1.本发明涉及海洋生物技术领域，特别涉及海蒿子多酚在制备美白化妆品中的应用及其制备方法。
背景技术：
2.海藻生活在特殊生态环境下，普遍含有具有特殊功能的生物活性物质如酚类、吲哚类、萜类等化合物，是海洋天然药物的重要来源。海藻多酚是从海藻中提取出来的多酚类化合物总称，褐藻多酚是从褐藻中提取出的一类酚类化合物，其结构单元为间苯三酚，一般认为寡聚的间苯三酚可以进行进一步的聚合，形成更高分子量的单宁，由于褐藻多酚分子量大，结构复杂，易氧化，不易纯化，红外、紫外及核磁共振等结构解析手段尚未获得十分明确的结构信息。
3.海藻多酚的研究与应用需要以多酚的提取分离技术为基础，因此，海藻多酚的有效提取分离工艺以及分析方法是多酚研究中不可缺少的环节。海藻多酚一般生产方法是以海藻为原料，采用溶剂提取法，如甲醇提取、乙醇提取以及水提取等，具有时间长、温度高、提取率低、提取物纯度低等缺点，不利于工业化生产。为进一步提升多酚提取率，一些物理辅助提取方法也被广泛应用于海藻多酚提取过程中，如高压辅助提取、微波辅助提取、超声波辅助提取、酶法辅助提取以及超临界二氧化碳萃取等。考虑到海蒿子中较高的糖浓度以及丰富的其他组成成分(如色素、蛋白质、脂肪酸等)，在制备的过程中，这些组分可能会混入海蒿子多酚中，进而影响提取多酚的质量。因此需要联合其他的技术进一步提纯超声波辅助乙醇提取的海蒿子多酚。
4.作为海藻中的主要活性物质且具有多种生物活性，海藻多酚正逐渐被研究与探索。已有研究报道了海藻多酚具有抗氧化、降血糖、抗癌、抗凝血、抗炎、酶(血管紧张素转换酶、基质金属蛋白酶、乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、透明质酸酶)抑制等活性。在研究中，大多数生物活性研究都是针对非人类进行的，包括在体外与体内的动物模型，但由于酶催化中心不同以及生物体的复杂性，海藻多酚作为药物使用的适用性与安全性还有待进一步研究。
技术实现要素：
5.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种新的海洋植物提取物，并采用分离材料进一步纯化，该提取物可以用于制备美白化妆品。
6.为了实现本发明目的，具体采用如下技术手段：
7.海蒿子多酚在制备美白化妆品中的应用。
8.海蒿子多酚在制备对酪氨酸酶的抑制作用的化妆品中的应用。
9.前述所述的海蒿子多酚的制备方法，所述的海蒿子多酚通过如下方法制备：
10.(1)新鲜的海蒿子洗净、冻干、粉碎、过筛，得海蒿子粉末；
11.(2)准确海蒿子粉末，按照料液比1∶15～60(w/v)加入体积浓度为30％～80％的乙
醇水溶液，充分混匀浸泡；
12.(3)超声提取海蒿子多酚，提取温度40～80℃，提取时间为20～200min，提取后抽滤，收集滤液；
13.(4)重复步骤(3)提取1～3次，合并滤液；
14.(5)将滤液30～60℃蒸发浓缩，得到海蒿子多酚粗提物；
15.(6)用大孔树脂或聚酰胺对粗提物初步纯化，得到海蒿子多酚粗品；
16.(7)用葡聚糖凝胶对海蒿子多酚粗品进一步纯化；
17.(8)真空冷冻干燥，得到海蒿子总多酚。
18.优选的，所述步骤(2)的料液比优选为1∶25～45，进一步优选为1∶31～1∶40。乙醇浓度优选为40％～60％，进一步优选为45％～55％。
19.优选的，所述步骤(3)的提取温度优选为50～70℃，进一步优选为60～70℃。超声时间优选为为20～100min，进一步优选为20～53min。
20.优选的，所述步骤(5)的浓缩温度优选为40～50℃。
21.优选的，所述步骤(6)初步纯化海蒿子多酚粗提物选用的大孔树脂型号优选为ls-305a、ab-8、xda-7、bs-45、nka-9、ads-17、ads-21、hpd100、da201、xad16n，进一步优选为ls-305a、da201、xad16n；聚酰胺树脂型号优选为尼龙-6和尼龙-66，进一步优选为尼龙-6。
22.优选的，所述步骤(7)进一步纯化多酚样品的葡聚糖凝胶型号优选为g-100、g-75、g-25、g15、lh-20，进一步优选为lh-20。
23.有益效果
24.1、本发明在超声波辅助作用下，采用乙醇水溶液提取多酚，经过抽滤、旋蒸浓缩得到海蒿子多酚粗提液，并经过纯化，最后冷冻干燥得到高纯度的多酚产品。
25.2、该方法生产所采用的提取时间短、操作简单、步骤较少、损失少、生产成本较低。
26.3、采用gb/t8313-2008《福林酚试剂比色法》测定多酚含量，用没食子酸作为标准物质，建立标准曲线，通过标准曲线来换算样品中的海蒿子多酚含量，计算更为准确；
27.4、真空冷冻干燥，既能保持海蒿子多酚产品在干燥过程中的质量稳定性，又能有效的去除残存的有机溶剂的味道，干燥除味效果好；
28.5、对比只用大孔树脂纯化海蒿子多酚粗提物，经两步纯化得到的海蒿子多酚纯度更高。
29.6、提取纯化得到的海蒿子多酚具有较强的酪氨酸酶抑制活性，且纯度高、提取率好、多酚活性保持良好，适合大规模工业化生产。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.海蒿子多酚制备实验如下：
32.实施例1
33.(1)新鲜的海蒿子冷冻干燥40小时，将其剪碎。然后将其放入粉碎机中并通过60目筛得到海蒿子粉末；
34.(2)准确称取一定量的海蒿子粉末，按照料液比1∶40(w/v)加入体积浓度为45％的乙醇水溶液，充分混匀浸泡；
35.(3)用数控超声波清洗器进行多酚的提取，超声功率为100w、超声频率为40khz，提取时间为40min，提取温度60℃，抽滤，滤渣在相同条件下再次提取，抽滤；
36.(4)将两次提取得到的滤液合并，在旋转蒸发仪上40～50℃蒸发浓缩，得到海蒿子多酚提取液。
37.(5)以没食子酸为标准品，采用gb/t8313-2008《福林酚试剂比色法》测定多酚含量为：5.5mg/g干海藻。
38.(6)用聚酰胺树脂(尼龙-6)对海蒿子多酚粗提取液进行初步纯化，以1.0bv/h流速进行上样，静置吸附1h，用1个柱体积的去离子水洗除杂质，用2.5个柱体积的50％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，40～45℃真空旋蒸浓缩，冻干得海蒿子多酚初纯品粉末。
39.(7)取经聚酰胺树脂纯化后的海蒿子总多酚，精密称定，用少量水超声溶解，离心，上清液上样于葡聚糖凝胶lh-20层析柱，分别以水、50％乙醇、无水乙醇洗脱，各组分洗脱液经旋蒸、冻干得海蒿子多酚精制粉末，测得50％乙醇组分海蒿子总多酚纯度最高，为54.5％。
40.实施例2
41.(1)新鲜的海蒿子冷冻干燥40小时，将其剪碎。然后将其放入粉碎机中并通过60目筛得到海蒿子粉末；
42.(2)准确称取一定量的海蒿子粉末，按照料液比1∶35(w/v)加入体积浓度为45％的乙醇水溶液，充分混匀浸泡；
43.(3)用数控超声波清洗器进行多酚的提取，超声功率为100w、超声频率为40khz，提取时间为40min，提取温度65℃，抽滤，滤渣在相同条件下再次提取，抽滤；
44.(4)将两次提取得到的滤液合并，在旋转蒸发仪上40～50℃蒸发浓缩，得到海蒿子多酚提取液。
45.(5)以没食子酸为标准品，采用gb/t8313-2008《福林酚试剂比色法》测定多酚含量为：6.0mg/g干海藻。
46.(6)用大孔树脂ls-305a对海蒿子多酚粗提取液进行初步纯化，以1.0bv/h流速进行上样，静置吸附1h，用1个柱体积的去离子水洗除杂质，用2.5个柱体积的50％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，40～45℃真空旋蒸浓缩，冻干得海蒿子多酚初纯品粉末。
47.(7)取经大孔树脂纯化后的海蒿子总多酚，精密称定，用少量水超声溶解，离心，上清液上样于葡聚糖凝胶lh-20层析柱，分别以水、50％乙醇、无水乙醇洗脱，各组分洗脱液经旋蒸、冻干得海蒿子多酚精制粉末，测得50％乙醇组分海蒿子总多酚纯度最高，为66.5％。
48.实施实例3
49.(1)新鲜的海蒿子冷冻干燥40小时，将其剪碎。然后将其放入粉碎机中并通过60目筛得到海蒿子粉末；
50.(2)准确称取一定量的海蒿子粉末，按照料液比1∶35(w/v)加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，充分混匀浸泡；
51.(3)用数控超声波清洗器进行多酚的提取，超声功率为500w、超声频率为40khz，提取时间为40min，提取温度65℃，抽滤，滤渣在相同条件下再次提取，抽滤；
52.(4)将两次提取得到的滤液合并，在旋转蒸发仪上40～50℃蒸发浓缩，得到海蒿子多酚提取液。
53.(5)以没食子酸为标准品，采用gb/t8313-2008《福林酚试剂比色法》测定多酚含量为：6.5mg/g干海藻。
54.(6)用大孔树脂da-201对海蒿子多酚粗提取液进行初步纯化，以1.0bv/h流速进行上样，静置吸附1h，用1个柱体积的去离子水洗除杂质，用2.5个柱体积的50％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，40～45℃真空旋蒸浓缩，冻干得海蒿子多酚初纯品粉末。
55.(7)取经大孔树脂纯化后的海蒿子总多酚，精密称定，用少量水超声溶解，离心，上清液上样于葡聚糖凝胶lh-20层析柱，分别以水、50％乙醇、无水乙醇洗脱，各组分洗脱液经旋蒸、冻干得海蒿子多酚精制粉末，测得50％乙醇组分海蒿子总多酚纯度最高，为56.5％。
56.实施实例4
57.(1)新鲜的海蒿子冷冻干燥40小时，将其剪碎。然后将其放入粉碎机中并通过60目筛得到海蒿子粉末；
58.(2)准确称取一定量的海蒿子粉末，按照料液比1∶35(w/v)加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，充分混匀浸泡；
59.(3)用数控超声波清洗器进行多酚的提取，超声功率为500w、超声频率为40khz，提取时间为40min，提取温度65℃，抽滤，滤渣在相同条件下再次提取，抽滤；
60.(4)将两次提取得到的滤液合并，在旋转蒸发仪上40～50℃蒸发浓缩，得到海蒿子多酚提取液。
61.(5)以没食子酸为标准品，采用gb/t8313-2008《福林酚试剂比色法》测定多酚含量为：7.5mggae/g干海藻。
62.(6)用大孔树脂ls-305a对海蒿子多酚粗提取液进行初步纯化，以1.0bv/h流速进行上样，静置吸附1h，用1个柱体积的去离子水洗除杂质，用2.5个柱体积的50％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，40～45℃真空旋蒸浓缩，冻干得海蒿子多酚初纯品粉末。
63.(7)取经大孔树脂纯化后的海蒿子总多酚，精密称定，用少量水超声溶解，离心，上清液上样于葡聚糖凝胶lh-20层析柱，分别以水、50％乙醇、无水乙醇洗脱，各组分洗脱液经旋蒸、冻干得海蒿子多酚精制粉末，测得50％乙醇组分海蒿子总多酚纯度最高，为70.5％。
64.对比例1
65.(1)新鲜的海蒿子冷冻干燥40小时，将其剪碎。然后将其放入粉碎机中并通过60目筛得到海蒿子粉末；
66.(2)准确称取一定量的海蒿子粉末，按照料液比1∶35(w/v)加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，充分混匀浸泡；
67.(3)用数控超声波清洗器进行多酚的提取，超声功率为100w、超声频率为40khz，提取时间为40min，提取温度60℃；
68.(4)重复提取2次，合并上清液；
69.(5)将上清液在旋转蒸发仪上40～50℃蒸发浓缩，得到海蒿子多酚提取液。
70.(6)采用gb/t8313-2008《福林酚试剂比色法》测定多酚含量为：7.57mg/g干海藻。
71.(7)用ls-305a大孔树脂动态吸附进行纯化，操作步骤为0.5mg/ml海蒿子多酚提取液50ml上样流速0.5bv/h，上样结束后静置1小时，分别用1bv水、1bv 5％乙醇除杂，用2.5bv 50％乙醇洗脱。将洗脱液真空冷冻干燥，得到海蒿子多酚提取物，总多酚纯度为20.4％。与实施例4多酚纯度相比显著降低。
72.实施例5
73.实施例4提取得到的海蒿子多酚提取物对酪氨酸酶的抑制作用实验：
74.采用多巴染色法测定被试样对酪氨酸酶活性的影响。
75.取60ul ph为6.8的磷酸缓冲液和20ul活度50u/ml的酪氨酸酶溶液，加入40ul不同质量浓度的海蒿子多酚，混匀静置8min后加40ul 0.01mol/l的l-多巴溶液，反应2min后在475nm波长处测量体系的吸光度值。以磷酸缓冲溶液为空白对照，曲酸作为阳性对照。实验平行3次。测定不同浓度样液对酪氨酸酶抑制活性的影响，计算抑制率，采用graphpad prism 8软件以抑制率对浓度作图并进行回归方程拟合，分别求出海蒿子多酚和曲酸的半数抑制质量浓度(ic
50
)。
76.抑制率(％)＝[[(a
1-a2)-(a
3-a4)]/(a
1-a2)]
×
100
[0077]
式中：a1为有酪氨酸酶但不含海蒿子多酚组吸光度；a2为不含酪氨酸酶和海蒿子多酚组吸光度；a3为含有酪氨酸酶和海蒿子多酚组吸光度；a4为有海蒿子多酚但不含酪氨酸酶组吸光度。
[0078]
实验结果：
[0079]
表2海蒿子提取物和曲酸对酪氨酸酶活性的影响
[0080][0081]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。