作为疫苗抗原的工程化冠状病毒刺突蛋白、其设计和用途的制作方法

作为疫苗抗原的工程化冠状病毒刺突蛋白、其设计和用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年5月12日提交的临时申请号63/023,599的优先权并且是所述临时申请的非临时申请，所述临时申请全部以引用方式并入本文。
技术领域
3.本公开内容涉及用于开发冠状病毒疫苗的疫苗平台，并且更具体地涉及含有工程化冠状病毒刺突蛋白的疫苗。在另一个实施方式中，本公开内容涉及用于对冠状病毒刺突蛋白进行工程化的方法和用于制备含有工程化冠状病毒刺突蛋白的疫苗的方法。
4.序列表的提交
5.文本文件序列表的电子提交内容以引用方式整体并入本文，所述文本文件序列表名为“sequence_listing”，创建于2021年5月11日，大小为54kb。


背景技术：

6.冠状病毒(cov)分为四个属：α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒。β-cov是有包膜的正链rna病毒，它能够感染哺乳动物，通常是蝙蝠和啮齿动物，尽管已知许多β-cov也会感染人类。人和动物感染cov通常会导致短期内轻度至中度的上呼吸道疾病。特征在于严重且通常致命的症状的严重急性呼吸系统综合症(sars-1)、中东呼吸综合症(mers)和sars-cov-2(sars-2)(也称为covid-19)除外。2019年12月发现第一例sars-2感染病例。根据疾病控制中心(cdc)的报告，截至2020年4月16日，仅在美国就报告了632,000例病例且估计有31,000人死亡，致死率为4.9％。sars-2对人具有高传染性。世界卫生组织(who)于2020年1月30日宣布sars-2全球大流行为全球卫生紧急事件。
7.目前尚无针对sars-2的特定治疗，但正在研究中。预防疾病进一步传播的最佳方法是开发特定疫苗。通过用良性疫苗进行免疫而不是通过自然感染活性sars-2病毒来更好地实现针对sars-2的群体免疫。康复患者出现低水平免疫反应的一种解释可能是sars-2的详尽免疫抑制功能。然而，对使用灭活病毒形式的传统疫苗进行的动物研究表明，灭活病毒疫苗可能特别容易诱发疾病的抗体依赖性增强(ade)。对于这些疫苗接种，th2型疾病增强可能是由抗核衣壳(np)反应引起的。希望开发不会刺激疫苗接受者的ade的sars-2疫苗。
8.尽管保持社交距离已成功抑制了sars-2的激进式传播，但预期社会的重新开放将导致感染人数在短期内激增，并可能出现季节性事件。一些地区的sars-2病毒突变版本的感染人数已经激增。sars相关性β-cov(sarsr)的总体突变率已计算为低至每代0.1个突变。尽管最近出现了突变，但sars-2病毒似乎同样稳定。希望任何sars-2疫苗也能提供针对短期变异的预防。
9.使用相关sars和mers-cov的大量动物和临床试验表明，可以生产针对更普遍的β-cov感染的有效疫苗。sars-2(covid-19)是第三种从动物宿主传播到人的致命性β-cov。考虑到已经在动物身上发现1,800种sarsr，其中一些可能最终感染人类，因此还希望开发针对特定人群的sarsr疫苗来避免未来的大流行。
10.还有其他因素支持对广泛反应性疫苗的需求，以提供针对sars-2变体和sarsr病毒株的预防。分析sarsr动物序列表明，s蛋白受体结合结构域(rbd)序列的微小变化增强了病毒与人ace2的结合，并且因此此类变化可能促进β-cov传播到人群中。rbd序列位于s蛋白的高度可变区。也已知病毒也会突变。随着数十亿人感染sars-2，预期会有许多突变。诱导针对s蛋白的更保守区域的免疫反应的疫苗将提供更广泛的针对不同sarsr的感染的预防。


技术实现要素：

11.在一个实施方式中，本公开内容提供了一种用于预防cov感染的疫苗。根据本公开内容的实施方式，用于预防cov感染的疫苗包含选自由以下组成的组的至少一个序列：编码cov的修饰s蛋白的至少一部分的cov dna序列、编码cov的修饰s蛋白的至少一部分的cov rna序列以及cov的修饰s蛋白的至少一部分的蛋白质序列，其中修饰s蛋白含有至少一个修饰。
12.在一个实施方式中，所述s蛋白具有s1区，并且所述至少一个修饰选自由以下组成的组：s1区的完全缺失、s1区的部分缺失、s1区的完全置换和s1区的部分置换。在另一个实施方式中，s1区具有至少一个可变区，并且至少一个修饰选自由以下组成的组：至少一个可变区的完全缺失、至少一个可变区的部分缺失、至少一个可变区的完全置换以及至少一个可变区的部分置换。在又另外的实施方式中，cov是sars-2β-cov并且至少一个可变区在氨基酸残基342和533之间。在另一个实施方式中，至少一个可变区包括受体结合结构域(rbd)。在一个实施方式中，至少一个修饰是可变区的部分置换或可变区的完全置换，其中可变区被肽接头置换。
13.在一个实施方式中，cov是α-cov。在另一个实施方式中，cov是β-cov。在另一个实施方式中，序列是cov dna序列或β-cov dna序列。在另一个实施方式中，序列是cov rna序列或β-cov rna序列。在一个实施方式中，rna是mrna。在又另一个实施方式中，序列是cov蛋白序列或β-cov蛋白序列。在另一个实施方式中，序列是sars-2β-cov序列。
14.在一个实施方式中，本公开内容提供了一种修饰的cov s蛋白。根据本公开内容的实施方式，修饰的cov s蛋白包含s1区和所述s1区中的选自由以下组成的组的至少一个修饰：s1区的部分缺失、s1区的完全缺失、s1区的部分置换以及s1区的完全置换。
15.在一个实施方式中，s1区具有至少一个可变区，并且至少一个修饰选自由以下组成的组：至少一个可变区的完全缺失、至少一个可变区的部分缺失、至少一个可变区的完全置换以及至少一个可变区的部分置换。在另一个实施方式中，cov是sars-2β-cov并且至少一个可变区在氨基酸残基342和533之间。在又另一个实施方式中，至少一个可变区包含受体结合结构域(rbd)。在另一个实施方式中，至少一个修饰是可变区的部分置换或可变区的完全置换，其中可变区被肽接头置换。
16.在一个实施方式中，本公开内容提供了一种制备疫苗以预防被至少一种cov感染的方法。根据本公开内容的实施方式，制备疫苗以预防被至少一种cov感染的方法包括产生包含s1区和所述s1区中的至少一个修饰的修饰s蛋白，其中至少一个修饰选自由以下组成的组：s1区的部分缺失、s1区的完全缺失、s1区的部分置换和s1区的完全置换。
17.在一个实施方式中，本公开内容提供了一种为哺乳动物受试者接种疫苗以预防至少一组cov的感染的方法。根据本公开内容的实施方式，为哺乳动物受试者接种疫苗以预防
至少一组cov的感染的方法包括基于cov s蛋白的相似性将广泛的一组cov分成同源组；产生每个同源组的修饰s蛋白，其中修饰s蛋白包含s1区和选自由以下组成的组的至少一个修饰：s1区的部分缺失、s1区的完全缺失、s1区的部分置换以及s1区的完全置换；并且鉴定每个同源组的至少一个共有序列，所述至少一个共有序列与同源组的所有其他成员具有超过60％的序列同一性，其中所述至少一个共有序列选自由以下组成的组：修饰s蛋白的蛋白质序列、编码修饰s蛋白的dna序列和编码修饰s蛋白的rna序列。
18.在另一个实施方式中，方法还包括制备包含至少一个共有序列的病毒载体。在另一个实施方式中，将广泛的一组cov分成同源组的步骤包括从哺乳动物收获至少一种cov。在另一个实施方式中，哺乳动物为人。
19.在另一个实施方式中，s1区具有至少一个可变区，并且至少一个修饰选自由以下组成的组：至少一个可变区的完全缺失、至少一个可变区的部分缺失、至少一个可变区的完全置换以及至少一个可变区的部分置换。
20.在一个实施方式中，cov是sars-2β-cov并且至少一个可变区在氨基酸残基342和533之间。在另一个实施方式中，至少一个可变区包含受体结合结构域(rbd)。在又另一个实施方式中，至少一个修饰是可变区的部分置换或可变区的完全置换，其中可变区被肽接头置换。
21.在另一个实施方式中，cov是α-cov。在又另一个实施方式中，cov是β-cov。
22.在一个实施方式中，共有序列是cov dna序列或β-cov dna序列。在又一个实施方式中，共有序列是cov rna序列或β-cov rna序列。在一个实施方式中，rna是mrna。在另一个实施方式中，共有序列是cov蛋白序列或β-cov蛋白序列。在一个实施方式中，序列是sars-2β-cov序列。
23.在一个实施方式中，所述方法还包括向哺乳动物受试者注射疫苗。
附图说明
24.图1是示出根据本公开内容的实施方式的编码s蛋白的sars-2β-cov rna片段的功能部分以及变异性最大的部分和引发最大免疫反应的部分的示意图。
25.图2示出了根据本公开内容的实施方式的修饰后的s蛋白的设计。
26.图3示出了mers-cov疫苗的活性。
具体实施方式
27.在详细解释本公开内容的任何实施方式之前，应理解的是，本公开内容的应用不限于在以下描述中阐述或附图中说明的部件的构造细节和布置细节。本发明能够有其它实施方式并且能够以各种方式实施或进行。而且，应理解的是，本文使用的措辞和术语是出于描述目的并且不应认为具有限制性。本文使用的“包括”、“包含”或“具有”以及其变化形式意指涵盖下文所列出的项目及其等效物以及另外的项目。在本文中使用“基本上包括”和“基本上由
……
组成”及其变体意图涵盖其后列出的项目，以及等效物和附加项目，只要此类等效物和附加项目不会从本质上改变其特性、用途或制造整体。在本文中使用“由
……
组成”及其变体意图包括其后列出的项目，并且仅包括这些项目。
28.参考附图，相同的数字自始至终指代相同的元件。应理解，尽管术语第一、第二等
可以在本文中用来描述各种元件、部件、区域和/或部分，但这些元件、部件、区域和/或部分不应受这些术语的限制。这些术语可能仅仅用来区分一个元件、部件、区域和/或部分与另一个元件、部件、区域和/或部分。因此，在不脱离本公开内容的情况下，第一元件、组件、区域或部分可以被称为第二元件、组件、区域或部分。
29.除非另有说明，否则本公开内容中的数值范围是近似值，并且因此可包括在所述范围之外的值。数值范围包括以一个单位为增量的来自较低值和较高值并包括较低值和较高值在内的所有值(除非另外特别说明)，只要在任一较低值和任一较高值之间存在至少两个单位的间隔即可。作为实例，如果组成、物理或其他性质，例如组分的按重量计的量等，为10至100，则预期明确列举所有单个值，例如10、11、12等和子范围，例如10至44、55至70、97至100等。对于含有明确值的范围(例如，1或2或3到5或6或7的范围)，包括任何两个明确值之间的任何子范围(例如，上述范围1-7包括子范围1至2；2至6；5至7；3至7；5至6等)。对于含有小于一的值或含有大于一的分数(例如，1.1、1.5等)的范围，在适当时，一个单位被认为是0.0001、0.001、0.01或0.1。对于含有小于十的单个数字的范围(例如，1至5)，一个单位通常被认为是0.1。这些仅仅是特定意图的实例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为在本公开内容中明确陈述。
30.可在本文使用空间术语(例如“下方”、“在
…
之下”、“下部”、“上方”、“上部”及其类似者)以用于方便描述，从而描述一个元件或特征与另一元件或特征的关系，如诸图中所示出。应理解，空间相对术语意图涵盖取决于使用或说明中的取向的不同取向。例如，如果翻转附图中的装置，那么描述为在其他元件或特征“下方”或“之下”的元件就将定向为在其他元件或特征“上方”。因此，示例性术语“下方”可以包含上方和下方的这两个定向。装置可以其他方式来定向(旋转90
°
或处于其他取向)，并且本文所使用的空间相关的描述词可相应地进行解释。
31.如本文所用，术语“和/或”包括相关联列举条目中的一个或多个的任何和所有组合。例如，当在诸如“a和/或b”的短语中使用时，短语“和/或”旨在包括a和b两者；a或b；a(单独)；和b(单独)。同样，在诸如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方式中的每一种：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
32.在一个实施方式中，本公开内容提供了一种用于制备预防受试者、特别是哺乳动物受试者并且更具体地人受试者的至少一种cov感染或至少一种β-cov感染的疫苗的方法。
33.鉴定β-cov
34.根据本公开内容的实施方式，用于制备预防受试者、特别是哺乳动物受试者并且更具体地人受试者的至少一种β-cov感染的疫苗的方法包括从动物宿主，特别是哺乳动物宿主中鉴别至少一种β-cov。在一个特定实施方式中，用于制备用于预防受试者、特别是哺乳动物受试者并且更具体地是人受试者的至少一种β-cov感染的疫苗的方法包括从选自由以下组成的组的哺乳动物宿主中鉴定出至少一种β-cov：蝙蝠、大鼠、人和它们的组合。在一个实施方式中，至少一种β-cov包含至少一种sarsr。在另一个实施方式中，至少一种β-cov包括至少一种sars-2β-cov。
35.鉴定同源组
36.根据本公开内容的实施方式，用于制备用于预防受试者、特别是哺乳动物受试者
并且更具体地人受试者的至少一种β-cov感染的疫苗的方法包括基于基因序列的相似性将鉴定的β-cov，例如从动物宿主中鉴定的那些分离到同源组中，并准备每个同源组的至少一个共有序列。同源组可以基于β-cov基因序列的整个部分、β-cov基因序列的多个部分或β-cov基因序列的单个部分的相似性。基因序列选自由以下组成的组：dna序列、rna序列、蛋白质序列和它们的组合。应当理解，如果鉴定出单个β-cov，它就是单个同源组的唯一成员。
37.在一个特定实施方式中，β-cov包含多个sarsr，并且多个sarsr被分成1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个同源组。在一个实施方式中，同源组是基于与刺突蛋白(s蛋白)、sars受体结合结构域(rbd)、包膜蛋白、核蛋白和它们的组合相关的基因序列的至少一个部分、或至少两个或更多个部分、或所有部分。
38.在另一个实施方式中，至少一种sars-2β-cov被鉴定并分成至少一个同源组。
39.在一个实施方式中，在每个同源组内，基因序列与同源组中的所有其他成员具有大于或等于60％、或大于或等于65％、或大于或等于70％、或大于或等于75％、或大于或等于80％、或大于或等于85％、或大于或等于90％、或大于或等于95％、或大于或等于96％、或大于或等于97％、或大于或等于98％、或大于或等于99％的序列同一性。
40.在一个实施方式中，在每个同源组内，基因序列与同源组中的其他成员具有大于或等于60％、或大于或等于65％、或大于或等于70％、或大于或等于75％、或大于或等于80％、或大于或等于85％至90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或小于100％的序列同一性。
41.在一个实施方式中，每个同源组的基因序列定义了同源组的不同蛋白质序列。在一个实施方式中，独特的蛋白质选自由以下组成的组：s蛋白、包膜蛋白、核蛋白和它们的组合。在另一个实施方式中，独特的蛋白质是s蛋白。
42.在一个特定实施方式中，分析多个sarsr并将其分成5个同源组，其中在每个同源组内，基因序列具有大于65％至99％的序列同一性。
43.现在提供用于鉴定同源组和共有序列的示例性方法。
44.sars-2β-cov具有约30kb的正义单链rna基因组和四种结构蛋白。其中一种结构蛋白是刺突(s)膜粒。这些s蛋白存在于sars-2β-cov的表面并介导细胞受体结合，因此决定了病毒的宿主嗜性。rna中编码s蛋白的蛋白质部分分成s1链条和s2链，其中s1链10和s2链20由呋喃切割位点25隔开，如图1所示。rbd 30位于s1链10中。已发现rbd的变化会影响病毒与血管紧张素转化酶2(ace2)的结合，并且这种结合的增强是通过促进病毒从动物宿主传播到人宿主来实现的。膜融合部分40位于s2链20中。图1进一步示出了s蛋白的七肽hr1和hr2、跨膜tm和胞质结构域。
45.sars-2β-cov s蛋白分裂成s1链10和s2链20。s2链20中的构象变化导致病毒融合在宿主细胞内。与包含rbd的s蛋白编码rna序列组合，这使得编码s蛋白的rna序列成为用于抗sars-2β-cov疫苗方案的重要候选。
46.图1还示出了sars-2β-cov的s蛋白部分，它们引发了更大的免疫反应(60)。如图所示，部分60b与rbd 30重叠并且是相当大的部分，这意味着存在与rbd 30相关的显着免疫反应。部分60d和60e在与变化较小的膜融合部分40重叠时较小，并因此不会引起强烈的免疫反应。在分析对不同β-cov诸如sars-cov-1和mers-cov的免疫反应时，观察到能够中和这些冠状病毒活性的抗体也可以与s蛋白的更保守区域结合，即在s2结构域20内的s蛋白茎区域
内。如图1中进一步示出，比对来自各种sarsr的rna的s蛋白编码序列显示整个基因(50)存在显着差异。因此，基于现有sars-2β-cov rna的疫苗可能无法有效预防由其他sarsr引起的感染。然而，当分析来自多个sarsr的rna的s蛋白编码序列时，可以将sarsr分成同源组，如表1所示。
[0047][0048]
*最接近类似于每组的共有序列的定量序列-使用emboss生成
[0049]
为了获得表1中的信息，使用vipr和ncbi找到序列。使用clustal omega完成全局比对。提取相关比对(》92％)以创建分组，使用clustal omega对其进行比对并使用blast多序列比对确认。
[0050]
对于sars-cov组，分析来自genbank和vipr的覆盖原始sars-cov-1的1130个序列。一些序列包含可能产生缺口的随机插入，但小的变体都保持了抗体结合。对于sars-cov2组，分析了超过3000个序列，包括新的进化枝20h、20i和20j(分别对应于南非、加利福尼亚和英国变体)。wiv-1是蝙蝠中突出的sarsr，但已显示在人细胞中复制。分析56种wiv-1病毒株，包括被认为引起sars-2β-cov的ratg13毒株。仅16个病病毒株具有完整的cds。如ncbi保守蛋白结构域家族cd21477和cn3d所示，变体之间的结构看起来很稳定。对于ynlf组，从蝙蝠、穿山甲和骆驼获得71个序列(39个是完整的cds)。这些sarsr病毒株与sars-2β-cov的相似性低于wiv1家族，但在某些地区与sars-cov组和sars-cov2组具有一些强烈的相似性。全局刺突比对是平庸的；然而，rbd比对显示出很强的相似性。对于bat2013组，分析了19个具有高相似性的样品。bat2013组显示出比其他组更高的方差，但许多病毒株显示出与相同抗体的交叉反应性。
[0051]
共有序列
[0052]
根据本公开内容的实施方式，制备用于预防受试者、特别是哺乳动物受试者并且更具体地人受试者的至少一种cov，并且优选地至少一种β-cov感染的疫苗的方法包括鉴定每个同源组的至少有一个共有序列。共有序列是对于在序列中的每个位置含有统计学上最常见残基的组开发的dna、rna或蛋白质序列。在一个实施方式中，同源组的共有序列与相应同源组的每个成员具有至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％共性。
[0053]
在一个特定实施方式中，共有序列是与相应同源组中的所有其他成员具有大于或等于60％、或大于或等于65％、或大于或等于70％、或大于或等于75％、或大于或等于80％、或大于或等于85％、或大于或等于90％、或大于或等于95％、或大于或等于96％、或大于或等于97％、或大于或等于98％、或大于或等于99％序列同一性的dna序列。
[0054]
在一个特定实施方式中，共有序列是与相应同源组中的所有其他成员具有大于或等于60％、或大于或等于65％、或大于或等于70％、或大于或等于75％、或大于或等于80％、或大于或等于85％、或大于或等于90％、或大于或等于95％、或大于或等于96％、或大于或
等于97％、或大于或等于98％、或大于或等于99％序列同一性的rna序列。
[0055]
在一个特定实施方式中，共有序列是与相应同源组中的所有其他成员具有大于或等于60％、或大于或等于65％、或大于或等于70％、或大于或等于75％、或大于或等于80％、或大于或等于85％、或大于或等于90％、或大于或等于95％、或大于或等于96％、或大于或等于97％、或大于或等于98％、或大于或等于99％序列同一性的蛋白质序列。
[0056]
在一个实施方式中，每个同源组的共有序列选自由以下组成的组：dna序列、rna序列、蛋白质序列和它们的组合。在一个实施方式中，至少一个同源组的共有序列是rna。在另一个实施方式中，rna是mrna。
[0057]
在一个实施方式中，所分析的β-cov是sarsr。在另一个实施方式中，sarsr包括分到至少一个同源组的至少一个sars-2β-cov，并且所述至少一个同源组的共有序列是dna序列、rna序列或蛋白质序列。应当理解，在其中鉴定了单个sarsr，例如单个sars-2β-cov，并且单个sarsr是同源组的唯一成员的实施方式中，共有序列可以是dna序列、rna序列或蛋白质序列，将与sarsr具有100％共性。
[0058]
在一个实施方式中，共有序列是sars-2β-cov dna序列，其中sars-2β-cov dna序列是s蛋白编码序列的至少一部分。
[0059]
在一个实施方式中，共有序列是sars-2β-cov rna序列，其中sars-2β-cov rna序列是s蛋白编码序列的至少一部分。
[0060]
在一个实施方式中，共有序列是sars-2β-cov蛋白序列，其中sars-2β-cov蛋白序列是s蛋白的至少一部分。
[0061]
刺突蛋白的修饰
[0062]
在一个实施方式中，共有序列是cov的s蛋白的至少一部分的蛋白质序列或编码s蛋白的至少一部分的cov dna或rna序列，并且s蛋白含有至少一个修改。也就是说，当共有序列是蛋白质序列时，它是针对修饰s蛋白。类似地，当共有序列是dna或rna序列时，它编码修饰s蛋白。
[0063]
图2a是示出全长s蛋白序列的示意图，而图2b-2d是示出s蛋白序列的示例性修饰的示意图。
[0064]
在一个实施方式中，s蛋白的s1区10被定义为在蛋白质末端的氨基末端开始并在与sars-2s蛋白中发现的肽酶识别位点694对应的氨基酸序列结束的蛋白质区域。在一个实施方式中，至少一个修饰位于s1区10(即，至少一个修饰是从氨基末端到694个氨基酸序列的蛋白质序列的全部或至少一部分。
[0065]
在一个实施方式中，至少一个修饰是在其整体中s1区10的缺失，例如从s蛋白的氨基末端到694个氨基酸序列的区域。在另一个实施方式中，至少一个修饰是s1区10的一个或多个序列，但少于整个序列的缺失，如图2b和2d所示。
[0066]
在一个实施方式中，s蛋白的“可变区”被定义为在比较天然存在的sars-cov病毒和/或sars-2变体的sarsr序列时显示出高序列可变性的s蛋白区域。s蛋白的示例性可变区是在图1中，其中50中所示的高频突变区是示例性可变区。在一个实施方式中，s蛋白具有被称为“可变区”的单个高度可变区。
[0067]
在一个实施方式中，至少一个修饰是至少一个可变区或可变区的完全或部分缺失，如图2b所示。
[0068]
在一个特定实施方式中，s蛋白的可变区位于对应于sars-2(nc_045512.2)的氨基酸残基342和533的氨基酸残基之间。在这种实施方式中，至少一个修饰是位于对应于氨基酸残基342和533的氨基酸残基之间的可变区的完全或部分缺失。
[0069]
在一个特定实施方式中，s蛋白具有对应于大部分或全部rdb区域的可变区。在这种实施方式中，至少一个修饰是rdb区域的完全或部分缺失。在一个实施方式中，rdb区位于对应于sars-2(nc_045512.2)的342和533处的氨基酸残基的氨基酸残基之间，或者进一步位于446和520处的氨基酸残基之间。
[0070]
在一个实施方式中，至少一个修饰是至少一个可变区或可变区的完全或全部置换，其中可变区是上文所述的任何实施方式或实施方式的组合。至少一个可变区或可变区可以被肽接头序列置换，所述肽接头序列被设计成桥接由缺失产生的间隙，如图2c所示。
[0071]
病毒载体
[0072]
根据本公开内容的实施方式，用于制备预防受试者、特别是哺乳动物受试者并且更具体地人受试者的至少一种cov感染、优选地β-cov感染的疫苗的方法包括将至少一个共有序列插入到病毒载体中。在一个实施方式中，病毒载体为腺病毒载体组分。
[0073]
为了使预先存在的和诱导的干扰性抗腺病毒免疫反应最小化，已从病毒载体组分中缺失所有内源基因，所述病毒载体组分是腺病毒载体组分。也就是说，在一个实施方式中，病毒载体组分是完全缺失(fd)的腺病毒载体。
[0074]
在一个实施方式中，共有序列是sars-2β-cov dna序列，其是修饰s蛋白编码序列的至少一部分；sars-2β-cov rna序列，其是修饰s蛋白编码序列的至少一部分；或sars-2β-cov dna序列，其中sars-2β-cov蛋白序列是修饰s蛋白的至少一部分，其中修饰s蛋白含有根据本文提供的任何实施方式或实施方式的组合的一个或多个修饰。
[0075]
疫苗组合物
[0076]
在一个实施方式中，本公开内容提供了一种疫苗组合物，并且更具体地提供一种预防cov、优选地β-cov并且更优选地sarsr的感染的疫苗。
[0077]
根据本公开内容的实施方式，疫苗包含携带在至少一种病毒载体上的来源于一种或多种cov或β-cov或优选地一种或多种sarsr的一个或多个共有序列。共有序列可以是根据本文所述的任何实施方式或实施方式的组合。
[0078]
在一个实施方式中，一个或多个共有序列是β-cov dna序列、rna序列、蛋白质序列或其组合，并且优选地是sarsr dna序列、rna序列、蛋白质序列或其组合。此外，在一个实施方式中，一个或多个共有序列是修饰s蛋白的共有序列。
[0079]
根据本公开内容的实施方式，一个或多个共有序列包含至少一种sarsr dna或rna序列或优选地至少一种sars-2β-cov dna或rna序列。在一个实施方式中，sarsr dna或rna序列或者sars-2β-cov dna或rna序列是修饰s蛋白编码序列的至少一部分。
[0080]
修饰s蛋白是根据本文提供的任何实施方式或实施方式的组合。在一个特定实施方式中，s蛋白含有至少一个修饰，其为至少一个可变区，优选地s1区中的至少一个可变区的部分或完全缺失或置换。在一个特定实施方式中，一个或多个共有序列包含至少一种sarsr dna或rna序列，并且优选地至少一种sars-2β-cov dna或rna序列，其为修饰s蛋白编码序列的至少一部分，并且至少一个修饰是rbd的部分或全部去除或置换。
[0081]
在一个实施方式中，共有序列的表达由启动子驱动。启动子可能对共有序列、被接
种的动物和疫苗的特定组成具有特异性。在一个实施方式中，启动子选自由以下组成的组：人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子、源自人生长基因的多腺苷酸化位点、延伸因子1-α、磷酸甘油酸激酶、泛素c、β肌动蛋白基因以和它们的组合。在实施方式中，启动子的活性可能受到化学物质的影响，所述化学物质例如但不限于抗生素。四环素是影响启动子活性的抗生素的非限制性实例。
[0082]
在一个特定实施方式中，疫苗被专门设计用于预防至少sars-2β-cov的感染。在这种实施方式中，一个或多个共有序列包含至少一种sars-2β-cov dna或rna序列。优选地，sars-2β-cov dna或rna序列为修饰s蛋白编码dna或rna序列，其中修饰s蛋白为含有至少一个修饰s蛋白，并且至少一个修饰为s1区中的至少一个缺失或置换。在另一个实施方式中，sars-2β-cov dna或rna序列是rna序列，其为修饰s蛋白编码序列(部分或全部)，其中s蛋白具有至少一个修饰，所述修饰是全部或一些rbd的缺失或置换。
[0083]
在一个实施方式中，共有序列是编码s蛋白(部分或全部)的sars-2β-cov rna序列，其中s1区的可变区的至少一部分被缺失或置换，sars-2β-cov dna序列是人密码子优化的，并且特异性rna的表达由人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子驱动，随后是源自人生长基因的多腺苷酸化位点。在其他实施方式中，sars-2β-cov rna的表达由其他启动子驱动，所述其他启动子例如但不限于源自延伸因子1-α、磷酸甘油酸激酶、泛素c、β肌动蛋白基因和它们的组合的启动子。在另一个实施方式中，sars-2β-cov rna的表达由启动子驱动，所述启动子的活性可能受化学物质影响，所述化学物质例如但不限于抗生素四环素。
[0084]
在另一个实施方式中，疫苗在一个或多个病毒载体中包含两个或更多个共有序列。根据本公开内容的实施方式，一个共有序列是sars-2β-cov dna、rna或s蛋白序列，并且疫苗包含至少一个另外的共有序列，其为sarsr dna、rna或蛋白质序列。
[0085]
疫苗接种的方法
[0086]
在一个实施方式中，本公开内容提供了一种为动物受试者、优选地哺乳动物受试者并且更优选地人受试者接种疫苗以预防至少一组cov、优选地β-cov的感染的方法。
[0087]
根据本公开内容的实施方式，所述方法包括修饰cov、优选地β-cov、并且更优选地sars-2β-cov的s蛋白以产生修饰s蛋白。修饰s蛋白包含至少一个修饰，其为s蛋白的s1区的完全缺失、部分缺失、完全置换或部分置换。在一个特定实施方式中，修饰s蛋白包含从氨基末端到位点694的s1序列的至少一个缺失或置换。在另一个实施方式中，修饰s蛋白具有可变区的部分缺失、可变区的完全缺失、可变区的部分置换或可变区的完全置换。在一个实施方式中，可变区是s蛋白的氨基残基342至533。在另一个实施方式中，可变区对应于一些或所有rbd。当修饰是可变区的全部或部分置换时，可变区可以被肽接头置换。
[0088]
修饰s蛋白可以直接用于疫苗中，例如单独使用或与病毒载体组合使用。在另一个实施方式中，可以使用编码修饰s蛋白的cov dna或rna的共有序列。
[0089]
根据本公开内容的实施方式，方法包括提供包含至少一种病毒载体的疫苗，所述病毒载体包含至少一个cov共有序列、或至少一个β-cov共有序列、或至少一个sarsr共有序列、或至少一个sars-2β-cov共有序列，所述共有序列是修饰s蛋白的共有序列。至少一个共有序列可包含在至少一种病毒载体中。疫苗可还包含质粒。将病毒载体(含有共有序列)和质粒转染到包装细胞中，并且将包装细胞包裹在衣壳中。
[0090]
在一个实施方式中，至少一个cov共有序列是根据本文所述的任何实施方式或实
施方式的组合。在一个特定实施方式中，至少一个cov共有序列是编码修饰s蛋白的至少一部分的β-cov dna或rna序列。
[0091]
方法还包括将共有序列注射到动物受试者、优选地哺乳动物受试者、例如人中。在一个实施方式中，单剂量足以提供针对至少一种cov、优选地至少一种β-cov的预防，并且更具体地提供针对与疫苗中含有的共有序列中的至少一者具有大于或等于60％、或大于或等于65％、或大于或等于70％、或大于或等于75％、或大于或等于80％、或大于或等于85％、或大于或等于90％、或大于或等于95％、或大于或等于96％、或大于或等于97％、或大于或等于98％、或大于或等于99％序列同一性的任何cov的预防。
[0092]
在其他实施方式中，可能需要两个或更多个剂量来提供预防。特别地，两个剂量或三个剂量或四个剂量足以提供针对至少一种cov的预防，更特别地提供针对与疫苗中含有的共有序列中的至少一者具有大于或等于60％、或大于或等于65％、或大于或等于70％、或大于或等于75％、或大于或等于80％、或大于或等于85％、或大于或等于90％、或大于或等于至95％、或大于或等于96％、或大于或等于97％、或大于或等于98％、或大于或等于99％序列同一性的任何cov的预防。
[0093]
实施例
[0094]
实施例1
[0095]
五只小鼠(balb/c小鼠)的对照组接种安慰剂。五只小鼠(balb/c小鼠)的实验组接种3
×
107个悬浮在载体悬浮缓冲液(pbs、mgcl
2 5mm、edta 0.1mm、蔗糖5％)中的gremersfl疫苗(含有带有与emx/2012mers-cov具有至少60％共性的共有序列的病毒载体)的基因组等效物。共有序列是mers-cov的全长s蛋白。对照组和实验组在第1天接受第一次肌肉注射，然后在第17天接受用相同的相应制剂的加强剂量。在第19天，两组均用ld50的mers进行鼻内感染。各组在第21天混合。测试小鼠是否存在中和emx/2012mers-cov对测试细胞的感染的抗体。如图3所示，对照小鼠没有显示抗体，而实验组显示出明显的病毒中和作用。
[0096]
尽管本文已详细描述了病毒载体和相关疫苗的多个实施方式，但清楚的是，可以对其进行修改和变化，所有这些修改和变化都落入本发明的真正精神和范围内。具体地，虽然本发明的病毒载体和疫苗已针对β-cov，并且更具体地针对sars-2和sarsr病毒进行了详细描述，但应当理解，病毒载体和疫苗可以根据本领域技术人员进行修改以适用于其他类型的cov，例如像α-cov、γ-cov和δ-cov。此外，因为许多修改和改变容易为本领域技术人员思及，所以不希望将本发明限制于所示出和描述的结构和操作，因此所有合适的修改和等效物均可以被视为落入本公开内容的范围内。