戈明结合支持与3、4和6-羟基以及n1阳离子的催化位点的相互作用。对于tcdb-udp，诺欧霉素ki＝4μm，但对于tcda-udp，诺欧霉素ki＝0.2μm，这证明了tcd同工酶的阳离子和羟基相互作用的明显差异。
[0113]
图示2
[0114][0115]
亚胺糖抑制的机制：异法戈明相对于udp-葡萄糖是非竞争性的，表明与tcdb-udp产物复合物的特异性相互作用。当udp以2x ki存在时，异法戈明的亲和力增加3倍，得到tcdb的290nm的表观ki值和tcda的更严格的15nm的表观ki值(初步结果)。tcdb的itc滴定显示单独的异法戈明没有结合，并且在过量udp存在下kd＝133nm。tcda-udp-异法戈明的新数据预测异法戈明的kd为7nm。
[0116]
这在药物功效范围内，并且使得tcd靶标的紧密结合抑制剂的前景高度可行。该结果对过渡态类似物的设计具有影响。在最优化的情况下，连接在靶酶的催化位点处结合的两个片段产生解离常数的乘积，条件是两者都可以发生最佳比对。对于tcda中的udp-异法戈明对，解离常数的乘积为[11.5μm x 7nm＝81fm]。对于tcdb，解离常数的乘积为[11.5μm x 133nm＝1.5pm]。只有当两个片段的最佳相互作用维持在催化位点时，才能达到抑制性片段强度的乘积。通过结构分析最佳地探索片段比对和最佳催化位点相互作用。
[0117]
tcdb-抑制剂复合物的结构分析：tcdb的催化结构域目前已经使用坐滴蒸汽扩散
法(22℃)与udp、异法戈明和诺欧霉素共结晶。良好质量的晶体在波长下从1.8至分辨率(lrl-cat光束线，argonne，il)衍射。使用phaser和tcdb的链-a(来自pdb id：5uqm)作为初始定相模型，通过分子置换来解析结构。抑制剂和udp在完全占据的情况下符合其电子密度。将结合的udp+异法戈明的几何结构与结合的udp-2f-葡萄糖的结构进行比较，udp-2f-葡萄糖是先前对tcdb报道的的化学稳定类似物(5uqm)。异法戈明和2-f-葡萄糖紧密重叠。异法戈明的阳离子n1与udp的β-磷酰基氧形成离子对，将其置于与共价连接的2-f-葡萄糖相同的位置并具有相同的糖环皱褶。结构研究支持udp和异法戈明片段均处于接近最佳结合的几何结构的提议。诺欧霉素占据与异法戈明相同的位置。
[0118]
用cho-k1细胞进行细胞变圆研究以测试异法戈明是否可以防止tcdb诱导的细胞变圆和细胞死亡。简言之，将50,000个cho-k1细胞接种在24-孔板中，并将100μm异法戈明与细胞一起温育60分钟。将100pm全长tcdb加入细胞中并温育24小时。通过光学显微镜检查观察细胞变圆。当用100pm tcdb处理时，100μm异法戈明足以保护cho-k1细胞免于变圆。
[0119]
实施例2
[0120]
等温滴定量热实验
[0121]
所有itc实验均使用microcal peaq-itc(malvern instruments)进行。实验在25℃下在含有280μl反应混合物(50mm hepes ph 7.5，100mm kcl，4mm mgcl2，1mm mncl2)和40μm tcdb-gtd的池中进行。在2μl的6s的19次注射中将配体滴定到蛋白质溶液中，注射之间的平衡期为150s。对于涉及udp和异法戈明和诺欧霉素的结合测定，在滴定异法戈明或诺欧霉素之前，将40μm tcdb-gtd与1mm udp一起在上述缓冲液中在样品池中温育30min。将所得数据拟合至一个不同结合位点的模型。从数据拟合中排除每个样品的第一次注射。滴定经过酶饱和点以校正稀释热。测试化合物的结果如图2中所示。
[0122]
在udp存在下异法戈明的结合-通过itc定量
[0123]
kd＝66.9
±
19.7nm
[0124]
δh＝-10.3
±
0.1kcal/mol
[0125]
δg＝-9.8
±
0.3kcal/mol
[0126]-tδs＝.5
±
0.2kcal/mol
[0127]
n＝0.5
±
0.01
[0128]
在udp存在下诺欧霉素的结合-通过itc定量
[0129]
kd＝179.7
±
69.7nm
[0130]
δh＝-5.2
±
0.1kcal/mol
[0131]
δg＝-9.3
±
0.3kcal/mol
[0132]-tδs＝4.2
±
0.3kcal/mol
[0133]
n＝1.2
±
0.1
[0134]
实施例3
[0135]
异法戈明和诺欧霉素防止tcda-和tcdb-诱导的细胞毒性
[0136]
测试了异法戈明和诺欧霉素预防tcda和tcdb诱导毒性的能力。细胞变圆是哺乳动物细胞中tcda和tcdb毒性的标志，并且可以通过光学显微镜检查可视化。以100μm测试异法戈明和诺欧霉素，并显示其防止由全毒素tcdb(0.1nm)或tcda(0.5nm)诱导的cho-k1细胞变
圆。用imr90和ht-29细胞观察到类似的结果。如文献中所述，通过rac1葡糖基化的蛋白质印迹分析来确定异法戈明和诺欧霉素针对tcd毒素防护的作用机制。rac1葡糖基化使用抗-rac1抗体(mab102)，其区分未糖基化与糖基化的rac1。用不同浓度的异法戈明或诺欧霉素(12.5μm-100μm)和tcda(1nm)或tcdb(0.1nm)处理imr90细胞。与总rac1水平(抗-rac123a8)相比，使用递增浓度的异法戈明或诺欧霉素处理imr90细胞导致未糖基化rac1(mab102)的剂量依赖性维持。因此，两种亚胺糖通过抑制tcda和tcdb gt活性来防止毒素诱导的细胞变圆。最终，基于文献中所述的方案，我们测量了在tcda和异法戈明或诺欧霉素存在下细胞凋亡的诱导。膜联蛋白v与磷脂酰丝氨酸结合，所述磷脂酰丝氨酸在早期凋亡期间暴露于细胞膜的外侧。将ht-29细胞与异法戈明或诺欧霉素(250μm或500μm)一起温育，并在处理后24hr通过流式细胞术分析膜联蛋白v信号。tcda诱导细胞凋亡，而添加任一亚胺糖阻止细胞凋亡(图4c和s11)。因此，异法戈明和诺欧霉素通过抑制tcd gt活性来防止培养的哺乳动物细胞的tcd诱导的细胞变圆，并防止ht-29细胞中的凋亡性细胞死亡。因此，异法戈明和诺欧霉素是保护cdi中免受tcda和tcdb细胞毒性的有吸引力的候选物。
[0137]
不同的方法和动物模型可以用于研究本文公开的化合物的作用。例如，fems microbiol.lett 352(2014)140-149；am j physiol gastrointest liver physiol 312：g623-g627，2017；us10046030和us10144775中公开的方法适用于动物模型中的研究。这些参考文献的全部公开内容通过引用并入本文作为参考。
[0138]
tcd抑制剂动物毒性和pk：通过口服管饲法或i.p.施用给予小鼠递增浓度的测试药物(3-300mg/kg)，用于在5天的时间期限内进行初步毒性筛选。在给药后观察小鼠的不良反应，包括嗜睡、食欲不振、运动性丧失、缺乏梳理或呼吸困难。在施用测试化合物后采集血样(5μl，尾部)。这些提供了用于药物口服利用度的样品(i.p.与口服比较)。
[0139]
口服可利用的化合物的安全剂量(1/4和1/8观察到的毒性)通过口服管饲法给予2组3只小鼠(6只小鼠)。采集血样(5μl，尾部)以通过ms分析pk。对于潜在的抗毒素，试验进行5天和28天，仅在前4天采集血样。在试验结束时，将动物实施安乐死，并通过标准组织学方法检查其组织以确定抗毒素的任何有害作用。在第4天收集尿液和粪便允许分析抗毒素排泄途径和代谢。
[0140]
tcd抑制剂对艰难梭菌感染的防护。用口服抗生素预处理小鼠以破坏肠道微生物组4天，清除抗生素一天，并且感染108艰难梭菌630(atcc，仅表达tcd毒素)。不处理感染24hr。对照感染组保持未处理。两个治疗组通过i.p.或口服施用给予高(1x和2x)但安全剂量的药物，每天一次。对每只小鼠每天采集一次血样以在适当的情况下跟踪药物和/或寄生虫水平。5天后，停止治疗并将动物与对照进行比较以确定感染或感染症状是否减轻。2-3周后，对所有动物实施安乐死。将血液和组织病理学样品与残留感染的对照进行比较。根据批准的动物方案对由于感染而濒临死亡的小鼠实施安乐死。
[0141]
tcd过渡态类似物肠持久性：开发过渡态类似物的驱动原理在于它们在生物系统中的强大持久性，例如在人体中单次口服剂量的dadme-immh所示例的。针对tcd的类似效果可以通过小剂量预防性抑制剂防止因艰难梭菌感染的发病率。注意，对于70kg的人，0.5mg/kg有效剂量小于单次50mg剂量，并且在多天内有效。本文测试了小鼠中的药物持久性。
[0142]
以6hr间隔处死用可变单一剂量的过渡态类似物处理的小鼠(每剂量n＝3)。冲洗小肠和大肠，分割，在液n2中冷冻，用甲醇提取并通过ms分析过渡态类似物含量。将稳定同
位素标记的抑制剂的内部质量标准物加入到提取组织样品中。使用内标的质谱分析确立了抑制剂的细胞保留和/或细胞代谢的速率。
[0143]
哺乳动物葡糖基转移酶的脱靶分析：人几乎不表达o-葡糖基转移酶，这支持tcd葡糖基转移酶作为聚焦靶标。一个例外是notch信号传导途径，其中特异性丝氨酸的o-葡糖基化对于notch功能的调节是关键。此外，udp-葡萄糖的过渡态类似物可以干扰蛋白质糖基化或碳水化合物代谢的其他步骤。除了细胞毒性研究之外，通过凝胶电泳分析用递增浓度的tcdb过渡态类似物处理的培养细胞的糖蛋白模式，然后进行糖蛋白分析。
[0144]
本领域技术人员将理解，本文描述的本发明不限于已经具体示出和描述的内容。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。还应当理解，以上描述仅代表实施方案的示例性实施例。该描述并不试图详尽地列举所有可能的变型。备选实施方案可能未针对组合物的特定成分或方法的步骤呈现，并且可能由所述要素的不同组合产生，或者其他未描述的替代实施方案可用于组合物、药盒或方法，不应被认为是对那些替代实施方案的放弃。应当理解，这些未描述的实施方案中的许多在所附权利要求的字面范围内，并且其他实施方案是等效的。