治疗或预防感染的方法
发明领域
1.本发明大体上涉及的领域是动物的免疫保护，并且更具体地，涉及通过使用包含梭菌目(clostridiales)的生物体的细胞的组合物来治疗或预防感染诸如病毒感染、原生动物感染或真菌感染的方法。
2.发明背景
3.文献资料中出现了许多描述使用益生菌作为动物的肠接种物的科学基础的文献。自从metchnikoff在19世纪首先建立对益生菌的理解(如我们对它所知的)的工作以来，许多研究已经表明微生物抑制病原体生长、提高饲料转化率或刺激免疫系统的能力。
4.一般认为，在低抗病性时间段诸如应激期间，不期望的微生物能够在包括人类的动物的胃肠道(gi道)中增殖。保持正常、健康的微生物平衡被认为是至关重要的，特别是在这样的应激时间段期间。因此，使用益生菌的基本概念是，如果(i)在应激和/或疾病时，(ii)在出生时，或(iii)在抗生素治疗后，将足够数量的适当微生物引入肠道中，则可以最小化或克服微生物失衡(生态失调)的负面后果。使用这样的活的、天然存在的微生物的制剂有助于在应激、疾病期间和抗生素治疗后恢复和维持gi道中有益微生物的适当平衡。
5.目前作为益生菌施用的主要细菌是诸如乳酸菌属(lactobacillus)、肠球菌属(enterococcus)和双歧杆菌属(bifidobacterium)的属。
6.发明概述
7.根据本发明的一些实施方案的方面，提供了一种治疗或预防有相应需要的受试者的感染的方法，该方法包括向受试者施用组合物，该组合物包含梭菌目(order clostridiales)的菌株的至少一种生物体。
8.根据本发明的一些实施方案的方面，提供了一种用于治疗或预防感染的组合物，该组合物包含梭菌目的菌株的至少一种生物体。
9.发明详述
10.本发明涉及通过使用包含梭菌目的生物体的细胞的组合物来治疗感染诸如病毒感染、原生动物感染或真菌感染的方法。
11.本发明人令人惊讶地发现，施用包含梭菌目的生物体的至少一种菌株的细胞的组合物可用于治疗病毒感染或其症状。
12.不希望受任何一种理论束缚，本发明人假设施用至动物的梭菌目微生物定殖于动物的消化系统，包括消化道、盲肠、回肠、十二指肠、空肠。在定殖后，微生物开始产生短链脂肪酸(scfa)，诸如丁酸、丙酸、戊酸和乙酸，所述短链脂肪酸(scfa)被动物的上皮细胞吸收，作为那些细胞的能量来源。
13.由于上皮细胞构成动物的先天免疫系统的一部分，其提供了动物对病原体诸如病原细菌、原生动物、真菌和病毒的广谱第一道防线，因此向上皮细胞提供能量来源并因此间接激活这样的细胞的组合物可以潜在地用于刺激先天免疫应答，诸如对病毒、原生动物或真菌的先天免疫应答。
14.此外，上皮细胞负责黏蛋白层的产生、抗微生物蛋白的分泌、腔抗原向树突状细胞
的转运，树突状细胞充当先天免疫系统和适应性免疫系统之间的信使。通过对腔空间取样，那些细胞可以向适应性免疫应答呈递诸如病毒颗粒的外来抗原，有助于增加对病毒(诸如sars-cov-2)的适应性应答。
15.本文所示的细节仅以示例的方式并且仅用于本发明的各种实施方案的说明性讨论的目的，并且为了提供被认为是本发明的原理和概念方面的最有用和容易理解的描述是什么而呈现。在这一点上，除了试图示出对本发明的基本理解所需的内容之外，不试图更详细地示出本发明的细节，本说明书使得本发明的若干种形式如何可以在实践中实施对于本领域技术人员来说是明显的。
16.现在将通过参考更详细的实施方案来描述本发明。然而，本发明可以以不同的形式体现，并且不应该被解释为限于本文阐述的实施方案。更确切地说，提供这些实施方案以使得本公开内容将是透彻的并且完整的，并且将向本领域技术人员充分地传达本发明的范围。
17.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文的本发明的说明书中使用的术语仅用于描述特定的实施方案，而不意图限制本发明。如在本发明的描述和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”也意图包括复数形式，除非上下文明确地另有指示。
18.除非另有指示，否则本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。因此，除非相反地指出，在以下说明书和所附权利要求书中所列出的数值参数是可以取决于试图通过本发明获得的期望性质而变化的近似值。至少且不试图限制将等效原则应用于权利要求书的范围，每个数值参数应当根据有效数字的数目和常规凑整方法来解释。
19.尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中列出的数值是尽可能精确地报告的。然而，任何数值固有地含有一定误差，其必然是由它们各自的测试测量中发现的标准差造成的。在整个本说明书中，给出的每个数值范围将包括落在此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文被全部清楚地写出。
20.本发明的另外的优点将部分地在以下说明书中阐述，并且部分地从说明书中将是明显的，或者可以通过实践本发明而得知。应该理解，上文的一般描述和下文的详细描述仅是示例性的和说明性的，而不是限制如所要求保护的本发明。
21.如本文使用的，术语“免疫保护”意图意指保护免于抗原的有害作用。向受试者提供免疫保护的组合物可以在暴露于抗原之前、之后或大体上同时施用。
22.如本文使用的，术语“治疗”包括预防、治愈、改善、缓解和减轻状况或其症状的情况或严重程度。
23.如本文使用的，术语“施用”包括任何施用模式，诸如口服、皮下、舌下、经黏膜、肠胃外、静脉内、动脉内、含服、舌下、表面(topical)、阴道、直肠、眼、耳、鼻、吸入、肌内、骨内、鞘内和透皮或其组合。“施用”还可以包括提供不同的化合物，当如上文摄入或递送时，该化合物必然转化为期望施用的化合物，这种类型的“不同化合物”通常被称为“前药”。“施用”还可以包括为包含特定化合物的剂型开处方或填处方。“施用”还可以包括提供实施涉及特定化合物或者包含一种或更多种化合物的剂型的方法的指导。
24.如本文使用的，关于动物的消化道的术语“定殖”意图意指每1g至少10^2cfu的细
菌繁殖于消化道。
25.如本文使用的，术语“调节免疫系统”意图意指按需要刺激或抑制免疫系统的活性，以改善动物的健康，诸如通过增加针对病原体的免疫活性来改善。
26.如本文使用的，术语“对ph的耐受性”是指暴露于该条件持续2小时时间，至少1％的细胞存活。
27.如本文使用的，关于细胞的术语“对胆盐的耐受性”是指当暴露于包含至少0.2wt％胆盐、至少1wt％胆盐或甚至至少2wt％胆盐的溶液持续24小时时间，至少10％的细胞存活。
28.根据本发明的实施方案的方面，提供了一种治疗或预防有相应需要的受试者的感染的方法，该方法包括向受试者施用组合物，该组合物包含梭菌目的菌株的至少一种生物体。
29.根据本发明的一些实施方案的方面，提供了一种用于治疗或预防感染的组合物，该组合物包含梭菌目的菌株的至少一种生物体。
30.根据实施方案，感染选自由病毒感染、原生动物感染和真菌感染组成的组。
31.根据实施方案，感染是病毒感染。
32.根据实施方案，病毒感染是由来自冠状病毒科的病毒引起的。
33.根据实施方案，所述病毒感染是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)引起的。
34.根据实施方案，所述组合物包含来自梭菌目的每种菌株或至少两种菌株的至少一种生物体。在一些这样的实施方案中，所述组合物包含来自梭菌目的两种不同菌株、至少三种不同菌株、至少四种不同菌株或甚至至少五种不同菌株的至少一种生物体。
35.根据实施方案，所述至少一种生物体具有至少一种选自由以下组成的组的性质：丁酸代谢，专性厌氧生长，经由还原性乙酰辅酶a途径的气体固定，对浓度大于0.05％、大于0.1％、大于0.2％或大于0.4％的胆盐的耐受性，对小于5.5、小于4.5、小于3.5或小于2.5的ph的耐受性以及自聚集。
36.根据实施方案，所述生物体包括选自由以下组成的组的科的成员：caldicoprobacteraceae；christensenellaceae；梭菌科(clostridiaceae)；defluviitaleaceae；真杆菌科(eubacteriaceae)；gracilibacteraceae；太阳杆菌科(heliobacteriaceae)；毛螺菌科(lachnospiraceae)；颤螺菌科(oscillospiraceae)；消化球菌科(peptococcaceae)；消化链球菌科(peptostreptococcaceae)；瘤胃菌科(ruminococcaceae)；互营单胞菌科(syntrophomonadaceae)及其组合。
37.根据实施方案，所述真杆菌科包括eubacterium aggregans。
38.根据实施方案，所述生物体包括选自由以下组成的组的属的成员：醋酸杆菌属(acetobacterium)、厌氧醋菌属(acetoanaerobium)、布劳特氏菌属(blautia)、丁酸杆菌属(butyribacterium)、梭菌属(clostridium)、脱亚硫酸菌属(desulfitobacterium)、脱硫肠状菌属(desulgotomaculum)、真杆菌属(eubacterium)、亨盖特梭菌属(hungateiclostridium)、lachnoclostridium、穆尔氏菌属(moorella)、产醋杆菌属(oxobacter)、paraclostridium、peptoclostridium、pseudoclostridium、瘤胃梭菌属(ruminiclostridium)、sporomua、terrisporobacter、栖热厌氧杆菌属
(thermoanaerobacter)、热厌氧杆菌属(thermoanaerobacterium)、thermoclostridium及其组合。
39.根据实施方案，所述生物体选自由以下组成的组：伍氏醋酸杆菌(acetobacterium woodii)、blautia producta、甲基营养丁酸杆菌(butyribacterium methylotrophicum)、丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)、自产乙醇梭菌(clostridium autoethanogenum)、拜氏梭菌(clostridium beijerinckii)、丁酸梭菌(clostridium butyricum)、食一氧化碳梭菌(clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌(clostridium drakei)、扬氏梭菌(clostridium ljungdahlii)、克氏梭菌(clostridium kluyveri)、巴氏梭菌(clostridium pasteurianum)、糖丁基梭菌(clostridium saccharobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(clostridium saccharoperbutylacetonicum)、粪味梭菌(clostridium scatologenes)、酪丁酸梭菌(clostridium tyrobutyricum)、eubacterium aggregans、粘液真杆菌(eubacterium limosum)、eubacterium callendari、霍氏真杆菌(eubacterium hallii)、eubacterium maltosivorans、paraclostridium bifermentans、普氏产醋杆菌(oxobacter pfennigii)、白蚁鼠孢菌(sporomusa termitida)、terrisporobacter glycolicus及其组合。
40.根据实施方案，所述组合物包含每毫升至少104菌落形成单位(cfu)所述生物体，诸如每毫升至少104、至少105、至少106、至少107或甚至至少108cfu所述生物体，诸如每毫升至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或高达10
10
cfu所述生物体。
41.根据实施方案，所述组合物还包含载体。根据实施方案，所述载体选自由盐的水溶液和/或糖的水溶液组成的组。根据实施方案，糖选自由甘露醇、乳糖、纤维素、葡萄糖、蔗糖、淀粉、直链淀粉、果糖和低聚果糖(fos)组成的组。根据实施方案，盐选自由nacl、cacl2、mgcl2和三(羟甲基)氨基甲烷组成的组。根据实施方案，盐的浓度在溶液的0.05％至0.5％的范围内。根据实施方案，糖的浓度在溶液的2％至10％的范围内。根据实施方案，载体选自由抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体、有机酸、乙二醇、聚乙二醇、植物油、油酸乙酯组成的组。根据实施方案，载体是磷酸盐缓冲溶液或甘油溶液。
42.根据实施方案，所述组合物还包含还原剂。根据实施方案，所述还原剂选自由半胱氨酸盐酸盐、硫化钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠及其组合组成的组。
43.根据实施方案，通过将所述生物体与所述载体混合以产生混合物并调节所述混合物以提供厌氧条件来制备所述组合物。根据实施方案，调节所述混合物包括添加至少一种氧清除剂/还原剂，诸如选自由半胱氨酸盐酸盐、硫化钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠及其组合组成的组中的一种。
44.根据实施方案，通过进一步使所述混合物冷却来制备所述组合物。根据实施方案，使所述混合物冷却包括使所述混合物通过冷水或冷气体诸如氮气。
45.根据实施方案，所述组合物中的氧浓度在约1微摩尔/升至约3000毫摩尔/升的范围内。在一些实施方案中，氧浓度小于100微摩尔/升、小于50微摩尔/升、小于10微摩尔/升或甚至小于1微摩尔/升。
46.根据实施方案，所述组合物包含所述生物体的活培养物。
47.根据实施方案，所述组合物包含所述生物体的形成孢子的培养物。
48.根据实施方案，所述组合物还包含选自由水、营养物、益生元、益生菌及其组合组
成的组中的至少一种。
49.根据实施方案，所述组合物还包含选自由调味剂和着色剂组成的组中的至少一种。
50.根据实施方案，所述组合物还包含选自由以下组成的组中的至少一种的细胞：解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)；bacillus toyonensis；凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)；地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)；巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)；bacillus mesentricus；多粘芽孢杆菌(bacillus polymyxa)；枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)；两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidium)；双叉双歧杆菌(bifidobacterium bifidus)；嗜热双歧杆菌(bifidobacterium thermophilus)；长双歧杆菌(bifidobacterium longum)；假长双歧杆菌(bifidobacterium pseudolongum)；乳酸双歧杆菌(bifidobacterium lactis)；丁酸梭菌(clostridium butyricum)；屎肠球菌(enterococcus faecium)；粪肠球菌(enterococcus faecalis)；大肠杆菌(eschericia coli)；嗜热乳杆菌(lactobacillus thermophilus)；嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)；短乳杆菌(lactobacillus brevis)；保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)；干酪乳杆菌(lactobacillus casei)；德氏乳杆菌(lactobacillus delbrueckii)；乳杆菌亚种；保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)；lactobacillus farciminis；发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)；鸡乳杆菌(lactobacillus gallinarum)；詹氏乳杆菌(lactobacillus jensenii)；副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)；植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)；罗氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)；鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)；乳酸乳杆菌(lactobacillus lactis)；唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)；lactobacillus sobrius；埃氏巨球型菌(megasphaera elsdenii)；乳酸片球菌(pediococcus acidolactici)；谢氏丙酸杆菌(propionibacterium shermanii)；费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)；产丙酸丙酸杆菌(propionibacterium acidipropionici)；詹氏丙酸杆菌(propionibacterium jensenii)；布拉酵母(saccharomyces boulardii)；酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)；saccharomyces servisia；粪链球菌(streptococcus faecalis)；屎链球菌(streptococcus faecium)；解没食子酸链球菌(streptococcus gallolyticus)；唾液链球菌(streptococcus salivarius)；链球菌亚种；嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)；牛链球菌(streptococcus bovis)及其组合。
51.根据实施方案，所述组合物包含生物体的混合物。
52.根据实施方案，所述生物体的混合物包括示出互养行为的生物体的互养混合物。
53.根据实施方案，所述互养行为对所述动物的有益的。
54.根据实施方案，所述生物体的混合物包含至少一种利用co2的生物体。
55.根据实施方案，所述利用co2的生物体是产乙酸菌。
56.根据实施方案，所述产乙酸菌选自由以下组成的组：聚乙酸菌属(acetitomaculum)；厌氧醋菌属；醋酸杆菌属；醋盐杆菌属(acetohalobium)；acetoneme；芽孢杆菌属(bacillus)；布劳特氏菌属；bryantella；丁酸杆菌属；喜热菌属(caloramator)；梭菌属；脱硫弧菌属(desulfovibrio)；肠球菌属(entrococcus)；真杆菌属；gottschalkia；
holophage；甲基杆菌属(methylobacterium)；微球菌属(micrococcus)；穆尔氏菌属；分枝杆菌属(mycobacterium)；natronielle；natronincola；产醋杆菌属；嗜胨菌属(peptoniphilus)；变形杆菌属(proteus)；reticulitermes；根瘤菌属(rhizobium)；瘤胃球菌属(ruminococcus)；酵母菌属(saccharomyces)；中华根瘤菌属(sinorhizobium)；鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)；鼠孢菌属(sporomusa)；互养球菌属(syntrophococcus)；thermoacetogenium；tindallia；密螺旋体属(treponema)；韦荣球菌属(veillonella)及其组合。
57.根据实施方案，所述生物体的混合物包含至少一种不利用co2的生物体。
58.根据实施方案，所述生物体的混合物包含至少一种形成乙酸的生物体和至少一种利用乙酸的生物体。
59.根据实施方案，所述生物体的混合物包含至少一种形成乳酸的生物体和至少一种利用乳酸的生物体。
60.根据实施方案，所述动物选自由禽类、人类、猫、狗、猪、牛组成的组。
61.根据实施方案，所述动物是禽类。
62.根据其中所述动物是禽类的实施方案，所述施用包括将所述组合物施加到包含所述禽类作为胚胎的卵的外表面。
63.根据其中所述动物是禽类的实施方案，所述施加包括喷雾。根据一种这样的实施方案，所述喷雾包括静电喷雾。
64.根据其中所述动物是禽类并且所述卵具有窄端(narrow end)和钝端(blunt end)的实施方案，所述施加包括施加到所述卵的所述窄端。根据一种这样的实施方案，在所述卵的所述窄端上每单位面积施加的所述组合物的量大于在所述卵的所述钝端上每单位面积施加的组合物的量。
65.根据一些这样的实施方案，在卵的窄端上每单位面积施加的所述组合物的量大于约10％、大于至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或甚至至少80％。
66.根据其中所述动物是禽类的实施方案，所述组合物中所述生物体的浓度、所述组合物的温度和所述组合物的空气含量各自被调节以提供每cm3蛋壳至少102菌落形成单位所述生物体，诸如所述卵内每cm3蛋壳至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或甚至至少10
10
cfu的所述生物体。
67.根据其中所述动物是禽类的实施方案，所述施加进行至少两次，诸如两次、三次、四次或甚至五次。
68.根据其中所述动物是禽类的实施方案，所述施加导致在孵化后第二天每克所述禽类的湿粪便至少10生物体菌落形成单位，诸如在孵化后第二天每克所述禽类的湿粪便至少10、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或甚至至少10
10
cfu。
69.根据其中所述动物是禽类的实施方案，所述施加导致在孵化后第二十天每克所述禽类的湿粪便至少102菌落形成单位，诸如在孵化后第二十天每克所述禽类的湿粪便至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或甚至至少10
10
cfu。
70.根据实施方案，所述禽类选自由肉鸡、母鸡、火鸡、鸭和家禽(fowls)组成的组。
71.根据其中所述动物是禽类的实施方案，所述施用包括将所述组合物卵内注射(in ovo injection)到包含所述禽类作为胚胎的卵中。
72.根据其中所述动物是禽类的实施方案，所述施用包括在孵化的2天内向所述禽类口服提供所述组合物。
73.根据其中所述动物是禽类的实施方案，所述口服提供所述组合物包括将所述组合物添加到提供给所述禽类的食物或饮料中。
74.根据其中所述动物是人类的实施方案，所述施用包括口服施用。根据一些这样的实施方案，口服施用所述组合物包括将所述组合物添加到提供给所述人类的食物或饮料中。根据一些这样的实施方案，所述生物体以10cfu至108cfu，诸如至少10cfu、至少102cfu、至少103cfu、至少104cfu、至少105cfu、至少106cfu、至少107cfu或高达108cfu的浓度存在于所述组合物中。
75.根据一些实施方案，所述组合物每天至少施用一次(诸如每天一次、两次、三次、四次或多于四次)或每周施用至少一次(诸如每周一次、两次、三次、四次、五次、六次或七次)。
76.根据实施方案，在施用如本文公开的组合物后，动物的消化道被所述生物体定殖。根据实施方案，所述定殖包括定殖十二指肠、空肠、回肠、小肠、盲肠和结肠中的至少一个。
77.根据本发明的一个方面，提供了用于制备如本文公开的组合物的方法，该方法包括厌氧发酵、诱导孢子形成和分离形成的细胞。根据实施方案，用于诱导孢子形成的方法包括在小于5％、小于3％或小于1％的磷酸盐浓度培养。根据实施方案，诱导孢子形成包括在小于1mm、小于0.1mm或小于0.01mm的氮浓度培养。根据实施方案，诱导孢子形成包括在大于37℃、大于55℃或大于75℃的温度培养。根据实施方案，诱导孢子形成包括在小于37℃、小于25℃或小于10℃的温度培养。根据实施方案，诱导孢子形成包括在包含至少100mm溶剂、至少10mm溶剂或至少1mm溶剂的介质中减少或预防呼吸问题、减少或预防球虫感染。根据实施方案，用于诱导孢子形成的方法包括在小于10mm、小于1mm或小于0.1mm的碳浓度培养。根据实施方案，用于诱导孢子形成的方法包括在小于6.0、小于5.0或小于4.0的ph培养。根据实施方案，用于诱导孢子形成的方法包括在大于8.0、大于9.0或大于10.0的ph培养。
78.根据实施方案，分离细胞包括絮凝、离心和通过大规模流式细胞术分离中的至少一种，以从孢子中分离营养细胞。
79.根据实施方案，所述受试者是卵内禽类，其中所述方法导致孵化率增加，诸如增加孵化蛋的百分比和/或增加按时孵化的蛋的数量，其中按时孵化率被认为是在产卵后第21天孵化。
实施例
80.产乙酸菌在污染条件下提高孵化率的卵内应用
81.在污染条件下卵内喂养分娩(iof)对孵化率的效果使用液体组合物来确定，所述液体组合物包含以下5种不同梭菌物种(cl-a1)在101(测试组i)或103(测试组ii)的cfu浓度的混合物：甲基营养丁酸杆菌；eubacterium aggregans；blautia producta；食一氧化碳梭菌；和扬氏梭菌。
82.每个测试组由87枚受精卵组成。
83.在产卵后第17天将组合物注射到卵的羊膜中。
84.100μl的盐水(9％)作为对照用于83枚受精卵的对照组。
85.在最佳孵育条件下，所有卵在单个孵化器中维持直到产卵后21天。
86.结果呈现在下文表1中。
87.如表所示，在对照的情况下获得了87％的孵化率，而每种cl-a1组合物获得了统计上显著的孵化率增加(测试组i和测试组ii分别为94％和96.4％)。此外，对照组中11％的卵孵化较晚(即，在从产卵开始的第21天之后)，而测试组i和测试组ii的所有卵都按时孵化。
88.不希望受任何一种理论束缚，本发明人假设增加的孵化率被认为是由于与未接受cl-a1处理的蛋相比，在污染条件下卵的感染率降低。
[0089] ％孵化率(按时)％孵化率(稍晚)％孵化率(总数)测试组i94.0％0％94.0％测试组ii96.4％0％96.4％对照组76.0％11％87％
[0090]
表1。